NO863065L - Fremgangsmaate for fremstilling av polysakkarider ved gjaering. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse vedrører en fremgangsmåte for fremstilling av polysakkarider praktisk uten dannelse av oksalat, ved fungal gjæring av én vandig oppløsning av et sukker med initial pH 2 til 3,karakterisert vedat NH<*>ioner innføres i blandingen slik at under gjæringen inneholder blandingen lxlO<-3>til llxlO"<3>og. foretrukket 3xl0"<3>til 6xl0~<3>gramioner NH<*>per liter.

Disse og andre treff ved oppfinnelsen fremgår av patentkrav-ene.

Oppfinnelsen vedrører således forbedringer ved fremstilling av polysakkarider ved hjelp av mikrobiologiske prosesser og vedrører mer spesielt fremstilling av polysakkarider omfattende polymerer av glukopyranose ved fungal gjæring av sukkerarter. Oppfinnelsen tillater fremstilling av slike polymerer ved hjelp av gjærsopp og spesielt slike polymerer hvori glukopyranosegruppene er forbundet ved hjelp av 1,6 og/ eller [1-1,3 bindinger, med gode utbytter og praktisk uten samtidig dannelse av oksalsyre.

Forskjellige polysakkarider har oppnådd industriell anvendelse og noen av dem er svært viktige. De anvendes således i vandige kosmetiske preparater, i malinger, i preparater omfattende forskjellige suspensjoner, i dyreforstoffer, som hypokolesterolmidler etc. En meget viktig anvendelse er utnyttelsen av polysakkaridene i boreslam ved petroleums-boring og assistert utvinning av råolje. En type av polysakkarid som har vist seg særlig interessant for disse sist-nevnte anvendelser omfatter kjeder av polymerer tildannet av enheter av D-glukose forbundet med -1,3 bindinger og som også bærer D-glukosegrupper knyttet til kjeden ved hjelp av P -1,6 bindinger. Disse forbindelser har ført til omfattende undersøkelser hvor resultatene blant annet er gjengitt i US patentskrift 3301848 som beskriver gjæring av forskjellige sukkerarter ved hjelp av trådformede mikroorganismer som f.eks. Sclerotium rolfsii, Sclerotium glucanicum, Corticium rolfsii, Sclerotinia gladoli, Stromatinia narcissi etc. De scleroglukaner som oppnås har polymerisasjonsgrader på om-trent 180 til 1600 og undergår kjemiske omdannelser ved erstatning av OH med andre funksjonelle grupper. Fra et medium omfattende 30 g sakkarose per liter og inneholdende 0,5 til 3 g/l av hver av saltene NaNO^, K2HP04,

MgS04, KC1 og gjærautolysat, såvel som 0,01 g/l FeSO^

oppnås ved flere døgns gjæring ved 28°C 8,2 g scleroglukan per liter. Denne prosess er industrielt gjennomførbar, men i tillegg til polysakkaridet dannes også oksalsyre og nærværet av denne er uønskelig for alle anvendelser og spesielt ved assistert utvinning av råpetroleum hvor utfelling av kalsium-oksalat blokkerer porene i bergarten. Det er således nødven-dig å fjerne oksalatet fra polysakkaridoppløsningen som oppnås ved gjæringen og dette øker fremstillingsomkostningene.

MAXWELL og BATEMAN, i "Phytopathology", 58, nr. 10 (1968), sidene 1351-1354 har vist at ved angjeldende gjæringstyper er det mulig å redusere dannelsen av oksalsyre i betraktelig grad ved å nedsette den initiale pH i dyrkingsmediet til 2,3 (side 1353, tabell 3). Forfatterne har imidlertid ikke målt konsentrasjonen av scleroglukan under disse forsøk. Forsøk hvorpå den forleiggende oppfinnelse er basert viser at en enkel nedsettelse av initial pH under 2,5 ikke tillater at konsentrasjonen av oksalsyre kan reduseres i tilstrekkelig grad og vil negativt påvirke fremstillingen av scleroglukan. De samme forsøk bekrefter iakttagelsen av de tidligere for-fattere at erstatning av en del av glukosen med glyserol gir en vesentlig reduksjon i oksalsyreinnholdet (glyserol er imidlertid ikke noen god karbonkilde og øker omkostningene ved prosessen).. Ingen av disse to foranstaltninger som er foreslått tidligere kan praktisk gi grunnlag for noen ekte industriell anvendelse og problemet med nærvær av oksalsyren eksisterer fremdeles.

Formålet med den foreliggende oppfinnelse er således i vesentlig grad å redusere eller endog fullstendig eliminere dannelsen av oksalsyre under gjæring av sukkerarter for fremstilling av polysakkarider ved hjelp av de mikroorganismer som er angitt i US patentskrift 3301848. Spesielt tillater oppfinnelsen fremstilling av scleroglukaner med ønsket poly-merisasjonsgrad ved hjelp av mikrobiologisk prosess liknende prosessen i det ovennevnte US patentskrift, med en fremstil-lingskapasitet per time per volumenhet dyrkingsmedium like så god som tidligere eller endog større, idet produktet samtidig er praktisk fritt for oksalater.

Forbedringen i samsvar med oppfinnelsen utnytter den tidligere kjente kunnskap om at den initiale pH i dyrkningsmediet for gjærsoppen skal være lav, spesielt fra 2 til 3 men er dertilkarakterisert vedat NH^ionene innføres, i mediet på en slik måte at under gjæringsperioden inneholder den lxlO<-3>til llxlO"<3>M/l og foretrukket 3xl0~<3>til

-3 -v

6x10 gramioner NH^per liter.

På grunn av dette forhold bevirker fjernelsen av oksalsyren ikke et fall i fremstillingen av polysakkaridet.

Ammoniumionene kan tilveiebringes i form av et salt som Nh4Cl, NH4N03, (NH4)2S04, (NH^HPC^,

(Nr^^SO^ etc. idet den foretrukne form er NH4C1.

På bakgrunn av forbruket av NH4ioner under gjæringen består en foretrukket form for oppfinnelsen i at det i mediet innføres en adekvat mengde ammoniumsalt initialt og at det tilsettes ytterligere mengder med få timers mellomrom, f.eks. hver 6, 8, 10 eller 12 time, for å holde det ovenfor angitte nivå. En annen foretrukket form består i å innføre kontinuerlig den mengdeandel av NH4i mediet som kompenserer for forbruket av ammonium, alt i samsvar med gjæringstakten.

Mens de forskjellige spesielle betingelser angitt i det foregående kan anvendes for næringsmedier av tidligere kjent type for betraktelig nedsettelse av oksalsyreinnholdet i gjærings- produktet oppnås ennå bedre resultater når man anvender gjaeringsmedier som er modifisert i samsvar med en spesiell utførelsesform av oppfinnelsen. Det er påvist at bruken av et medium hvor alle komponenter er fullstendig kjente og definerte kjemiske spesier, i motsetning til tidligere kjente media som anvender komplekse naturlige ekstrakter, som gjærautolysat eller kornstøpvaeske, gir bedre resultater innenfor rammen for oppfinnelsen. Et foretrukket trekk ved oppfinnelsen består således i å anvende følgende medium for gjæringen hvori konsentrasjonene er uttrykt i gram per liter.

Som tidligere kan fremgangsmåten i henhold til oppfinnelsen gjennomføres ved forskjellige temperaturer, spesielt mellom 15 og 35°C, men foretrukket mellom 26 og 30°C. Da gjæringen er aerob luftes mediet med 0,1 til 1 volum luft per volum medium og per minutt og foretrukket med 0,3 til 0,6. Det er nødvendig å omrøre mediet med økende hastigheter (mellom 150 og 700 omdreininger/minutt) i avhengighet av den oppnådde viskositetsgrad.

Oppfinnelsen illustreres ved hjelp av eksempler på gjæring med soppen Sclerotium rolfsii (ATCC stamme 15206) i 20 liters gjæringskar (totalt volum) ved 28°C, med en omrøringshas-tighet som progressivt økes som en funksjon av viskositeten av mediet. I hvert tilfelle fremstilles først et inokulat ved 48 til 72 timers foreløpig gjæring av det ønskede medium med soppen i en 2 liters gjæringsbeholder eller foretrukket i flere beholdere som sammenrøres umiddelbart før inokulering-en. Deretter innføres 1200 ml inokulat i 13,8 liter av mediet fremstilt i det 20 liters gjæringskar og gjæringen fortsettes i 55 til 72 timer. En fraksjon av det homogene flytende material fjernes fra gjæringskaret for å bestemme summen av mycel + polysakkarid benevnt "nativt" ved utfelling med alkohol. Filtrering av en annen fraksjon av den flytende masse for å separere mycel og polysakkarid etterfulgt av utfelling av filtratet (også med alkohol) gir den mengde av scleroglukan som er dannet. På den annen side måles oksalsyre i supernatantvæsken etter sentrifugering av en fraksjon av gjæringsmosten ved hjelp av kromatografering i flytende eller gassformet fase og også ved hjelp av en enzymatisk prøvetager som utgjøres av en elektrode som er sensitiv for oksygen, omgitt av en proteinmembran som inneholder oksalat-oksydase. Konsentrasjonen av sukker som ikke er forbrukt under gjæringen bestemmes derved.

EKSEMPEL 1

Gjæringen gjennomføres på den måte som er beskrevet i US patentskrift 3301848 i 20 liters gjæringskar eller i omrørte 0,5 liters gjæringskar, men med følgende sammensatte medium (inneholdene er gitt i g/l vann):

initial pH er 4,5.

Resultatene er gitt i oppsummeringstabellen i slutten av eksemplene for sammenlikning med resultatene fra oppfinnelsen .

EKSEMPEL 2

Man går frem som i eksempel 1 men pH i mediet ble først inn-stilt til 2,5.

EKSEMPEL 3

Mediet i eksempel 2 med pH 2,5 ble tilveiebrakt med 3 g/l NH4C1 eller 5. 6xl0~2 mol/l NH^, idet alle andre betingelser var som i eksempel 1.

EKSEMPEL 4

Arbeidsmåten forble generelt den samme men dyrkingsmediet i de foregående eksempler ble erstattet med dyrkingsmediet i samsvar med oppfinnelsen (g/l):

pH=2,5 (NH4= 11x10 3 mol/l

resultater etter eksempel 6)

EKSEMPEL 5

Mediet med initial pH 4,5 var det samme som i eksempel 1 med unntagelse av at uorganisk nitrogen, ammoniumnitrat med 0,74 g erstattet natriumnitratet. Også 0,3 g/l NH^Cl ble tilsatt hver gang konsentrasjonen av NhJ" ioner i mediet falt under 3x10 mol per liter som foregitt tre eller fire ganger under hele varigheten av gjæringen.

EKSEMPEL 6

Mediet med initial pH 2,5 var det samme som i eksempel 4 med 0,3 g/l Nh^Cl ble tilsatt mediet hver gang konsentrasjonen av NH<*>ioner falt under 3xl0<-3>mol/l.

Oppsummering av resultater

Sammenlikning av resultatene i de omrørte småbeholdere i eksempel 1 med resultatene i eksempel 2 viser at reduksjonen av pH i samsvar med tidligere kjent teknikk ikke er tilstrekkelig til å redusere dannelsen av oksalsyre til spormengde-nivået. Eksempel 3 indikerer at en høy konsentrasjon av ammoniumioner tillater fullstendig undertrykkelse av fremstillingen av oksalsyre. En slik konsentrasjon frembringer imidlertid også en vesentlig reduksjon i fremstillingen av scleroglukan. Dette er imidlertid et mediannivå (med hensyn til konsentrasjonen av NH^ ioner i gjæringsmediet) som inhiberer produksjonen av oksalsyre uten å ha noen negativ innvirkning på utbyttet av polysakkarid. Dette er vist bedre i sammenlikningen i de 20 liters gjæringskar.

Eksempel 4 som anvender små beholdere viser at fremstillingen av scleroglukan er minst like så god med det nye medium og dannelsen av oksalsyre er vesentlig redusert.

Den endelige konsentrasjon av polysakkarid er generelt høyere

.i de 20 liters gjæringskar (hvor parametere med omrøring og lufting styres bedre) enn i småbeholdere. Sammenlikning av resultatene i 20 liters gjæringskar i eksempel 1 med resul-

tåtene i eksempel 5 viser at tilsetningen av ammoniumioner under gjæringen frembringer en betraktelig reduksjon men ikke total undertrykkelse i fremstillingen av oksalsyre, med tidligere kjent gjæringsmedium. Den styrte tilsetning av NH^Cl under gjæringen med det nye medium tillater total undertrykkelse av fremstillingen av oksalsyre uten å redusere utbyttet av scleroglukan^. Dette er basert på mediannivået nevnt i det foregående.

Claims (6)

1. Fremgangsmåte for fremstilling av polysakkarider praktisk uten dannelse av oksalat, ved fungal gjæring av den vandige oppløsning av et sukker med initial pH 2 til 3, karakterisert ved at NH <*> ioner innføres i mediet slik at under gjæringen inneholder dette 1x10 til 11x10 og foretrukket 3x10 til 6x10 gramioner NH^ per liter.

2. Fremgangsmåte som angitt i krav 1, karakterisert ved at NH^ ionene tilføres ved hjelp av et ammoniumsalt av en uorganisk syre, spesielt saltsyre, salpetersyre, svovelsyre eller fosforsyre.

3. Fremgangsmåte som angitt i krav 1 eller 2, karakterisert ved at ammoniumionene tilsettes mediet ved forskjellige tidspunkter under gjæringen.

4. Fremgangsmåte som angitt i krav 3, karakterisert ved at NH^ ionene tilsettes mediet ved kontinuerlig injeksjon av en oppløsning av et ammoniumsalt.

5. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-4, karakterisert ved at oligoelementer og vitaminer i gjasringsmediet alle er i form av kjemisk veldefinerte forbindelser.

6. Fremgangsmåte som angitt i krav 1-5, karakterisert ved at det anvendes et gjæringsmedium som i g/l inneholder følgende forbindelser: