DE3625868A1 - Verfahren zur herstellung von polysacchariden auf mikrobiologischem wege - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft Verbesserungen bei der Herstellung von Polysacchariden auf mikrobiologischem Wege. Insbesondere betrifft die Erfindung die Herstellung von Polysacchariden, die aus Polymeren von Glucopyranose bestehen, durch Pilzfermentation von Zuckern. Die erfindungsgemässen Verbesserungen ermöglichen unter Verwendung von Schimmelpilzen die Herstellung von derartigen Polymeren und insbesondere von Polymeren, bei denen die Glucopyranosegruppen durch β1,6- oder/und β-1,3-Bindungen verknüpft sind, wobei gute Ausbeuten erzielt werden und die gleichzeitige Bildung von Oxalsäure praktisch unterbleibt.

Für verschiedene Polysaccharide gibt es gegenwärtig industrielle Anwendungsmöglichkeiten, von denen einige besonders wichtig sind. Beispielsweise werden sie in wässrigen Zusammensetzungen, Kosmetika, Anstrichmitteln, Präparationen von verschiedenen Suspensionen, zur Tierfütterung, als Mittel bei Hypocholesterinämie und dergl. verwendet. Ein besonders wichtiges Einsatzgebiet ist die Verwendung von Polysacchariden in Erdölbohrlöchern und bei der Rohölgewinnung. Ein Polysaccharidtyp, der für die letztgenannten Einsatzgebiete besonders geeignet ist, umfasst Polymerketten, die durch D-Glukose-Struktureinheiten, die über β-1,3-Bindungen verknüpft sind, gebildet sind und die unter anderem D-Glucosegruppen, die über β-1,6-Bindungen mit der Kette verknüpft sind, tragen. Über derartige Verbindungen gibt es zahlreiche Arbeiten, über deren Ergebnisse man beispielsweise in der US-PS 33 01 848 nachlesen kann, worin die Fermentation von unterschiedlichen Zuckern mit Hilfe von filamentösen Mikroorganismen, wie Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum, Corticium rolfsii, Sclerotinia gladoli, Stromatinia narcissi und dergl., beschrieben ist. Die erhaltenen Scleroglucane weisen einen Polymerisationsgrad von etwa 180 bis 1600 auf und können durch Substitution der OH-Gruppen durch andere funktionellen Gruppen chemisch umgewandelt werden. Aus einem Medium mit 30 g Saccharose pro Liter, das jeweils 0,5 bis 3 g/Liter NaNO₃, K₂HPO₄, MgSO₄, KCl und Hefeautolysat sowie 0,01 g/Liter FeSO₄ enthält, erhält man nach einer Fermentation (Züchtung) von einigen Tagen bei 28°C 8,2 g Scleroglucan pro Liter. Dieses Verfahren ist grosstechnisch anwendbar, ist jedoch mit dem Nachteil behaftet, dass neben dem Polysaccharid Oxalsäure gebildet wird, was bei sämtlichen Einsatzgebieten und insbesondere bei der Rohölgewinnung, wo die Ausfällung von Calciumoxalat eine Verstopfung von Gesteinsporen bewirkt, stört. Man muss daher dafür Sorge tragen, dass aus der durch Fermentation erhaltenen Polysaccaridlösung das Oxalat entfernt wird, was sich auf die Herstellungskosten auswirkt.

Maxwell und Bateman weisen in "Phytopatology" Bd. 58, Nr. 10 (1968), S. 1351-1354 nach, dass es bei der in Frage stehenden Fermentation möglich ist, die Bildung von Oxalsäure erheblich zu verringern, indem man den ursprünglichen pH-Wert des Züchtungsmediums auf 2,3 absenkt (vergl. S. 1353, Tabelle 3). Jedoch haben die Autoren bei ihren Untersuchungen die Konzentration an Scleroglucan nicht gemessen. Untersuchungen, die zur vorliegenden Erfindung führten, haben gezeigt, dass eine einfache Verringerung des ursprünglichen pH-Werts unter 2,5 es nicht ermöglicht, die Konzentration an Oxalsäure in ausreichendem Masse abzusenken, und dass eine derartige Senkung des pH-Werts sich noch negativer auf die Bildung von Scleroglucan auswirkt. Durch diese Untersuchungen ist die Beobachtung der vorstehenden Autoren bestätigt worden, wonach bei einem Ersatz eines Teils der Glucose durch Glycerin eine spürbare Verringerung des Gehalts an Oxalsäure erzielt wird (Glycerin stellt aber ansonsten keine günstige Kohlenstoffquelle dar und erhöht die Produktionskosten). Somit ist schliesslich keiner der beiden Wege, die im vorgenannten Stand der Technik empfohlen werden, für eine tatsächliche grosstechnische Anwendung geeignet, so dass die durch die Anwesenheit von Oxalsäure gegebenen Schwierigkeiten noch nicht gelöst sind.

Aufgabe der Erfindung ist es, bei der Fermentation von Zuckern zur Bildung von Polysacchariden unter Verwendung der in der US-PS 33 01 848 genannten Mikroorganismen die Bildung von Oxalsäure erheblich zu verringern oder vollständig zu unterdrücken. Insbesondere sollen nach einem mikrobiologischen Verfahren, das dem der vorgenannten US-PS ähnlich ist, Sclerogulcane vom gewünschten Polymerisationsgrad erhalten werden, wobei die Produktion pro Stunde und pro Volumeneinheit der Kulturbrühe im Vergleich zum bekannten Verfahren ebenso gut oder sogar besser ist und das Produkt praktisch frei von Oxalaten anfällt.

Die erfindungsgemässe Verbesserung des vorerwähnten mikrobiologischen Verfahrens folgt insoweit dem Stand der Technik, als der anfängliche pH-Wert des Züchtungsmediums des Schimmelpilzes nieder ist und insbesondere 2 bis 3 beträgt. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass dem Medium NH₄⁺-Ionen in solcher Weise zugesetzt werden, dass zu jedem Fermentationszeitpunkt 1 × 10^-3 bis 11 × 10^-3 M/l und vorzugsweise 3 × 10^-3 bis 6 × 10^-3 Grammionen NH₄⁺ pro Liter enthalten sind.

Aufgrund des vorgenannten Merkmals ist mit dem Ausbleiben der Oxalsäurebildung keine Verringerung der Polysaccharidbildung verbunden.

Die Ammoniumionen können in Salzform, z. B. NH₄Cl, NH₄NO₃, (NH₄)₂SO₄, (NH₄)₂HPO₄, (NH₄)₂SO₃ und dergl., vorliegen und vorzugsweise in Form von NH₄Cl.

Da im Verlauf der Fermentation ein Verbrauch an NH₄⁺-Ionen stattfindet, besteht eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung darin, dass man dem Medium zu Beginn die angemessene Menge an Ammoniumsalz zusetzt und anschliessend alle paar Stunden, beispielsweise nach 6, 8, 10 und 12 Stunden, portionsweise weiteres Ammoniumsalz zusetzt, um den vorstehend genannten Gehalt an Ammoniumionen einzuhalten. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens besteht darin, dass man dem Medium kontinuierlich NH₄⁺ zusetzt und entsprechend dem Fermentationverlauf die verbrauchten Ammoniumionen ersetzt.

Obgleich die vorerwähnten verschiedenen Spezialbedingungen für die Nährmedien des Stands der Technik zur starken Verringerung des Gehalts an bei der Fermentation gebildeter Oxalsäure geeignet sind, lassen sich noch wesentlich bessere Ergebnisse erzielen, wenn man Medien verwendet, die gemäss einem speziellen Merkmal der Erfindung modifiziert sind. Es hat sich herausgestellt, dass die Verwendung eines Mediums, in dem sämtliche chemischen Bestandteile genau bekannt und definiert sind (im Gegensatz zu den gemäss dem Stand der Technik verwendeten Medien, die komplexe natürliche Extrakte wie Hefeautolysat oder Maisquellflüssigkeit enthalten) im Rahmen des erfindungsgemässen Verfahrens zu wesentlich besseren Ergebnissen führen. Ein bevorzugtes Merkmal der Erfindung besteht somit in der Verwendung des nachstehend aufgeführten Fermentationsmediums, wobei die Konzentrationen in g pro Liter angegeben sind.

Wie beim Stand der Technik kann das erfindungsgemässe Verfahren bei verschiedenen Temperaturen durchgeführt werden, insbesondere im Bereich von 15 bis 35°C und vorzugsweise im Bereich von 26 bis 30°C. Da die Fermentation aerob verläuft, ist es zweckmässig, das Medium mit 0,1 bis 1 Volumenteil Luft pro Volumenteil des Mediums und pro Minute zu belüften, wobei ein bevorzugtes Belüftungsverhältnis 0,3 bis 0,6 beträgt. Ferner ist es entsprechend der sich einstellenden viskosen Beschaffenheit des Mediums erforderlich, das Medium mit zunehmender Geschwindigkeit zu rühren (von 150 bis 700 U/min).

Nachstehend wird die Erfindung anhand von Beispielen zur Züchtung mit dem Pilz Sclerotium rolfsii (Stamm ATCC 15206) erläutert, wobei Fermenter mit einem Gesamtvolumen von 20 Liter verwendet werden. Die Temperatur beträgt 28°C. Die Rührgeschwindigkeit wird in Abhängigkeit von der Viskosität des Mediums zunehmend gesteigert. In sämtlichen Fällen wird zunächst durch eine 48- bis 72-stündige vorherige Fermentation des gewünschten Mediums mit dem Pilz in einem Fermenter mit 2 Liter Fassungsvermögen oder in mehreren bewegten Flaschen, deren Inhalt unmittelbar vor der Überimpfung vereinigt wird, ein Inokulum hergestellt. Anschliessend werden 1200 ml des Inokulums in 13,8 Liter Medium, das in einem 20 Liter fassenden Fermenter bereitgestellt worden ist, eingeführt. Die Züchtung wird 55 bis 72 Stunden fortgesetzt. Sodann wird eine Fraktion der homogenen flüssigen Masse aus dem Fermenter entnommen, um die Summe aus Myzel + Polysaccharid - als "nativ" bezeichnet - durch Fällung mit Alkohol zu bestimmen. Nach Filtration einer weiteren Fraktion der flüssigen Masse zur Abtrennung von Myzel und Polysaccharid unter anschliessender Fällung des Filtrats (ebenfalls mit Alkohol) erhält man die Menge an gebildetem Scleroglucan. Ferner wird der Oxalsäuregehalt im Überstand nach Zentrifugation einer Fraktion des Fermentationsprodukts chromatographisch in flüssiger oder gasförmiger Phase bestimmt. Eine derartige Bestimmung wird auch mittels einer enzymatischen Sonde durchgeführt, die aus einer sauerstoff- empfindlichen Elektrode besteht, die mit einer Schutzmembran, die Oxalatoxidase enthält, umgeben ist. Schliesslich wird auch die Konzentration des während der Fermentation nicht verbrauchten Zuckers ermittelt.

Beispiel 1

Die Züchtung wird gemäss US-PS 33 01 848 in 20 Liter fassenden Fermentern oder in 0,5 Liter fassenden Schüttelflaschen unter Verwendung des nachstehend angegebenen Mediums (die Mengenangaben beziehen sich auf g/Liter Wasser) durchgeführt.

Die Ergebnisse sind in nachstehender Tabelle wiedergegeben und erlauben einen Vergleich mit den erfindungsgemässen Beispielen.

Beispiel 2

Man verfährt wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, dass der pH-Wert des Mediums vorher auf 2,5 eingestellt wird.

Beispiel 3

Das Medium von Beispiel 2 mit einem pH-Wert von 2,5 wird mit 3 g/Liter NH₄Cl, d. h. 5,6 × 10^-2 Mol/Liter NH₄⁺, versetzt, wobei sämtliche übrigen Bedingungen gleich wie in Beispiel 1 sind.

Beispiel 4

Das allgemeine Verfahren wird beibehalten, wobei man aber das Kulturmedium der vorstehenden Beispiele durch das nachstehend angegebene erfindungsgemässe Medium ersetzt (g/Liter).

Beispiel 5

Das Medium mit einem ursprünglichen pH-Wert von 4,5 ist das gleiche wie in Beispiel 1, mit der Abänderung, dass als mineralischer Stickstoff anstelle von Natriumnitrat 0,74 g Ammoniumnitrat verwendet werden. Ferner werden immer dann, wenn die Konzentration an NH₄⁺-Ionen im Medium unter 3 × 10^-3 Mol/Liter abfällt, 0,3 g/Liter NH₄Cl zugesetzt. Dieser Zusatz erfolgt 3 oder 4 mal während des gesamten Fermentationsverlaufs.

Beispiel 6

Das Medium mit einem ursprünglichen pH-Wert von 2,5 entspricht dem Medium von Beispiel 4, wobei aber 0,3 g/Liter NH₄Cl jedesmal dann zugesetzt werden, wenn die Konzentration an NH₄⁺-Ionen unter 3 × 10^-3 Mol/Liter fällt.
Ergebnisse

Tabelle I

Tabelle II

Ein Vergleich der Ergebnisse in Schüttelflaschen gemäss Beispiel 1 einerseits und Beispiel 2 andererseits zeigt, dass eine Verminderung des pH-Werts entsprechend dem Stand der Technik nicht ausreicht, um eine Verringerung der Oxalsäure auf Spurenmengen zu erreichen. Beispiel 3 zeigt, dass eine hohe Konzentration an Ammoniumionen eine vollständige Unterdrückung der Oxalsäurebildung ermöglicht. Jedoch bringt eine derartige Konzentration an Ammoniumionen auch eine starke Verringerung der Bildung an Scleroglucan mit sich. Es gibt in Bezug auf die Konzentration an NH₄⁺-Ionen im Fermentationsmedium einen mittleren Konzentrationsbereich, bei dem die Bildung an Oxalsäure verhindert wird, ohne dass sich ein nachteiliger Einfluss auf die Polysaccharidausbeute ergibt. Dies ergibt sich auch aus einem Vergleich der in Fermentern mit 20 Liter Fassungsvermögen durchgeführten Beispiele.

Das in Schüttelkolben durchgefühte Beispiel 4 zeigt, dass die Bildung von Scleroglucan im erfindungsgemässen Medium mindestens ebenso gut wie bei bekannten Verfahren ist und dass sich eine deutliche Verringerung an gebildeter Oxalsäure ergibt.

Die Endkonzentration an Polysaccharid ist in Fermentern mit 20 Liter Fassungsvermögen (wo die Rühr- und Belüftungsbedingungen besser kontrollierbar sind) im allgemeinen höher als in den Flaschen. Ein Vergleich der Ergebnisse mit Fermentern von 20 Liter Fassungsvermögen von Beispiel 1 mit den Ergebnissen von Beispiel 5 zeigt, dass gemäss dem Stand der Technik zwar eine starke Verringerung aber keine vollständige Unterdrückung der Bildung an Oxalsäure erreichbar ist. Durch eine kontrollierte Zugabe an NH₄Cl während des Fermentationsverlaufs ist es beim erfindungsgemässen Medium möglich, die Oxalsäurebildung vollständig zu unterdrücken, ohne dass die Ausbeute an Scleroglucan verringert wird. Es handelt sich hiermit um den mittleren Bereich, von dem vorstehend die Rede gewesen ist.

Claims (6)

1. Verfahren zur Herstellung von Polysacchariden praktisch ohne Oxalatbildung, bei dem man eine Pilzfermentation in einer wässrigen Lösung eines Zuckers bei einem anfänglichen pH-Wert von 2 bis 3 durchführt, dadurch gekennzeichnet, dass dem Medium NH₄⁺-Ionen in solcher Weise zugesetzt werden, dass zu jedem Fermentationszeitpunkt 1 × 10^-3 bis 10 × 10^-3 und vorzugsweise 3 × 10^-3 bis 6 × 10^-3 Grammionen NH₄ pro Liter enthalten sind.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die NH₄⁺-Ionen in Form eines Ammoniumsalzes einer anorganischen Säure, insbesondere als Hydrochlorid, Nitrat, Sulfat oder Phosphat, zugesetzt werden.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Ammoniumionen dem Medium zu verschiedenen Fermentationszeitpunkten zugesetzt werden.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, dass die NH₄⁺-Ionen dem Medium durch kontinuierliches Einspritzen einer Lösung des Ammoniumsalzes zugesetzt werden.

5. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Spurenelemente und Vitamine des Fermentationsmediums alle als chemisch definierte Verbindungen vorliegen.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass das Fermentationsmedium die nachstehend aufgeführten Verbindungen in den in g/Liter angegebenen Mengen enthält: