DE2632157A1

DE2632157A1 - Behandlung von einzellenprotein

Info

Publication number: DE2632157A1
Application number: DE19762632157
Authority: DE
Inventors: Stockton-On-Tees Norton; David Charles Steer; Hugh Lewis Williams
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Priority date: 1975-07-16
Filing date: 1976-07-16
Publication date: 1977-02-03
Also published as: NO762475L; IT1064669B; NL7607772A; AU1592176A; GB1498688A; DK144826B; CH603067A5; DK144826C; JPS5212976A; NO147955B; NO147955C; US4133904A; FR2318225A1; SE429091B; SE7608103L; FR2318225B1; BE844127A; DK320976A; AU513229B2; JPS5614269B2

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Behandlung von Einzellenprotein zur Reduzierung von dessen llukleinsäuregehalt.

Einzellenprotein, welches durch Kultivierung von Mikroorganismen in kontinuierlicher Permentierung erhalten werden kann, enthält im allgemeinen einen höheren Anteil von Nukleinsäuren als in der Mehrzahl von anderen Lebensmitteln und Speisemitteln enthalten ist. Pur einige potentielle Anwendungen von Einzellenprotein kann es vorteilhaft sein, diesen hohen Nucleinsäuregehalt auf ein

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Maß zu reduzieren.

Wenn beispielsweise das Einzellenprotein für den menschlichen Verbrauch bestimmt ist, soll eine Reduzierung seines Nucleinsäuregehaltes bevorzugt sein. Den Menschen fehlt das Enzym Uricase_/und sie sind im Gegensatz zu den Tieren, welche dieses Enzym besitzen, nicht in der lage, die aus den Nukleinsäuren herrührende Harnsäure zu Allantoin umzusetzen. Somit ist in menschlichen Nahrungsmitteln ein hoher Gehalt von FuIcIe insäur en unerwüns cht.

Die Verfahren, die zur Entfernung von Nukleinsäuren aus Einzellenprotein vorgeschlagen wurden, umfassen häufig das mechanische Aufbrechen der Zellen. Diese Verfahrensweise ermöglicht es, daß die NuIdeinsäuren aus den Zellen herausgelöst werden, wobei die verschiedenen Löslichkeiteigenschaften von Nukleinsäuren im Vergleich mit Protein ausgenutzt werden. Beispielsweise ist in "The Nucleic Acids", Band 1, herausgegeben von E. Chargaff und J.IT. Davidson, Academic Press 1955 s Seite 391 ein Verfahren zur Abtrennung und Gewinnung von Ribonucleinsäure beschrieben, (welche normalerweise den größeren Teil der Nukleinsäuren in Einzellenprotein ausmacht), welches.die Fragmentierung der Zellen^unter Verwendung einer Naß-Zerkleinerungsmühle mit anschließender Extraktion mit heißen

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Salzlösungen umfaßt. Heiße Salzlösungen haben den Vorteil, daß die Proteinlöslichkeit möglichst klein gemacht wird, während sie gute lösungsmittel für Nukleinsäuren sind.

In der britischen Patentschrift Nr. 1381 306 ist ein "Verfahren zur Abtrennung von Bakterienzellen aus einem wässrigen Medium beschrieben, wobei die Zellen geflockt werden, indem das Medium wenigstens einem der folgenden Stufen unterworfen wird:

(A) Erhöhung des pH-Werts des Mediums auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 8 bis 11 durch Behandlung mit einem Alkali und

(B) Erhitzen des Mediums auf eine Temperatur innerhalb des Bereiches von 50 bis 200° C; wobei nach Stufe (A) und/oder Stufe (B) der pH-Wert auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 2 bis 5 durch Behandlung mit einer Säure erniedrigt wird und die geflockten Zellen aus dem Medium abgetrennt werden.

Es wurde nun gefunden, daß das Verfahren der britischen Patentschrift 1 381 306 einem Verfahren angepaßt werden kann, wobei Einzellenprotein mit einem reduzierten

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Nucleinsäuregehalt erzeugt werden kann.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Behandlung von Einzellenprotein, wobei ein wässriges Medium mit einem Gehalt an Mikroorganismenzellen den folgenden Stufen unterworfen wird: (A) Behandlung mit einer Säure zur Erniedrigung seines pH-Werts auf einen Viert von nicht größer als 5 und (B) Erwärmen auf eine Temperatur von wenigstens 60° C, wobei die Stufen (A) und (B) entweder hintereinander oder gleichzeitig durchgeführt werden und anschließend (C) Behandlung mit einem Alkali zur Erhöhung des pH-Werts des Mediums auf einen Wert von wenigstens 6, während die Temperatur des Mediums bei einem Wert von wenigstens 60° C gehalten wird und danach die Zellen aus dem Medium abgetrennt werden. Durch das erfindungsgemäße Verfahren wird der Nucleinsäuregehalt der Mikroorganismenzellen, die das Einzellenprotein bilden, ohne Verwendung einer mechanischen Fragmentierung der Zellen, welche unerwünscht ist, reduziert. Es wird angenommen, daß dieses erwünschte Ergebnis aus folgendem Grund erzielt wird. Die Hitze- und Säurebehandlung und die anschließende Alkalibehandlung läßt die Zellen für Nukleinsäuren durchlässig werden, indem möglicherweise Teile der äußeren Schichten der Zellwände entfernt werden. Die Nukleinsäuren dringen durch die geschwächten Zellwände in das umgebende Medium und der Nukleinsäuregehalt der Zellen wird dadurch reduziert.

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Wenn die Zellen aus dem Medium abgetrennt werden, werden sie von den Nukleinsäuren darin getrennt.

Die Mikroorganismenzellen, welche das Einzellenprotein bilden, können Hefezellen oder Bakterienzellen, vorzugsweise die letzteren sein. Das Verfahren ist zur Behandlung von Bakterienzellen der Gattungen Pseudomonas, Alealigenes und Bacillus sehr geeignet, beispielsweise Stämme der Spezies Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeioginosa, Pseudomonas diminuta, Alealigenes faecalis, Bacillus cereus und insbesondere Pseudomonas methylotropha, Die Eigenschaften der letzten Spezies sind in der britischen Patentschrift Kr. 1. 370 892 beschrieben. Kulturen einer Anzahl von Stämmen dieser letzten Spezies wurden in the national collection of Industrial Bacteria (NCIB), lorry Research Station, Aberdeen, Scotland, UK hinterlegt und sind dort verfügbar und entsprechende Hinterlegungen erfolgten bei the Collections of the US Department of Agriculture (NERL) at Peoria, Illinois und dem Fermentation Research Institute (PRI), Japan. Die Zahlenbezeichnungen, die diese Kulturen erhielten, sind die folgenden:

NCIB Nr. 10508-15 und 10592-6

NRRL Nr. B 5352-64

PRI Nr. PERM 1215 - 27

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Andere Bakterienspezies,welche durch das Verfahren behandelt werden können,sind Pseudomonas roeea, Microcylus polymorphum und Hyphomicrobium variabile. Die Eigenschaften dieser Spezies sind in der "britischen Patentschrift Wr. 370 892 aufgeführt und Kulturen einer Anzahl von Stämmen sind "bei den oben aufgeführten Verwahrungssteilen hinterlegt worden und sind vom ITCIB erhältlich» Die Zahlenbezeichnungen dieser letzten Kulturen sind wie folgt:

IiGIB Nr. 10516-7 und 10597-612 ERRL Nr. B 5381-2 und B 5365-80 I¹RI Nr. PERM 1228-45

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahren kann die Alkalibehandlungsstufe (in welcher der pH des Mediums auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 8 bis 11 durch Behandlung mit einem Alkali erhöht wird) des Verfahrens der britischen Patentschrift Nr. 1 381 306 vor dem Erhitzen und der Behandlung mit Säure ohne irgendeinen Nachteil durchgeführt werden.

Während des Erhitzens des Mediums (Stufe B) wird die Temperatur zweckmäßigerweise auf 60° bis 100° C, vorzugsweise 70° bis 90° C erhöht. Die Säurebehandlung (Stufe A) erniedrigt zweckmäßigerweise den pH auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 2 bis 5» vorzugsweise 2,5 bis 4,5.

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Die anschließende Behandlung mit einem Alkali (Stufe C) erhöht den pH zweekmäßigerweise auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 6 bis 10, vorzugsweise 6 bis 8. Vor der Behandlung mit Alkali (Stufe C) wird das Medium vorzugsweise sowohl erhitzt, als auch bei dem niedrigeren pH,, zweckmäßigerweise für eine Zeitspanne von wenigstens einer Minute, vorzugsweise zwei bis zehn Minuten,gehalten.

Nachdem das Medium bei einer erhöhten Temperatur und einem erniedrigten pH für eine Zeitspanne gehalten worden war, sollte die Temperatur bei wenigstens 60° C während der Alkalibehandlung gehalten werden. Es ist vorteilhaft, etwas des Mediums vor der Behandlung mit Alkali zu entfernen, um die Behandlungskosten zu reduzieren.

Die zur Behandlung des Mediums verwendete Säure kann zweckmäßigerweise eine anorganische Säure, wie beispielsweise Schwefelsäure, Salzsäure oder Phosphorsäure oder ein Säuregas, wie beispielsweise Kohlendioxyd oder Schwefeldioxyd sein. Wenn das Verfahren eine Stufe in einem Gesaiatprozeß für die Einzellenproteinproduktion bildet, ist die Säure vorzugsweise eine Phosphorsäure/Schwefelsäuremischung mit geeigneten Verhältnissen, damit das Medium nach der Abtrennung der geflockten Zellen zu der Fermentationsstufe des Verfahrens rezirkuliert werden kann. Nach dem Ansäuren und dem Erhitzen ist es bevorzugt, daß die

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Behandlung mit dem Alkali so mild wie möglich ist,

um das Aufbrechen der großen Flocken, die während des Ansäuernsund der Hitze"behandlung gebildet werden, möglichst klein zu halten. Zu geeigneten Alkalien zählen Natriumhydroxyd, Kalziumhydroxyd, Natriumkarbonat und Ammoniak.

Bei der Behandlung durch das erfindungsgemäße Verfahren enthält das Medium vorzugsweise 0,05 "bis 2 $ Gewicht/Volumen eines Salzes, zweckmäßigerweise Natriumchlorid oder Ammoniumphosphat.

Nach der Behandlung mit Alkali kann die Abtrennung der geflockten Zellen durch herkömmliche Techniken, "beispielsweise Zentrifugierung oder Filtration oder durch Flotation "bewirkt werden.

Die Erfindung wird durch die nachfolgenden Beispiele erläutert:

Beispiel 1

Eine 10 $-ige Suspension von geflockten Zellen eines Organismus der Spezies Pseudomonas methylotropha, die, wie in der "britischen Patentschrift ITr. 1 381 306 "beschrieben, gebildet wurde, wurde danach wie folgt behandelt:

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50 Gramm Natriunchlorid wurden zu 5 Liter des Mediums hinzugefügt und der pH wurde von 4,3 auf 7,0 unter Verwendung einer verdünnten caustischen Sodalösung erhöht. Die Temperatur wurde auf 80° C gesteigert und 5 Minuten lang gehalten* Das behandelte Medium wurde mit 35 Liter heißem Wasser vermischt und das ezP wurde durch Zentrifugieren gewonnen. Das ezP wurde in einem Vakuumofen bei 50° C getrocknet.

Die Analyse der behandelten Probe ist in Tabelle I gezeigt, in welcher die Ergebnisse mit denjenigen einer ähnlichen Probe von geflockten Zellen, welche nicht zur Reduzierung der iTukl ein säure behandelt worden waren₇verglichen sind. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß der Nucleinsäuregehalt der behandelten Probe viel niedriger ist.

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- ίο -

Tabelle	Analyse	I	unbehandelte Probe
Verlust bei 105°c	behandelte Probe	4,4 io
Asche bei 55O⁰C	2,9 io	8,3 io
Gesamt P	3,1 io	2,6 £
Gesamt S	0,8 io	0,99 Ji
Gesamt Cl	0,2 io	< 0,02 io
Gesamt Ca	0,64 io	0,12 #
Gesamt Ua	0,18 io	1,13 io
Gesamt K	0,58 io	0,22 #
Ammoniak ITp	0,02 io	0,05 io
Gesamt N₂	0,006 io	13,0 /₀
Nucleinsäure	15,4 io	14,7 Jt
Gesamtsäure	1,8 io	5,9 io
Gesamt-Anhydroaminosäureη	6,8 io	57,3 #
Asparaginsäure	69,9 io	7,2 *
Threonin	8,5 *	3,7 *
Serin	4,5 io	2,7 96
Glutaminsäure	5,2 *	8,4 io
Prolin	10,2 $	2,7 Jt
Glycin	3,3 io	4,2 io
Alanin	4,9 *	5,6 #
Valin	6,6 io	4,5 /0
Methionin	5,7 #	2,0 io
2,6 £

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- 11 Tabelle I (Fortsetzung)

Analyse

Isoleucin Leucin Tyrosin Phenylalanin Histidin Lysin Arginin

"behandelte Probe	unbehandelte Probe
4,7 io	3,8 io
7,5 io	5,8 io
3,1 io	2,6 io
3,7 io	2,9 io
1,9 io	1,6 io
6,4 io	5,4 #
5,1 io	4,0 io

Tabelle - Die Analyse der Proben von Pseudomonas methylotropha mit und ohne Behandlung zur Reduzierung der Uucleinsäure.

Beispiel 2

Sieben Kulturen von jeweils einem der Stämme Pseudomonas methylotropha ASI (NCIB 10515)» Pseudomonas diminuta, Pseudomonas aeroginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseusomonas alcaligenes, Alcaligenes faecalis, und Bacillus cereus wurden in Schüttelflaschen gezüchtet um ein Liter Kultur zu ergeben. Jede Kultur wurde in zwei Teile aufgeteilt und ein Teil wurde mit einem gleichen Wasservolumen

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verdünnt, zentrifugiert und in einem Vakuumofen "bei 5O⁰C getrocknet. Dieser Teil bildete die Kontrolle. Der andere Teil wurde auf 80⁰C erhitzt, dem 1 $ Gewichts/Volumen ITa Cl zugesetzt war. Der pH wurde dann auf 4 zehn Hinuten lang erniedrigt und danach wurde die Kultur fünf Minuten lang wieder neutralisiert, mit dem zweifachen Volumen verdünnt, zentrifugiert und in einem Vakuumofen "bei 50⁰C getrocknet. ITucleinsäurebe Stimmungen wurden gemacht. Die Ergebnisse sind in Tabelle II aufgeführt.

Tabelle II

Nucleinsäuregehalt nucleinsäuregehalt Stamm der Kontrolle der Testkultur

(Ji Gew./Vol.) (5$ Gew./Gew.)

P. nethylotropha AS-I 10,1 3,5

P. diminuta 9,2 3,9

P. aeroginosa 7,1 7,0

P. fluorescens 11,7 4,7

P. alcaligenes 11,6 4,9

Alealigenes faecalis 10,3 6,2

Bacillus cereus 4,5 2,2

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Beispiel 3

Zwei Kulturen, jeweils eine, eines Pseudomonas fluorescens- und eines Pseudomonas alcaligenes - Stammes^ wurden wie in Beispiel 2 behandelt, mit Ausnahme, daß die Zugabe von Ea Cl !-weggelassen wurde. Die Ergebnisse waren wie folgt:

nucleinsäuregehalt Nucleinsäuregehalt

der Kontrolle der Testkultur

(fo Gew./Vol.) (<fo G-ew./öew.)

Ps. fluorescens 10,9 7,0

Ps. Alcaligenes 9,3 4,8

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Claims

-H- Patentansprüche:

1. Verfahren zur Behandlung von Einzellenprotein, dadurch gekennzeichnet, daß man ein wässriges Medium mit einem Gehalt an Mikroorganismenzellen den folgenden Stufen unterwirft:

(A) Behandlung mit einer Säure zur Erniedrigung seines pH-Werts auf einen Wert von nicht größer als 5 und

(B) Erhitzen auf eine Temperatur von wenigstens SO⁰Q, wobei die Stufen (A) und (B) entweder hintereinander oder gleichzeitig durchgeführt werden, und anschließend

(C) Behandlung mit einem Alkali zur Erhöhung des pH-Wertes des Mediums auf einen Wert von we-" nigstens 6, während die Temperatur des Mediums hei einem Wert von wenigstens 60 C gehalten wird/und danach die Zellen aus dem Medium abgetrennt werden,

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen von jeweils einer der Gattungen Ps eudomonas, Alealigenes oder Bacillus verwendet.

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3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man Zellen der Spezies Pseudomonas methylotropha einsetzt.

4. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Stufe

(A) und/oder (B) den pH-Wert des Mediums auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 8 "bis 11 durch Behandlung mit einem Alkali erhöht.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Stufe

(B) die Temperatur des Mediums auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 60° "bis 100⁰C erhöht.

6. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Stufe (A) den pH-Wert des Mediums auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 2 bis 5 erniedrigt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man während der Stufe

(C) den pH-Wert des Mediums auf einen Wert innerhalb des Bereiches von 6 bis 10 erhöht.

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8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man vor der Behandlung mit Alkali in Stufe (C) das Medium wie in Stufe (B) erhitzt, und bei einem niedrigeren pH-Wert als in Stufe (A) für eine Zeitspanne von zwei "bis zehn Minuten hält.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Säure in Stufe (A) Schwefelsäure, Salzsäure, und/oder Phosphorsäure verwendet.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Alkali in Stufe (C) Uatriumhydroxyd, Kalziumhydroxyd, Natriumkarbonat und/oder Ammoniak verwendet.

11. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß das Medium 0,05 $ bis 2 fo Gew./Vol. eines Salzes enthält.

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