FR2585723A1 - Procede ameliore d'obtention de polysaccharides par fermentation - Google Patents

Abstract

AMELIORATION D'UN PROCEDE D'OBTENTION DE POLYSACCHARIDES PAR FERMENTATION FONGIQUE D'UNE SOLUTION AQUEUSE D'UN SUCRE A PH INITIAL DE 2 A 3; DES IONS NH SONT INTRODUITS DANS LE MILIEU DE TELLE MANIERE QUE CELUI-CI EN CONTIENNE, A TOUT MOMENT DE LA FERMENTATION, 10 A 10 PAR LITRE.

Description

L'invention se rapporte à des perfectionnements

dans la production de polysaccharides par voie microbiolo-

gique. Elle vise, plus particulièrement, l'obtention de

polysaccharides constitués par des polymères de glucopyra-

nose, par fermentation fongique de sucres. Les perfection- nements suivant l'invention permettent la préparation à l'aide de moisissures de tels polymères, et en particulier de ceux dans lesquels les groupes glucopyranose sont liés

par des liaisons (5-1,6 ou/et (-1,3, avec de bons rende-

ments et pratiquement sans formation simultanée d'acide oxa-

lique. Divers polysaccharides ont trouvé actuellement des applications industrielles dont certaines présentent

beaucoup d'importance. Ainsi les emploie-t-on dans des com-

positions aqueuses, cosmétiques, dans des peintures, des

préparations de diverses suspensions, en alimentation ani-

male, comme hypocholestérolémiant, etc. Une très importante application est l'utilisation de polysaccharides dans les boues de forage des puits de pétrole et dans la récupération

assistée du brut. Un type de polysaccharide, qui s'est révé-

lé particulièrement intéressant pour ces dernières utilisa-

tions, comprend les chaînes de polymères formées par des mo-

tifs de D-glucose reliés par des liaisons P -1,3 et portant, en outre, des groupes D-glucose attachés à la chaîne par des liaisons (-1,6. Ces composés ont donné lieu à de nombreux travaux, dont on peut lire les résultats, entre autres, dans le brevet US 3 301 848 qui décrit la fermentation de différents sucres à l'aide de microorganismes filamenteux,

tels que Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum, Corti-

cium rolfsii, Sclerotinia gladoli, Stromatinia narcissi et autres... Les scléroglucanes obtenus présentent des degrés de polymérisation d'environ 180 à 1600 et se prêtent à des

transformations chimiques par substitution des -OH par d'au-

tres groupes fonctionnels. A partir d'un milieu à 30g de saccharose par litre, contenant 0,5 à 3 g/l de chacun des sels NaNO3, K2HPO4, MgSO4, KCl et d'autolysat de levure, ainsi que 0,01 g/l de FeSO4, on obtient en quelques jours

de fermentation à 28 C, 8,2 g de scléroglucane par litre.

Ce procédé est industriellement viable, mais à c8té du poly-

saccharide on trouve de l'acide oxalique dont la présence

est gênante pour toutes les applications, et - en particu-

lier - dans la récupération assistée du pétrole brut, o la précipitation de l'oxalate de calcium boucherait les pores de la roche. On est donc obligé d'éliminer l'oxalate de la solution de polysaccharide obtenue par fermentation, et

cela grève les frais de fabrication. -

MAXWELL et BATEMAN, dans "Phytopatology"-58, n 10 (1968), pages 1351-1354, ont montré que, lors des

fermentations en question, il est possible de considérable-

ment réduire la formation d'acide oxalique par l'abaisse-

ment du pH initial du milieu de culture à 2,3 (page 1353, Tableau 3); les auteurs n'avaient toutefois pas mesuré la

concentration en scléroglucane lors de leurs expériences.

Les expériences sur lesquelles est fondé le présent brevet montrent qu'une simple diminution du pH initial en-dessous

de 2,5 ne permet pas d'abaisser suffisamment la concentra-

tion en acide oxalique, et influe de plus négativement sur

la production de scléroglucane. Ces mêmes expériences infir-

ment l'observation des précédents auteurs comme quoi le rem-

placement d'une partie du glucose par du glycérol se traduit par une baisse sensible de la teneur en acide oxalique. (Le glycérol n'est par ailleurs pas une bonne source de carbone et augmente le coût du procédé). En définitive, aucun des deux moyens, proposés dans cette technique antérieure, ne peut donner lieu à une application vraiment industrielle, et le problème de la présence de l'acide oxalique reste ainsi posé. La présente invention a pour objet la réduction très poussée, voire la suppression complète de la formation d'acide oxalique au cours de la fermentation de sucres en

vue de la production de polysaccharides par les microorga-

nismes cités dans le brevet U.S. 3 301 848. Elle permet no-

tamment d'obtenir des scléroglucanes de degré de polyméri-

sation voulu, par un procédé microbiologique similaire à celui du brevet US cité plus haut, avec une production ho-

raire par unité de volume de bouillon de culture aussi bon-

ne ou même meilleure, le produit étant pratiquement exempt d'oxalates.

Le perfectionnement, suivant l'invention, du pro-

cédé microbiologique décrit plus haut, utilise la connais-

sance de l'art antérieurence que le pH initial du milieu de

culture de la moisissure est bas, notamment de 2 à 3; ce-

pendant, il est caractérisé en ce que des ions NH+4 sont

introduits dans le milieu de telle manièreque celui-ci con-

tienne, à tout moment de la fermentation, 1x10 3 à 11x10-3

M/l et de préférence 3x10-3 à 6x10-3 iongrammes NH4 par li-

tre. Grâce à cette caractéristique la disparition de l'acide oxalique n'entraîne pas une chute de production du

polysaccharide.

Les ions ammonium peuvent être pris sous la forme d'un sel tel que NH4Cl, NH4NO3, (NH4)2S04, (NH4)2HP04,

(NH4)2S03 etc.; la forme préférée étant NH4Cl.

Etant donné l'épuisement des ions NH4 qui a lieu

au cours de la fermentation, une forme préférée de l'inven-

tion consiste à mettre dans le milieu la quantité adéquate de sel d'ammonium au départ, et d'en rajouter ensuite par portions, toutes les quelques heures, par exemple toutes les 6, 8, 10 ou 12 heures, de façon à respecter les teneurs indiquées plus haut. Une autre forme préférée consiste à introduire dans le milieu, en continu, le complément de NHl, en compensation de l'ammonium consommé, au fur et à mesure

que progresse la fermentation.

Bien que les différentes conditions spéciales, sus-

indiquées, soient applicables aux milieux nutritifs de la technique antérieure, pour réduire fortement la teneur en acide oxalique du produit de la fermentation, des résultats encore meilleurs sont obtenus lorsqu'on utilise des milieux modifiés suivant un trait particulier de l'invention. Il s'est en effet avéré que l'usage d'un milieu o tous les éléments sont des espèces chimiques parfaitement connues et

définies, par opposition aux milieux de l'art antérieur em-

ployant des extraits naturels complexes tels que l'autolysat de levure ou l'eau de trempage du mals (corn steep liquor), donne des résultats meilleurs dans le cadre du procédé de l'invention. Une caractéristique préférée de l'invention consiste donc à employer, pour la fermentation, le milieu suivant, dans lequel les concentrations sont exprimées en

gramme par litre.

Sucre, notamment glucose

K2HPO4....................

NH4NO3......................

KCl........................

MgSO4.7H20.................

FeSO4.7H20................. MnSO4.H20..................

ZnSO4. 7H20................

Thiamine................... Ions-NH4 par litre Tout comme dans la dé suivant l'invention peut ratures, notamment entre 15 En général Préféré

à 50 30 à 40

0,1 à 1,4 0,6 à 0,8

0,13 à 0,94 0,2 à 0,9

0 à 0,25 0,1 à 0,2

0,02 à 0,3 0,15 à 0,25

0,001-0,005 0,003-0,004

0,001-0,004 0,002-0,003

0,001-0,005 0,003-0,004

-2 _ 10-5 5x10-3_ 104

0,001-0,0100 0,0025-0,06

technique antérieure, le procé-

être réalisé à diverses tempé-

et 35 C, mais de préférence en-

tre 26 et 30 C. La fermentation étant aérobique, il y a

lieu d'aérer le milieu entre 0,1 et 1 volume d'air par vo-

lume de milieu et par minute et mieux entre 0,3 et 0,6.Il faut aussi agiter le milieu avec des vitesses croissantes (entre 150 et 700 tours/minute) au fur et à mesure qu'il

devient visqueux.

L'invention est illustrée non limitativement par des exemples de fermentation avec le champignon Sclerotium

rolfsii (souche ATCC 15206), dans des fermenteurs de 20 li-

tres (volume total),à 28 C, avec une vitesse d'agitation pro-

gressivement augmentée en fonction de la viscosité du mi-

lieu. Dans chaque cas, on préparait d'abord un inoculum par 48 à 72 heures de fermentation préalable du milieu voulu avec le champignon, dans un fermenteur de 2 litres ou bien

dans plusieurs fioles agitées rassemblées juste avant ino-

culation. Ensuite 1200 ml d'inoculum étaient introduits dans 13,8 litres de milieu préparé dans le fermenteur de litres et la fermentation était poursuivie durant 55 à

72 heures. On prélevait alors une fraction de la masse li-

quide homogène du fermenteur pour déterminer la somme mycé-

lium + polysaccharide, appelée "natif", par précipitation à l'alcool. La filtration d'une autre fraction de la masse liquide pour séparer mycélium et polysaccharide suivie de

la précipitation du filtrat (à l'alcool également), don-

naient la quantité de scléroglucane formé. D'autre part,

on dosait l'acide oxalique dans le surnageant après centri-

fugation d'une fraction du moût de fermentation par chroma-

tographie en phase liquide ou gazeuse et également au mo-

yen d'une sonde enzymatique constituée par une électrode

sensible à l'oxygène, entourée d'une membrane protéique con-

tenant de l'oxalate oxydase. On déterminait aussi la concen-

tration en sucre non consommé durant la fermentation.

EXEMPLE 1

La fermentation était conduite à la manière décri-

te dans le brevet US 3 301 848, en fermenteurs 20 litres ou bien en fioles agitées de 0,5 litre, mais avec le milieu complexe suivant (les teneurs sont données en g/l d'eau): glucose 35 corn steep liquor 4 (extrait de mais) NaNO3 1,6

* KH2PO4 0,8

35. MgSO4.7H20 1,2 vitamine B 1 5x103

pH initial 4,5.

Les résultats sont donnés au Tableau récapitulatif, à la fin des exemples, pour servir de comparaison avec ceux de l'inveniion.

EXEMPLE 2

On a opéré comme dans l'exemple 1, mais le pH

du milieu fut amené préalablement à 2,5.

EXEMPLE 3

Le milieu de l'exemple 2, à pH 2,5, fut addition-

né de 3 g/l de NH4Cl, soit 5,6 x10mole/l de NH+, toutes

les autres conditions étant les mêmes qu'à l'exemple 1.

EXEMPLE 4

Le mode opératoire général restant le même, on a remplacé le milieu de culture des exemples précédents par celui de l'invention (g/l): À glucose 35

K2HPO4 0,7

* NH4NO3 0,88

À KCl 0,15 20. MgSO4.7H20 0,20 FeSO4.7H20 3,66x103 MnSO4.H20 2,68x103 ZnSO4.7H20 3,56x10-3 Chlorhydrate de thiamine 10

+ -3

pH=2,5 NH4 = 11x103 mole/l EXEMPLE (résultats après l'exemple 6)

EXEMPLE 5

Le milieu à pH initial 4,5 est le même qu'à l'e-

xemple 1 sauf pour l'azote minéral ot le nitrate d'ammonium à 0,74 g remplace le nitrate de sodium. De plus, on ajoute 0,3 g/l de NH4Cl chaque fois que la concentration en ions NH+ dans le milieu tombe en dessous de 3x10-3 mole/litre, ce qui se produit trois ou quatre fois sur la durée totale

de la fermentation.

EXEMPLE 6

Le milieu à pH initial 2,5 est le même qu'à l'e-

xemple 4, mais on lui ajoute 0,3 g/l de NH4Cl chaque fois que la concentration en ions NH+ tombe en-dessous mole/l. Récapitulation des résultats TABLEAU 1: comparaison en fioles agitées(g/l) exemple Milieu Natif Scléro- 1 Technique connue 2 Technique connue 3 Technique connue + 3g/l NH4Cl 4 Nouveau pH 2,5 pH 4,5 pH 2,5 pH 2,5 glucane pur

12,3 7,3

11,4 6,2

7,4 12,7 2,2 8,7 de 3x10-3 Acide oxalique 1,5 0,7 0,5 0,5 TABLEAU 2: comparaison en

Exemple Milieu

fermenteurs 20 Natif 1 Technique connue pH 4,5 Technique connue pH 4,5 en cours + NH4Cl/de fermentation 4 Nouveau, pH 2,5 6 Nouveau, pH 2,5 + NH4Cl 16,1 17,3 ,7 19,6 La comparaisondes résultats en fioles de l'exemple 1 avec ceux de l'exemple 2 montre que l'abaissement du pH selon la technique connue n'est pas suffisant pour réduire la formation d'acide oxalique à l'état de traces. L'exemple 3 indique qu'une forte concentration en ions ammonium permet

de supprimer complètement la production d'acide oxalique.

Toutefois, une telle concentration entraîne également une

forte diminution de la production de scléroglucane. Il exis-

te cependant un moyen terme (en ce qui concerne la concentra-

tion en ions NH4 dans le milieu de fermentation) qui empê-

che la production d'acide oxalique sans avoir d'influence négative sur le rendement en polysaccharide. C'est ce qui est montré plus loin dans la comparaison en fermenteurs 20 1..

Scléro-

glucane pur (en g/l) 12,5 11,3 13,5 13,7 Acide oxalique 3,2 0,5 0,4

< 0,03

L'exemple 4 en fioles montre que la production de scléroglucane est au moins aussi bonne avec le nouveau

milieu et la formation d'acide oxalique nettement réduite.

La concentration finale en polysaccharide est d'une façon générale plus forte en fermenteurs 20 1 (o

les paramètres d'agitation et d'aération sont mieux con-

trô81és) qu'en fioles. La comparaison des résultats en fer-

menteurs 20 1 de l'exemple 1 avec ceux de l'exemple 5 mon-

tre que l'ajout d'ions ammonium en cours de fermentation

se traduit par une forte diminution, mais non la suppres-

sion totale, de la production d'acide oxalique, avec le mi-

lieu de l'art antérieur. L'adjonction contrôlée de NH4Cl au cours de la fermentation avec le nouveau milieu permet de supprimer totalement la production d'acide oxalique sans diminuer le rendement en scléroglucane. Il s'agit ici du

moyen terme dont il est question plus haut.

Claims (6)

REVENDICATIONS

1. Procédé de préparation de polysaccharide pratique-

ment sans formation d'oxalate, par fermentation fongique d'une solution aqueuse d'un sucre à pH initial de 2 à 3, caractérisé en ce que des ions NH+ sont introduits dans le milieu de telle manière que celui-ci contienne, à tout mo-

-3 - 3

ment de la fermentation, lx103 à 10x10-3 et de préférence

3x10-3 à 6x103 iongrammes de NH4 par litre.

2. Procédé suivant la revendication 1, dans lequel les ions NH4 sont apportés par un sel d'ammonium d'acide inorganique, en particulier chlorhydrate, nitrate, sulfate

ou phosphate.

3. Procédé suivant la revendication 1 ou 2, caracté-

risé en ce que les ions ammonium sont rajoutés au milieu

en différents moments de la fermentation.

4. Procédé suivant la revendication 3, caractérisé

en ce que les ions NHE sont apportés au milieu par l'in-

jection continue d'une solution de sel d'ammonium.

5. Procédé suivant une des revendications précéden-

tes, caractérisé en ce que les oligoéléments et vitamines du milieu de fermentation sont tous à l'état de composés

chimiques définis.

6. Procédé suivant une des revendications précéden-

tes, caractérisé en ce que le milieu de fermentation con-

tient, en g par litre, les Sucre, notamment glucose

K2HPO4

NH4NO3

KC1 MgSO4. 7H20 FeSO4. 7H20 MnSO4. H20 ZnSO4. 7H20 Thiamine Ions NH4 par litre composés suivants En général

à 50

0,1 à 1,4

0,13 à 0,94

0 à 0,25

0,02 à 0,3

0,001 - 0,005

0,001 - 0,004

0,001 - 0,005

-2 _ 10-5

Préféré

à 40

0,6 à 0,8

0,2 à 0,9

0,1 à 0,2

0,15 à 0,25

0,003 - 0,004

0,002 - 0,003

0,003 - 0,004

x10-3 - 10-4

0,001 - 0,0100 0,0025 - 0,06