JPH0510077B2

JPH0510077B2 -

Info

Publication number: JPH0510077B2
Application number: JP60088255A
Authority: JP
Inventors: Sadaji Uragami
Original assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Current assignee: Mitsubishi Gas Chemical Co Inc
Priority date: 1985-04-24
Filing date: 1985-04-24
Publication date: 1993-02-08
Also published as: JPS61247397A

Description

【発明の詳細な説明】

〔産業上の利用分野〕本発明は、ピロロキノリンキノンの製造法に関
し、さらに詳細には、細菌を使用したピロロキノ
リンキノンの製造法に係わる。ピロロキノリンキノン（以下PQQと略称）は、
別名、２，７，９−トリカルボキシ−1H−ピロ
ロ〔２，3f〕キノリン−４，５−ジオンであり、
化学構造式は以下の如くである。 PQQは、1979年に、メタノール資化性細菌の
メタノール脱水素酵素の補酵素として精製、結晶
化され、構造決定がなされた。（S.A.Salisbury
et al.，Nature，280巻p.843（1979））さらに、近年、細菌にかぎらず、真核生物のカ
ビ、酵母、さらには、哺乳動物にもPQQ酵素が
所在していることが明らかになつた。このように、PQQは、補酵素として酵素反応
又は物質代謝系を活性化するものであり、医薬品
として重要な役割を果す物質と考えられている。〔従来技術、発明が解決しようとする課題〕従来、PQQの製造法としては、有機化学的合
成法が知られている（例えば、JACS.，103巻、
5599〜5600頁（1981））。しかしながら有機化学的合成法には多段階の合
成反応から成るために製造に長時間を要し、異性
体をはじめとする副生物の除去のために煩雑な操
作を必要とし、またPQQの収率も低いという問
題があつた。また、発酵法による製造法（特開59−113896）
も知られているが、その生産量は、0.1〜0.3×
10^-8Ｍ／（培養液１当り4μg〜12μg）と非常
に低く、工業的に得ることは到底出来ない。本発明者らは、細菌を用いるPQQの生産技術
を確立することを目的とした。〔課題を解決するための手段、作用〕本発明者らは、PQQを多量に生産する細菌を
見出すべく研究を重ねた結果、アクロモバクター
属、メチロバチルス属、メチロモナス属、メチロ
バクテリウム属、プロトモナス属、ミコプラナ
属、アンシロバクター属、ミクロチクルス属、ハ
イホミクロビウム属、キサントバクター属、チオ
バチルス属またはアンテロモナス属に属する細菌
がPQQを多量に生産することを見出して本発明
を完成した。すなわち、本発明はアクロモバクター属、メチ
ロバチルス属、メチロモナス属、メチロバクテリ
ウム属、プロトモナス属、ミコプラナ属、アンシ
ロバクター属、ミクロチクルス属、ハイホミクロ
ビウム属、キサントバクター属、チオバチルス属
またはアンテロモナス属に属し、ピロロキノリン
キノンを生産する能力を有する細菌を、メタノー
ルおよび／またはメチルアミンを炭素源とする培
地中に培養し、培養液または培養上澄液からピロ
ロキノリンキノンを分離採取することを特徴とす
るピロロキノリンキノンの製造法である。本発明において使用される細菌としては、アク
ロモバクター属、メチロバチルス属、メチロモナ
ス属、シユードモナス属、メチロバクテリウム
属、プロトモナス属、ミコプラナ属、アンシロバ
クター属、ミクロチクルス属、ハイホミクロビウ
ム属、キサントバクター属、チオバチルス属また
はアンテロモナス属に属し、PQQを多量に生産
する菌株であればいずれでもよいが、これらの菌
の代表例として、アクロモバクターメタノロフ
イラ ATCC 21275、同ATCC 21452、同ATCC
21961、メチロバチルスグリコゲネス ATCC
29475、メチロモナスメタノリカ NRRL Ｂ
−5458、メチロモナスサラシカ ATCC
33146、メチロモナスクララ ATCC 31226、
メチロモナスメタノカタラレスリカＢ−78
（微工研菌寄第4036号）、同Ｂ−42（微工研菌寄第
4037号）、同Ｂ−452（微工研菌寄第4038号）、メチ
ロモナスメタノフラクトリカＢ−145（微工研
菌寄第4039号）、同Ｂ−134（微工研菌寄第4040
号）、同Ｂ−148（微工研菌寄第4041号）、同Ｂ−65
（微工研菌寄第4042号）、同Ｂ−58（微工研菌寄第
4043号）、メチロモナスエスペクシイーＢ−
185（微工研菌寄第2661号）、同Ｂ−341（微工研菌
寄第2662号）、同BV−３（微工研菌寄第2663号）、
メチロバクテリウムオルガノフイラムATCC
29983、プロトモナスエクストルクエンスJCM
2802、同JCM 2805、同JCM 2806、同JCM
2811、同JCM 2812、同JCM 2813、同JCM
2814、同JCM 2815、同JCM 2816、同JCM
2817、同JCM 2818、同JCM 2819、同JCM
2820、同JCM 2821、同JCM 2822、同JCM
2823、同JCM 2824、同JCM 2825、同JCM
2826、同JCM 2827、同JCM 2829、同JCM
2830、同JCM 2831、同JCM 2832、ミコプラナ
ルブラ NCIB 10409、アンシロバクターア
クアテイクス ATCC 25396、同DSM 334、同
ATCC 27068、同ATCC 27069、（アンシロバク
ターアクアテイクスの菌名は、International
Journal of Systematic Bacteriology，33巻、
p.397〜398（1983）に準拠）、ミクルチクルスエブ
レニウス ATCC 21373、ミクルチクルスポリ
モリフアム NCIB 10516、ミクルチクルスメ
タノリカＣ−18（微工研菌寄第4416号）、同Ｃ−
37（微工研菌寄第4417号）、同Ｃ−42（微工研菌寄
第4418号）、同Ｃ−53（微工研菌寄第4419号）、ハ
イホミクロビウムバクアブル NCIB 10517、
ハイホミクロビウムブルガレ NCIB 9698、
同NCIB 9775、ハイホミクロビウムメチロボ
ラム IFO 14180、ハイホミクロビウムエスピ
ー DSM 1869、キサンドバクターオートトロ
フイカム DSM 432、同DSM 431、同DSM
597、同DSM 685、同DSM 1393、同DSM
1618、同DSM 2009、キサントバクターフラバ
ス NCIB 10071、チオバチルスノベルス
NCIB 10456、同ATCC 8093、チオバチルス
ベルスタスATCC 25364、（チオバチルスベル
スタスの菌名は、International Journal of
Systematic Bacteriology，33巻p.211〜217、
（1983）に準拠）、アルテロモナスサラソメタノ
リカ ATCC 33145などがある。これらの菌株
は、すべて公知である。これらの菌株より得られ
た変異株も使用することが出来る。これらのPQQ生産細菌を培養するに当つて用
いられる培養培地は、主炭素源として、メタノー
ルおよび／またはメチルアミンを含有することが
必要である。さらに培地成分として、通常の窒素
源、無機物の適量が使用される。窒素源としては、通常はたとえば硫酸アンモニ
ウム、尿素、硝酸アンモニウム、リン酸アンモニ
ウム、ペプトン、肉エキス等が用いられ、無機塩
類としては通常はたとえばリン酸塩、マグネシウ
ム塩、鉄塩、その他必要に応じて微量金属塩が用
いられる。更に、アミノ酸、核酸、ビタミン、酵
母エキス、麦芽エキス等、生育促進物質も使用さ
れる。又、使用菌株が栄養要求性を示す場合に
は、その要求性物質を培地に添加する必要があ
る。また、メチロモナスサラシカ ATCC
33146、アルテロモナスサラソメタノリカ
ATCC 33145などは、生育にNaClが必要なので、
培地中に、NaClを２〜４％添加するか、あるい
は、培地作成に用いる水として海水を使用する必
要がある。培養温度は、通常25〜45℃の範囲で各菌株にと
つて生育増殖に適した温度を選択すればよい。培
養PHは、通常６〜８の範囲で各菌株にとつて生
育、増殖に適したPHを選択する。培養方式は、回分培養あるいは連続培養のいず
れでもよい。窒素源として、アンモニウム塩を使用する場合
は、菌体が増殖するに伴つて培養液中のPHが低下
するので、培養期間中の培地のPHを一定に保つた
めに、アンモニア、苛性カリ、もしくは苛性ソー
ダ等を添加して培養液のPHを調節する必要があ
る。これらの中でアンモニアが特に好ましい。このようにして培養して得られた培養液からた
とえば、ろ過もしくは遠心分離などの通常の固液
分離手段によつて、菌体を除去し、培養上澄液を
得る。得られた培養上澄液、あるいは場合によつ
ては菌体を含有する培養液そのままからPQQを
分離する。培養液からのPQQの分離、採取方法は、通常
の方法によつて行なうことが出来る。例えばイオ
ン交換クロマトグラフイー、濃縮物のゲルろ過
法、凍結乾燥物の溶媒抽出法あるいはアフイニイ
テイクロマトグラフイーなどが利用できる。培養液より得られたPQQの同定には、ペーパ
ークロマトグラフイー、薄層クロマトグラフイ
ー、元素分析、核磁気共鳴スペクトルおよび質量
分析などの手段が用いられる。また、定量法としては、飴山らの「シユードモ
ナスエルギノーサのＤ−グルコース脱水素酵素
活性欠損変異株を用いる方法（FEBS Letters，
130巻、179〜183頁、1981年）」、あるいは、高速
液体クロマトグラフイーなどによつて行なうこと
ができる。〔実施例〕以下実施例によつて本発明を更に具体的に説明
する。実施例１純水１あたり、（NH₄）₂SO₄ 3g、KH₂PO₄
1.4g、Na₂HPO₄ 2.1g、MgSO₄・7H₂Ｏ
0.2g、CaCl₂・2H₂Ｏ 30mg、FeC₆H₅O₇・XH₂Ｏ
30mg、MnCl₂・4H₂Ｏ５mg、ZnSO₄・7H₂Ｏ
５mg、CuSO₄・5H₂Ｏ 0.5mg、チアミン塩酸
塩４mg、バントテン酸カルシウム４mg、ビオチン
20μgおよびメタノール８mlを溶解し、PHが7.1に
調整された液200mlを１容三角フラスコに入れ、
120℃で20分間殺菌し、これを培地とした。これに前記と同様な培地を用いて30℃で24時間
前培養された各菌株の培養液をそれぞれ１容量％
接種し、30℃で回転振とう培養を行なつた。培養
開始後48時間で培養液中のメタノール濃度は
0.001％以下となつた。この培養液を遠心分離し、
上澄液を得、その中のPQQ含量を測定した。結果を第１表に示す。

【表】

【表】実施例２純水１あたり、（NH₄）₂SO₄ 3g、KH₂PO₄
1.4g、Na₂HPO₄ 2.1g、MgSO₄・7H₂Ｏ
0.2g、CaCl₂・2H₂Ｏ 30mg、FeC₆H₅O₇・XH₂Ｏ
30mg、MnCl₂・4H₂Ｏ５mg、ZnSO₄・7H₂Ｏ
５mg、CuSO₄・5H₂Ｏ 0.5mg、メチルアミン
塩酸塩5gを溶解し、PHが7.1に調整された液200ml
を１容三角フラスコに入れ、120℃で20分間殺
菌し、これを培地とした。これに前記と同様な培地を用いて30℃で24時間
前培養したチオバチルスベルスタス ATCC
25364の培養液を１容量％接種し、30℃で回転振
とう培養を行なつた。培養開始後、48時間で培養
液中のメチルアミン濃度は0.01％以下となつた。
この培養液を遠心分離し、上澄液を得、その中の
PQQ含量を測定したところ、培養液１当り、
340μgのPQQを含有していた。実施例３海水１あたり、（NH₄）₂SO₄ 3g、KH₂PO₄
1.4g、Na₂HPO₄ 2.1g、MgSO₄・7H₂Ｏ
0.2g、CaCl₂・2H₂Ｏ 30mg、FeC₆H₅O₇・XH₂Ｏ
30mg、MnCl₂・4H₂Ｏ５mg、ZnSO₄・7H₂Ｏ
５mg、CuSO₄・5H₂Ｏ 0.5mg、酵母エキス
0.2g、ビタミンB₁₂10μg、メタノール８mlを溶解
し、PHが7.1に調整された液200mlを１容三角フ
ラスコに入れ、120℃で20分間殺菌し、これを培
地とした。これに前記と同様な培地を用いて30℃で24時間
前培養した各菌株の培養液を１容量％接種し、30
℃で回転振とう培養を行なつた。培養開始後36時
間で、培養液中のメタノール濃度は0.001％以下
となつた。この培養液を遠心分離し、上澄液を
得、その中のPQQ含量を測定した。結果を表２
に示す。

〔発明の効果〕

本発明によれば、細菌を使用して、ピロロキノ
リンキノンを安価にかつ安定的に得ることが可能
である。

Claims

【特許請求の範囲】

１アクロモバクター属、メチロバチルス属、メ
チロモナス属、メチロバクテリウム属、プロトモ
ナス属、ミコプラナ属、アンシロバクター属、ミ
クロチクルス属、ハイホミクロビウム属、キサン
トバクター属、チオバチルス属または、アンテロ
モナス属に属し、ピロロキノリンキノンを生産す
る能力を有する細菌を、メタノールおよび／また
はメチルアミンを炭素源とする培地中に培養し、
培養液または培養上澄液からピロロキノリンキノ
ンを分離採取することを特徴とするピロロキノリ
ンキノンの製造法。