NO813565L

NO813565L - Fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold

Info

Publication number: NO813565L
Application number: NO813565A
Authority: NO
Inventors: Thomas R Hopkins
Original assignee: Provesta Corp
Priority date: 1980-10-24
Filing date: 1981-10-22
Publication date: 1982-04-26
Also published as: MX7086E; JPS6244911B2; ES8206620A1; DE3173733D1; JPS57138380A; ES506539A0; US4341802A; EP0050831A2; EP0050831B1; GB2085895B; EP0050831A3; CA1167399A; GB2085895A

Description

Fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold.

Den foreliggende oppfinnelse angår gjæringsprosesser. Nærmere bestemt angår den fremgangsmåter til fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold og spesielt proteiner som er nyttige for menneskelig forbruk.

Biologiske prosesser og spesielt gjæringsprosesser har

vært anvendt i århundrer, f.eks. i forbindelse medølbrygging.

I den senere tid har slike biologiske prosesser vakt betyde-

lig interesse for fremstilling av protein, både som fortil-setning og til syvende og sist for menneskelig forbruk. Det er kjent at et av hindrene for anvendelse av gjæringspro-

sesser til fremstilling av encelleprotein for menneskelig forbruk er det høye innhold av nukleinsyre i encelleproteinet.

Forskjellige fremgangsmåter har vært foreslått i faget

for å redusere nukleinsyreinnholdet i proteinet. Blant disse fremgangsmåter er behandling av de proteinholdige celler med alkali, syrer eller varmesjokk. Mens visse detaljer er kjent fra disse forskjellige fremgangsmåter til reduksjon av innholdet av nukleinsyrer i encelleprotein, har der ikke vært beskrevet eller foreslått noen integrert fremgangsmåte som ville tillate fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold (NARP) med godt utbytte under anvendelse av bare et begrenset antall fremgangsmåtetrinn.

Det er derfor en hensikt med oppfinnelsen å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold (NARP) sammenlignet med utgangsproteinet.

En ytterligere hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av et mikroorganisme-celleprodukt med forbedret utnyttelse av både karbonkilden og mineralmediet i forhold til kjente fremgangsmåter.

Ytterligere en hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en fremgangsmåte til fremstilling av funksjonelt protein, spesielt oppløselig protein med relativt lavt nukleinsyreinnhold og med gode funksjonelle egenskaper som f.eks. piskbarhet samt med akseptabel smak og farge.

Disse og andre hensikter, fordeler, detaljer og trekk ved oppfinnelsen og utførelsesformer for denne vil fremgå for fagfolk av den etterfølgende detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen, av kravene og av tegningen, hvor fig. 1 og 2 er skjematiske flytdiagrammer som beskriver fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

I henhold til oppfinnelsen er det nå funnet at encelleprotein etter" behandling med syrer og varme ikke bare har redusert nukleinsyreinnhold, men at disse celler også meget effektivt kan ekstraheres med en base, hvorved der fås en oppløsning av vannoppløselig NARP og i denne suspendert fast NARP som kan separeres fra oppløsningen.

I henhold til en første utførelsesform for oppfinnelsen er der således skaffet en fremgangsmåte til fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold (NARP). I denne fremgangsmåte blir en encelleprotein-blanding inneholdende celler med høyt nukleinsyreinnhold og en væske underkastet et prosesstrinn for fjerning av nukleinsyre, idet en betydelig andel av nukleinsyren i enkeltcellene overføres til væsken. Under dette trinn forblir cellene hovedsakelig intakt og kan lett sentrifugeres eller filtreres. Dette trinn skaffer en blanding av celler med redusert nukleinsyreinnhold og en nukleinsyreholdig væske. Cellene med redusert nukleinsyreinnhold separeres fra den nukleinsyreholdige væske. I henhold til oppfinnelsen blir disse deretter underkastet

en ekstraksjon med en base ved en pH-verdi på ca. 10,6 eller mer for oppnåelse av en NARP-blanding av en væskefase og en fast fase. Væskefasen utvinnes som en NARP-oppløsning som utgjør et første produkt av fremgangmåten, og den faste fase utvinnes som et NARP-produkt som utgjør et annet produkt av fremgangmåten.

Det oppløselige NARP kan benyttes i forskjellige matvareprodukter som en erstatning for eller et tillegg til eggehvite, kasein eller andre oppløselige animalske eller vege-tabilske proteinandeler. Det gjenværende faste NARP-celleprodukt kan anvendes som en proteinanrikningsbestanddel ved fremstilling av matvareprodukter. Begge NARP-produkter, dvs. det vannoppløselige NARP og det gjenværende faste NARP-celleprodukt, er anvendelige for menneskelig forbruk. Blant frem-gangsmåtene til å tvinge i det minste en vesentlig andel av nukleinsyrene ut av cellene og inn i den omgivende væske uten å sprenge cellene foretrekkes det for tiden å under-kaste cellene en behandling med syre og varme. Spesielt fordelaktig er en behandling av encelleproteinblandingen med mineralsyrer ved forhøyede temperaturer. I henhold til en annen utførelsesform for oppfinnelsen er der skaffet en fremgangsmåte til fremstilling av celler med redusert nukleinsyreinnhold. Ved denne fremgangsmåte blir en mikroorganisme og et mineralholdig vekstmedium sammen utsatt for gjæringsbetingelser i en gjæringssone. Et avløp føres ut fra gjæringssonen og inn i en syrningssone sammen med en syre. Etter inkubasjon ved forhøyet temperatur i et fastlagt tidsrom blir den syrnede blanding av en nukleinsyreholdig væskefase og en fast cellefase tappet av. Etter denne syrebehandling blir tofaseblandingen separert i en væskefase som er hovedsakelig fri for mikroorganismeceller, og en cellerik fase. Cellefasen har et redusert innhold av nukleinsyre i forhold til cellene i det avløp som forlater gjæringssonen, men har et hovedsakelig uendret innhold av protein sammenlignet med cellene før disses syrning. Minst en del av væskefasen som inneholder oppløselige nukleinsyrer og er hovedsakelig fri for cellemateriale, føres tilbake til gjæringssonen. Denne fremgangsmåte er ifølge oppfinnelsen forbedret ved at den nukleinsyreholdige væskefase nøytraliseres før en del av denne fase føres inn i gjæringssonen. Denne nøytralisering utføres med et oksyd, hydroksyd, karbonat eller bikarbonat av et eller flere metaller eller metallekvivalenter. Den syre og base som anvendes for syrebehandlingen resp. nøytralisasjons-trinnet, vil være slik at nøytralisasjonstrinnet vil danne ett eller flere av de mineraler som enten allerede er tilstede eller er ønskelige i vekstmediet i gjæringssonen. Denne annen utførelsesform for oppfinnelsen tillater effektiv bruk av det mineralmedium som føres tilbake til gjæringen. I tillegg omfatter imidlertid fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en justering av pH-verdien av den væskefase som føres inn i gjæringsbeholderen. Denne justering av pH-verdien fører sam-tidig til en tilførsel av noen av deønskede mineraler i gjæringstrinnet. Videre blir nukleinsyrene på ny ført inn

i gjæringsbeholderen, hvor de tjener som en kilde for karbon, nitrogen og fosfor. Den samlede effektivitet av fremgangsmåten i denne utførelsesform blir derfor vesentlig økt.

De følge"nde detaljer angående fremgangsmåten er generelt foretrukket i begge de ovenfor beskrevne utførelsesformer for oppfinnelsen.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes på mikroorganismer som er istand til å frembringe ikke-giftig encelleprotein. Slike mikroorganismer innbefatter bakterier, gjær og sopper. Gjær foretrekkes for tiden.

Egnede gjærsorter omfatter arter av slektene Candida, Hansenula, Torulopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Lipomyces, Crytococcus, Nematospora og Brettanomyces. De foretrukne slekter innbefatter Candida, Hansenula, Torulopsis, Pichia og Saccharomyces. Eksempler på egnede arter innbefatter :

Egnede bakterier innbefatter arter fra slektene Bacillus, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Pseudomonas, Methanomonas, Brevibacterium, Acetobacter, Micrococcus, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Microbacterium, Achromo-bacter, Methylobacter, Methylosinus og Methylocystis. Foretrukne slekter innbefatter Bacillus, Pseudomonas, Protamino-bacter, Micrococcus, Arthrobacter og Corynebacterium.

Eksempler på egnede arter innbefatter:

Egnede sopper innbefatter arter fra slektene Aspergillus, Monilia, Rhizopus, Penicilliura, Mucor, Alternaria og Helmin-thosporium.

Eksempler på egnede sopparter innbefatter:

Ved utførelse av fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse menes det at mikroorganismen, kilden for karbon og energi for vekst av mikroorganismen og gjæringsbetingel-sene og -fremgangsmåtene>ikke er kritiske. Man bør anvende de gjæringsbetingelser og de kilder for karbon og energi som er kjent i faget, eller slike som er fastlagt for den spesielle valgte mikroorganisme.

Metanolgjæring under anvendelse av bakterier er f.eks. beskrevet i US patentskrift 3 98 2 998. En gjæring som innbefatter en gjær, er beskrevet i detalj i US patentskrift 4 168 201. Det henvises til innholdet i begge disse patent-skrifter .

Nukleinsyrefjerning

I henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen blir avløpet fra gjæringsbeholderen behandlet i et prosesstrinn for reduksjon av nukleinsyreinnholdet. Enhver fremgangsmåte til reduksjon av nukleinsyreinnholdet som ikke forårsaker en utstrakt (eller vesentlig) cellesprengning, og som reduserer nukleinsyreinnholdet til under ca. 2 vektprosent, kan anvendes. Eksempler på fremgangsmåter til fjerning av nukleinsyrer omfatter

(a) syrebehandling

(b) basebehandling

(c) varmesjokk og enzymvirkning.

Disse fremgangsmåter til reduksjon av nukleinsyreinnholdet er tidligere omtalt, se f.eks. L. Viikari og M. Linko, Process Biochemistry, mai 1977, pp. 17, 18, 19 og 35 og

J.A. Zee og R.E. Simard, Applied Microbiology, 2^9, 59-62

(1975) .

En egnet fremgansmåte til reduksjon av nukleinsyreinnholdet er en behandling med syre. Bruken av en syrebehandling er funnet å være enkel, pålitelig og økonomisk. En hvilken som helst egnet mineralsyre, såsom svovelsyre, saltsyre, fosforsyre o.l., kan anvendes. Syren tilsettes avløpet fra gjær ingsbeholderen i en konsentrasjon på ca. 0,2 - 4 N. Temperaturer på mellom 50 og 100°C er tilfredsstillende. Reaksjonstiden for syrebehandlingen vil avhenge av syrekon-sentrasjonen, den anvendte mineralsyre og temperaturen, men vil vanligvis ligge mellom 10 minutter og flere timer.

Når væskestrømmen fra separasjonstrinnet som følger etter syrebehandlingen, skal føres tilbake til gjæringsbeholderen, vil valget av syre ofte fastlegges slik at det skaffer det anion som benyttes i det tilførte mineralmateriale for gjæringen. Når det tilførte mineralmateriale inneholder fosfatsalter, vil man således benytte fosforsyre for syrebehandlingen. Når sulfatsalter anvendes i mineralmatnings-materialet, vil man på lignende måte benytte svovelsyre for syrebehandlingen.

Det er blitt fastslått at det ved anvendelse av mildere betingelser (lavere syrekonsentrasjoner, f.eks. 0,4 N, eller lavere reaksjonstemperaturer, f.eks. 80°C) i syrebehandlings-. trinnet er sterkt foretrukket å tilsette base til den sure blanding før separeringen for å innstille pH-verdien på ca. 7-9 for å tillate en relativt rask frigjøring av de hydrolyserte nukleinsyrer fra cellene. Under sterkere betingelser med høyere syrekonsentrasjoner, f.eks. 0,8 N, eller høyere temperaturer, f.eks. 95°C, er en tilsetning av én base før separasjonstrinnet foretrukket, men ikke like avgjørende. I det sistnevnte tilfelle ville man tilsette base til væskestrømmen fra separasjonstrinnet for å innstille pH-verd.ien på ét akseptabelt nivå før resirkuleringen av væsken til gjæringsbeholderen. En rimelig berøringstid mellom, det syrebehandlede cellemateriale og basen er av betydning. Vanligvis er berøringstider på mere enn 1 minutt ønskelige.

Skjønt den base som anvendes i den ovenfor beskrevne basetilsetning, kan være en hvilken som helst egnet base, f. eks. NaOH, KOH, Ca(OH)2, Mg (OHO 2, NH^OH, etc, er det ofte fordelaktig å anvende hydroksydene eller oksydene av metaller som anvendes i det mineralmedium som tilføres gjæringsbeholderen, hvis væskestrømmen fra separasjonstrinnet skal føres tilbake til gjæringsbeholderen. Karbonater og bikarbonater kan også anvendes. Typiske metaller eller metallekvivalenter som kan benyttes, er Ca, K, Na, Mg, Fe, Cu, Zn, Mn, og NH^. Når det innmatede mineralmedium inneholder I^SO^og MgSO^, vil f.eks. syren ved syrebehandlingen være H2SO^og basen vil være en blanding av KOH og Mg(OH)2. Dette skaffer nødvendige mineraler for vekst av mikroorganismene og hindrer innføring av salter som ikke er nødvendige eller kanskje endog er

giftige for mikroorganismene.

Blandingen fra nukleinsyre-reduksjonstrinnet separeres ved anvendelse av teknikker som f.eks. sentrifugering eller filtrering for å gi en cellefraksjon med et lavere nuklein-syrenivå enn i de opprinnelige celler og en væskestrøm som inneholder nukleinsyrer. Cellefraksjonen behandles med en vandig base for proteinekstraksjon. I det minste en del av væskestrømmen fra separasjonstrinnet føres tilbake til gjæringsbeholderen, normalt med pH-verdien innstilt på detønskede nivå for den spesielle mikroorganisme som anvendes.

Ekstraksjon av oppløselig protein

Cellene med redusert nukleinsyreinnhold behandles med en vandig base under egnede betingelser for ekstraksjon av en del av proteinet. Egnede baser innbefatter KOH, NaOH, Ca(0H)2>NH^OH, ^CO^ etc. Proteinekstraksjonsbetingelsene er generelt: pH-verdi over 10,6, temperatur mellom 0 og 80°C, ekstraksjonstid mellom et par minutter og flere timer. De anvendte baser har en styrke som vanligvis ligger i området 0,5 N - 15 N, fortrinnsvis 1 N - 5 N.

Den base som for tiden foretrekkes for proteinekstraksjonen, er ammoniumhydroksyd. De sterkere baser som f.eks. NaOH har vært oppgitt å forårsake dannelse av lysinoalanin, som kan resultere i nyreskader hos mennesker. Dessuten med-fører bruken av baser såsom NaOH en økning i saltinnholdet av det isolerte oppløselige protein. Ammoniumhydroksyd synes i stor grad å redusere dannelsen av lysinoalanin, og over-skytende ammoniakk kan fjernes fra det oppløselige protein under tørketrinnet.

Ved avslutningen av proteinekstraksjonstrinnet blir den . resulterende blanding separert i en væskestrøm som inneholder det ekstraherte protein, og et proteinholdig fast stoff som er det ekstraherte cellemateriale. Separasjonen kan utføres ved slike metoder som sentrifugering eller filtrering.

De faste stoffer fra separeringen kan tørkes, f.eks. i en forstøvningstørke, for å skaffe et tørt materiale som inneholder protein, fibre, lipider og karbohydrater. Dette materiale har et lavt innhold av nukleinsyrer og er egnet for bruk i dyrefor eller som proteinsuplement i matvarer for mennesker.

Væskestrømmen fra separasjonstrinnet kan tørkes, f.eks. i en forstøvningstørke, for fjerning av vannet og oppnåelse av et tørket oppløselig protein med et meget lavere nuklein syreinnhold enn hva som ville ha vært tilstede hvis prosess-trinnet for reduksjon av nukleinsyren ikke hadde vært anvendt. Proteinet er uten smak og lukt og har en tilnærmet hvit farge. Det har ønskelige funksjonelle egenskaper som ligner på egen-skapene av eggehvite og andre proteiner av høy kvalitet, og

kan anvendes i forskjellige matvarer.

Når ammoniumhydroksyd anvendes i proteinekstraksjonstrinnet, kan den ammoniakk som fjernes ved produkttørke-trinnet, samles opp, f.eks. ved kondensasjon eller ved absorb-sjon i vann, og føres tilbake til andre steder i prosessen, f.eks. til gjæringsbeholderen A på fig. 1 eller gjæringsbeholderen H eller punktene 10, 11 eller 14 på fig. 2.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er beskrevet på fig.

1. Gjæringsavløpet fra gjæringen med en mikroorganisme i

gjæringsbeholderen A føres gjennom en ledning 1 til et nukleinsyrereduksjonstrinn B. Etter avslutning av nuklein-syrereduksjonstrinnet blir produktet ført gjennom en ledning 2 med eller uten et nøytralisasjonstrinn til et separeringstrinn C, f.eks. en sentrifuge, hvor cellene med redusert nukleinsyreinnhold separeres fra den nukleinsyreholdige væske. Væsken kan i det minste delvis føres tilbake til gjæringsbeholderen A gjennom en ledning 3, vanligvis etter pH-regulering, for å skaffe nukleinsyrer, vitaminer og mineraler for den voksende mikroorganisme i gjæringssonen. Cellene med redusert nukleinsyreinnhold overføres gjennom en ledning 4 til et basebehandlingstrinn D, hvor en egnet base tilsettes gjennom en ledning 5 og cellene behandles under betingelser som medfører ekstraksjon av oppløselig protein. Ved avslutningen av ekstraksjonstrinnet blir produktblandingen ført gjennom en ledning 6 til et separasjonstrinn E, f.eks. en sentrifuge, hvor blandingen separeres i en væskefase som inneholder oppløselig protein, og et fast stoff som inneholder det proteinholdige celleresiduum. Det oppløselige protein kan anvendes som vandig oppløsning, hvis det skulle væreønskelig, eller det kan tørkes i et trinn F "'for isolasjon av proteinet. Likeledes kan det proteinholdige faste residuum fra separasjonstrinnet anvendes som et fuktig fast stoff

eller tørkes i et tørketrinn G for å gi et tørt proteinholdig residuum.

Fig. 2 beskriver et mer spesifikt eksempel på fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse. Denne prosess innbefatter et surt nukleinsyrereduksjonstrinn og et ammoniumhydroksyd-proteinekstråksjonstrinn. Avløpet fra gjæringsbeholderen H overføres gjennom en ledning 7 til et syrebe-handlingstrinh I, hvor en syre føres inn gjennom en ledning 8. Etter syrebehandling under betingelser som er egnet til reduksjon av nukleinsyreinnholdet i cellene, blir den behandlede blanding ført gjennom en ledning 9 til et separasjonstrinn J. En base kan tilsettes den behandlede blanding gjennom en ledning 10 for innstilling av pH-verdien til tilnærmet nøytralitet, eller en base kan tilsettes væskestrømmen 12 fra separasjonstrinnet gjennom en ledning 11. Væskestrøm-men 12 blir helt eller delvis ført tilbake til gjæringsbeholderen for å skaffe ekstraherte nukleinsyrer samt viataminer og mineraler fra gjæringsavløpet for den voksende mikroorganisme.

Cellene 13 med redusert nukleinsyreinnhold som kommer fra separasjonstrinnet J, behandles i trinn K med ammoniumhydroksyd eller vannfri ammoniakk som tilføres gjennom en ledning 14, under egnede betinglser for ekstraksjon av det oppløselige protein fra cellene. Ved avslutning av ekstraksjonstrinnet blir produktblandingen ført gjennom en ledning 15 til et separasjonstrinn L, f.eks. en sentrifuge, hvorfra der fås en væskestrøm 16 som inneholder det oppløselige protein, og et materiale'" 17 som inneholder gjenværende protein. Produktene kan anvendes.slik de mottas fra separasjonstrinnet L, eller de kan tørkes i trinnene M og N for å gi tørket opp-løselig protein 19 resp. tørket faststoff 18 med et rest-proteininnhold. Hvis det ønskes, kan ammoniakk fra tørkene M og N samles opp og føres gjennom ledninger 20 og 21 tilbake til gjæringsbeholderen H eller til ledningene 10, 11 og 14 for tilsetning av base.

De følgende eksempler er ment ytterligere å belyse foretrukne detaljer ved oppfinnelsen uten at denne er begrenset til disse.

Eksempler

Nukleinsyreinnholdet ble bestemt ved perklorsyreekstrak-(2)

sjon og spektrofotometrisk analyse ved 260 nm . Protein-innholdene ble fastlagt ved ekstraksjon med NaOH ved 100°C i nærvær av CuSO^*5H20 og måling av absorbsjonen av protein/ kobber-komplekset ved 540 nm under anvendelse av storfe-standard. (<2>)

albuminserum som standard.

Det gjæringsavløp som ble benyttet i noen av eksemplene, var fra den kontinuerlige gjæring av en gjærkultur av Pichia pastoris som er deponert hos United States Department of Agriculture, Agriculture Research Service, Northern Regional Research Laboratory, Peoria, Illinois og er betegnet som NRRL Y-11430. Gjæringen ble utført ved 30°C under anvendelse av et metanolmatningsmateriale og ga en celledensitet på ca. 125. g celler (tørrvekt) pr. liter avløp.

Det gjæringsavløp som ble anvendt i de andre eksempler, var en termofil blandet bakteriekultur HTB-53 som er deponert som NRRL B-8158. Bakteriene er hver for seg klassifisert som (1) en stor gram-positiv buet stav, avdeling Bacteria, klasse Schizomycetes, orden Eubacteriales, familie Bacillaceae, slekt Bacillus, (2) en stor gram-negativ stav, avdeling Bacteria, klasse Schizomycetes, orden Eubacteriales, familie Bacillaceae, slekt Bacillus, og (3) en kort gram-negativ stav,'avdeling Bacteria, klasse Schizomycetes. Denne blandede termofile bakteriekultur ble dyrket ved kontinuerlig gjæring ved ca. 55°C med metanol som kilde for karbon og energi. Gélledensiteten under gjæringen var ca. 45 g (tørr-vekt) pr. liter gjæringsvæske.

Eksempel 1

Et forsøk ble utført for å demonstrere fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I forsøk 1 ble en reaksjonsbeholder fylt med 50 ml av gjæringsavløpet fra dyrkingen av Pichia pastoris og 0,6 ml konsentrert svovelsyre for å danne en blanding med en svovelsyrestyrke på 0,43 N. Blandingen ble oppvarmet til 80°C i 30 minutter, hvoretter en mettet natrium- hydroksydoppløsning ble tilsatt for innstilling av pH-verdien på 8,7. Etter ca. 10 minutter ble blandingen sentrifugert (den på toppen flytende væske ble oppbevart for senere analyse) , og sentrifugepillen ble vasket med destillert vann. Den vaskede pille ble suspendert på ny i destillert vann (samlet volum 50 ml), og 6 ml konsentrert ammoniumhydroksyd-oppløsning ble tilsatt suspensjonen for å danne en blanding med en ammoniumhydroksydstyrke på 1,61 N. Denne suspensjon ble oppvarmet ved 50 - 80°C i 30 minutter og ble deretter sentrifugert for å gi en vandig ovenpåsvømmende væske som inneholdt funksjonelt oppløselig protein, og en resterende proteinpille.

Flere av produktene fra dette forsøk ble analysert med hensyn til innhold av protein, nukleinsyrer, aske og andre komponenter. Resultatene er angitt i tabell I, uttrykt som sammensetningen av 100 g av det opprinnelige encelleprotein og den endelige fordeling av komponentene i de forskjellige prosessprodukter.

Resultater i tabell I viser fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse for fremstilling av et oppløselig funksjonelt protein og et restprotein med lavt innhold av nukleinsyre. Mesteparten av den opprinnelige nukleinsyre fra encelleproteinet finnes i den ovenpåflytende væske i sentrifugen etter syrebehandlingstrinnet. I fravær av et syrebehandlingstrinn ville mesteparten av nukleinsyrene foreligge i den fraksjon som inneholder det oppløselige funksjonelle protein (se eksempel III).

Eksempel II

Et annet forsøk ble utført i overensstemmelse med fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. I forsøk 2 ble en reaksjonsbeholder av rustfritt stål fylt med 3 liter av gjæringsav-løpet fra gjæringen av Pichia pastoris (5,9 g nukleinsyrer pr. liter og 66,8 g protein pr. liter) og 36 ml konsentrert svovelsyre for å danne en blanding med en konsentrasjon av svovelsyre på 0,43 N. Blandingen ble oppvarmet til 80°C, holdt på denne temperatur i 30 minutter, behandlet med mettet natriumhydroksydoppløsning til en pH-verdi på 8 - 9 og tillatt å stå i 10 minutter. Sentrifugering av blandingen ble utført, og sentrifugepillen ble vasket med vann. Proteinet med redusert nukleinsyreinnhold (som en vandig suspensjon) inneholdt 54,1 g protein pr. liter og bare 0,5 g nukleinsyrer pr. liter. Konsentrert ammoniumhydroksyd ble tilsatt en suspensjon av proteinet for å gi en ammoniumhydroksydkonsen-trasjon på 1,84 N. Denne suspensjon ble oppvarmet til 55°C, holdt på denne temperatur i ca. 15 minutter og sentrifugert. Den ovenpåflytende væske (13 g protein pr. liter og 1 g nukleinsyrer pr. liter) ble dialysert mot vann for fjerning av salter og ble deretter frysetørket for å gi det funksjonelle protein.

Eksempel III

En rekke forsøk ble utført for å vise betydningen av nukleinsyre-fjerningen før ekstraksjonen av det oppløselige protein og sammenligne forskjellige nukleinsyre-reduksjons-prosesser. De anvendte behandlingstrinn i hvert forsøk er oppsummert nedenfor:

I hvert forsøk ble gjæringsavløpet fra gjæringen av Pichia pastoris anvendt. I forsøk 4 ble 30 ml av gjærings-avløpet blandet med 0,6 ml 85 %'s H^PO^for å gi en blanding med en H^PO^-konsentrasjon på 0,93 N. Denne blanding ble oppvarmet til 85°C i en time, innstilt på en pH-verdi på 8 med konsentrert NH^OH og tillatt å stå ved værelsetemperatur

(ca. 25°C) i en time. Blandingen ble sentrifugert, og pillen ble vasket med vann.

I forsøk 5 ble 30 ml av gjæringsavløpet blandet med

0,42 ml konsentrert NH^OH for å gi en blanding med en NH^OH-konsentrasjon på 0,21 N. Denne blanding ble oppvarmet til 95°C i en time og sentrifugert, og sentrifugepillen ble vasket med vann.

I alle tre forsøk ble 25 ml av en cellesuspensjon (ferske celler i forsøk 3, H^PO^-behandlede celler i forsøk 4 og NH^OH-behandlede celler i forsøk 5) blandet med 3,5 ml konsentrert NH^OH for å gi en blanding med en NH^OH-konsentrasjon på 1,84 N. Blandingen ble oppvarmet til 80°C i ca. 10 minutter og deretter sentrifugert for å gi en ovenpåflytende væske inneholdende funksjonelt protein og en pille som er restpro-teinet. Analyseresultatene av de forskjellige produkter er gjengitt i tabell II.

Resultatene i tabell II viser at det ekstraherte funksjonelle protein i fravær av et første nukleinsyrereduksjonstrinn (forsøk 3) inneholder en høy andel nukleinsyrer (ca.

30 % nukleinsyrer). I forsøkene 4 og 5 med nukleinsyrereduksjonstrinn med bruk av enten H^PO^eller NH^OH ble der oppnådd

ekstrahert funksjonelt protein med meget lavere nukleinsyreinnhold. Det lavere innhold av protein i det funksjonelle protein i forsøk 5 tyder på at bruk av NH^OH i nukleinsyre-fjerningstrinnet reduserer effektiviteten av proteinekstraksjonstrinnet.

Eksempel IV

Kokosmakroner ble fremstilt fra funksjonelt protein ekstrahert i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Det anvendte funksjonelle protein var de kombinerte produkter fra flere forsøk i likhet med det i eksempel I. Dette funksjonelle protein ble dialysert mot vann for fjerning av salter og lyofilisert. Oppskriften anvendte 8 g protein i 60 ml vann (svarende til 2 eggehviter), 1/2 ts vanilje, 2/3 kopper sukker og 1 1/3 kopp kokosmasse (flaked coconut). Etter pisking av proteinet med vaniljen ble sukker tilsatt og piskingen fortsatt inntil blandingen var stiv. Etter at kokosmassen var tilsatt blandingen, ble denne tillatt å stå

i 10 timer. Småkaker ble stekt ved 163°C i 20 minutter. De resulterende kaker hadde et godt utseende og en god smak. Disse resultater viser at det protein som er ekstrahert ved fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse, har funksjonelle egenskaper i likhet med eggehvite.

Eksempel V

Forsøk 6 ble utført i henhold til den foreliggende oppfinnelse for ekstraksjon av protein fra bakterielt SCP. En blanding inneholdende 0,4 N saltsyre (HCl) ble fremstilt fra 2,9 liter gjæringsavløp fra gjæringen av den termofile bakte-rieblanding HTB-53 og 100 ml konsentrert saltsyre. Blandingen ble oppvarmet til 80°C i 20 minutter og nøytralisert med 55 ml mettet natriumhydroksydoppløsning (50 % vekt/volum). Sentrifugering av blandingen ga en ovenpåflytende væske og en pille. Pillen ble blandet med vann og konsentrert NH^OH til et volum på 3 liter og en NH^OH-konsentrasjon på 2,1 N. Oppvarming av denne blanding i 20 minutter ved 80°C med leilighetsvis om-røring fulgt av sentrifugering ga en ovenpåflytende væske inneholdende oppløselig protein og en pille inneholdende restprotein og andre cellematerialer. Analysen av de forskjellige fraksjoner ved prosessen er angitt i tabell III. En prøve av gjæringsavløpet ble sentrifugert for å gi en pille og en ovenpåflytende væske for de to første prøver.

Resultatene i tabell III viser at fremgangsmåten ifølge den foreliggende oppfinnelse til fjerning av nukleinsyre fra SCP og ekstraksjon av protein fra proteinet med redusert nukleinsyreinnhold er egnet for bruk med bakterieceller.

Eksempel VI

Eksempel V ble hovedsakelig gjentatt, idet der imidlertid istedenfor bakteriekulturen ble anvendt en gjærkultur, nærmere bestemt et celleavløp av Pichia pastoris. Resultatene av dette eksempel er vist i tabell IV.

Også dette eksempel viser at en effektiv reduksjon av nukleinsyreinnholdet oppnås, og at både pillen fra ammonium-hydroksydekstråksjonen og den ovenpåflytende væske utgjør proteinprodukter.med redusert nukleinsyreinnhold sammenlignet med utgangscellematerialet fra avløpet.

Eksempel VII

Eksempel V ble hovedsakelig gjentatt bortsett fra

følgende modifikasjoner:

Ved syreoppslutningen ble der benyttet 30 ml konsentrert H2S04 (0,54 N)(istedenfor HC1) pr. 45 ml Pichia pastoris-kulturmedium. Syren ble tilsatt ved 50°C, og blandingen ble oppvarmet til 80°C. Ved 80°C ble vannbadet slått av og blandingen tillatt å sette seg ved 70 - 8 0°C i en time. Intet nøytraliseringstrinn ble utført, men blandingen ble sentrifugert med det samme. Pillen ble suspendert på ny i ca. 2,5 1 vann. Til denne resuspenderte celleblanding ble der satt 420 ml NH^OH ved en temperatur på 30°C, og blandingen ble så oppvarmet til 80 C. Blandingen ble holdt på denne temperatur i en time. Blandingen hadde da endret farge fra gul til en lysegrønn farge. Det synes som om en kortere NH^OH-behand-lingstid ville ha vært å foretrekke for å unngå fargeendringen. Resultatene av dette eksempel er vist i tabell V.

Også dette eksempel viser at der ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan fremstilles to forskjellige produkter som begge har redusert nukleinsyreinnhold. Resultatene viser også at dataene er lett reproduserbare.

Eksempel VIII

Eksempel V ble igjen hovedsakelig gjentatt, bortsett fra som følger: 30 ml konsentrert H2SO^ble i dette eksempel tilsatt ved ca. 50°C. Blandingen ble oppvarmet til 80°C og holdt på denne temperatur i 30 minutter. Til nøytralisering ble der anvendt 68,5 g KOH (85 %), og den endelige pH-verdi ble fastlagt til 5,85. Det syrebehandlede og nøytraliserte produkt ble sentrifugert ved 3 000 o/min i 5 minutter og vasket en gang med varmt vann. Ammoniumhydroksyd ved 4 0°C ble tilsatt det faste cellemateriale, og blandingen ble oppvarmet til 80°C og holdt på denne temperatur i 30 minutter.

Resultatene er vist i tabell VI.

Eksempel IX

Det foregående eksempel ble gjentatt bortsett fra at

51 ml konsentrert H2S04og 113 g KOH (85 %) ble anvendt.

Svovelsyren var 0,6 N. Resultatene av dette forsøk er vist i tabell VII.

De to ovenstående eksempler viser at funksjonelt protein med redusert nukleinsyreinnhold kan oppnås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen.

Eksempel X

Dette eksempel beskriver et forsøk i et forsøksanlegg ved bruk av avløp fra en gjæringsbeholder med Pichia pastoris som gjær. Avløpet ble samlet opp i en 340 l's beholder og holdt på en temperatur på ca. 10°C. Til denne beholderen ble der

satt 3,75 1 konsentrert H»SO.. Innholdet av beholderen ble

o 2 4

oppvarmet til 80 C og holdt på denne temperatur i 20 minutter. Den endelige pH-verdi var 0,95. Deretter ble 8,64 kg KOH (85 %) tilsatt, hvilket økte pH-verdien til 3,85 og temperaturen med ca. 10°C. Den behandlede væske inneholdt ca. 60 g Pichia pastoris pr. liter. Produktet ble behandlet i en kontinuerlig vaskende sentrifuge av merket "Merco",.. og strømmen delte seg i forholdet 3,5:0,9 (avløpsvann : cellekrem).

Sentrifugering i stor skala ble utført på det gjenværende NH 0H-behandlede materiale.

Ovenpåflytende væske fra

(a) og (b) se fotnoter i tabell III.

Separasjonen var ikke optimal, dvs. at "faststoff"-fraksjonen på 340 1 fortsatt inneholdt en meget betydelig mengde væske .og dermed holdt tilbake noe av den ekstraherte nukleinsyre. 52 1 NH .OH-oppløsning ble tilsatt denne "faststoff"-fraksjonen. Det oppnådde produkt ble igjen sentrifugert og vasket og delte seg i forholdet 6,0:1,5. Underløpet ("faststoff"-fraksjonen) ble fortynnet og ført gjennom sentrifugen på ny uten vasking. Den første ovenpåflytende væske var svært klar, og god separasjon av faststoffer var således mulig.

Væsken ble forstøvningstørket med en innløpstemperatur på 28 2°C og en utløpstemperatur på 99°C. De oppnådde resultater er gjengitt i tabell VIII.

Eksempel XI

I dette eksempel ble 5 ml bakteriecellekrem som var vasket en gang (HTB-53, den samme cellekrem som anvendt ovenfor i eksempel V), syrnet med 60 ml I^SO^ (0,4 N). Denne blanding ble oppvarmet ved 80 C i 30 minutter. Deretter ble blandingen "nøytralisert" med 0,1 ml mettet natriumhydroksyd. Den "nøytraliserte" blanding ble sentrifugert, og pillene ble suspendert på ny i vann. 0,6 ml konsentrert NH^OH ble tilsatt denne blanding og blandingen ble holdt på 34,5°C i 25 minutter. Den således oppnådde blanding ble faseseparert i en sentrifuge, og pillene og den ovenpåflytende væske ble analysert for proteininnhold. Intet nukleinsyreinnhold ble fastlagt i dette eksempel. De oppnådde resultater er vist i tabell IX.

Eksempel XII

Det foregående eksempel ble gjentatt, bortsett fra at celle-kremen i dette tilfelle var et avløp fra en gjæringsbehoIder hvor gjæren Pichia pastoris ble anvendt som mikroorganisme. De oppnådde resultater fremgår av tabell X.

Resultatene av de siste to eksempler menes ikke å være representative for oppfinnelsen av følgende grunn. Det menes at den høye andel av protein som ekstraheres i syrebehandlingstrinnet, fulgt av "nøytraliseringen" (20 % resp. 18 %), skyltes en for høy pH-verdi under "nøytralisering"-trinnet. De samlede mengder av ekstrahert protein i de forsøk som var ment å skulle være sammenligningsforsøk, er derfor ikke representative. Denne antagelse er basert på senere målinger av proteinekstraksjonens avhengighet av pH-verdien. Disse målinger har vist at proteinekstraksjonen øker raskt for de ovennevnte mikroorganismer og driftsbetingelser ved en pH-verdi over 10,5, mens lite protein overføres fra cellene til væskefasen ved pH-verdier mellom ca. 5,4 og 8.

Eksempel XIII

I dette eksempel blir virkningen av ammoniumhydroksyd, sammenlignet med natriumhydroksyd, på tverrbindingen av proteiner bestemt.

240 mg chymotrypsinogen eller 240 mg ribonuklease ble oppløst i 12 ml kaldt vann, og hver av disse oppløsninger ble

fordelt på 12 prøverør med skrulokk og et innhold på 1 ml. Disse prøverør ble oppbevart på is inntil de var klar for bruk. For hvert protein ble 0,25 ml konsentrert ammonium-. hydroksyd (15 N) tilsatt hvert av 5 av disse rør, og 0,25 ml NaOH (0,5 N) ble tilsatt hvert av 5 ytterligere prøverør.

De således fremstilte prøver ble inkubert ved 80°C i tidsrom på 0,5, 3, 10 og 120 minutter. Deretter ble blandingen frosset og lyofilisert til den var tørr. Etter fremstil-lingen av prøvene ble disse analysert ved elektroforese på natriumdodecylsulfat-polyakrylamid-geler.

Resultatet av elektroforese-forsøkene var at tverrbinding av proteinet fant sted i begge grupper av prøver. Det ble imidlertid funnet at graden av tverrbinding er meget langsommere med ammoniumhydroksyd enn med natriumhydroksyd, til tross for det forhold at ammoniumhydroksydet forelå i en mengde på 30 ganger mengden av natriumhydroksyd. Graden av tverrbinding med konsentrert ammoniumhydroksyd var dessuten meget mindre enn den som ble oppnådd med fortynnet natriumhydroksyd. Dette er en ytterligere grunn til at ammoniumhydroksyd for tiden er den foretrukne base for ekstraheringen av NARP.

Claims

1. Fremgangsmåte til fremstilling av protein med redusert nukleinsyreinnhold (NARP) fra en blanding av encelleprotein (SCP), karakterisert ved

(a) at en SCP-blanding inneholdende enkeltceller med høyt nukleinsyreinnhold og en væske underkastes et prosesstrinn for fjerning av nukleinsyre, idet en betydelig andel av nukleinsyren i enkeltcellene overføres til væsken, mens enkeltcellene forblir hovedsakelig intakte, hvorved der fås en blanding av celler med redusert nukleinsyreinnhold og en nukleinsyreholdig væske, (b) at cellene med redusert nukleinsyreinnhold separeres fra den nukleinsyreholdige væske, (c) at cellene med redusert nukleinsyreinnhold underkastes en ekstraksjon med en base ved en pH-verdi på ca. 10,6 eller mer for oppnåelse av en NARP-blanding av en væskefase og en fast fase, (d) at væskefasen,.som er hovedsakelig fri for uopplø se-lig cellemateriale, og den faste fase, som er- hovedsakelig fri for væsken, separeres, (e) at væskefasen utvinnes som en NARP-oppløsning som utgjør et første produkt av fremgangsmåten, og (f) at den faste fase utvinnes som et NARP-celleprodukt som utgjør et annet produkt av fremgangsmåten.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at trinn (a) utføres ved at SCP-blandingen underkastes en syre- og varmebehandling og spesielt bringes i berø ring med en mineralsyre ved forhøyet temperatur.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 2, karakterisert ved at SCP-blandingen bringes i berøring med H2S04' e-"--'-er at blandingen bringes i berøring med H^ PO^°9 det første separasjonstrinn (d) utføres først etter forutgående nøytralisering av den nukleinsyreholdige væske.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at den nukleinsyreholdige blanding nøytrali-seres til en pH-verdi på ca. 5-10 før det første separeringstrinn (d), og at cellene med redusert nukleinsyreinnhold først deretter separeres fra den nukleinsyreholdige væske.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at SCP-blandingen fås ved at en blanding av en mikroorganisme og et vekstmedium utsettes for gjæringsbetingelser i en gjæringssone og SCP-blandingen utgjør i det minste en del av utløpet fra gjæringssonen, spesielt at minst en del av den nukleinsyreholdige væske føres inn i gjæringssonen, og spesielt at trinn (a) utføres ved at encelleproteinblandingen underkastes en behandling med en syre og varme og syren nøytraliseres med et oksyd, hydroksyd, karbonat eller bikarbonat av et metall eller en metallekvivalent som er tilstede i vekstmediet som mineraler eller spormineraler.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 5, karakteri-s, e r t ved at syren er en mineralsyre, hvis anion er det samme som anionet i mineralene eller spormineralene, eller at nøytraliseringen utføres før det første separeringstrinn (b) .

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at ekstraksjonen utføres med en 0,5 N - 15 N base, spesielt at ekstraksjonen utføres med NH^ OH.

8. Fremgangsmåte som angitt i et av de foregående krav, karakterisert ved at den anvendte mikroorganisme er en gjær.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av celler med redusert nukleinsyreinnhold, karakterisert ved (a) at en mikroorganisme og et mineralholdig vekstmedium for mikroorganismen utsettes for gjæringsbetingelser i en gjæringssone, (b) at et avløp fra gjæringssonen føres over i en syrningssone hvor det bringes i berøring med en syre for over-føring av minst en del av de nukleinsyrer som inneholdes i cellene av mikroorganismen, til den omgivende væske, (c) at en syrnet blanding av en nukleinsyreholdig væskefase og en fast cellefase hvis celler har redusert innhold av nukleinsyre, men hovedsakelig uendret innhold av protein sammenlignet med cellene i avløpet, føres ut av syrningssonen, (d) at væskefasen og den faste cellefase i en separe-ringssone separeres i en cellerik fase og i en væskefase som er hovedsakelig fri for mikroorganismeceller, (e) at væskefasen føres ut av separeringssonen, (f) at minst en del av den nukleinsyreholdige væskefase føres inn i gjæringssonen, og (g) at væskefasen før den føres inn i gjæringssonen nøy-traliseres med et oksyd, hydroksyd, karbonat eller bikarbonat av et eller flere metaller eller metallekvivalenter, idet syren og metallene velges slik at syreanionet og metallene sammen vil danne et eller flere av de mineraler som allerede er tilstede eller er ønskelige i vekstmediet. 1,0. Fremgangsmåte som angitt i krav 9, karakterisert ved at nøytraliseringstrinnet utføres før separeringstrinnet, eller at syren velges blant svovelsyre, saltsyre og fosforsyre og nø ytraliseringstrinnet utføres med en base valgt blant hydroksyder og karbonater av natrium, kalium, kalsium, magnesium og ammonium og blandinger herav.