NO811943L - Fremgangsmaate til fremstilling av encelleprotein med lavt nukleinsyreinnhold - Google Patents

Description

Oppfinnelsen angår encelleprotein med redusert innhold av nukleinsyre. En annen side ved oppfinnelsen angår en fremgangsmåte til fremstilling av slikt encelleprotein.

Uttrykket "encelleprotein" har en rekke forskjellige meninger.

Det er vanligvis brukt som en henvisning til et proteinholdig produkt som er isolert fra encellede mikroorganismer. Ifølge en annen vanlig praksis, som er benyttet i den foreliggende beskrivelse og krav med mindre noe annet er angitt, anvendes uttrykket på et helt celleprodukt hvor både protein- og celleveggmaterialer av de encellede mikroorganismer foreligger.

Hurtig økning i verdens befolkning har gjort fortsatt av-hengighet av vanlig matvareprotein upraktisk. Encelleprotein (SCP) er én mulig løsning på proteinmangelen i verden. For tiden brukes SCP hovedsakelig til dyremat. SCP blir imidlertid i en eller annen form allerede anvendt til menneskeføde og ventes å få større betydning i fremtiden.

SCP fremstilt ved dyrkingen av mikroorganismer inneholder generelt en større del nukleinsyrer enn vanlige matvarer. Skjønt mengden av nukleinsyrer som foreligger i SCP varierer avhengig av den spesielle mikroorganisme som anvendes, foreligger generelt 5-18 prosent nukleinsyrer (tørr vekt) i SCP. Det endelige meta-bolske produkt som dannes i mennesker fra purin-molekyIdelen i nukleinsyrer er urinsyre. Mennesker er ikke i besittelse av enzymet urikase som oksyderer urinsyre til allantoin, en opp-løselig og utskillbar metabolitt. Konsumpsjon av en proteinkilde med et høyt innhold av nukleinsyrer resulterer i et høyere plasma-innhold av urinsyre. Da urinsyre er bare svakt oppløselig ved fysiologiske pH-verdier, kan dette føre til dannelsen av urinsyre-krystaller i leddene, hvilket kan forårsake gikt eller leddgikt.

For ernæring av mennesker bør nukleinsyreinnholdet av encelleproteinet reduseres til mindre enn ca. 9% dersom en vesentlig mengde encelleprotein anvendes i kosten. Den anbefalte daglige rasjon (Recommended Daily Allowance) av protein er 65 g pr. dag for en voksen mann på 70 kg, og De forente nasjoners rådgivende gruppe for proteinkalorier (the Protein Calorie Advisory Group og the United Nations System) anbefaler at mengden av nukleinsyre som inntas pr. dag fra mikrobielt protein bør være mindre enn 2 g. Følgelig må nukleinsyreinnholdet av mikrobielt protein være mindre enn ca. 3 vektprosent dersom disse kriterier skal imøtekommes når mikrobielt protein er den eneste kilde til protein i kostholdet. Nukleinsyreinnholdet må være mindre enn ca. 6% dersom det mikrobielle protein utgjør 50% av proteinet i kostholdet. Når SCP inneholder celleveggmaterialer i tillegg til mikrobielt protein, foreligger proteinet typisk, som for eksempel i gjær, i mengder på ca. 60 vektprosent regnet på den samlede vekt av SCP. Under disse forhold bør inneholdet av nukleinsyre være mindre enn 2 vektprosent dersom SCP er den eneste kilde til protein i kosten, og mindre enn ca. 4 vektprosent dersom SCP utgjør 50% av proteinet i kosten.

I litteraturen er der beskrevet en rekke metoder til fjerning av nukleinsyrer fra SCP. Disse metoder omfatter varmesjokk, behandling med syre, behandling med base og enzymvirkning. Noen metoder er forholdsvis uvirksomme for fjerning av nukleinsyre eller fjerner en stor del av proteinet sammen med nukleinsyrene. Andre metoder er for kompliserte eller krever slike kostbare trinn at de ikke er økonomisk attraktive for anvendelse i stor måle-stokk. Nok andre forårsaker dannelse av ikke-naturlig forekommende aminosyrer. En av disse ikke-naturlig forekommende aminosyrer, lysinalanin, er f.eks. funnet å forårsake nyreskader ("Protein Nutritional Quality of Foods and Feeds", Part 2, M. Friedman (Ed.), 1975, pp. 595-816).

Dessuten kan den fremgangsmåte som anvendes til reduksjon av nukleinsyreinnholdet virke inn på renheten av SCP-produktet såvel som dets smak, lukt og farge. For anvendelse som et til-skudd til kostholdet, f.eks., er det ønskelig at encelleproteinet er uten smak, lukt og farge for å unngå at det virker inn på den naturlige farge og smak av de matvarer som det skal kombineres med. Videre er det ønskelig med et encelleprotein-produkt som stort sett er fritt for forurensende kjemikalier, f.eks. ammoniumhydroksyd.

En hensikt med oppfinnelsen er å skaffe et encelleprotein-produkt med redusert innhold av nukleinsyre og en fremgangsmåte til dets fremstilling. En annen hensikt er å skaffe en slik fremgangsmåte som ikke fører til et vesentlig redusert proteininnhold i encelleprotein-produktet. Nok en hensikt med oppfinnelsen er å skaffe en fremgangsmåte som ikke resulterer i dannelsen av vesent- lige mengder lysinalanin. En ytterligere hensikt er å skaffe en fremgangsmåte som gir et encelleprotein-produkt med gode farge-, smak- og lukt-karakteristikker og som stort sett er fritt for forurensende kjemikalier. Ytterligere hensikter er å skaffe encelleprotein-produkter med de karakteristiske trekk som fås ved fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen. Andre hensikter og fordeler vil fremgå for fagfolk fra beskrivelsen og de nedenfor angitte eksempler.

I store trekk omfatter oppfinnelsen å fremstille et fluidum inneholdende celler ved utførelse av gjæring av minst en art av en mikroorganisme under vandige gjæringsbetingelser, å behandle fluidet inneholdende cellene med NH^OH ved en pH-verdi på ca. 7-10 og en temperatur som stort sett ligger i området 65-99°C, fortrinnsvis 85-90°C, og å separere cellene fra fluidet. Et ytterligere trekk ved oppfinnelsen omfatter å tørke de således separerte celler for fjerning av vannet og NH^OH, hvilket gir et tørket encelleprotein-produkt som stort sett er fritt for forurensende kjemikalier såsom ammoniumhydroksyd.

Nok en side ved oppfinnelsen omfatter behandling av et fluid inneholdende celler av minst en art av en gjærsort ved en pH-verdi i området 8,5-10,0.

Enda en side ved oppfinnelsen omfatter å behandle et fluid inneholdende celler av minst en art av bakterier ved en pH-verdi på 7-9,0.

Ytterligere sider ved oppfinnelsen omfatter encelleprotein-produkter med redusert innhold av nukleinsyre fremstilt i henhold til den foreliggende oppfinnelse.

Andre sider ved oppfinnelsen omfatter å behandle mikrobielle celleprodukter med et oksydasjonsmiddel for fremstilling av et encelleprotein med forbedret farge, smak og lukt.

I. Omfanget av mikroorganismer

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen er i store trekk anvende-lig på bakterier og gjærsorter som er nyttige som en proteinkilde. Med henblikk på økonomi , tilgjengelighet og vannblandbarhet av de lavere rettkjedede alkoholer som matningsmaterialet for gjæringen, er det for tiden foretrukket at bakteriene og gjær-sortene er i stand til å assimilere en eller flere alkoholer inneholdende 1-6 karbonatomer pr. molekyl, f.eks. metanol, etanol, 1-propanol, 1-heksanol og lignende, som kilden for karbon og energi i veksten eller formeringen av mikroorganismene.

Egnede gjærsorter omfatter arter fra slektene Candida, Hansenula, Torulopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Lipomyces, Cryptococcus, Nematospora og Brettanomyces. De foretrukkede slekter omfatter Candida, Hansenula, Torulopsis, Pichia og Saccharomyces. Eksempler på egnede arter omfatter:

De ovenfor beskrevne gjærsorter kan dyrkes i en satsvis eller kontinuerlig gjæringsprosess i nærvær av oksygen, en alkohol og en assimilerbar nitrogenkilde. Forskjellige typer gjærings-prosesser som er kjent i faget kan anvendes. F.eks. kan en skum-fermentator slik det er beskrevet i US-PS 3 982 998 anvendes.

Egnede bakterier omfatter arter av slektene Bacillus, Mycobacterium, Actinomyces, Nocardia, Pseudomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Methylococcus, Arthrobacter, Metylomonas, Brevibacterium, Acetobacter, Micrococcus, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Microbacterium, Achromobacter, Methylobacter Methylosinus og Methylocystis. Foretrukkede slekter omfatter Bacillus, Pseudomonas, Protaminobacter, Micr<p>coccus, Arthrobacter og Corynebacterium.

Eksempler på egnede arter omfatter:

Oksygen kan tilføres til fermenteringsprosessen i form av

luft eller oksygenanriket luft. Nitrogenkilden for gjæringen kan være en hvilken som helst organisk eller uorganisk nitrogenholdig forbindelse som kan avgi nitrogen i en form som er egnet til metabolsk anvendelse av den voksende organisme. Egnede organiske nitrogenforbindelser omfatter f.eks. proteiner, aminosyrer, urin-stoff og lignende. Egnede uorganiske nitrogenkilder omfatter ammoniakk, ammoniumhydroksyd, ammoniumnitrat og lignende. De for tiden foretrukkede nitrogenkilder for den foreliggende oppfinnelse er ammoniakk og ammoniumhydroksyd fordi disse forbind-elser lett kan fjernes under SCP-produksjonsprosessen og ikke øker saltinnholdet av SCP-produktet. Mengden av NH^OH som tilsettes vil være avhengig av den pH-verdi som ønskes for reaksjonsblandingen. Uten noen tilsetning av NH^OH vil pH-verdien generelt være ca. 2 for et mineralnæringsstoff-medium av den nedenfor angitte type. For anvendelsen av gjærsorter i gjæringsprosessen ligger pH-verdien fortrinnsvis i området 3-5, og for anvendelsen av bakterier bør pH-verdien fortrinnsvis ligge i området 6-7,5.

Der benyttes tilstrekkelig vann i fermenteringsorganet til

å skaffe de nødvendige betingelser for den mikroorganisme som anvendes. Mineraler, vekststoffer, vitaminer og lignende til-

settes generelt i mengder som varierer i henhold til de spesielle mikroorganismers behov, og er generelt kjent for fagfolk eller kan lett bestemmes av disse. Et typisk eksempel på et egnet mineralnæringsstoff-medium er som følger:

Spormineraloppløsningen i den ovenfor angitte oppskrift er som følger:

Aviontsert vann til å bringe oppløsningen på 1 1.

Veksten av mikroorganismen er følsom overfor driftstempe-raturen i gjæringsapparatet og hver enkelt art av mikroorganisme har en optimal temperatur for vekst. Eksempler på gjæringstempe-raturer ligger i området 20-65°C. Den temperatur som velges vil generelt avhenge av den mikroorganisme som anvendes i prosessen, da hver art vil ha et noe forskjellig temperatur/vekstrate-forhold.

Gjæringstrykkene ligger generelt i området 9,8 kPa-9,8 MPa, vanligvis 98 kPa-2,94 MPa, fortrinnsvis 98-490 kPa, da de høyere trykk gir et større innhold av oppløst oksygen i det vandige medium og i alminnelighet høyere produktiviteter.

Utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet kan anvendes direkte

i trinnet til reduksjon av nukleinsyren. Skjønt det er mindre foretrukket fordi det føyer et ekstra og kostbart trinn til prosessen, kan utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet også sentri-fugeres, filtreres eller forstøvningstørkes for å gi SCP-cellene, og cellene kan resuspenderes i en egnet væske, f.eks. vann, før behandlingen med ammoniumhydroksyd, eller SCP-cellene kan blandes direkte med det vandige ammoniumhydroksyd.

II. Fjerning av nukleinsyre

I henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen, blir et fluid inneholdende celler av minst en art av mikroorganismer, hvilket fluid i en foretrukket utførelsesform er utløpsstrømmen fra et gjæringsapparat, behandlet med ammoniumhydroksyd ved en pH-verdi på 7-10 og en temperatur som stort sett ligger i området 65-99°C i et tidsrom som er virksomt for reduksjon av nukleinsyreinnholdet til under et ønsket nivå uten for stort tap av protein.

For gjærceller er 8,5-10 et foretrukket pH-område for reduksjonen av nukleinsyreinnholdet til et egnet nivå.

For Pichia er et foretrukket område for reduksjon av nukleinsyreinnholdet til et egnet nivå ca. 9,25-10, for det minst mulige tap av protein. For Hansenula er et foretrukket område ca. 8,8-9,6. Og for bakterier anses et for tiden foretrukket område å være ca. 7-9,0 for det minst mulige tap av protein.

I alle tilfeller er det imidlertid ventet at behandling

av encelleprotein i pH-området på ca. 7-10 vil i det minste redusere innholdet av nukleinsyre i encelleproteinet uten å forårsake vesentlig tap av protein. pH-verdier på over ca. 10 kan føre til et for stort tap av proteininnhold og i det minste i visse tilfeller, til dannelsen av lysinalanin.

Ammoniumhydroksydet kan tilsettes som en konsentrert vandig oppløsning eller det kan dannes in situ ved tilsetning av ammoniakk til den vandige SCP-blanding. Andre baser kan også anvendes til reduksjon av nukleinsyreinnholdet, men NH^OH fore-trekkes fordi det lett kan fjernes under tørkeprosessen og ikke øker saltinnholdet av SCP-produktet.

Fjerningen av nukleinsyre utføres stort sett ved en temperatur på 65-99°C for fremstilling av et encelleprotein med et nukleinsyreinnhold som er forenlig med at encelleproteinet utgjør en større del av det daglige menneskelige proteinbehov. Ved temperaturer på under ca. 65°C er nukleinsyrefjerningen uønsket langsom og ved temperaturer på over ca. 99°C er der et uønsket stort tap av protein. Fortrinnsvis ligger temperaturen mellom 85°C og 99°C for fremstilling av et SCP-produkt som har et nukleinsyreinnhold som er forenlig med at det kan anvendes som den eneste kilde til protein for det daglige menneskelige behov uten for stort tap av protein. Som det er vist i de følgende eksempler, vil den reaksjonstemperatur som velges være relatert til pH-verdien. Ved pH-verdier nær den nedre del av det ovenfor angitte egnede område (nær pH 7) kan der generelt anvendes høyere temperaturer innen det angitte temperaturområde. Ved høyere pH-verdier (nær pH 10) ken der anvendes lavere temperaturer innen det spesifiserte temperaturområde med tilfredsstillende fjerning av nukleinsyre.

Den tid som er nødvendig for reduksjon av nukleinsyre avhenger av den spesielle mikroorganisme som anvendes og -av temperaturen og pH-verdien i behandlingen. Ved lavere temperaturer og pH-verdier vil det være nødvendig med lengre tid. Ved høyere temperaturer og pH-verdier vil kortere tider være egnede. Generelt kan tiden velges over et vidt område og vil være fra

noen få minutter til flere timer. Generelt vil imidlertid behandlingstiden ligge i området 5-60 min. Den optimale tid for den spesielle mikroorganisme og temperatur kan lett bestemmes ved noen få velvalgte forsøk.

Ved slutten av ammoniumhydroksyd-behandlingen blir blandingen separert ved metoder såsom sentrifugering eller filtrering for utvinning av encelleproteinet som har et redusert innhold av nukleinsyre. Det fuktige SCP-produkt blir deretter fortrinnsvis forstøvningstørket for å fordampe det resterende vann og NH^OH

for fremstilling av et tørket SCP-produkt i hvilket saltinnholdet ikke er øket. Den ovenpåflytende væske (supernatant) fra separa-sjonstrinnet inneholder de nukleinsyrer som er fjernet fra encelleproteinet. Disse nukleinsyrer kan utvinnes ved teknikker som er kjent i faget, f.eks. forsyrning eller ultrafiltrering.

De utvunnede nukleinsyrer kan behandles ved en enzymatisk hydrolyse, hvilket er velkjent i faget, for utvinning av mono-nukleotider som er nyttige, f.eks. som smaksfremmende midler.

III. Eksempler

Detaljerte utførelsesformer av den foreliggende oppfinnelse skal nå beskrives, idet det skal forstås at disse bare er eksempler på oppfinnelsen som kan utføres på en rekke forskjellige måter. De således angitte detaljer skal derfor ikke oppfattes som noen begrensning.

De følgende analysemetoder ble anvendt i eksemplene: Nukleinsyrer. De samlede nukleinsyrer ble ekstrahert fra prøvene med 0,5 N vandig perklorsyre ved 70°C i 20 min. Nukleinsyreinnholdet i ekstraktet ble bestemt spektrofotometrisk ved 260 nm (nanometer).

Protein. Protein ble ekstrahert fra prøven med 5 ml 0,8 N natriumhydroksyd ved 100°C i 5 min. Ekstraktet ble avkjølt til værelsetemperatur, og 200 jul av 18,75 vektprosents CuSO^<*>5H20

ble tilsatt. Blandingen ble tillatt å stå ved værelsetemperatur (ca. 25°C) i 30 min, og proteininnholdet ble målt ved absorptan-sen av protein/kobber-komplekset ved 540 nm under anvendelse av serumalbumin fra storfe som standard.

Karbohydrat. For måling av det samlede karbohydrat ble prøvene ekstrahert med 1 N HC1 i 30 min ved 100°C. Hydrolysatene ble avkjølt til værelsetemperatur (ca. 25°C) og nøytralisert med NaOH. Det samlede reduksjonssukker ble deretter analysert ved Nelson's metode (J.M. Clark, Jr., "Experimental Biochemistry", W.H. Freeman&Co., San Francisco, Calif., 1963, pp. 12-14).

Lyslnalanin. Innholdet av lysinalanin i prøvene ble bestemt ved den metode som er beskrevet av Sakamoto et al. (M. Sakamoto, F. Nakayama og K.I. Kajiyama; M. Friedman Ed., "Protein Cross-linking", Vol. 1, Plenum Press, N.Y. 1976, pp. 687-712).

Eksempel I

I en kontinuerlig aerob gjæringsprosess ble metanol og-

et vandig mineralsaltmedium i et volumforhold på 40:60 matet inn hver for seg til et gjæringsapparat som var podet med gjærarten Pichia pastoris Culture 21-1, deponert ved the Northern Ulitiza-tion and Research Division, Agricultural Research Service, US Department of Agriculture, Peoria, Illinois med deponeringsnummer NRRL Y-11430. Gjæringsapparatet var et 1500 l's skumfylt gjæringsapparat med et væskevolum på ca. 610 1 med automatisk kontroll av pH-verdi, temperatur og nivå. Omrøring ble skaffet ved en turbin (750 omdreininger pr. min) ved den nedre ende av et sugerør. Luft ble tilført med en hastighet på ca. 4 volumer luft (ved ca. 262 kPa og 25°C) pr. volum gjærstoff i gjæringsapparatet pr. min. Vannfri ammoniakk ble tilsatt med en slik hastighet at pH-verdien av gjæringsblandingen ble holdt på ca. 3,5.

Det vandige mineralsaltmedium ble fremstilt ved at der

til hver liter ledningsvann ble blandet inn 15,86 ml 75 prosentsH3P04, 9,53 g K2S<0>4, 7,8 g MgS04.7H20, 0,6 g CaCl2.2H20, 2,6 g 85 prosents KOH og 5,2 ml av en spormineraloppløsning. Biotin ble matet inn separat via metanolstrømmen med en hastighet på

1 ml pr. 1 metanol.

Spormineraloppløsningen ble fremstilt ved at der for hver liter oppløsning ble blandet inn 65 g FeS04-7H20, 20 g ZnS04-7H20, 3,0 g MnS04.7H20, 3,0 g MnS04.H20, 6,0 g CuS04.5H20, 5,0

ml konsentrert H2S04og tilstrekkelig avionisert vann til å bringe oppløsningen på 1 liter.

Det vandige mineralsaltmedium ble matet inn med en hastighet på 27-30 l/h og metanolen med en hastighet på 18-20 l/h.

Gjæringen ble utført ved 30°C og et trykk på ca. 262

kPa med en oppholdstid på 13,5-12,2 timer.

Av analytiske hensyn ble gjærcellene separert fra gjæ-rings-utløpsstrømmen ved sentrifugering, vasket ved suspensjon i vann og resentrifugering, tørket over natten ved 100°C og veiet. På tørr basis ble gjærcellene produsert med et utbytte på ca. 40 g pr. 100 g metanol-matningsmateriale, idet celle-tettheten var ca. 125 g celler (tørrvekt) pr. liter utløpsstrøm.

Eksempel II

Et forsøk ble utført for å vise fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen for reduksjonen av nukleinsyreinnholdet av et encelleprotein. En blanding av 2,4 liter konsentrert ammoniumhydroksyd (28,4 vektprosent ammoniakk) og 189 liter utløpsstrøm fra gjæringsapparatet fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 som beskrevet i eksempel I, ble varmet opp ved 90°C i 20 min. pH-verdien av blandingen var ca. 9,5. Ved reaksjonstidens slutt ble ca. 189 liter vann tilsatt og den resulterende blanding ble sentrifugert og vasket. Det faste produkt ble forstøvningstørket i en Anhydro forstøvningstørker, type III-A. Faststoffet og den ovenpåflytende væske ble analysert for protein og nukleinsyreinnhold. Resultatene er angitt i tabell I sammen med resultatene av en sammenligningsanalyse av ubehandlet SCP isolert fra utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet ved forstøvningstørking. Resultatene er angitt på basis av 100 g SCP-utgangsmateriale.

Resultatene i tabell I viser prosessen ifølge oppfinnelsen for reduksjon av nukleinsyrene i SCP. Det faste produkt inneholder ca. 1,2 vektprosent nukleinsyrer regnet på tørrvekten av det faste SCP-produkt, en betydelig reduksjon fra de 6,2 vekt prosent nukleinsyrer som foreligger i sammenligningsprøven, og mindre enn det anbefalte nivå på 2% nukleinsyre som fortrinnsvis bør oppnås dersom SCP skal utgjøre den eneste kilde til protein for mennesker.

Aminosyreinnholdet av encelleproteinet med redusert innhold av nukleinsyre ble bestemt og er angitt i tabell II. Fett-syreinnholdet av encelleproteinet med redusert innhold av nukleinsyre ble også bestemt og er angitt i tabell III. De tilsvarende verdier for et encelleprotein som ble fremstilt direkte fra utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris er inkludert i tabell II og III for sammenligning.

En undersøkelse av encelleproteinet med redusert nukleinsyreinnhold viste at produktet hadde mindre av den typiske gjær-aktige smak og lukt enn sammenlignings-encelleproteinet. I mot-setning til den gule farge av sammenlignings-encelleprotéinet var det behandlede encelleprotein lysere og lett gyllenbrunt av farge.

Eksempel III

Lysinalanininnholdet av SCP med redusert nukleinsyreinnhold fra eksempel II ble bestemt og funnet å være bare ca. 0,001 vektprosent lysinalanin regnet på vekten av det samlede tørre SCP. For sammenligning ble en prøve av utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet fra gjæringen av Pichia pastoris NRRL Y-11430, som stort sett var den samme som den gjæringsapparat-utløpsstrøm som ble anvendt i eksempel II, behandlet med NaOH ved pH 12 og 90°C i 20 min. En analyse av det utvunnede SCP for lysinalanin viste at 0,84 vektprosent lysinalanin forelå, regnet på den samlede SCP-tørrvekt.

Disse resultater viser at ammoniumhydroksyd-behandlingen ifølge den foreliggende oppfinnelse gir et SCP med et redusert innhold av nukleinsyre og stort sett ikke noe lysinalanin. Behandling med en base ved en høyere pH-verdi gav et SCP-produkt med en betraktelig mengde lysinalanin. Da det er kjent at menneskelig konsumpsjon av lysinalanin er uønsket pga. en tendens til å forårsake nyreskader, har fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen en fordel over metoder til reduksjon av nukleinsyre som anvender betingelser under hvilke ikke-naturlig forekommende aminosyrer såsom lysinalanin dannes.

Eksempel IV

Et forsøk ble utført for å vise de forandringer i innholdet av protein, nukleinsyrer, karbohydrater og lipider i SCP som fås som et resultat av ammoniumhydroksyd-behandlingen ifølge oppfinnelsen. Fire prøver av utløpsstrøm fra gjæringsapparatet fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 som beskrevet i eksempel I ble anvendt. Prøve nr. 1 var en sammenligningsprøve som ble holdt på is. Prøve nr. 2 ble blandet med konsentrert ammoniumhydroksyd (NH^OH) i et forhold på 14 ml NH4OH pr. liter utløpsstrøm (pH 9,25) og varmet opp i en time ved 90°C. Prøve nr. 3 ble blandet med NH^OH i et forhold på 28 ml NH4OH pr. liter utløpsstrøm (pH 9,91) og varmet opp i 30 min ved 85°C. Prøve nr. 4 ble blandet med NH40H i et forhold på 28 ml NH40H pr. liter utløpsstrøm (pH 9,91) og varmet opp i en time ved 80°C.

Ved reaksjonstidens slutt ble prøver nr. 2, 3 og 4 av-kjølt med is, og alle fire prøver ble sentrifugert ved 10 000 omdreininger pr. min i 20 min. Faststoffene fra sentrifugeringen ble lyofilisert. De ovenpåflytende væsker fra sentrifugeringen ble varmet opp i en ovn til 110°C i ca. en time for å fjerne ammoniakk og ble deretter lyofilisert. Lyofilisasjonsproduktene som var avledet fra sentrifuge-faststoffene og de ovenpåflytende væsker ble analysert. Resultatene er angitt i tabell IV hvor vektene er uttrykt i forhold til 100 g opprinnelig SCP-fast-stoffer. Det uorganiske saltinnhold av utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet ble bestemt ved vekten av ovenpåflytende væske i prøve 1, og ble subtrahert fra hver av vektene av oven-påf lytende væske.

Resultatene i tabell IV viser at tre forskjellige ammoniumhydroksyd-behandlinger (2, 3 og 4) reduserer innholdet av nukleinsyre betraktelig mens bare en liten del av proteinet fjernes. Nukleinsyreinnholdet i de faste produkter fra behandling 2, 3 og 4 var 2,1-2,2 vektprosent (tørrvekt) hvilket er adskillig lavere enn de 7,8 vektprosent nukleinsyrer som ble oppnådd i sammenligningsprøve 1.

Eksempel V

Virkningen av pH-verdien på fjerningen av nukleinsyrer fra SCP ved behandling med ammoniumhydroksyd ble undersøkt. En rekke prøver av utløpsstrøm fra gjæringsapparatet fra gjæringen av Pichia pastoris NRRL Y-11430 som beskrevet i eksempel I ble behandlet ved 80°C i en time med ammoniumhydroksyd ved forskjellige pH-nivåer. Ved fullførelsen av ammoniumhydroksyd-behandlingen ble produktblandingene avkjølt, sentrifugert og vasket. Faststoffene fra sentrifugeringene ble analysert for nukleinsyreinnhold og resultatene er vist i tabell V.

De i tabell V angitte resultater viser at NH^OH-behand-linger ved pH-nivåer på 9,25-10,45 fjerner betydelige mengder nukleinsyrer fra SCP, og prosentandelen som fjernes øker med høyere pH-verdier. Prøve nr. 7 er et sammenligningsforsøk som bare anvender vann istendenfor NH^OH og mindre enn 20% av nukleinsyrene ble fjernet.

For å bestemme virkningen av de forskjellige pH-nivåer på proteininnholdet av det behandlede SCP, ble enda noen prøver av gjæringsapparat-utløpsstrømmen fra gjæringen av Pichia pastoris NRRL Y-11430 som beskrevet i eksempel I behandlet ved forskjellige pH-nivåer ved 90°C i 40 min. Produktblandingene ble avkjølt, sentrifugert og vasket. Faststoffene fra sentrifugeringen ble analysert for protein. pH-verdien og proteininnholdet er vist i tabell VI.

Resultatene i tabell VI viser at de høyere pH-verdier bevirker fjerning av større mengder protein. Ved pH-verdier på over ca. 10 øker proteintapene hurtig og blir uakseptabelt store.

Eksempel VI

Virkningen av temperaturen på fjerningen av nukleinsyrer fra SCP ved behandling med ammoniumhydroksyd ble undersøkt. Prøver av utløpsstrøm fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 som beskrevet i eksempel I ble behandlet ved forskjellige temperaturer med 0,2 N og 0,4 N NH^OH i en time. Pro-duktblandingen ble avkjølt, sentrifugert og vasket. Faststoffene fra sentrifugeringene ble analysert for nukleinsyreinnhold. Resultatene i tabell VII er angitt som nukleinsyrer som foreligger, regnet som en vektprosentandel av den opprinnelige mengde nukleinsyrer som forelå før behandlingen. Et sammenligningsfor-søk (prøve 19) ved 90°C uten tilsetning av NH^OH er inkludert for sammenligning.

De i tabell VII angitte resultater viser at temperaturer på under ca. 65°C er forholdsvis uvirksomme for fjerning av nukleinsyrer fra SCP. Således reduserte ikke temperaturer på under ca i 65°C innholdet av nukleinsyre i SCP til det punkt hvor SCP kan utgjøre så meget som 50% av det daglige proteinbehov hos mennesker. Ved temperaturer på ca. 65°C og høyere har imidlertid SCP et nukleinsyreinnhold som tillater at SCP kan utgjøre så meget som 50% av det daglige proteinbehov hos mennesker. Under-søkelse av dataene viser at i det minste ved en temperatur på over 85°C har encelleproteinet et nukleinsyreinnhold som er forenlig med at encelleprotein skaffer hele det daglige proteinbehov hos mennesker.

Resultatene i tabell VII viser også at generelt er behandling med 0,4 N NH^OH (ved høyere pH-verdi) mer virksom i å redusere nukleinsyreinnholdet enn behandling med 0,2 N NH^OH. Generelt, så lenge pH-verdien ligger i de foretrukkede områder, er det ventet at temperaturbehandlinger på mellom 65 og 99°C vil redusere nukleinsyreinnholdet til et nivå som er forenlig med at SCP bidrar med så meget som 50% av det daglige menneskelige behov for protein, og temperaturbehandlinger på mellom ca. 85 og 99°C vil gi SCP-produkter med et nukleinsyreinnhold som er forenlig med at SCP er den eneste kilde for det daglige menneskelige behov for protein.

Resultatene i tabell VII viser også at et sammenlignings-forsøk ved 90°C med bare vann og intet NH^OH, fjernet mindre enn 30% av nukleinsyrene.

I andre forsøk med NH^OH-behandlinger ved pH-verdier på

ca. 9,5 i 40 min ble det vist at ved 98°C ble ca. 30% av SCP-proteinet fjernet mens ved 95°C ble ca. 27% av proteinet fjernet. Mengden av protein som ble fjernet under behandling ved 90°C var bare 18%. Dette tyder på at 99°C er den øvre grense for fjerning av nukleinsyre uten for stort proteintap, og at proteintapet blir gradvis større over ca. 90°C.

Eksempel VII

En undersøkelse ble foretatt av virkningen av tid på fjerningen av nukleinsyrer fra SCP ved behandling med ammoniumhydroksyd. En serie av 10 ml's prøver av gjæringsapparat-utløpsstrøm fra den aerobe gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 som beskrevet i eksempel I ble justert på 0,2 N med ammoniumhydroksyd (pH 9,3) og holdt på 90°C. En annen serie av 10 ml<1>s prøver av den samme gjæringsapparat-utløpsstrøm ble justert på 0,4 N med ammoniumhydroksyd (pH 9,7) og ble holdt på 85°C. Prøver ble tatt fra hver serie ved intervaller og analysert for nukleinsyreinnholdet. Resultatene i tabell VIII er angitt som mengden av nukleinsyrer som foreligger regnet som prosent av det opprinnelige nukleinsyreinnhold.

Resultatene i tabell VIII viser at fjerningen av nukleinsyre er hurtigere ved 85°C med 0,4 N NH^OH enn ved 90°C med 0,2 N NH^OH. Fjerningen av nukleinsyre er hurtig inntil ca. 30 min og blir langsommere mellom 30 og 60 min. Etter 60 min ble der ikke notert noen særlig forandring.

Eksempel VIII

En ammoniumhydroksyd-behandling i henhold til fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen ble utført på encelleproteinet fra den aerobe gjæring av Hansenula polymorpha. Hansenula polymorpha ble dyrket i en kontinuerlig aerob gjæringsprosess i en 4 l's reaktor ved 40°C. Metanol ble anvendt som kilden til karbon og energi for den voksende mikroorganisme og det vandige mineralsaltmedium var det samme som beskrevet i eksempel I. Gjæringen ble utført ved en celletetthet på 70-80 g (tørr) pr. 1 næringsvæske.

To serier av 4,5 ml<1>s prøver av gjæringsapparat-utløpsstrøm fraHansenula polymorpha ble blandet med 0,25 ml vann og 0,25 ml 4N NH^OH for å gi 5 ml<1>s prøver med 0,2 N NH^OH med pH-verdier på 8,8-8,9. To andre serier med 4,5 ml<1>s prøver av den samme utløps-strøm fra gjæringsapparatet ble blandet med 0,5 ml 4N NH^OH for å gi 5 ml's prøver inneholdende 0,4 N NH^OH og pH-verdier på 9,4-9,6. Disse serier ble behandlet ved forskjellige temperaturer fra 80 til 90°C og prøver ble tatt ved intervaller fra hver serie for analyse av nukleinsyreinnholdet. Resultatene er vist i tabell

IX.

De i tabell IX angitte resultater viser virkningen av ammoniumhydroksyd-behandlingen ifølge oppfinnelsen for fjerning av en vesentlig del av nukleinsyrene fra SCP fra Hansenula polymorpha.

Eksempel IX

Fjerningen av nukleinsyrer fra bakterielt SCP ved behandling med ammoniumhydroksyd viser forskjellen i letthetsgrad mellom bakterier og gjærsopper med hensyn til fjerning av nukleinsyrene. En termofil blandet bakteriekultur betegnet som en blandet rase HTB-53 og deponert ved the Northern Utilization and Research Division, U.S. Department of Agriculture, Peoria, Illinois, med deponeringsnummer NRRL B-8158, ble dyrket i en kontinuerlig aerob gjæring i et 4 l's gjæringsapparat ved 55°C. pH-verdien ble holdt på ca. 6,3 ved tilsetning av ammoniumhydroksyd-oppløsning, og metanol ble anvendt som kilden til karbon og energi av den voksende mikroorganisme. Den vandige mineralsaltoppløsning som ble anvendt er angitt nedenfor:

Spormineraloppløsningen ble fremstilt som beskrevet nedenfor:

En rekke 4,5 ml<1>s porsjoner av utløpsstrøm fra gjæringsapparatet ble blandet med forskjellige mengder vann og 4 N

NH^OH for å gi 5 ml<1>s prøver ved forskjellige pH-nivåer fra

6,3 til 9,5. Disse prøver ble varmet opp ved 80°C i en time.

Ved reaksjonstidens slutt ble prøvene avkjølt, fortynnet med

kaldt vann og sentrifugert. Sentrifuge-faststoffene ble analysert for nukleinsyreinnhold. Resultatene er vist i tabell X.

Tabell X viser at fjerningen av betydelige mengder nukleinsyrer fra bakterielt SCP oppnås ved pH-verdier så lave som 7,1. Ved pH-verdier på over ca. 9,0 ble der notert liten reduksjon

av nukleinsyreinnholdet. En sammenligning av disse resultater med resultatene i eksempel V hvor der ble anvendt en gjær under de samme betingelser av tid og temperatur, viser at gjæren generelt krevet en høyere pH-verdi enn bakteriene for effektiv nuklein-syrefjerning.

Fremgangsmåten ifølge oppfinnelsen kan anvendes til fremstilling av et encelleprotein med et redusert nukleinsyreinnhold slik at encelleproteinet er egnet til, menneskelig konsumpsjon.

IV. Oksydasjonsbehandling

En ytterligere side ved oppfinnelsen omfatter å behandle et encelleprotein-produkt, hvilket fortrinnsvis men ikke nødven-digvis har et redusert innhold av nukleinsyre, med et oksydasjonsmiddel for fremstilling av et encelleprotein-produkt med forbedret farge, lukt og smak.

Oksydasjonsmiddelet kan være et hvilket som helst egnet oksydasjonsmiddel som er virksomt for fremstilling av et encelleprotein-produkt med forbedret farge, lukt og smak. Fortrinnsvis er oksydasjonsmiddelet et peroksyd fordi det er lett tilgjengelig og virksomt, skjønt andre oksydasjonsmidler som er kjent i faget kan selvsagt også anvendes. Peroksydet kan være et hvilket som helst peroksyd valgt fra gruppen hydrogenperoksyd, natrium-peroksyd, kaliumperoksyd, magnesiumperoksyd, kalsiumperoksyd og lignende. Fordi det er relativt billig og reaktivt, og fordi overskudd av forbindelsen lett kan fjernes fra encelleproteinet ved tørking, er det for tiden mest foretrukkede peroksyd hydrogenperoksyd.

Behandlingen ifølge oppfinnelsen omfatter å bringe SCP i berøring med oksydasjonsmiddelet under betingelser som er virk-somme for forbedring av fargen, lukten og smaken av encelleproteinet. Et hvilket som helst celleprodukt bestående av mikrobielle celler kan behandles på denne måte, skjønt celleproduktet består fortrinnsvis av protein med redusert innhold av nukleinsyre som her beskrevet. Proteinet med redusert innhold av nukleinsyre som her beskrevet kan bringes i berøring med oksydasjonsmiddelet på et hvilket som helst tidspunkt. F.eks. kan oksydasjonsmiddelet settes til en blanding av ammoniumhydroksyd og SCP ved slutten av nukleinsyrereduksjons-trinnet. Alternativt kan det nuklein-syrereduserte protein separeres fra ammoniumhydroksyd/SCP-blandingen, f.eks. ved sentrifugering, forstøvningstørking og lignende, og det separerte protein med redusert innhold av nukleinsyre kan deretter bringes i berøring med et oksydasjonsmiddel ifølge oppfinnelsen. Andre tidspunkter hvor berøring kan utføres vil være åpenbare for fagfolk og ligger selvsagt også innen oppfinnelsen rekkevidde.

Berøringen finner fortrinnsvis sted med SCP i vandig suspensjon fordi de foretrukkede oksydasjonsmidler er vannoppløse-lige og en vandig suspensjon letter reaksjonen. Den vandige suspensjon kan inneholde en hvilken som helst egnet mengde SCP. Fortrinnsvis vil den vandige suspensjon ha 1-30 g SCP pr. 100 ml samlet suspensjon. Mengden av peroksyd som anvendes kan være en hvilken som helst egnet mengde som er virksom for oksydasjon av proteinet med redusert nukleinsyreinnhold for fremstilling av et SCP-produkt med forbedret farge, smak og lukt. Mengden av peroksyd vil fortrinnsvis ligge i området 0,01-1 g peroksyd pr. 100 ml vandig suspensjon av SCP. Normalt kan der anvendes peroksydnivåer i nærheten av den nedre grense for det ovenfor angitte peroksyd-område sammen med lavere nivåer av SCP. På samme måte kan høyere peroksydnivåer anvendes sammen med større mengder SCP.

Som antydet blir i alminnelighet peroksydet satt til en oppslemming eller vandig suspensjon av nukleinsyreredusert SCP, og i løpet av den tid hvorunder tilsetningen utføres kan opp-slemmingen eller den vandige suspensjon være på en hvilken som helst temperatur mellom værelsetemperatur og den ønskede temperatur for peroksydbehandling. Temperaturen for peroksydbehandlingen kan i store trekk være fra ca. 40 til ca. 90°C og fortrinnsvis fra ca. 50 til ca. 90°C. Behandlingstiden ved temperaturen for peroksydbehandling kan være en hvilken som helst tid som er virksom for fremstilling av et SCP med redusert nuklein syreinnhold som har forbedret farge, smak og lukt. Fortrinnsvis er behandlingstiden 5-60 min. Fortrinnsvis blir peroksyd/SCP-oppslemmingen omrørt, underkastet agitasjon eller blandet for å gi god blanding.

Etter peroksydbehandlingen kan det peroksydbehandlede protein med redusert innhold av nukleinsyre separeres fra opp-slemmingen ved sentrifugering, filtrering, forstøvningstørking og lignende.

Det resulterende SCP-produkt har en lysere farge og forbedret farge- og smaksegenskaper sammenlignet med SCP som ikke er blitt behandlet med peroksyd.

Eksempel X

Et oppfinnelsesforsøk ble utført for å vise peroksydbehandlingen av SCP med redusert nukleinsyreinnhold for fremstilling av et forbedret SCP-produkt. En prøve av utløpsstrømmen fra gjæringsapparatet fra en aerob gjæring av Pichia pastoris NRRL Y-11430 i likhet med gjæringen som er beskrevet i eksempel I, ble behandlet med vandig NH^OH ved en pH-verdi på 9,5 og en temperatur på 90°C i 40 min for fjerning av en del av nukleinsyrene. Den resulterende blanding ble sentrifugert og 30 vektprosents vandig I^C^ble satt til produktfraksjonen for å bringe r^C^-konsentras jonen av produktf raks jonen på en sluttkonsentra-sjon på 0,06 vektprosent. Blandingen ble deretter varmet opp ved 6G°c i 15 min, avkjølt og tørket i et forstøvningstørkeapparat. Det resulterende SCP-pulver var lysere av farge, hadde mindre lukt og mindre gjærsmak enn SCP-pulver fremstilt uten hydrogen-peroksydbehandlingen.

Claims (10)

1. Fremgangsmåte til å redusere innholdet av nukleinsyre i encelleprotein,karakterisert ved at et fluidum inneholdende celler fremstilles ved gjæring av minst én art av en mikroorganisme under vandige gjæringsbetingelser, og at minst en del av den således produserte utløpsstrøm som utgjør den celleholdige væske fjernes, at det celleholdige fluidum varmes opp sammen med NH^OH ved en pH-verdi på 7-10 til en temperatur på 65-99°C, og at cellene separeres fra fluidet.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisertved at de således separerte celler tørkes for fjerning av vann og NH^OH for å gi et tørket encelleprotein-produkt.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1,karakterisertved at temperaturen ligger i området 85-90°C.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterise_rt ved at pH-verdien ligger i området 8,5-10, og mikroorganismen velges fra gjærsorter eller bakterier som kan gi gjæring under vandige gjæringsbetingelser.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 4,karakterisertved at gjærsorten velges fra slektene Candida, Hansenula, Torulopsis, Saccharomyces, Pichia, Debaryomyces, Lipomyces, Cryptococcus, Nematospora og Brettanomyces, eller at gjærsorten velges fra slektene Candida,Hansenula, Torulopsis og Saccharomyces , eller slektene Pichia og Hansenula, eller at mikroorganismen er en eller flere arter valgt fra den følgende gruppe:

eller at mikroorganismen fortrinnsvis er en eller flere slekter valgt fra:

eller at mikroorganismen er Pichia pastoris, eller at minst én av artene av mikroorganismene er Pichia pastoris og den nevnte pH-verdi ligger i området 9,25-10,0, eller at minst én av artene av mikroorganismene er Pichia pastoris NRRL Y-11430 og pH-verdien ligger i området 9,25-10,0 eller at gjæringen utføres ved en pH-verdi i området 3-5.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 2,karakterisertved at i det minste én av artene av mikroorganismene erHansenula polymorpha og pH-verdien ligger i området 8,8-9,6.

7. Fremgangsmåte som angitt i krav 3,karakterisertved at mikroorganismen er en slekt av en bakterie valgt fra Bacillus, Mycobacterium, Actinomyces,Nocardia, Pseudomonas, Methanomonas, Protaminobacter, Methylococcus, Arthrobacter, Methylomonas, Brevibacterium, Acetobacter, Micrococcus, Rhodopseudomonas, Corynebacterium, Microbacterium, Achromobacter, Methylobacter, Methylosinus og Methylocystis.

8. Fremgangsmåte som angitt i krav 7,karakterisert vedat mikroorganismen velges fra Bacillus, Pseudomonas, Protaminobacter, Micrococcus, Arthrobacter og Corynebacterium eller at mikroorganismen er én eller flere arter valgt fra gruppen:

eller at bakteriene er en termofil/blandet bakteriekultur betegnet som en blandet rase HTB-53 med deponeringsnummer NRRL B-8158, særlig hvor pH-verdien ligger i området 7-9,0 og særlig hvor gjæringen utføres ved en pH-verdi i området 6-7,5.

9. Fremgangsmåte til fremstilling av et encelleprotein-produkt,karakterisert vedat et celleprodukt bestående av mikrobielle celler oksyderes ved at det bringes i berøring med et oksydasjonsmiddel under oksydasjonsbetingelser og det således oksyderte celleprodukt separeres ut.

10. Fremgangsmåte som angitt i krav 9,karakterisert vedat celleproduktet består av celler fremstilt som angitt i et av kravene 1, 4, 5 eller 7, eller at oksydasjonsmiddelet er valgt fra hydrogenperoksyd, kaliumperoksyd, natrium-peroksyd, magnesiumperoksyd og kalsiumperoksyd, eller at oksydasjonsmiddelet er hydrogenperoksyd, eller at berøringen av celleproduktet med oksydasjonsmiddelet finner sted med celleproduktet i vandig suspensjon, eller at berøringen av celleproduktet med oksydasjonsmiddelet finner sted.med celleproduktet i vandig suspensjon med 1-30 g celler pr. 100 ml vandig suspensjon og oksydasjonsmiddelet er hydrogenperoksyd som foreligger i en mengde på 0,01-1 g pr. 100 ml vandig suspensjon, særlig hvor hydrogen-peroksydet foreligger i en mengde på ca. 0,06 vektprosent regnet på den vandige suspensjon, eller at celleproduktet bringes i berøring med oksydasjonsmiddelet i vandig suspensjon, idet berøringen i vandig suspensjon utføres ved en temperatur i området 40-90°C og berøringen i vandig suspensjon utføres over et tidsrom på 5-60 min, særlig hvor temperaturen ligger i området 50-90°C.