DK144826B

DK144826B - Fremgangsmaade til behandling af bakterieceller for at recudere nukleinsyreindholdet deraf

Info

Publication number: DK144826B
Application number: DK320976AA
Authority: DK
Inventors: D C Steer; H L Williams
Original assignee: Ici Ltd
Priority date: 1975-07-16
Filing date: 1976-07-15
Publication date: 1982-06-14
Also published as: NO762475L; IT1064669B; NL7607772A; AU1592176A; GB1498688A; CH603067A5; DK144826C; JPS5212976A; NO147955B; NO147955C; US4133904A; DE2632157A1; FR2318225A1; SE429091B; SE7608103L; FR2318225B1; BE844127A; DK320976A; AU513229B2; JPS5614269B2

Description

144826

Den foreliggende opfindelse angår en fremgangsmåde til behandling af bakterieceller for at reducere nukleinsyre-indholdet deraf.

Enkeltcelleprotein, der kan fås ved dyrkning af bakterier 5 ved kontinuerlig forgæring, indeholder i reglen en større mængde nukleinsyrer, end der er indeholdt i størstedelen af andre næringsmidler og foderstoffer. Til nogle potentielle anvendelser af enkeltcelleprotein kan der være en fordel ved at reducere dette høje nukleinsyren!veau i 10 nogen grad.

Foreslåede fremgangsmåder til fjernelse af nukleinsyrer fra enkeltcelleprotein indebærer hyppigt mekanisk sprængning af cellerne. Denne operation gør det muligt, at nukleinsyrerne kan opløses ud af cellen, idet man udnyt-15 ter forskellige opløselighedsegenskaber af nukleinsyrer sammenlignet med protein. F.eks. er der i "The Nucleic Acids", bind 1, redigeret af E.Chargaff & J.N.Davidson, Academic Press 1955, side 391, beskrevet en fremgangsmåde til adskillelse og udvinding af ribonukleinsyre (som normalt ud-20 gør størstedelen af nukleinsyrerne i enkeltcelleprotein), som indebærer fragmentering af cellerne under anvendelse af en våd knusemølle, efterfulgt af ekstraktion med varme saltopløsninger. Varme saltopløsninger har den fordel at formindske proteinopløselighed, medens de er gode opløs-25 ningsmidler for nukleinsyrer.

I dansk patentskrift nr. 140.559 er beskrevet en fremgangsmåde til adskillelse af bakterieceller fra et vandigt medium, hvori cellerne flokkuleres ved at opvarme mediet til en temperatur i intervallet 50 - 200°C og derefter nedsætte 30 pH-værdien af mediet til en værdi i intervallet 2-5, hvor efter de flokkulerede celler skilles fra mediet.

2 U4 826

Det har nu vist sig, at fremgangsmåden ifølge dansk patentskrift nr. 140.559 kan tilpasses til at give en fremgangsmåde, ved hvilken enkeltcelleprotein med nedsat nuklein-syreindhold kan fremstilles.

5 Fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at et vandigt medium indeholdende bakteriecellerne underkastes trinene (A) behandling med en syre for at nedsætte pH-værdien til en værdi i intervallet 2 - 5 og (B) opvarmning til en temperatur i intervallet 60-100°C, idet trin 10 (A) og (B) udføres i vilkårlig rækkefølge eller samtidig, og derefter (C) behandling med et alkali for at hæve mediets pH-værdi til en værdi i intervallet 6-10, medens temperaturen af mediet holdes på en værdi på mindst 60°C, hvorefter cellerne skilles fra mediet.

15 Ved fremgangsmåden Ifølge opfindelsen reduceres nukleinsyre-indholdet af bakteriecellerne, uden at der benyttes mekanisk fragmentering af cellerne, hvilket er uønsket. Det antages, at det gode resultat opnås af følgende grund. Varmen og syrebehandlingen, efterfulgt af alkalibehandling, gør cellerne per- 20 meable for nukleinsyrer, muligvis ved at fjerne dele af de ydre lag af cellevæggene. Nukleinsyrerne trænger gennem de svækkede cellevægge ind i det omgivende medium, og nuk-leinsyreindholdet af cellerne reduceres derved. Når cellerne skilles fra mediet, er de adskilt fra nukleinsyrerne deri.

25 Fremgangsmåden er meget egnet til behandling af bakterieceller af slægterne Pseudomonas, Alcaligenes og Bacillus, f.eks. stammer af arterne Pseudomonas fluorescens. Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas diminuta, Alcaligenes fae-calis, Bacillus cereus og især Pseudomonas methylotropha.

30 Sidstnævnte er en art, hvis egenskaber er beskrevet i dansk patentskrift nr. 131.382. Kulturer af nogle stammer af denne sidstnævnte art er blevet deponeret og er til rådighed fra 3 144826

The National Collection of Industrial Bacteria (NCIB),

Torry Research Station, Aberdeen, Skotland, og tilsvarende deponeringer er foretaget i samlingerne i US Department of Agriculture (NRRL) i Peoria, Illinois, og The Fermen-5 tation Research Institute (FRI) i Japan. De numeriske betegnelser for disse kulturer er følgende: NCIB numrene 10508-15 og 10592-6 NRRL " B 5352-64 FRI " FERM 1215 - 27.

10 Andre bakteriearter, der kan behandles ved fremgangsmåden, er Pseudomas rosea, Microcylus polymorphum og Hyphomicro-bium variabile. Egenskaberne af disse arter er også'anført i dansk patentskrift nr. 131.382, og kulturer af nogle stammer er blevet deponeret på de ovennævnte steder og er til-15 gængelige fra NCIB. De numeriske betegnelser for disse sidstnævnte kulturer er følgende: NCIB numrene 10516-7 og 10597-612 NRRL " B 5381-2 og B 5365-80 FRI " FERM 1228-45.

20 Ved udførelsen af fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan alkalibehandlingstrinet (ved hvilket mediets pH-værdi hæves til en værdi i intervallet 8 til 11 ved behandling med et alkali) i fremgangsmåden ifølge dansk patentskrift nr. 140.559 udføres før opvarmning og behandling med syre uden nogen ulem-25 per.

Under opvarmning af mediet (trin B) hæves temperaturen fortrinsvis til 70 - 90°C. Syrebehandlingen (trin A) nedsætter fortrinsvis pH-værdien til en værdi i intervallet 2,5 - 4,5. Den påfølgende behandling med et alkali (trin C) 30 hæver fortrinsvis pH-værdien til en værdi i intervallet 6-8. Før behandling med alkali (trin C) bliver mediet både opvarmet og holdt ved den lavere pH-værdi, hensigts 144826 4 mæssigt i en periode på mindst 1 minut, fortrinsvis 2-10 minutter.

Efter at have holdt mediet ved en forhøjet temperatur og 5 nedsat pH-værdi i en periode skal temperaturen holdes på mindst 60°C under alkalibehandlingen. Det er fordelagtigt at fjerne noget af mediet før behandling med alkali for at nedsætte udgifterne til behandlingen.

Syren, der anvendes til at behandle mediet, kan hensigts-10 mæssigt være en uorganisk syre såsom svovlsyre, saltsyre eller phosphorsyre eller en sur gas såsom carbondioxid eller svovldioxid. Når fremgangsmåden udgør et trin i en samlet fremgangsmåde til fremstilling af enkeltcelleprotein, er syren fortrinsvis en blanding af phosphorsyre og 15 svovlsyre i passende mængdeforhold til, at mediet efter fraskillelse af flokkulerede celler kan recirkuleres til processens forgæringstrin. Efter syrning og opvarmning foretrækkes det, at behandling med alkali skal være så mild som mulig for at formindske opbrydningen af de store flokke, 20 der dannes under syrningen og varmebehandlingen. Egnede alkalier indbefatter natriumhydroxid, calciumhydroxid, natri= umcarbonat og ammoniak.

Til behandling ved fremgangsmåden ifølge opfindelsen indeholder mediet fortrinsvis 0,05 - 2% w/v af et salt, hen-25 sigtsmæssigt natriumchlorid eller ammoniumphosphat.

Efter behandling med alkali kan fraskillelse af flokkulerede celler bevirkes på sædvanlig måde såsom ved centrifugering eller filtrering eller ved flotation.

Opfindelsen illustreres af følgende eksempler.

30 EKSEMPEL 1.

En 10% suspension af flokkulerede celler af en organisme 5 1A A 8 2 6 af arten Pseudomonas methylotropha, dannet som beskrevet i dansk patent nr. 140.559, blev derefter behandlet som følger: 50 g natrlumchlorid blev sat til 5 liter medium, og pH-vær-5 dien blev hævet fra 4,3 til 7,0 under anvendelse af fortyndet natriumhydroxidopløsning. Temperaturen blev hævet til 80°C og holdt i 5 minutter. Det behandlede medium blev blandet med 35 liter varmt vand; SCP blev udvundet ved centrifugering. SCP blev tørret i en vakuumovn ved 50°C.

10 Analysen af den behandlede prøve er vist i tabel 1, hvori resultaterne er sammenlignet med resultaterne for en lignende prøve af flokkulerede celler, som ikke var blevet behandlet for at reducere nukleinsyren. Af tabellen kan det ses, at nukleinsyreindholdet af den behandlede prøve er me-15 get lavere.

6 144826

Tabel 1

Analyse Behandlet prøve % w/w Ubehandlet prøve % w/w

Tab ved 105°C 2,9% 4,4%

Aske ved 550°C 3,1% 8,3%

Total P 0,8% 2,6%

Total S 0,2% 0,99%

Total Cl 0,64% <0,02%

Total Ca 0,18% 0,12%

Total Na 0,38% 1,13%

Total K 0,02% 0,22%

Ammoniak N2. - 0,006% 0,05%

Total N2 13,4% 13,0%

Nukleinsyre 1,8% 14,7%

Total syre 6,8% 5,9%

Total anhydroaminosyrer 69,9% 57,3%

Aspartinsyre 8,3% 7,2%

Threonin 4,3% 3,7%

Serin 3,2% 2,7%

Glutaminsyre 10,2% 8,4%

Prolin 3,3% 2,7%

Glycin 4,9% 4,2%

Alanin 6,6% 5,6%

Valin 5,7% 4,5%

Methonin 2,6% 2,0%

Isoleucin 4,7% 3,8%

Leucin 7,5% 5,8%

Tyrosin 3,1% 2,6%

Phenylalanin 3,7% 2,9%

Histidin .1,9% 1,6%

Lysin 6,4% 5,4%

Arginin 5,1% 4,0% ____I_i

Analyse af prøver af Pseudomonas methylotropha med og uden behandling for at reducere nukleinsyren.

144826 7 EKSEMPEL 2.

Syv kulturer, hver af en af stammerne Pseudomonas methylo-tropha ASI (NCIB 10515), Pseudomonas diminuta, Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas al-caligenes, Alcaligenes faecalis og Bacillus cereus, blev 5 dyrket i rysteflasker til dannelse af 1 liter kultur. Hver kultur blev delt i to dele, og den ene del blev fortyndet med et lige så stort rumfang vand, centrifugeret og tørret i en vakuumovn ved 50°C. Denne del dannede kontrollen. Den anden del blev opvarmet til 80°C med 1% w/v Na Cl tilsat.

10 pH-værdien blev så nedsat til 4 i 10 minutter, og derefter blev kulturen genneutraliseret i 5 minutter, fortyndet til sit dobbelte rumfang, centrifugeret og tørret i en vakuumovn ved 50°C. Der blev foretaget nukleinsyrebestemmelser. Resultaterne er anført i tabel 2.

15 Tabel 2

Nukleinsyreindhold i Nukleinsyreindhold Stamme kontrol (% w/w) i forsøgskultur ____(% w/w)_ P.raethylotropha AS-1 10,1 3,5 20 P.diminuta 9,2 3,9 P.aeruginosa 7,1 7,0 P.fluorescens 11,7 4,7 - P.alcaligenes 11,6 4,9

Alcaligenes faecalis 10,3 6,2 25 Bacillus cereus 4,5 2,2 EKSEMPEL 3.

To kulturer, en af en Ps.fluorescens og en af en Ps.alcaligenes stamme, blev behandlet som i eksempel 2 med undtagel

Claims

144826 se af, at tilsætningen af Na Cl blev udeladt. Resultaterne var som følger: Nukleinsyreindhold i Nukleinsyreindhold kontrol (% w/w) i forsøgskultur (% w/w) Ps.fluorescens 10,9 7,0 5 Ps.alcaligenes 9,3 4,8 Patentet angår ikke fremgangsmådens anvendelse ved tilvirkning af næringsmidler. Patentkrav ..

1. Fremgangsmåde til behandling af bakterieceller for at re-10 ducere nukleinsyreindholdet deraf, kendetegnet ved, at et vandigt medium indeholdende baktericelierne underkastes trinene (A) behandling med en syre for at nedsætte pH-værdien til en værdi i intervallet 2 - 5 og (B) opvarmning til en temperatur i intervallet 60-100°C, idet 15 trin (A) og (B) udføres i vilkårlig rækkefølge eller samtidig, og derefter (C) behandling med et alkali for at hæve mediets pH-værdi til en værdi i intervallet 6-10, medens temperaturen af mediet holdes på en værdi på mindst 60°C, hvorefter cellerne skilles fra mediet.

2. Fremgangsmåde ifølge krav 1, kendetegnet ved, at bakteriecellerne er af arten Pseudomonas methylotropha.

3. Fremgangsmåde ifølge krav 1 og 2, kendetegnet ved, at mediets pH-værdi hæves til en værdi i intervallet 8-11 ved behandling med et alkali før trin (A) og/eller 25 trin (B) .