DE2436188A1 - Verfahren zur herstellung von zeaxanthin - Google Patents
Verfahren zur herstellung von zeaxanthinInfo
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Description
.-hg. O. Vüe&fiausen ι ü. Juii 1974
V/:rlsrirr.ayorsi^Sa 4S
TcJ. (ü 8ώ) Ü9 ei 25
TcJ. (ü 8ώ) Ü9 ei 25
Societe des Produits Nestle S.A., Vevey / Schweiz
"Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin"
Die Erfindung bezieht sich, auf ein Verfahren zur Herstellung von
Zeaxanthin durch Kultivierung eines dieses Pigment erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Flavobacter, bei welchem der Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert wird, das mindestens
ein Kohlehydrat als assimilierbare Kohlenstoffquelle, mindestens eine assimilierbare Aminostickstoffquelle mit einem Gehalt an
freien Aminosäuren, Mineralsalze, Spurenelemente und Vitamine
enthält.
Das als Zeaxanthin (3>3'-Dihydroxy-ß-carotin) bezeichnete gelbe
Pigment kann beispielsweise als Zusatz zum Futter von Hühnern verwendet werden, um die gelbe Farbe der Haut dieser Tiere oder
die Färbung des Eigelfis zu verstärken. Dieser Stoff kann aber
auch als Färbemittel beispielsweise in der kosmetischen und
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in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden.
Die Synthese von Pigmenten durch gewisse Mikroorganismen, insbesondere von Carotinpigmenten durch Bakterien von der
Gattung Flavobacter, ist allgemein bekannt. Jedoch erweist sich die industrielle Herstellung dieser Pigmente durch
Biosynthese im allgemeinen schwierig. Außerdem machen die erhaltenen Ausbeuten, die häufig sehr gering sind, die Verwendung
beträchtlicher Mengen Kulturmedium nötig, um größere Mengen Pigment herzustellen.
Es ist auch bekannt, dem Kulturmedium Mineralsalze, Spurenelemente
und Vitamine oder andere Stoffe zuzusetzen, welche das Wachstum der Mikroorganismen und die Bildung von Produkten
ihres Metabolismus begünstigen. Jedoch reicht auch bei Verwendung solcher angereicherter Kulturmedien die Bildung des
Zeaxanthins nicht aus, um das Verfahren rentabel zu gestalten.
Der vorliegenden Erfindung lag nunmehr die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Biosynthese
zu schaffen, welches eine beträchtlich erhöhte Ausbeute an diesem Pigment ermöglicht, ohne daß die Betriebskosten wesentlich
erhöht werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren 1st dadurch gekennzeichnet, daß
man das Spektrum der Aminosäuren im Medium derart verändert, daß der Gehalt mindestens einer schwefelhaltigen Aminosäure aus der
Gruppe Methionin, Cystin und Cystein im Verhältnis zum Gehalt der anderen Aminosäuren im Medium erhöht wird, wobei die Menge
des Methionine und/oder Cystine und/oder Cysteine, die dem
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Medium zugegeben wird, 1 mg/ml nicht überschreitet, und daß
man die Kultivierung solange fortsetzt, bis eine beträchtliche Menge intracellulares Zeaxanthin gebildet worden ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren gestattet die Erzielung von
erhöhten Ausbeuten gegenüber den bekannten Verfahren, wobei die Zunahme je nach der Durchführungsweise beispielsweise
bis zu einem Faktor von vier gehen kann. Die Ausbeutezunahme führt natürlich zu einer beträchtlichen Abnahme der Produktionskosten.
Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man
als assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose oder Saccharose in einer Menge von 0,1 bis 15 Gew.-J, bezogen auf das Kulturmedium,
und als assimilierbare Aminostickstoffquelle einen Hefeextrakt und/oder einen Maisauszug und/oder ein Proteinhydrolysat
in einer Menge von 0,1 bis 8 Gew.-X, bezogen auf das Kulturmedium, verwenden. Man kann außerdem in das Kulturmedium
Magnesiumsulfat in einer Menge von 0,1 bis 2 Gew.-ί
einverleiben. Alle oben genannten Stoffe werden beispielsweise mit einer Menge destillierten Wassers verdünnt, die die Differenz
auf 100 Gew.-i ausmacht.
Man kann das Spektrum der Aminosäuren des Kulturmediums dadurch modifizlerens daß man Methionin und/oder Cystin und/oder Cystein
in der angegebenen Menge in der L- und/oder D- und/oder DL-Form zugibt. Vorzugsweise wird der Gehalt an Methionin und/oder Cystin
und/oder Cystein im Kulturmedium auf 3 bis 10% des Gehalts der anderen Aminosäuren im Kulturmedium eingestellt.
Man kann zu der so hergestellten Nährlösung dann ein Inoculum
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eines Zeaxanthin erzeugenden Mikroorganismus von der Gattung Flavobacter zugeben. Mit dem Ausdruck "Mikroorganismus von
der Gattung Flavobacter"ist hier ein Mikroorganismus gemeint,
der aus den Bakterien dieser Gattung oder den Mutanten dieses Mikroorganismus ausgewählt ist. Das Fermentationsverfahren kann
unter fortlaufender Rührung und Belüftung und bei einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Temperatur während einer
Zeit ausgeführt werden, die nötig 1st, daß eine beträchtliche Menge intracellulares Zeaxanthin gebildet wird. Hierauf kann
man, gegebenenfalls nach einer Konzentrierung der Kulturbouillon, das Zeaxanthin aus den Zellen mit Hilfe eines polaren organischen
Lösungsmittels, wie z.B. Aceton, Äthylalkohol oder einem chlorhaltigen Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, Extrahieren.
Es ist auch möglich, die Biomasse vom Kulturmedium durch beispielsweise Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abzutrennen
und die Biomasse, so wie sie 1st, als Zusatz zum Futter von Hühnern zu verwenden oder mit Hilfe eines polaren
organischen Lösungsmittels einer Extraktion zu unterwerfen.
Es hat sich gezeigt, daß die Konzentration an Zeaxanthin in
einer auf diese Welse hergestellten Biomasse Insgesamt höher
liegt (beispielsweise um 5OJt höher) als die Konzentration,
die durch Kultivierung des gleichen Mikroorganismus in einem bekannten Nährmedium erhalten wird. Es ist welter darauf hinzuweisen,
daß diese Erhöhung keine Funktion der der Grundnährlösung zugesetzten absoluten Menge an Methionin und/oder Cystin
und/oder Cystein sondern seiner relativen Menge 1st, d.h. seiner Menge im Verhältnis zur Menge der in der Grundnährlösung oder
Im Kulturmedium anwesenden Aminosäuren. Es hat sich aber gezeigt,
daß ein Hemmungseffekt eintritt, wenn der Gehalt an schwefelhaltigen Aminosäuren Im Kulturmedium auf einen zu hohen Wert gebracht
wird. Dies 1st der Grund, warnm die Menge des Methionine
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und/oder Cystine und/oder Cysteine, die dem Nährmedium zugegeben
wird, auf einen Wert von nicht mehr als 1 mg/ml geschränkt wurde.
Es wurde weiterhin festgestellt, daß ein ähnlicher Effekt erzielt wird, wenn man der Grundnährlösüng mindestens eines
der zweiwertigen Metallionen Fe ,Co , Mn und Mo zugibt. Ohne Zusatz mindestens einer der erwähnten schwefelhaltigen
Aminosäuren führt dieser Effekt zu einer Erhöhung der Konzentration an Zeaxanthin in der Biomasse bis zu 50% und zu einer
Zunahme der Biomasse ebenfalls bis zu 50$, was also eine Verdoppelung
der Bildhng an Zeaxanthin im Verhältnis zu der Menge bedeutet, die durch Kultivierung des gleichen Mikroorganismus
in einem bekannten Nährmedium erzielt wird.
So wird also gemäß einer Ausführungsform das Spektrum der Oligoelemente
im Kulturmedium durch Zusatz mindestens eines der zweiwertigen Metallionen Fe ,Co , Mn und Mo modifiziert,
wobei die Menge der Ionen Fe und/oder Co und/oder Mn und/ oder Mo , die dem Medium zugesetzt wird, auf einen Wert von
nicht mehr als 0,2 m beschränkt ist, um einen Hemmungseffekt zu vermeiden. Vorzugsweise werden von den erwähnten Metallionen
Mengen von 0,0005 bis 0,1 m zugegeben. Es ist besonders vorteilhaft, Mengen der genannten Mfetallionen zwischen 0,001 und
0,05 πι zuzusetzen. Die erwähnten Metallionen können in Form
von gut löslichen Salzen zugesetzt werden, wie z.B. als Eisen-(II)-sulfat, Eisen(II)-Chlorid, Kobaltchlorid, Natriummolybdat
oder Mangansulfat. Vorzugsweise wird als Aminosäure Methionin und als Metallion Fe zugegeben.
Beim gleichzeitigen Zusatz* mindestens einer der erwähnten schwe-
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feihaltigeη Aminosäuren und mindestens eines der erwähnten
Metallionen ist ein Synergismus festzustellen. Die Bildung des Zeaxanthins kann in diesem Fall das Vierfache zu der
Menge erreichen, die durch Kultivierung des gleichen Mikroorganismus in einer bekannten Nährlösung erzielt wird. Der
Teil der Zunahme, der auf eine Vermehrung der Konzentration des Zeaxanthins in der Biomasse zurückzuführen ist, gegenüber
dem Teil, der auf eine Vermehrung der Biomasse selbst zurückzuführen ist, liegt nur in der Größenordnung von 20£.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert.
Es wird ein Kulturmedium der folgenden Zusammensetzung hergestellt:
Glucose 3%
Kaseinhydrolysat (Trypton) 1%
Hefeextrakt ' IJIf
Magnesiumsulfat 0>ü>£
destilliertes Wasser auf lOOJt
Dieses Medium wird in Flaschen eingebracht, hierauf 20 min bei 1200C sterilisiert und schließlich auf 25°C abgekühlt. Der
pH des Mediums beträgt nach der Sterilisation 7»3· Dann wird
in das Medium ein Inoculum eines Mutanten vom Stamm ATCC No. 21588 der Gattung Flavobacter eingebracht. Die Kultivierung
dieses Mikroorganismus wird in dem genannten Medium 48 st bei
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einer Temperatur von 250C durchgeführt, wobei das Medium
durch fortlaufendes Bewegen der Flaschen auf einem mit 200 U/min laufenden Drehschüttler belüftet wird. Die Flaschen werden
dann zentrifugiert, worauf die Zellenmasse abgetrennt wird. Sie beträgt 10,5 g Trockenfeststoffe Je 1 Kulturbouillon.
Die in den Zellen enthaltene Menge Zeaxanthin wird durch Extraktion des Pigments und Messung der optischen Dichte
des Extrakts bestimmt..Zur Herstellung des Extrakts wird zunächst eine Suspension der Zellen in 5 ml Salzwasser hergestellt,
dann ein gleiches Volumen Aceton zugegeben, einige Minuten geschüttelt und anschließend filtriert. Dann wird
die optische Dichte des Filtrats in einem Spektralphotometer bei 450 nm gemessen. Die Zeaxanthinmenge wird durch Vergleich
der gemessenen optischen Dichte mit einer Eichkurve bestimmt, die durch Messen der optischen Dichte mehrerer Lösungen mit
verschiedenen Gehalten an reinem Zeaxanthin erhalten worden ist.
Das gleiche Extraktionsverfahren und die gleiche Messung wird mit mehreren Proben der gleichen Kultur durchgeführt. Aus diesen
Resultaten wird der Durchschnittswert gebildet. Die so ermittelte Menge des in den Zellen enthaltenen Zeaxanthins oder die
"spezifische Konzentration" beträgt bei dieser Bestimmungsweise 5,16 mg je g Zellenmasse, was eine Bildung von 5^>2,ug Zeaxanthin
Je ml Kulturbouillon bedeutet. Diese Werte haben eine Genauigkeit von jt 3—5%.
Die folgenden Beispiele sind in Form einer Tabelle angegeben. In der Spalte mit der Überschrift "Art der Behandlung" ist
die dem Kulturmedium zugesetzte Substanz wie auch die zugesetzte Menge angegeben. Diese Menge ist in g Aminosäure je
Nährmedium und in molarer Ionenkonzentration angegeben. In der mit "Zeaxanthin" überschriebenen Spalte.ist die Menge Zeaxanthin
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genannt, die iri/Ug/ml Kulturbouillon erhalten worden ist. In
der Spalte mit der Überschrift "Zellenmasse" ist die Menge
an Trockenfeststoffen angegeben, die in g je 1 Bouillon gebildet worden ist. In der Spalte mit der Überschrift "spezifische
Konzentration" ist die Menge Zeaxanthin genannt, welche in den gebildeten Zellen in mg Zeaxanthin Je g Trockenfeststoffe
enthalten ist.
Die Durchführung entspricht in Jedem Fall den Angaben von
Beispiel 1. Die Zugabe der schwefelhaltigen Aminosäure und/oder
des zweiwertigen Metallions erfolgt kurz, vor dem Einbringen des Inoculums oder vor der Sterilisation des Mediums. Die
Werte über die Bildung der Zellenmasse und des Zeaxanthins sind auch hier wie in Beispiel 1 mit einer Genauigkeit von +_ 3-5#
zu verstehen. Sie stellen arithmetische Mittelwerte von Resultaten dar, die mit 3-10 Proben der gleichen Kultur erhalten
worden sind.
In den letzteren Beispielen wurden einige Veränderungen des
Grundmediums und der Natur des Inoculums vorgenommen, um sicher zustellen, daß der Erfolg des Verfahrens nicht von einer bestimmten
Zusammensetzung des Mediums oder vom Verhalten eines bestimmten Mutanten abhängt. Dies 1st der Grund, warum im
Beispiel 20 das Grundmedium 2% Hefeextrakt und 1% Trypton enthielt,
im Beispiel 21 das Grundmedium 1% Hefeextrakt und 2% Trypton enthielt und im Beispiel 22 der verwendete Mutant nicht
der gleiche war, wie er in den anderen Beispieleß verwendet wur de.
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| Art der | -9- . | 0,002 | Zeaxanthin | 2436188 | - spezifi | |
| Zusatz | Behandlung | 0,01 | ,ug/ml | sche Kon zentration mg/g |
||
| Beispiel | nichts | Konzentration g/l molar |
0,001 | 54,2 | Zellen | 5,16 |
| Methionin | 0,002 | 65,8 | masse g/l |
6,14 | ||
| 1 | Methionin | 0,06 | 0,002 | 77,0 | 10,5 | 9,27 |
| 2 | Methionin | 0,12 | 72,0 | 10,7 | 9,47 | |
| 3 | Methionin | 0,24 | 0,002 | 50,3 | 8,3 | 8,24 |
| 4 | Cystin | 0,H8 | 71,4 | 7,6 | 6,2 | |
| 5 | Cystein | 0,12 | 0,01 | 73,0 | 6,1 | 6,75 |
| 6 | Fe++ | 0,12 | 118,8 | 11,5 | 8,19 | |
| 7 | Fe++ | 0,002 | 124,4 | 10,8 | 9,01 | |
| 8 | Co++ | 0,002 | 91,4 | 14,5 | 9,23 | |
| 9 | Mo+ + | 88,0 | 13,8 | 8,38 | ||
| 10 | Mn++. | 0,002 | 86,0 | 9,9 | 7,41 | |
| 11 | Methionin | 10,5 | ||||
| 12 | Fe++ | 0,001 | 168 | 11,6 | 14,48 | |
| 13 | Methionin | 0,12 | 0,002 | |||
| Fe+* | 188 | 11,6 | 19,5 | |||
| 14 | Cystein | 0,12 | 0,002 | |||
| Fe++ | 151,4 | 9,6 | 10,8 | |||
| 15 | Cystin Fe | 0,12 | 0,002 | 143,2 | 10,3 | |
| Methionin | ++ 0,12 | 13,9 | ||||
| 16 | Mn++ | 0,002 | 146,4 | 14,0 | 9,8 | |
| 17 | Methionin | 0,12 | ||||
| Co+ + | 131,1 | 14,8 | 11,3 | |||
| 18 | Cystin Mn | 0,12 | 134,6 | 10,6 | ||
| Methionin | ++ 0,12 | 11,6 | ||||
| 19 | Fe+* | 156,4 | 12,6 | 11,67 | ||
| 20 | Methionin | 0,12 | ||||
| Fe++ | 165,0 | 13,4 | 12,5 | |||
| 21 | Methionin | 0,12 | ||||
| Fe++ | 168,0 | 13,2 | 13,2 | |||
| 22 | 0,12 | |||||
| 12,7 | ||||||
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Claims (8)
1) Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Kultivierung eines dieses Pigment erzeugenden Mikroorganismus von der
Gattung Flavobacter, bei welchem der Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert wird, das mindestens ein Kohlehydrat
als assimilierbare Kohlenstoffquelle, mindestens eine freie Aminosäuren enthaltende assimilierbare Aminostickstoffquelle,
Mineralsalze, Spurenelemente und Vitamine enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man das Spektrum der Aminosäuren
des Mediums modifiziert, so daß der Gehalt mindestens einer schwefelhaltigen Aminosäure aus der Gruppe Methionin, Cystin
und Cystein im Verhältnis zum Gehalt der anderen Aminosäuren im Medium erhöht wird, wobei die Menge des Methionine und/oder
Cystins und/oder Cysteins, die dem Medium zugegeben wird, 1 mg/ml nicht überschreitet, und daß man die Kultivierung solange fortsetzt,
bis eine beträchtliche Menge intracellulares Zeaxanthin gebildet worden ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als
Kohlehydrat Glucose oder Saccharose in einer Menge von 0,1 bis I^ Gew.-it, bezogen auf das Medium, verwendet und daß man die
Aminosäuren in Porm eines Hefeextrakts und/oder einee Maisauszugs
und/oder eines Proteinhydrolysats in einer Menge von 0,1 bis 8 Gew.-Jt, bezogen auf das Medium, verwendet.
3.Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Medium Magnesiumsulfat in einer Menge von 0,1 bis 2 Gew.-Jf,
enthält.
4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das
Methionin und/oder Cystin und/oder Cystein in der L- und/oder D- und/oder DL-Form zugesetzt wird.
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5. Verfahren nach Anspruch h, dadurch gekennzeichnet, daß der
Gehalt des Mediums an Methionin und/oder Cystin und/oder Cystein 3 bis 10ί des Gehalts des Mediums an anderen Aminosäuren
beträgt.
6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß Spektrum der Oligoelemente des Mediums verändert wird, indem
der Gehalt des Mediums an mindestens einem der zweiwertigen Metallionen Fe ,Co , Mo und Mn erhöht wird, wobei die
Menge der dem Medium zugesetzten Ionen Fe und /oder Co und/oder Mo und/oder Mn einen Wert von 0,2 molar nicht
überschreitet.
7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Menge der zugesetzten Metallionen Fe + und/oder Co und/oder
Mo + und/oder Mn + zwischen 0,0005 und 0,1 molar liegt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die erwähnte Menge der zugesetzten Metallionen zwischen 0,001 und
0,05 molar liegt.
9· Verfahren nach Anspruch 5 und einem der Ansprüche 6 bis 8,
dadurch gekennzeichnet, daß als Aminosäure Methionin und als Metallion Fe " zugesetzt wird.
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