JPH0214037B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明は細胞を用いて下記化学構造式（）の
ピロロキノリンキノン（以下PQQと略称）を製
造する方法に関する。 PQQはキノ酵素のアポ型酵素をホロ化して酵
素を活性化する能力を有し、メタノール資化性細
菌のメタノール脱水素酵素、酢酸菌のアルコール
脱水素酵素、アルデヒド脱水素酵素又はグルコー
ス脱水素酵素などの補酵素として機能しているほ
か、動物、植物及び微生物起源のアミン酸化酵素
及びアミン脱水素酵素又は一部のアミノ酸ラセマ
ーゼの補酵素として、生理学的に重要な機能を有
する物質である。更に他の酸化還元酵素や転位酵
素の補酵素、例えばチアミンピロリン酸、ニコチ
ンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミ
ドアデニンジヌクレオチドホスフエート、ピリド
キサールホスフエート、フラビンアデニンジヌク
レオチド、フラビンモノヌクレオチドなどは、そ
れぞれ、ビタミンB1、ニコチン酸、ビタミン
B6、ビタミンB2などの型で摂取することが必須
である。これと同様に、PQQは重要な酵素反応
の補酵素となつて機能していることから未同定で
はあるがPQQもビタミン作用を有するきわめて
重要な物質であるといえる。いずれにせよ、
PQQは補酵素として酵素反応又は物質代謝系を
活性化するものであり、医薬品として重要な役割
を果す物質である。 従来、PQQの製造法としては有機化学的合成
法が知られている〔例えばJACS.、103巻、5599
〜5600頁（1981）参照〕。しかしながら、有機化
学的合成法には、合成反応が多段階から成るため
に製造に時間を要し、異性体をはじめとする副生
物の除去のために煩雑な操作を必要とし、また
PQQの収率も低いという問題があつた。 本発明者らはかかる従来のPQQの合成法の問
題点を排除し、高純度のPQQを簡単な操作で短
時間かつ高収率で経済的に製造できる方法を開発
すべく鋭意研究をすすめた結果、細胞、特に微生
物を培養することによりPQQを大量かつ経済的
に供給することができることを見出し、本発明を
するに至つた。 すなわち、本発明に従つたPQQの製造方法は、
グルコノバクター属、アセトバクター属、ミクロ
コツカス属、シユードモナス属、コリネバクテリ
ウム属、エシエリヒア属、サルシナ属、セラチア
属、エルビニア属、クレブシラ属、アシネトバク
ター属、ハイホミクロビウム属、ラクトバチルス
属及びストレプトコツカス属の少なくとも一つに
属するピロロキノリンキノン生産能を有する微生
物を栄養培地中で培養して培養物中にピロロキノ
リンキノンを生成せしめ、これを採取することか
ら成る。 PQQの製造方法として細胞、特に微生物の細
胞を培養してその培養液中にPQQ（及びその類縁
化合物）を生成蓄積せしめ、これを例えば抽出に
よつて採取する方法は本発明方法が最初であり、
かかる方法によりPQQの大量供給が可能となり、
例えばPQQの医薬用としての開発と利用に大き
く貢献することができる。なお、PQQと同時に
生産される可能性のあるPQQの類縁化合物とし
ては、例えば下記式（）のフエナンスロリジオ
ンが考えられる。 （上記式において、R₁＝R₃＝COOCH₃、R₂＝R₄
＝Ｈ；R₁＝R₃＝Ｈ、R₂＝R₄＝COOCH₃；又はR₁
＝R₄＝Ｈ、R₂＝COOCH₂H₅、R₃＝COOCH₃） 本発明方法において使用することのできる
PQQ生産能を有する微生物としては、グルコノ
バクター属（Gluconobacter industrius IFO
3260、Gluconobacter suboxydans IFO 12528）、
アセトバクター属（Acetobacter aceti IFO
3284、Acetobacter ascendens IFO 3299）、ミ
クロコツカス属（Micrococcus roseus IFO
3764）、シユードモナス属（Pseudomonas
fluorescens IFO 3081、Pseudomonas AMI
NCIB 9133）、コネリバクテリウム属
（Corynebacterium sepedonicum IFO 13763）、
エシエリヒア属（Escherichia coli Ｋ−12 IFO
3301）、サルシナ属（Sarcina lutea IFO
12708）、セラチア属（Serratia marcescens IFO
3046）、エルビニア属（Erwinia herbicola IFO
12686）、クレブシラ属（Klebsiella pneumoniae
IFO 3317）、アシネトバクター属
（Acinetobacter calcoaceticus IFO 12552）、ハ
イホミクロビウム属（Hyphomicrobium
neptunium ATCC 15444）、等に属するバクテリ
ア、ラクトバチルス属（Lactobacillus casei
IFO 3425）、ストレプトコツカス属
（Streptococcus faecalis IFO 3181）等の属に属
する乳酸菌、酵母、糸状菌、放線菌及び不完全菌
に属す微生物があげられる。その他、タバコをは
じめとする植物カルス、ほ乳動物の白血球細胞や
肝細胞などの細胞もPQQの生産能を有する。 本発明方法において使用することのできる培地
としては、前記微生物などが培養により増殖し得
るものであれば任意のものでよく、例えばグリセ
ロール、マニトールなどの糖アルコール類、グル
コース、フルクトースなどの還元糖類、蔗糖、マ
ルトースなどの二糖類や炭水化物の加水分解物の
ほか、廃糖密、亜硫酸パルプ廃液および酢酸、グ
ルコン酸などの糖酸が利用できる。例えばシユー
ドモナス AM1 NCIB 9133などのようなメタ
ノール資化性菌の場合には、メタノール、メチル
アミン及びメタンなどを炭素源とすることができ
る。窒素源としては、アミノ酸、核酸類のほかに
蛋白質加水分解物、酵母エキス、コーンステイー
プリカーのような有機態のものや、アンモニウム
塩、硝酸塩などの無機態のものを使用することが
できる。 本発明方法は、前記したように、糖質を原料と
して直接発酵法により培養液中にPQQを生成蓄
積させる方法の他に、別途に培養して調製した微
生物細胞の洗浄細胞懸濁液にPQQ生合成の前駆
体となりうる化合物、すなわち、グリセロール、
マニトール、フルクトース、グルコースなどの糖
質とグルタミン酸、アスパラギン酸、アラニンな
どのアミノ酸の混合物を加えて反応させ、反応液
中に生成するPQQを取得することもできる。 本発明方法における培養は好気的条件下に、例
えば通気撹拌や往復振盪方法によつて培養するこ
とができる。培養条件は、特に限定はないが、一
般的に言えば、温度０〜40℃、PH２〜９及び20〜
100時間程度の条件で実施する。 培養液又は培養物からのPQQの採取方法は慣
用方法に従つて行うことができる。例えば、イオ
ン交換クロマトグラフイー、濃縮物のゲル濾過
法、凍結乾燥物の溶媒抽出法あるいはアフイニテ
イクロマトグラフイーなどが利用できる。 PQQの補酵素活性の検定と、培養液中の生成
物の濃度の検定は、次のようにして行うことがで
きる。キノ酵素のアポ酵素の調製には、発明者ら
がすでに発表した方法（FEBS Letters、130巻、
179〜183頁、1981年）において使用したシユード
モナス・エルギノサIFO 3445のＤ−グルコース
脱水素酵素活性欠損変異株を用いることができ
る。本菌株はPQQ生成能を欠くが、その細胞膜
中には通常のレベルのアポＤ−グルコース脱水素
酵素を生成蓄積している。このような変異株より
調製した細胞膜画分にPQQ（及び類縁化合物）を
含む培養液、反応液あるいは菌体抽出液を加える
ことによつて、アポ酵素はホロ化され、Ｄ−グル
コース脱水素酵素活性が発現する。発現する酵素
活性の強度が、添加されたPQQの量に比例関係
を示すPQQの濃度域を、化学合成したPQQを用
いて測定し検量線を作成することによつて、培養
液等の試料中に含まれるPQQ量を求める（第１
図、検量線）。PQQを定量することは、PQQを補
酵素とする他の種類のキノ酵素からアポ酵素を調
製し、これにPQQを添加することによつて酵素
を活性化することで同様に行うことができる。ま
た、PQQの定量は高速液体クロマトグラフイー
によつても行うことができる。 以下に本発明の実施例を説明するが、本発明の
範囲をこれらの実施例に限定するものでないこと
はいうまでもない。 実施例 １ 500ml容三角フラスコに、グリセロール0.4％、
グルタミン酸ナトリウム0.6％、K₂HPO₄0.05％、
KH₂PO₄0.05％、MgSO₄・7H₂O0.02％、
FeSO₄・7H₂O0.001％、NaCl0.001％、MnSO₄・
4H₂O0.001％、チアミン塩酸0.00004％、ニコチ
ン酸0.00004％、パントテン酸カルシウム0.00004
％、パラアミノ安息香酸0.00001％を含む培地100
mlを加え、これにグルコノバクター・インダスト
リウスIFO 3260を接種して、100〜120rpmで振
盪し乍ら通気培養した。 第２図はその培養経過を示したもので、菌の生
育が対数増殖期末期から定常期初期にあたる時期
に培養液中のPQQの蓄積が最高になることを示
している。第２図は、培養中の培養液の一部を無
菌的にとり出し、遠心分離して菌体を除去して得
られる上清0.1mlを33マイクログラムのアポＤ−
グルコース脱水素酵素を含む細胞膜画分に加え、
室温で30分放置して酵素をホロ化させたのち、発
現した酵素活性の強度から培養液中のPQQ濃度
を算出してグラフに示したものであり、菌の生育
は600nｍでの吸光度で表示した。 酵素活性を求めるために、予めホロ化した上記
の酵素液（0.11ml）に50ｍＭトリスヒドロキシア
ミノメタン−塩酸緩衝液、PH8.75にアジ化ナトリ
ウムを24ｍＭ含むもの１ml、6.7ｍＭ、２，６−
ジクロロフエノールインドフエノール0.04ml、６
ｍＭフエナジンメトスルフエート0.2mlを加え、
反応液全量を水で2.9mlとし、25℃で600nｍの吸
光度変化を調べ、同様に調製した盲検との間で吸
光度に増減が生じないことを確認した。次いで８
ｍＭアジ化ナトリウムを含む1Mグルコースを一
方のキユベツトに0.1ml加え、その時点以降の吸
光度変化をレコーダーで記録した。ホロ化の程度
及びホロ酵素の濃度と２，６−ジクロロフエノー
ルインドフエノールの褪色とがよい相関を示す。
化学合成されたPQQを用いて、同様の操作によ
つて得た第１図の検量線から各試料中のPQQ濃
度を算出した。PQQが最高に生成される時点で
培養を停止し、菌体を除去して得られる培養液を
アンバーリストＡ−21カラム（オルガノ(株)製）に
吸着させ、0.35M NaClを含む50％メタノールに
よつて不純物を溶出させたのち、飽和NaClを含
む50％メタノールによつて溶出されてくる画分に
PQQが含まれていた。 得られたPQQ画分を下記条件で液体クロマト
グラフイー分析を行つたところ、化学合成された
PQQと両者はピークの保持時間（13分）が一致
していた。 機 器：日本分光製高速液体クロマトグラフ、ト
ライローター カラム：HW−40S（トヨパール） 溶離液：水−アセトニトリル（１：１） 検出器：UV（254nｍ） 流 速：1.0ml／min 次に、PQQ画分から大量分取して、PQQを単
離し、PQQ5.2μｇを得た。 実施例 ２ シユードモナスAM1 NCIB 9133をメタノー
ル0.4％、硫安0.1％、KH₂PO₄0.15％、
K₂HPO₄0.15％、MgSO₄・7H₂O0.003％を含む培
地で30℃で60〜90時間実施例１と同様にして通気
かくはん培養した。この間、メタノールを0.1％
ずつ24時間ごとに補充して培養を行つた。60〜72
時間の培養でPQQの生成蓄積は２〜３×10^-7M
に達した。PQQ濃度の検定法及びPQQの単離法
は実施例１と同様に行つた。得られたPQQは8μ
ｇであつた。 シユードモナスAM1 NCIB 9133を用いて、
実施例１に示した培地と同組成の培地を用いて
PQQの生成を行わせた場合も70〜100時間の培養
で２〜３×10^-7MのPQQ濃度に達した。 実施例 ３ 微生物による物質生産がフイードバツク調節さ
れることはしばしば見られることであるが、
PQQ生成もその例外ではない。フイードバツク
調節による制御を受けずにPQQを生成させた例
を以下に示す。 実施例１に示した培地と同組成の培地に菌株
（グルコノバクター・インダストリウス
IFO3260、アセトバクター・アセチIFO 3284、
シユードモナスAM1 NCIB 9133などのうち１
菌株）を接種して30℃で通気かくはん培養を行つ
た。この際、陰イオン性イオン交換樹脂（アンバ
ーリストＡ−21）を透析チユーブに入れてあらか
じめ滅菌しておいたものを培養フラスコの中へ入
れた。培地100ml当り１ｇのイオン交換樹脂を加
えた。細胞によつて培養液中に生成されるPQQ
は透析膜を通してイオン交換樹脂に吸着されるた
め、培養液中のPQQ濃度はイオン交換樹脂を添
加しないで培養した場合の培養液と比較すると、
培地中のPQQ濃度は10分の１以下に保たれてい
た。イオン交換樹脂を添加しなかつた培養では培
養液中のPQQ濃度が著しく減少する定常期末期
（約100時間目）まで培養を続けたのち、透析膜を
とり出し、封入されていたイオン交換樹脂から
PQQの溶出を行つた。得られたPQQは15〜20μｇ
であつた。 実施例 ４ グルコノバクター・サブオキシダンスIFO
12528を実施例１に示した培地と同組成の培地を
用いてPQQの生成を行わせた。その結果、30時
間の培養で1.0×10^-8MのPQQ濃度に達した。 実施例 ５ アセトバクター・アセチIFO 3284を実施例１
に示した培地と同組成の培地を用いてPQQの生
成を行わせた。その結果、30時間の培養で1.0×
10^-8MのPQQ濃度に達した。 実施例 ６ アセトバクター・アセンデンスIFO 3299を実
施例１に示した培地と同組成の培地を用いて
PQQの生成を行わせた。その結果、30時間の培
養で5.2×10^-8MのPQQ濃度に達した。 実施例 ７ 50容培養タンクに、実施例１で用いたのと同
一の組成の培地30を加え、これにグルコノバク
ター・インダストリウスIFO 3260を接種し、30
／分の通気及び500rpmの撹拌条件下に通気培
養した。24時間経過後のPQQ濃度はロツトNo.１
で6.0×10^-8M（収量0.63mg）、ロツトNo.２で11.2×
10^-8M（収量1.17mg）であつた。 実施例 ８ 実施例１に示した培地と同組成の培地を用いて
下記第１表に示す菌体を用いて培養を行なつた。
得られた菌体を蒸留水で洗浄後、菌体１容に対し
９容のメタノールを加えて一夜撹拌した。遠心分
離によつて菌体を除去した上清を蒸発乾固させ、
これに水を加えて実施例１と同様にPQQを定量
した。結果を以下の第１表に示す。PQQは菌体
中のタン白（mg）当りの量で示した。

【表】 実施例 ９ 実施例１に示した培地と同組成の培地を用いて
グルコノバクター・インダストリウスIFO 3260
の培養を行ない、得られた菌体を蒸留水で洗浄
後、OD₆₀₀＝10.0になるように菌体に蒸留水を加
えてこれを洗浄細胞懸濁液とした。 洗浄細胞懸濁液をOD₆₀₀＝1.0になるように
0.1Mリン酸カリウム緩衝液（PH7.0）で稀釈した
後、この稀釈液にグリセロール濃度が0.4％、グ
ルタミン酸濃度が0.6％になるようにグリセロー
ル又はグルタミン酸を加えて30℃で反応を行なつ
た。生成したPQQは実施例１と同様に定量した。 結果を以下の第２表に示す。

【表】 酸
なし 2 6

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ グルコノバクター属、アセトバクター属、ミ
   クロコツカス属、シユードモナス属、コリネバク
   テリウム属、エシエリヒア属、サルシナ属、セラ
   チア属、エルビニア属、クレブシラ属、アシネト
   バクター属、ハイホミクロビウム属、ラクトバチ
   ルス属及びストレプトコツカス属の少なくとも一
   つに属するピロロキノリンキノン生産能を有する
   微生物を栄養培地中で培養して培養物中にピロロ
   キノリンキノンを生成せしめ、これを採取するこ
   とを特徴とするピロロキノリンキノンの製造方
   法。 ２ グルコノバクター属、アセトバクター属、ミ
   クロコツカス属、シユードモナス属、コリネバク
   テリウム属、エシエリヒア属、サルシナ属、セラ
   チア属、エルビニア属、クレブシラ属、アシネト
   バクター属、ハイホミクロビウム属、ラクトバチ
   ルス属及びストレプトコツカス属の少なくとも一
   つに属するピロロキノリンキノン生産能を有する
   微生物を栄養培地中で培養して得られた微生物細
   胞を分離し、この分離微生物細胞の存在下に糖質
   とアミノ酸を反応させてPQQを生成せしめるこ
   とを特徴とするピロロキノリンキノンの製造法。