JPH0568578A - テアニンの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】グルタミンとエチルアミンの混合物にｐＨ９〜
１２の条件下でグルタミナーゼを作用させることを特徴
とするテアニンの製造方法であり、該グルタミナーゼは
Pseudomonas属の微生物から得られる酵素を使用するこ
とができる。また、ニッケル、コバルト、カドミウムま
たは亜鉛の存在下でグルタミナーゼを作用させるとさら
に効率良くテアニンを合成することができる。 【効果】本発明によって新規なテアニンの効率的な製造
方法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能とする
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】 【産業上の利用分野】

【０００１】本発明は、γ−グルタミルエチルアミド
（以下、テアニンという）の新規な製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術・発明が解決しようとする課題】テアニン
は玉露の旨味の主要成分として知られ、茶をはじめとす
る食品の香味物質として重要な物質である。また一方、
テアニンを含めてγ−グルタミル誘導体は、動・植物体
における生理活性物質として作用することが指摘されて
いる。例えば、Chem. Pharm. Bull., 19(7) 1301-1307
(1971), 同19(6), 1257-1261(1971), 同 34(7), 3053
-3057 (1986), 薬学雑誌, 95(7), 892-895 (1975) に
は、テアニンやグルタミンがカフェインによって誘発さ
れる痙攣に拮抗することが報告されており、このことか
らこれらの化合物が中枢神経系に作用することが考えら
れ、生理活性物質としての有用性が期待されている。

【０００３】従来より、テアニンの製造方法としてはテ
アニンを含有する玉露の生産用茶園において得られる茶
葉乾燥物より抽出する方法が一般的である。しかし、こ
の場合、テアニンは茶葉乾燥物あたりわずか１．５％前
後程度しか蓄積されず、また一般の煎茶用茶園では光合
成が活発であるため、ほとんど蓄積されないのが実情で
ある。従って、茶葉乾燥物からの抽出法では工業的に実
用的ではないことが指摘されている。

【０００４】このようなことから、工業的生産方法の開
発が期待されており、その一つとして、テアニンを化学
的に有機合成する方法が報告されている（Chem. Pharm.
Bull., 19(7) 1301-1307 (1971)）。しかし、このよう
な有機合成反応では収率が低く、生成物の分離精製等に
おいて煩雑な操作を必要とするという問題点が指摘され
ている。また、特公昭６３−２８５９６号公報では酵母
が糖の醗酵の際に生成するＡＴＰを利用して、グルタミ
ン合成酵素の存在下でグルタミン酸からテアニンを合成
する方法が開示されている。しかしながら、該公報に開
示されている方法は酵母の至適ｐＨが中性（６〜８）で
あるのに対して、グルタミン合成酵素によるテアニン合
成反応の至適ｐＨが１０〜１１であるために両反応を組
み合わせることは容易ではなく、実施が困難であること
が指摘されている。

【０００５】ところで、グルタミナーゼはグルタミンを
加水分解してグルタミン酸とアンモニアを生成するが、
ヒドロキシルアミンを加えて反応条件を選ぶことによ
り、γ−グルタミルヒドロキサム酸を生成することが知
られている（S.C. Hartman, Journal of Biological Ch
emistry, 243巻, 853 〜863 ページ, 1968年）。しか
し、このようなグルタミナーゼを用いてテアニンを製造
する方法は知られていない。従って、本発明の目的は簡
易かつ工業的有利にテアニンを製造する方法を提供する
ことにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは前記の課題
を解決するために、前記のヒドロキシルアミンをエチル
アミンに置き換えて種々実験を重ねた。その結果、特定
の反応条件下においてグルタミナーゼを反応させること
により、意外にもテアニンを得ることができることを見
い出し、本発明を完成するに到った。即ち、本発明の要
旨は、グルタミンとエチルアミンの混合物にｐＨ９〜１
２の条件下でグルタミナーゼを作用させることを特徴と
するテアニンの製造方法に関する。

【０００７】本発明においては、ｐＨ９〜１２の条件下
で行う必要がある。これはｐＨが９より小さいと図１に
示すようにグルタミンの加水分解反応が大きくなるため
テアニンの合成が抑えられ、ｐＨが１２より大きくなる
と図２に示すようにグルタミナーゼの安定性が悪くなる
ためテアニンの合成が進まなくなる。

【０００８】本発明におけるグルタミナーゼは、その由
来に特に限定されるものではなく、例えば微生物由来の
ものとしては、 Pseudomonas属等の細菌、Saccharomyce
s 属等の酵母、Aspergillus 属等のかび等の由来の酵素
が挙げられる。ここで、 Pseudomonas属の微生物として
は、Pseudomonas nitroreducens, Pseudomonas aptata,
または Pseudomonas denitrificans等が好適な例として
挙げられる。また、グルタミナーゼのその他の由来とし
ては、植物、動物などであってもよい。

【０００９】本発明におけるグルタミナーゼは、次のよ
うな物理化学的性質を有するものである。 （１）作用 ｐＨ９〜１２の条件下ではグルタミンのγ位の転移反応
を触媒し、グルタミンとエチルアミンの反応によりテア
ニンを合成する。ｐＨ９未満の条件下では主としてグル
タミンを加水分解してグルタミン酸を生成する。 （２）基質特異性 グルタミンを基質とする。 （３）至適ｐＨおよび安定ｐＨ テアニン合成の至適ｐＨは９〜１２（図１参照）、安定
ｐＨは４５℃、１０分間の熱処理ではｐＨ１１．５まで
安定である（図２参照）。 （４）至適温度および安定温度 至適温度は３５〜４０℃、安定温度はｐＨ１１の条件
下、１０分間の熱処理では４０℃まで安定である（図２
参照）が、数時間から数十時間に及ぶ反応では反応温度
を３０℃とすることが好ましい。至適温度は温度条件を
１０、２０、３０、３５、４０、５０℃に設定した場合
のテアニン生成量（３０℃における生成量を１００とす
る）が、それぞれ２２、５２、１００、１４７、１５
０、１２であることに基づくものである。

【００１０】本発明における金属イオンによるグルタミ
ナーゼ活性の影響は、ニッケル、コバルト、カドミウ
ム、または亜鉛の存在下で酵素反応を行うと、グルタミ
ナーゼによってグルタミンが加水分解されてグルタミン
酸を生成する反応は抑制されるが、テアニンの合成には
直接影響を与えない。即ち、加水分解活性の測定にはＬ
−γ−グルタミルｐ−ニトロアニリド（ｐＨ９）を、転
移反応活性の測定にはＬ−グルタミン＋エチルアミン
（ｐＨ１１）を用いてなされた試験では、表１に示され
るように、ニッケル、コバルト、カドミウム、または亜
鉛の存在下で酵素反応を行うと、グルタミンが加水分解
されてグルタミン酸を生成するのは抑制され、テアニン
の合成には直接影響を与えていない。

【００１１】従って、ニッケル、コバルト、カドミウ
ム、または亜鉛の存在下で反応させるとグルタミン酸の
生成が抑制されているので、その分より効果的にテアニ
ンを合成することができる。例えば、このニッケルを実
際の反応液に添加した場合、図３に示されるようにニッ
ケル添加によってテアニンの生成は増加し、グルタミン
酸の生成は抑制されている。

【００１２】

【表１】

【００１３】本発明における至適グルタミン濃度は、エ
チルアミンを１．５Ｍに固定し、グルタミン濃度を０．
１〜０．７Ｍの範囲で反応させてホウ酸緩衝液（Ｎａ₂
Ｂ₄ Ｏ₇ −ＮａＯＨ、ｐＨ１１）中、３０℃で１〜７時
間反応させて求めた（グルタミナーゼの使用量は１．０
Ｕ／ｍｌ）。図４に示されるように０．７Ｍグルタミ
ン、５時間で約２８０ｍＭ（約５０ｇ／Ｌ）のテアニン
が生成しており、５時間以降では加水分解を受けて減少
する傾向が見られる。この結果からすると、グルタミン
濃度は０．３〜０．７Ｍが好ましく、グルタミンからの
転換率及び最大生成量を考慮すると、なかでもグルタミ
ン濃度０．３Ｍ付近が最適である。なお、テアニン生成
におけるグルタミンに対するＫｍ値は約２０ｍＭであ
る。

【００１４】本発明における至適エチルアミン濃度は、
グルタミンを０．３Ｍに固定し、エチルアミン濃度を２
Ｍの範囲まで変化させた場合、１Ｍ以上の濃度でテアニ
ンの生成量が一定となる。即ち、グルタミンを０．３Ｍ
に固定し、エチルアミン濃度を２Ｍの範囲まで変化さ
せ、ホウ酸緩衝液（ｐＨ１１）中、３０℃で５時間反応
させて求めた。図５に示されるようにエチルアミンは１
Ｍ以上の濃度でテアニンの生成量が一定となる。なお、
エチルアミンに対するＫｍ値は約１３０ｍＭである。

【００１５】グルタミナーゼ量とインキュベーション時
間との関係は、ホウ酸緩衝液（ｐＨ１１）中、３０℃で
０．３Ｍグルタミン及び１．５Ｍエチルアミンをグルタ
ミナーゼ０．０５〜０．５Ｕ／ｍｌの範囲で２３時間ま
で反応させた場合、図６に示されるように０．１〜０．
３Ｕ／ｍｌでは直線的に増加し、時間を引き延ばすこと
である一定の生成量に達する。

【００１６】これらの点から、本発明において効率的な
反応をおこなうためには、ｐＨ９〜１２の条件下におい
て、グルタミン濃度は通常０．３〜０．７Ｍ、エチルア
ミン濃度はグルタミン０．３Ｍに対して通常１．０Ｍ以
上が好ましい。また、グルタミナーゼ量は反応時間が１
０時間未満の場合は通常０．８〜１．０Ｕ／ｍｌ程度、
１０時間〜３０時間の場合は０．３〜０．４Ｕ／ｍｌが
好ましい。また、反応時間が数時間以上の場合、反応温
度は通常３０〜３５℃が好ましい。このようにして得ら
れるテアニンの反応液からの単離精製は、通常の公知の
方法が用いられ、例えば溶媒分配および各種クロマトグ
ラフィー、ＨＰＬＣを組み合わせることにより容易に行
うことができる。

【００１７】

【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳しく説
明するが、本発明はこれらにより何ら限定されるもので
はない。 グルタミナーゼの調製例 （ａ）Pseudomonas nitroreducens IFO 12694 の培養 グルタミン酸ナトリウム０．６％、酵母エキス０．１
％、グルコース１．０％、ＫＨ₂ ＰＯ₄ ０．０５％、
Ｋ₂ ＨＰＯ₄ ０．０５％、ＭｇＳＯ₄ ・７Ｈ₂ Ｏ
０．０７％、ＥＤＴＡ−Ｆｅ ０．０１％を含む培養液
（ｐＨ７）を用いて、３０リットル容のジャーファメン
ター（３０℃、通気１ｖｖｍ＝２５リットル／ｍｉｎ、
回転数２，０００ｒｐｍ）中、Pseudomonas nitroreduc
ens IFO 12694 株を約２０時間培養した。 （ｂ）無細胞抽出液 １７５リットル分の菌体を洗浄後、３０ｍＭリン酸カリ
ウム緩衝液（ｐＨ７．０）７．５リットルに懸濁し、５
〜２０℃で超音波破砕し、無細胞抽出液を得た。 （ｃ）硫酸アンモニウム分画 ７％アンモニア水でｐＨを７に調整しながら硫酸アンモ
ニウム分画を行ない、４５〜９０％飽和画分を得た。こ
れを０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液に溶かし、同緩衝
液に対して透析した。 （ｄ）ＤＥＡＥ−セルロースカラムクロマトグラフィー 透析酵素液を０．０１Ｍリン酸カリウム緩衝液で緩衝化
した。次にＤＥＡＥ−セルロースカラム（１５×６０ｃ
ｍ）に吸着させ、グルタミナーゼを０．１Ｍの食塩を含
む緩衝液で溶出した。

【００１８】以上の操作で、実用上十分な純度のグルタ
ミナーゼを得ることができるが、さらにＣＭ−セルロー
スカラムクロマトグラフィー、セファデックスＧ１５０
カラムクロマトグラフィー、ハイドロキシアパタイトカ
ラムクロマトグラフィー、ブチルトヨパールカラムクロ
マトグラフィーを行うことにより、ディスク電気泳動的
に単一な標品が得られる。精製率は２５０倍、回収率は
１０％である。

【００１９】実施例１ グルタミン０．３Ｍ及びエチルアミン１．５Ｍをホウ酸
緩衝液（Ｎａ₂ Ｂ₄ Ｏ₇ −ＮａＯＨ、ｐＨ１１）中、
０．３Ｕ／ｍｌグルタミナーゼにて３０℃、２２時間反
応させた。反応液１リットルより２２５ｍｍｏｌｅのテ
アニンを単離した。なお、副生成物のグルタミン酸は２
０ｍｍｏｌｅであった。テアニンの反応液からの単離精
製は、反応液をＤｏｗｅｘ５０×８、Ｄｏｗｅｘ１×２
カラムクロマトグラフィーにかけ、これをエタノール処
理することにより行った。

【００２０】この単離物質をアミノ酸アナライザー、ペ
ーパークロマトグラフィーにかけると、標準物質と同じ
挙動を示し、塩酸あるいはグルタミナーゼで加水分解処
理を行うと、１：１の割合で、グルタミン酸とエチルア
ミンを生じた。このように、単離物質がグルタミナーゼ
によって加水分解されたことから、エチルアミンがグル
タミン酸のγ位に結合していたことが示される。また、
加水分解で生じたグルタミン酸がＬ型であることも、グ
ルタミン酸デヒドロゲナーゼ（ＧｌｕＤＨ）により確認
された。図７はテアニンのＩＲスペクトルであり、標
品、単離物質ともに同一のスペクトルが得られた。これ
らのことから、単離物質がテアニンであることが確認さ
れた。

【００２１】実施例２ 実施例１と同様の反応液に１ｍＭのＮｉＣｌ₂ を添加
し、同条件で反応を行ったところ、反応液１リットルよ
り２４０ｍｍｏｌｅのテアニンを単離した。なお、副生
成物のグルタミン酸は１０ｍｍｏｌｅであった。

【００２２】

【発明の効果】本発明によって新規なテアニンの効率的
な製造方法を提供し、簡易かつ工業的有利な生産を可能
とすることができる。

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はグルタミナーゼによるテアニン合成の至
適ｐＨを示す図である。

【図２】図２はグルタミナーゼの安定ｐＨおよび安定温
度を示す図である。

【図３】図３はニッケル添加によるテアニン合成への影
響を示す図である。

【図４】図４はグルタミン濃度によるテアニン合成への
影響を示す図である。

【図５】図５はエチルアミン濃度によるテアニン合成へ
の影響を示す図である。

【図６】図６はグルタミナーゼ量とインキュベーション
時間との関係を示した図である。

【図７】図７はテアニンの標品および単離物質について
のＩＲスペクトルを示した図である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 金 武祚 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内 (72)発明者 萩原 宣行 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内 (72)発明者 立石 雅也 三重県四日市市赤堀新町９番５号 太陽化 学株式会社内

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 グルタミンとエチルアミンの混合物にｐ
   Ｈ９〜１２の条件下でグルタミナーゼを作用させること
   を特徴とするテアニンの製造方法。
2. 【請求項２】 ニッケル、コバルト、カドミウムまたは
   亜鉛の存在下でグルタミナーゼを作用させる請求項１記
   載の製造方法。
3. 【請求項３】 グルタミナーゼが Pseudomonas属の微生
   物から得られる酵素である請求項１または２記載の製造
   方法。
4. 【請求項４】 請求項３記載の Pseudomonas属の微生物
   が、Pseudomonas nitroreducens, Pseudomonas aptata,
   または Pseudomonas denitrificansである請求項３記載
   の製造方法。