DE2436189C3

DE2436189C3 - Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin

Info

Publication number: DE2436189C3
Application number: DE2436189A
Authority: DE
Inventors: Mariette Suzanne Catherine Orbe Carels; Jaroslav Yverdon Dasek; David Morges Shepherd
Original assignee: Societe des Produits Nestle SA
Current assignee: Societe des Produits Nestle SA
Priority date: 1973-07-26
Filing date: 1974-07-26
Publication date: 1978-05-03
Also published as: BE816767A; PL93397B1; CA1038316A; DK388874A; DE2436189B2; FR2238757B1; AU7142474A; DK140484C; IT1017451B; SE420506B; US3951743A; CH572981A5; DK140484B; SE7409224L; FR2238757A1; SU562204A3; JPS5042090A; DE2436189A1; GB1467303A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Kultivierung eines dieses Pigment erzeugenden Mikroorganismus der Gattung Flavobacter, bei welchem der Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert wird, das mindestens ein Kohlehydrat als assimilierbare Kohlenstoffquelle, mindestens eine freie Aminosäure entnaltende assimilierbare Aminostickstoffquelle, Mineralsalze, Spurenelemente und Vitamine enthält.

zeichnete gelbe Pigment kann beispielsweise als Zusatz zum Futter von Hühnern verwendet werden, um die gelbe Farbe der Haut dieser Tiere oder die Färbung des Eigelbs zu verstärken. Dieser Stoff kann aber auch als Färbemittel beispielsweise in der kosmetischen und in der Nahrungsmittelindustrie verwendet werden.

Die Synthese von Zeaxanthin durch Kultivierung eines Mikroorganismus von der Gattung Flavobacter ist beispielsweise aus der DT-OS 21 38 000 bekannt. Zur

ίο Erhöhung der Ausbeute an Zeaxanthin können gemäß dieser Literaturstelle verschiedene Zusatzstoffe zugegeben werden, wie z. B. Mineralsalze, Spurenelemente und Vitamine. Als ein mögliches Vitamin wird auch Pyridoxin erwähnt. Es hat sich jedoch erwiesen, daß auch bei Verwendung solcher angereicherter Kulturmedien die Bildung des Zeaxanthins nicht ausreicht, um das Verfahren rentabel zu gestalten.

Um zu höheren Bildungen von Zeaxanthin zu gelangen, ist es aus der FR-OS 21 58 2% bekannt, bei der Erzeugung von Zeaxanthin durch Kultivierung von Bakterien der Gattung Flavobacter ganz enge Konzentrationsgrenzen bei der Kohlenstoff- und Stickstoffquelle einzuhalten, so daß während der Kultivierung eine laufende Zugabe dieser Stoffe und eine ständige

Überwachung des Nährmediums erforderlich ist. Dieses Verfahren erlaubt zwar die Erzeugung von mehr Zeaxanthin, welche jedoch durch eine umständlichere Arbeitsweise erkauft wird.

Der vorliegenden Erfindung lag nunmehr die Aufgabe

ίο zugrunde, ein Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Biosynthese zu schaffen, welches eine beträchtlich erhöhte Ausbeute an diesem Pigment ermöglicht, ohne daß die Betriebskosten wesentlich erhöht werden.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man bei einem Verfahren der eingangs skizzierten Art die Zusammensetzung des Mediums durch Zugabe von Pyridoxin und mindestens einer der zweiwertigen Metallionen Fe⁺ +, Co^{+ +}, Mo^{+ +} und Mn⁺ +, wobei die Menge der zugesetzten Ionen einen Wert von 0,2molar nicht überschreitet, und/oder mindestens einer der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin, Cystein und Cystin, wobei die Menge der dem Medium zugesetzten schwefelhaltigen Aminosäure 1 mg/ml nicht überschreitet, modifiziert.

Die vorliegende Erfindung basiert auf der Feststellung, daß durch die gemeinsame Verwendung von Pyridoxin einerseits und einem der zweiwertigen Metallionen Fe⁺+, Co⁺+, Mo⁺+ und Mn ⁺ + und/oder einer der Aminosäuren Methionin, Cystein und Cystin andererseits eine wesentlich höhere Ausbeute an Zeaxanthin erhalten werden kann. Die Zunahme der Ausbeute an Zeaxanthin kann bis zu 200% gehen, wodurch natürlich die Produktionskosten beträchtlich verringert werden. Der Teil der Zunahme, der auf eine Vermehrung der Konzentration des Zeaxanthins in der Biomasse zurückzuführen ist, überwiegt den Teil, der auf eine Vermehrung der Biomasse selbst zurückzuführen ist, welche nur in der Größenordnung von 10% liegt.

fto Für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann man als assimilierbare Kohlenstoffquelle Glucose oder Saccharose in einer Menge von 0,1 bis 15Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, und als assimilierbare Aminostickstoffquelle einen Hefeextrakt und/oder einen Maisauszug und/oder ein Proteinhydrol >sat in einer Menge von 0,1 bis 8 Gew.-%, bezogen auf das Kulturmedium, verwenden. Man kann außerdem in

Das als Zeaxanthin (3'3-Dihydroxy-/»-carotin) be- das Kulturmedium Magnesiumsulfat in einer Menge von

0,1 bis 2 Gcw.-% einverleiben. Alle obengenannten Stoffe werden beispielsweise mit einer Menge destillierten Wassers verdünnt, die die Differenz auf 100Gew.-% ausmacht.

Man kann die Zusammensetzung des Mediums modifzieren, indem man das Pyridoxin in einer Menge von 0,1 bis l^g/ml zusetzt. Vorzugsweise wird das Pyridoxin in einer Menge von 0,1 bis 0,3 μg/ml zugegeben.

Wenn jedoch der Gehalt an Pyridoxin im Medium auf einem zu hohen Wert gehalten wird, dann wird eine Hemmung festgestellt Selbstverständlich wird ein Fachmann keine ungeeignet hohe Menge Pyridoxin, sondern lediglich eine wirksame Menge zugeben, so daß sie beispielsweise innerhalb der oben angegebenen bevorzugten Grenzen liegt.

Die Menge der zweiwertigen Metallionen Fe⁺ \ Co⁺+, Mn^t+ und Mo⁺⁺ ist auf einen Wert von nicht mehr als 0,2-m beschränkt, um einen Hemmungseffekt zu vermeiden. Vorzugsweise werden von den erwähnten Metallionen Mengen von 0,0005- bis 0,1 -m zugegeben. Es ist besonders vorteilhaft. Mengen der genannten Metallionen zwischen 0,001- und 0,05-m zuzusetzen. Die Metallionen können in Form von gut löslichen Salzen zugesetzt werden, wie z. B. als Eisen(Il)-sulfat, Eisen(II)-chlorid, Kobaltchlorid, Natriummolybdatoder Mangansulfat.

Die Menge der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin, Cystin und Cystein ist auf einen Wert von 1 mg/ml beschränkt, um einen Hemmungseffekt zu vermeiden. Bevorzugt wird dem Medium eine schwefelhaltige Aminosäure in einer Menge von 50 bis 500 μg/ml zugesetzt. Es wird besonders bevorzugt, 100 bis 200 μg/ml zuzugeben.

Vorzugsweise ist das zugesetzte Metallion Fe^{+ +} und die zugesetzte Aminosäure Methionin.

Man kann zu der so hergestellten Nährlösung dann ein Inoculum eines Zeaxanthin erzeugenden Mikroorganismus von der Gattung Flavobacter zugeben. Mit dem Ausdruck »Mikroorganismus von der Gattung Flavobacter« ist hier ein Mikroorganismus gemeint, der aus den Bakterien dieser Gattung oder den Mutanten dieses Mikroorganismus ausgewählt ist. Das Fermentationsverfahren kann unter fortlaufender Rührung und Belüftung und bei einem geeigneten pH-Wert und einer geeigneten Temperatur während einer Zeit ausgeführt werden, die nötig ist, daß eine beträchtliche Menge intracellulares Zeaxanthin gebildet wird. Hierauf kann man, gegebenenfalls nach einer Konzentrierung der Kulturbouillon, das Zeaxanthin aus den Zellen mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels, wie z. B. Aceton, Äthylalkohol oder einem chlorhaltigen Lösungsmittel, beispielsweise Chloroform, extrahieren. Es ist auch möglich, die Biomasse vom Kulturmedium durch beispielsweise Zentrifugieren, Dekantieren oder Filtrieren abzutrennen und die Biomasse, so wie sie ist, als Zusatz zum Futter von Hühnern zu verwenden oder mit Hilfe eines polaren organischen Lösungsmittels einer Extraktion zu unterwerfen.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele fto näher erläutert. Die Beispiele 1, 2 und 3 dienen zum Vergleich.

Beispiel 1

(Vergleich) ^h?

Es wird ein Kulturmedium der folgenden Zusammen-

Glucose 3%

Kaseinhydrolysat (Trypton) 1 %

Hefeextrakt 1 %

Magnesiumsulfat 0,5%

Destilliertes Wasser auf 100%

Dieses Medium wird in Flaschen eingebracht, hierauf 20 min bei 120⁰C sterilisiert und schließlich auf 25°C abgekühlt. Der pH des Mediums beträgt nach der Sterilisation 7,3. Dann wird in das Medium ein Inoculum eines Mutanten vom Stamm ATCC N. 21 588 der Gattung Flavobacter eingebracht. Die Kultivierung dieses Mikroorganismus wird in dem genannten Medium 48 st bei einer Temperatur von 25° C durchgeführt, wobei das Medium durch fortlaufendes Bewegen der Flaschen auf einem mit 200 U/min 'laufenden Drehschüttler belüftet wird. Die Flaschen werden dann zentrifugiert, worauf die Zellenmasse abgetrennt wird. Sie beträgt 10,3 g Trockenfeststoffe je 1 Kuiturbouillon.

Die in den Zellen enthaltene Menge Zeaxanthin wird durch Extraktion des Pigments und Messung der optischen Dichve des Extraktes bestimmt. Zur Herstellung des Extrakts wird zunächst eine Suspension der Zellen in 5 ml Salzwasser hergestellt, dann ein gleiches Volumen Aceton zugegeben, einige Minuten geschüttelt und anschließend filtriert. Dann wird die optische Dichte des Filtrats in einem Spektralphotometer bei 450 nm gemessen. Die Zeaxanthinmenge wird durch Vergleich der gemessenen optischen Dichte mit einer Eichkurve bestimmt, die durch Messen der optischen Dichte mehrerer Lösungen mit verschiedenen Gehalten an reinem Zeaxanthin erhalten worden ist.

Das gleiche Extraktionsverfahren und die gleiche Messung wird mit mehreren Proben der gleichen Kultur durchgeführt. Aus diesen Resultaten wird der Durchschnittswert gebildet. Die so ermittelte Menge des in den Zellen enthaltenen Zeaxanthins oder die »spezifische Konzentration« beträgt bei dieser Bestimmungsweise 6,1 mg je g Zellenmasse, was eine Bildung von 62,4 μg Zeaxanthin je ml Kulturbouillon bedeutet. Diese Werte haben eine Genauigkeit von ±3-5%.

Die folgenden Beispiele sind in Form einer Tabelle angegeben. In der Spalte mit der Überschrift »Art der Behandlung« ist die dem Kulturmedium zugesetzte Substanz wie auch die zugesetzte Menge angegeben. Diese Menge ist in mg Pyridoxin und/oder Aminosäure je 1 Nährmedium und in molarer Ionenkonzentration angegeben. In der mit »Zeaxanthin« überschriebenen Spalte ist die Menge Zeaxanthin genannt, die in μg/ml Kulturbouillon erhalten worden ist. In der Spalte mit der Überschrift »Zellenmasse« ist die Menge an Trockenfeststoffen angegeben, die in g je I Bouillon gebildet worden ist. In der Spalte mit der Überschrift »spezifische Konzentration« ist die Menge Zeaxanthin genannt, welche in den gebildeten Zellen in mg Zeaxanthin je g Trockenfeststoffe enthalten ist.

Die Durchführung entspricht in jedem Fall den Angaben von Beispiel 1. Die Zugabe des Pyridoxins zum Medium erfolgt kurz nach der Sterilisation. Die Zugabe des zweiwertigen Metallions und/oder der Aminosäure erfolgt kurz vor der Einführung des Inoculums oder vor der Sterilisation des Mediums. Die Werte über die Bildung der Zellenmasse und des Zeaxanthins sind auch hier wie in Beispiel 1 mit einer Genauigkeit von ±3 — 5% zu verstehen. Sie stellen arithmetische Mittelwerte von Resultaten dar, die mit 3—10 Proben der gleichen Kultur erhalten worden sind.

In den letzteren Beispielen wurden einige Veränderungen des Grundmediums und der Natur des Inoculums vorgenommen, um sicherzustellen, daß der Erfolg des Verfahrens nicht von einer bestimmten Zusammensetzung des Mediums oder vom Verhalten eines bestimmten Mutanten abhängt So enthielt in

Beispiel 8 das Grundmedium 2% Hefeexirakt und 1% Trypton und in Beispiel 9 das Grundmedium 1% Hefeextrakt und 2% Trypton. Im Beispiel 10 war der verwendete Mutant nicht der gleiche wie in den anderen Beispielen.

Beispiel	Art der Behandlung	Konzentration	molar	Zeaxanthin	I	Zellenmasse	Spezifische
	Zusatz	mg/1			1		iN-onz-cniraiiun
				μ§/>ηΙ	\ 183,7	g/l	mg/g
1 (Vergl.)	nichts	0,2	0,01	62,4		10,3	6,1
2 (Vergl.)	Pyridoxin		1 0,01 J	83,8	12,7	6.6
3 (Vergl.)	Fe+ +	0,2		109,6	13,4	8.2
4	Pyridoxin Fe+ +	0,2 120		130,4	11,6	11,2
5	Pyridoxin Methionin	0,2	0,01	97,6	7.2	13,5
6	Pyridoxin
	Fe+ +	120		187.4	11,4	16.4
	Methionin	0,5	0,01
7	Pyridoxin
	Fe⁺^	120		126	11.3	IU
	Methionin	0,2	0,01
8	Pyridoxin
	Fe+ +	120		178,5	11.3	15,8
	Methionin	0.2	0,1
9	Pyridoxin
	Fe+ +	120		175,8	10,9	16,1
	Methionin	0,2	0,01
10	Pyridoxin
	Fe + +	120	11,2	16,4
	Methionin

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Zeaxanthin durch Kultivierung eines dieses Pigment erzeugenden Mikroorganimus von der Gattung der Flavobacter, bei welchem der Mikroorganismus in einem Nährmedium kultiviert wird, das mindestens ein Kohlehydrat als assimilierbare Kohlenstoffquelle, mindestens eine freie Aminosäuren enthaltende assimilierbare Aminostickstoffquelle, Mineralsalze, Spurenelemente und Vitamine enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man die Zusammensetzung des Mediums durch Zugabe von Pyridoxin und mindestens eines der zweiwertigen Metallionen Fe⁺⁺, Co^{+ +}, Mo+* und Mn⁺⁺, wobei die Menge der zugesetzten Ionen einen Wert von 0,2molar nicht überschreitet, und/oder mindestens einer der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin, Cystein und Cystin, wobei die Menge der dem Medium zugesetzten schwefelhaltigen Aminosäure 1 mg/ml nicht überschreitet, modifiziert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Kohlehydrat Glucose oder Saccharose in einer Menge von 0,1 bis 15Gew.-%, bezogen auf das Medium, verwendet, daß man die Aminosäuren in Form eines Hefeextrakts und/oder eines Maisauszugs und/oder eines Proteinhydrolysate in einer Menge von 0,1 bis 8 Gew.-%, bezogen auf das Medium, verwendet und daß das Medium Magnesiumsulfat in einer Menge von 0,1 bis 2 Gew.-o/o enthält.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pyridoxin in einer Menge von 0,1 bis 1 μg/ml zusetzt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß man das Pyridoxin in einer Menge von 0,1 bis 0,3 μg/ml zusetzt.

5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß r.ian die zweiwertigen Metallionen in einer Menge zwischen 0,0005- und 0,1-molar zusetzt.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß man die zweiwertigen Metallionen in einer Menge zwischen 0,001 - und 0,05molar zusetzt.

7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man die schwefelhaltige Aminosäure in einer Menge von 50 bis 500 μg/ml zusetzt.

8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß man die schwefelhaltige Aminosäure in einer Menge von 100 bis 200 μg/ml zusetzt.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß man als Metallion Fe⁺⁺ und als Aminosäure Methionin zusetzt.