DE2016569B2 - Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glukose zu Fructose - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose in Glucose enthaltenden Flüssigkeiten, bei welchem die Ausbildung von Verfärbungen in den Flüssigkeiten während der Isomerisierung verringert wird.

Der Hauptverwendungszweck von Glukose und von Glukose enthaltendem Maissirup liegt bei der Verarbeitung von Lebensmitteln, beispielsweise beim Backen, sowie in der Getränke- und Konserven-Industrie, um ein Süßen zu erzielen oder um das Kristallwachstum zu regulieren. Da jedoch der Glukose ein hoher Süßigkeitsgrad von Haus aus mangelt und sie einen relativ milden Geschmack hat, sind ihre Verwendungszwecke etwas eingeschränkt Diesen Nachteil kann man bis zu einem gewissen Ausmaß dadurch überwinden, daß man Glukose oder Maissirup mit Rohrzucker oder Invertsirup vermischt, um die Süßigkeit zu steigern. Dieses Vorgehen hat sich jedoch auf Grund von wirtschaftlichen und anderen Faktoren als nicht ganz zufriedenstellend erwiesen. Es wurde erkannt, daß, wenn es gelänge während der Herstellung von Maissirupen und anderen Glucose enthaltenden Sirupen einen signifikanten Teil der Glukose in Fruktose umzuwandeln, Sirupe erhalten werden könnten, die süß genug sind, um auch anderen Zwecken zu dienen.

Es ist seit langem bekannt daß Glukose in Fruktose umgewandelt werden kann, wenn man Glukose enthaltende Flüssigkeiten, wie Maissirup, in Gegenwart eines alkalischen Katalysators erhitzt Auf Grund der Unselektivität der alkalischen Katalysatoren werden jedoch verschiedene störende Nebenprodukte gebildet, beispielsweise große Mengen von gefärbten Körpern und von sauren Stoffen. Die Reinigung der mit Alkali isomerisierten Flüssigkeiten, um die störenden Nebenprodukte daraus zu entfernen, erfordert jedoch ziemlich komplizierte und teuere Reinigungsmaßnahmen. Aus diesen Gründen hat die alkalische Isomerisierung bis jetzt keine praktische Bedeutung erlangt, was wahrscheinlich auf die wirtschaftlichen Verhältnisse bei der Raffinierung der mit Alkalien isomerisierten Flüssigkeit und auf die relativ schlechte Qualität des erhaltenen Produkts zurückzuführen ist

Verschiedene Mikroorganismen stellen Enzyme her, die Glukose in Glukose enthaltenden Sirupen zu Fruktose isomerisieren. Diese Enzyme werden als Glukose-Isomerasen bezeichnet In einer in Science, VoL 125, Seiten 648-9 (1957) erschienenen Arbeit wird

ίο beschrieben, daß ein aus Pseudomonas hydrophila erhaltenes Enzym Glukose zu Fruktose isomerisiert Ferner wird in der Brit Patentschrift 11 03 394 und in der Japan. Patentschrift 17 640 (1966) beschrieben, daß Mikroorganismen der Art Streptomyces, wie Strepto myces flavovirens, Streptomyces achromogenes, Strep tomyces echinatus, Streptomyces albus und Streptomyces phaeochromogenes Glukose-Isomerase produzieren. Obgleich Glukose isomerisierende Enzyme hinsicht- Hch der Konvertierung von Glucose zu Fruktose selektiver sind als die alkalischen Katalysatoren, sind jedoch mit der technischen Anwendung dieser Enzyme noch eine Reihe von Problemen verbunden. Beispielsweise werden bei der enzymatisch en Isomerisierung erhebliche Mengen von gefärbten Körpern gebildet die die Reinigung der erhaltenen Produkte schwierig gestalten. Ferner besitzt das isomerisierende Enzym die Neigung, innerhalb kürzerer Zeiträume als gewünscht inaktiviert zu werden. Die Bildung von gefärbten

in Körpern und die Inaktivierung des isomerisierenden

Enzyms sind stark von den Bedingungen abhängig, bei

weichen die Isomerisierungsreaktion durchgeführt wird.

Wenn die Reaktion über relativ lange Zeiträume

und/oder bei hohen Temperaturen, um hohe Fruktose-

r> ausbeute zu erhalten durchgeführt wird, dann werden größere Mengen von gefärbten Körpern gebildet und das Enzym wird in inem größeren Ausmaß inaktiviert

Die Reinheit des Glukose-Isomerase-Präparats beeinflußt auch die Bildung von gefärbten Körpern in der isomerisierten Flüssigkeit Wenn relativ große Mengen an Fremdstoffen in dem Glukose-Isomerase-Präparai anwesend sind, dann besteht eine größere Tendenz zur

Bildung größerer Mengen von gefärbten Körpern. Aufgabe der Erfindung ist es, ein wirksames

<r> Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glukose zu Fructose zu zeigen, bei dem die Bildung von gefärbten Körpern weitgehend vermieden oder vermindert wird.

Diese Aufgabe wird durch das Verfahren gemäß den

w Patentansprüchen gelöst

Obgleich nach dem vorliegenden Verfahren die Bildung von gefärbten Körpern nicht vollständig eliminiert werden kann, kann noch die geringe Menge von gefärbten Körpern, die noch gebildet wird, durch relativ einfache Reinigungsmaßnahmen entfernt werden.

Bei dem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung sind wasserlösliche Sulfite oder Bisulfite, sowie andere Stoffe, die Sulfit- oder Bisulfitionen bilden, z. B.

μ SOr oder HzSOrLösungen geeignet Diese Stoffe können der Glukose enthaltenden Flüssigkeit vor oder während der Isomerisierung zugesetzt werden. Die Sulfit- oder Bisulfitionen können auch den Glukose enthaltenden Flüssigkeiten in der Weise zugeführt

h5 werden, daß man die Flüssigkeiten durch Ionenaustauscherharze in der Sulfitform leitet Vorzugsweise werden jedoch die Bisulfit- und Sulfitsalze den Glukose enthaltenden Flüssigkeiten vor dem Ingangsetzen der

Isomerisierung zugesetzt, da in diesem Falle die vollständige Wirkung dieser Salze erhalten werden kann.

Die zur Bildung von Glukose-Isomerase, die für das Verfahren der Erfindung geeignet ist, bevorzugten Mikroorganismen gehören zu der Art Streptomyces. Der am meisten bevorzugte Mikroorganismus ist Streptomyces ATCC 2) 175, Die taxanomisehen Eigenschaften dieses Mikroorganismus sind untenstehend ·> angegeben.

Taxonomische Eigenschaften von Streptomyces ATCC 21175 A) Morphologische Beobachtungen

1. Spiralförmige Sporophoren, die 3 bis 6 Windungen haben; einige wenige unvollständige Sporophoren bilden Haken und Ösen.

2. 10 bis 50 Sporen in den Sporophoren

3. Keine Fragmente bildendes Mycelium

4. Die Oberfläche der Sporen ist stachelig, wenn die Sporeq im Elektronenmikroskop bei Verstärkungen von mehr als 1000 x betrachtet werden; die Sporen sind rund oder leicht elliptisch.

Kultur-Medium

Hefe-Extrakt-Malz-Extrakt-Agar; Hafermehl-Agar; Glycerin-Asparagin-Agar; Glycerin-Stärke-Glutamat-Agar; Hefe Extrakt-Glukose-Agar; Tyrosin-Agar; Glycerin-synthetisches Agar; Kalzium-Malat-Glycerin-Agar; Kartoffelnährmedium-Agar; Kartoffel-Zylinder, wie vor wie vor wie vor

B) Farbe der Kolonie

Die repräsentativste Farbe dir Sporen und der Luft-Mycelien »en masse« an der Oberfläche der reifen Kolonien ist beige-braun oder trüb-braun. Auf der Tresner-Backus-Farbscheibe ist die Bewertungsfarbe auf Tabelle 3.

C) Umgekehrte Seite der Kolonie

Keine getrennte Pigmentierung. Grau oder bräunlich gelb auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar, Haferschleim-Agar und Stärke-Agif.

D) Farbe im Medium Keine Pigmentbildung.

E) KohlenstofTverwertung

L-Arabinose, D-Fructose, i-Inosit, D-Mannit, Rhamnose und D-Xylose werden zum Wachstum verwertet. Auf Rohrzucker und Ra(Tinose kein Wachstum.

F) Andere physiologische Eigenschaften

Das Wachstum ist streng aerobisch und mesophil. Kein Wachstum bei 50' C auf Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar.

Proteolytische Aktivität - positiv auf Gordon und Smith-Kasein-Agar. Diastatische Aktivität - positiv auf anorganischen Salzen-Stärke-Agar. Flüchtige Verbindungen mit erdigem oder moorigem Geruch werden während des aktiven Wachstums der Kultur auf den meisten Medien gebildet.

Ein weiterer zu der Art Streptomyces gehörender Mikroorganismus, der zur Herstellung .1er Glukose-Isomerase eingesetzt wird, ist Streptomyce)» Λ ι CC 21 176.

Da Glukose-Isomerase hauptsächlich in diesen Mikroorganismen intracellulär gebildet wird, kann eine Quelle für Glukose-Isomerase in der Weise erhalten werden, daß man einfacherweise die Zellen von dem Wachstumsmedium abtrennt. Die Glukose-Isomerase kann von den Zellen dieser Mikroorganismen durch die bekannten Methoden abgetrennt werden, z, B. durch Schallbehandlung etc.

Die Glukose-Isomerase kann zur Isomerisierung von Glukose in einer Glukose enthaltenden Flüssigkeit zu Fruktose eingesetzt werden oder das Zellmaterial kann direkt verwendet werden. Bei Verwendung des Zellmaterials ist die Tendenz zur Bildung von mehr gefärbten Körpern und anderen störenden Nebenpro dukten höher als wenn abgetrennte und gereinigte Glukose-Isomerase verwendet wird, was auf die Zufuhr der Fremdstoffe zurückzuführen ist. Jedoch sind die zur

Yi Abtrennung der Glukose-Isomerase erforderlichen Arbeitsweisen im allgemeinen zettraubend und machen zusätzliche Kosten notwendig. Deswegen ist das Verfahren der Erfindung besonders zur Unterdrückung der Bildung von gefärbten Körpern geeignet, wenn eine

μ enzymatische Isomerisierung durchgeführt wird, bei •,velcher als Quelle für die Glukose-Isomerase Zellmaterial eingesetzt wird. Da im allgemeinen während der enzymatischen Isomerisierung als Enzymaktivatoren Salze des Magnesiums, Kobalts, Chroms und/oder

h> Mangans notwendig sind, werden Salze der schwefligen Säure mit den genannten Metallen bevorzugt. Im Falle von Streptomyces ATCC 21 175 ist das bevorzugte Salz Magnesiumsulfit.

Der pH-Bereich for die Durchführung der enzymatischen Isomerisierungsresktion beträgt etwa 6 bis etwa 8,5, wobei der Bereich von etwa 6,5 bis etwa 7,5 besonders bevorzugt wird. Die Temperatur der Glukose enthaltenden Flüssigkeit während der Isomerisierung wird bei etwa 45 bis etwa 80⁰C, vorzugsweise etwa 50 bis etwa 65^CC während der Isomerisierungsreaktion gehalten.

Die Menge der in der Glukose enthaltenden Flüssigkeit vorgesehenen Bisulfit- oder Sulfitsalze kann variieren. Es werden genügende Mengen dieser Salze zugesetzt, um einen SO2-Gehalt in der Flüssigkeit von etwa 0.02 bis etwa 0,3 Gew.-%, bezogen auf den Gehalt der Flüssigkeit an Trockensubstanz, zu erzielen. Besonders bevorzugt wird ein SCh-Gehalt von 0,03 bis etwa 0,08 Gew.-%.

Obgleich das die Glukose isomerisierende Enzym bei hohen Temperaturen relativ stabil ist, ist es doch der allen Proteinen gemeinen thermischen Denaturierung unterworfen. Die Anwesenheit der Sulfitsalze während der Isomerisierung, insbesondere bei hohen Isomerisierungstemperaturen, übt nun überraschenderweise einen Schutzeffekt auf das die Glukose isomerisierende Enzym aus. Dadurch wird der Vorteil erzielt, daß zur Erzielung der gleichen Fruktoseausbeute bei Anwesenheit von Sulfiten oder Bisulfiten geringere Mengen des Enzyms benötigt werden, bzw. daß bei Verwendung der gleichen Enzyme höhere Fruktoseausbeuten erhältlich sind.

In den Beispielen bedeuten die angegebenen Prozentwerte Gewichtsprozent, die auf das Gewicht der Trockensubstanz der Glukose enthaltenden Flüssigkeiten bezogen sind.

Die Analysenmethoden, die in den nachstehenden Beispielen erwähnt sind, wurden folgendermaßen durchgeführt:

Die Farbe der Glukose enthaltenden Flüssigkeiten wurde spektrophotometrisch bestimmt, indem die Absorption bei 450 und 600 πιμ einer in geeigneter Weis«* verdünnten Flüssigkeit in einer 1-cm-Zelle gegenüber Wasser als Vergleichssubstanz gemessen wurde. Die Färbung wurde unter Verwendung der folgenden Formel errechnet:

Färbung =

(100) (109) (/4 450-/160O)
C

IO säuert und mit 2 ml einer Stärkepaste als Indikator versetzt, Die Lösung wurde sodann mit einer 0,0625 n-Jodlösung titriert (1 ml entspricht 0,002 g SO₂), bis die Blaufärbung eine Minute anhielt. Der SO₂-Prozentgehalt auf Trockenbasis wurde folgendermaßen bestimmt:

Prozentualer SO,-Gehalt

Titration (ml) χ 0,002

Probengewicht χ Trockensubstanz

Fruktosegehalt der isomerisierten Flüssigkeit

Der Fruktosegehalt der isomerisierten Flüssigkeit wurde bestimmt, indem die Veränderung der spezifischen Drehung, die während der Isomerisierung auftrat, bestimmt wurde. Die spezifischen Drehungen wurden unter Verwendung eines automatischen Polarimeter« gemessen. Die Drehungen wurden bei einer Konzentration von 5 g/100 ml in einer au^f 25⁰C thermostatierten Glaszelle bestimmt. Der Weg in Her Zelle betrug 20 mm. Die spezifischen Drehungen wurden am Beginn der Isomerisierungsreaktionen bestimmt, nachdem alle Bestandteile des Isomerisierungsreaktionsgemisches vereinigt worden war. Zur Bestimmung der Veränderung des Fruktosegehalts wurde die spezifische Drehung der isomerisierten Flüssigkeit zur Zeit t bestimmt. Sämtliche Proben wurden mit verdünnter Salzsäure auf einem pH-Wert von 4,0 eingestellt, um die

jn Wirkung des Enzyms vor der Verdünnung zur Bestimmung der Drehungen zu verhindern. Die Änderung des Fruktosegehalts wurde nach der folgenden Formel errechnet:

i'i Prozent F =

A 450 = Absorption bei 450 πΐμ
A 600 = Absorption bei 600 ιτίμ
C = Konzentration in g Trockensubstanz ^

pro SÖOml Flüssigkeit

SO₂-Konzentration in den Glukose enthaltenden Flüssigkeiten

Das Schwefeldioxid in den Flüssigkeiten wurde folgendermaßen bestimmt:

Eine Flüssigkeitsprobe im Bereich von 50 bis 60 g wurde genau in eine Schale eingewogen und quantitativ in einen 800-ml-Kjeldahl-Kolben überführt, wobei 300 ml destilliertes Wasser verwendet wurden. Hierzu t>o wurden 10 ml konzentrierte Phosphorsäure und danach 1 g Natriumbicarbonat gegeben. Der Kolben wurde unmittelbar danach mit einer Standard-Kjeldahl-Destillationsvorrichtung verbunden und es wurden ungefähr 250 ml in einen Erlenmeyer-Kolben destilliert, der 25 ml h5 Wasser und 10 bis 12 ml einer 0,8%igen Natriumhydroxid-Lösung enthielt. Nach Vervollständigung der Destillation wurde das Destillat mit Phosphorsäure ange-100 (λ, -·>ο)

- 138.9

Spezifische Drehung am Beginn der Isomerisierung
Spezifische Drehung zur Zeit 1

In der Formel ist der Faktor — 138,9 die Veränderung in der spezifischen Drehung, die auftritt, wenn die Glukose vollständig in Fruktose überführt wird.

Glukose- Isomerase-Aktivität

Die Bestimmung der Glukose-Isomerase-Aktivität ist auf einer Modifikation der von Takasaki in Japanese Journal of Agr. Biol. Chem., 30, Seiten 1247-1253, beschriebenen Methode. Die Aktivität des Standard-Enzyms, welches zur Eichung des automatisierten Analysenablaufs verwendet wurde, wurde nach der Methode von Takasaki bestimmt, mit der Ausnahme, Haß die Aktivität bei einem pH von 7,5 anstelle von 7,2 bestimmt wurde. Die Definition einer Glukose-Isomerase-Einheit (GIU) ist diejenige Menge des Enzyms, die unter den Testbedinguiigen (pH 7,5, 70⁰C, 1 Stunde, Testlösung 0,1 m in D-Glukose, 0,005 m in Magnesiumsulfat und 0,05 m in pH 7,5 Phosphatpuffer) 1 mg D-Fruktose pro Stunde produziert. Frische Zellen und trockene Zellen wurden in destilliertem Wasser suspendiert und mit einer Beschallungseinrichtung 2 bis 3 Minuten beschallt, um die Zellstruktur zu zerstören und das Enzym in die flüssige Phase freizusetzen. Die beschallten Produkte wurden zentrifugiert und geeignete aliquote Teile der klaren überstehenden Flüssigkeit wurden abgenommen und für die Untersuchung nach der automalischen Methode in den geeigneten Bereich (OiOGiU/ml) verdünnt.

Beispiel 1

Dieses Beispiel zeigt die enzymatische Isomerisierung von Glukose in Glukose enthaltenden Flüssigkeiten in Gegenwart und in Abwesenheit von Sulfitsalzen.

Streptomyces ATCC 21 175 wurde unter aerobischen untergetauchten Fermentationsbedingungen bei einem pH von 7 in einem vorher sterilisierten wäßrigen Medium gezüchtet. Das Medium enthielt 1% Sorbit, 0,75% Dextrose, genügend Maiskolben-Hydrolysat, um 1 % Xylose zu ergeben, 4% Quellungswasser von 29° Βέ und 0,024% Kobalt(II)-ionen. Die Fermentation wurde bei 30°C, einem Luftstrom von I Volumen Luft pro Volumen des Mediums pro Minute und einem

Rückdruck von 0,7 kg/cm² durchgeführt. Die Fermenta tionsbrühe wurde mit 200 Upm mechanisch gerühr Nach 65 Stunden wurden mit der Brühe 4°/ Filterhilfsmittel vermischt. Das Zellenmaterial wurd von der Brühe durch Filtration unter Unterdrucl abgetrennt. Der Filterkuchen wurde mit entsalzten Wasser gewaschen, in kleine Stücke gebrochen um 5 Stunden in einem Ofen mit Zwangsluftumlauf bei eine Lufttemperatur von 60,0° C getrocknet. Die Aktivitä des luftgetrockneten Filterkuchens betrug 660 GIU/g.

Eine Reihe von vier Glukose enthaltenden Flüssigkei ten, die aus Hydrolysaten von Maisstärke hergestell worden war, wurde bereitet. Die Zusammensetzung is in der nachstehenden Tabelle angegeben:

Tabelle I

	Probe	1	55.5	4
	I	55.5	0.001	67,5
Glukosegehalt (Prozent auf Trockenbasis)	55,5	().()() I		0,001
(Molarität) CoCI3 · 6 H2O	0.001		0.005
Na2SO, (Prozent auf Trockenb.)	0.25
MgCI2 · 6 H2O (Molarität)	0.005	0.25	keine	0,25
MgSO, -6H2O (Prozent auf Trockenbasis)		0,12	2.3	0.12
Gesamt SO2 (Prozent auf Trockenbasis)	0,13	2,3		4.6
Glukose-Isomerase (GIU/g Trockenbasis)	2.3

Diese Proben wurden bei einer Temperatur von 70°C η Die Farbe und der Fruktosegehalt der Flüssigkeiter

92 Stunden isomerisiert, wobei der pH-Wert durch Zugabe einer 0,5%igen Natriumhydroxid-Lösung auf 6,5 gehalten wurde. Über den drei Proben, die die Sulfite enthielten, wurde eine Stickstoff-Atmosphäre gehalten.

wurden während der Isomerisierung bestimmt. Die Ergebnisse dieser Bestimmungen sind in Tabelle Il zusammengestellt.

Tabelle II	Probe Nr.	I	Farbe	Probe Nr.	2	Farbe	Probe Nr.	3	Farbe	Probe Nr. 4	Farbe
Isomerisierungs-	%		6	%		6	%		6	%	7
Zeit	Fruktose	9	Fruktose	9	Fruktose	11	Fruktose	9
Stunden	0	IO	0	11	0	36	0	10
0	2.9	7	5,4	8	3.4	53	9	6
8	9,4	10	12,1	14	8,3	96	18	17
20	9,8	17	12.7	71	7.4	251	20,2	211
26	16,7	98	19,1	409	13,2	434	26,8	707
44	21,0		22,1		14,6		30,5
68	25,0	25,3	27,5	32,5
92

Aus Tabelle II wird ersichtlich, daß, wie die Menge der Fruktose zunahm, gleichfalls die Farbe der isomerisierten Flüssigkeit anstieg. Bei jeder der Isomerisierungsreaktionen, die in Gegenwart von Sulfiten durchgeführt worden war, wurde weniger Farbe gebildet, als in den Flüssigkeiten, die bei gleicher Fruktosebikhing keine Sulfite enthielten. Aus der Tabelle wird auch ersichtlich, daS in den Proben, die die Suifilsaize enthielten, mehr Fruktose gebildet worden war. was darauf hinweist daß die Sulfite den Inaktivierungsgrad des Enzyms während der Isomeribo sierung verringerten.

Beispiel 2 Dieses Beispiel zeigt die enzymatische Isomerisierung

von Glukose in Glukose enthaltenden Flüssigkeiten unter Verwendung von verschiedenen Mengen von

Glukose-Isomerase in Gegenwart von verschiedenen Mengen von Sulfiten. Zwei Reihen von vier Glukose enthaltenden Flüssie-

ίο

keitsproben (Mutterlaugen von der primären Dextrose-Kristallisation, 90 DE) wurden hergestellt, die 0,005 m Magnesiumchlorid und 0,001 m Kobaltchlorid enthielten. Die Reihe A enthielt 53.4% Trockensubstanz, die Reihe B 56,/% Trockensubstanz. Die Proben wurden mit verschiedenen Mengen des luftgetrockneten Filterkuchens des Beispiels 1 und mit Sulfitsalzen versetzt. Die Isomerisierungen wurden bei 70° C verschiedene Zeiten lang unter Stickstoff durchgeführt. Es wurden die Farbe und die während der Isomerisierung gebildete Fruktose bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IH zusammengestellt.

Tabelle IM	%	%	-	-	Gesamt	Isomerisierung	%	Farbe	11	3	4	4	(
Probe	Na2SO3	NaIISOj	-	-	SO2	Zeit (Stunden)	Fruktose		35	8	7	3	r
		GIU/g Trockensubstanz)	-	-				-	70	84	17	6	\
Reihe Λ (4.2	0,05	-	-	0,025	0	0	!57	310	291	130	1
I	0,05		-	0,025	17	12,9	297	477	511	470	j
I	0,05	-	-	0,025	29	19,3	410	647	645	640	1
1	0,05	...	0,05	0,025	41	24,8	-	-	-		1
1	0,05	0,05	0,05	0,025	66	3 i,9	6	I
i	0,05	0,05	0,05	0,025	90	36,8	15
	0,05	0,05	0,05	0,025	114	35,8	54	«
I	0,05	0,05	0,05	0,054	0	0	128
2	0,05	0,05	0.05	0,054	17	14,9	264	£ E
2	0,05	0,05		0,054	29	22,6	550	I
2	0,05	0,05	0,054	41	26,9	5
2	0,05	0,075	0,054	66	33,0	9
2	0,05	0,075	0,054	90	36,4	12
2	0,05	0,075	0,054	114	36,9	58
*	0,075	0,075	0,081	0	0	323
3	0,075	0,075	0,081	17	14,4	684
3	0,075	0,075	0,081	29	20,8
3	0,075	0,075	0,081	41	26,4
3	0,075	0,10	0,081	66	31,8
3	0,075	0,10	0,081	90	35,8
3	0,075	0,10	0,081	114	35,8
3	0,10	0,10	0,108	0	0
4	0,10	0,10	0,108	17	14,0
4	0,10	0,10	0,108	29	20,4
4	0,10	0,10	0,108	41	26,2
4	0.10	GIU/g Trockensubstanz)	0,108	66	32,7
4	0,10	0,05	0,108	90	36,3
4	0,10	0,05	0,108	114	37,4
4	0,05
Reihe B (8,5	0,05	0,025	0	0
	0,05	0,025	14	21,3
	0,05	0,025	25,5	30,6
	0,05	0,025	38	35,5
	0,05	0,025	62	39,2
	0,05	0,025	92	40,5
	0,05	0,054	0	0
2	0,05	0,054	14	20,0
2	0,05	0,054	25,5	29,5
2	0,054	38	34,7
2	0,054	62	39,5
2	0.054	92	40,5
2

	11	Nn2SO,	%	20 16 569	12	%	Farbe
		n.075	Nu I ISOj			Fruklose	4
Fortsel/iing		0,075	0,075		Isomerisierung	0	8
I'robe	0,075	0,075	Cicsaml	Zeit ',Stunden)	21,5	7
	0,075	0,075	SO,	0	30,7	24
3	0,075	0,075	0,081	14	35,8	296
3	0,075	0,075	0,081	25,5	39,7	745
3	0,10	0,075	0,081	38	31.0	4
3	0,10	0,10	0,081	62	0	7
3	0,10	0,10	0,081	92	20,5	7
3	0,10	0,10	0,081	0	29,1	14
4	M IQ	0,10	0,108	14	35,4	1 Λ Ί ι τ /
4	0,10	η in	0,108	25,5	V) 3	606
4		0,10	0,108	38	41,0
4		0,108	AT
,1		η inc	92
4	0,108

Aus Tabelle III wird ersichtlich, daß im allgemeinen bei vergleichbaren Fruktosegehalten eine Steigerung des Sulfitgehalts zu der Ausbildung einer schwächeren Färbung führte. Gleichfalls führt der Einsatz von höheren Werten der Glukose-Isomerase zu niedrigeren Farben bei vergleichbaren Fruktose- und Sulfitwerten.

H e i s ρ i e I 3

Dieses Beispiel zeigt den Einsatz von lonenaustauscherharzen, um Sulfitionen in Glukose enthaltenden Flüssigkeiten zur Verfügung zu stellen und die enzymatische Isomerisierung der Glukose enthaltenden Flüssigkeiten.

Eine Glukose enthaltende Flüssigkeit (Mutterlauge der primären Dextrose-Kristallisation, 90 DE), die 60 g Trockensubstanz pro 100 ml enthielt und die eine Farbe von 8 hatte, wurde auf 70°C erhitzt. Es wurde genügend Magnesiumchlorid und Kobaltchlorid zugegeben, um darin eine molare Konzentration von 0,005 bzw.0,001 zu erzielen. Sodann wurde Natriumbisulfit-Lösung bis zu einem Gehalt von 0,1% SC-zugesetzt und der pH-Wert der Flüssigkeit mit verdünnter Natriumhydroxidlösung auf 6,5 eingestellt. Hierzu wurde eine genügende Menge eines getrockneten Filterkuchens von Streptomyces ATCC 21 175, der gemäß Beispiel 1 bereitet worden war, zugesetzt, wodurch 9,0 GIU/g Trockensubstanz erhalten wurden. Die Flüssigkeit wurde 24 Stunden bei einer Temperatur von 70°C isomerisiert. Der pH-Wert wurde während der Isomerisierung durch Zugabe von verdünnter Natriumhydroxidlösung auf 6,5 gehalten. Der Fruktosegehalt und die Farbe wurden nach 22 Stunden bestimmt. Dabei wurden 33,8% und 18% gefunden. Nach 24 Stunden wurde die isomerisierte Flüssigkeit abfiltriert und in vier 400-ml-Portionen aufgeteilt, von denen jede 233 g Trockensubstanz enthielt. Jede Portion wurde getrennt durch lonenaustauschersäulen, die verschiedene Mengen eines Harzes auf Basis von Styrol in der Sulfitform enthielten. Nach der Ionenaustauscher-Behandlung wurde der pH-Wert der Portionen mit einer verdünnten Natriumhydroxid-Lösung auf 6,5 eingestellt. Hierzu wurde genügend Kobaltchlorid gegeben, um eine molare Konzentration von 0,005 zu erhalten. Die Temperatur der Portionen wurde auf 70⁰C und der pH-Wert durch Zugabe einer verdünnten Natriumhydroxid-Lösung währc.id der Isomerisierung auf 6,5 gehalten. Während der Isomerisierungsreaktion wurden die Farbe und der Fruktosegehalt bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV	Beschreibung	Isomerisierung	m3 Ionen	%	Farbe
Probe	der Probe	Zeit	austauscher
			pro kg	Fruktose
			verarbeit.
			Trocken
			substanz		8
		(Stunden)	(X 102)
	ursprüngliche	6			18
	Isomerisierung				7
	desgl.	22	-	33,8
	nach Behandlung	24	155	35,8
1	mit dem Ionen				10
	austauscherharz				31
	desgl.	42	155	39,8
I	desgl.	66	155	41,6
I

	13	20 16 569	Beispiel	tu Ionen	4	14	%	l-arbe
				austauscher
F-Wtsel/imp	Beschreibung			pro kg	l'ruktose
Probe	der l'robe	Isomerisierung	verarbeit.
		/eil	Trocken
			substanz		63
			(x 102)
			155	42.8
					9
	nach Behandlung	(Stunden)			15
1	mit dem lonen-	72	77.5	35.8	72
	austauscherharz		77.5	40.2	173
	desgl.		77.5	42.0	10
2	desgl.	24	77,5	42,9	15
2	desgl.	42	51,6	36.0	99
2	desgl.	66	51.6	40.0	234
2	desgl.	72	51.6	41,8	9
3	desgl.	24	51.6	43.7	18
3	desgl.	42	39,2	35,6	157
3	desgl.	66	39,2	40.2	306
3	desgl.	72	39,2	41,8
4	desgl.	24	39,2	43.8
4	desgl.	42
4	desgl.	66
4		72

Dieses Beispiel zeigt die Stabilisierungswirkung von Sulfitionen auf das Glukose isomerisierende Enzym unter den Bedingungen einer Isomerisierungsreaktion.

475 g des getrockneten Filterkuchens, der gemäß Beispiel 1 hergestellt worden war, wurden in einer genügenden Menge einer 0,005 m Kobaltchlorid-Lösung suspendiert, daß 51 erhalten wurden. Die Suspension wurde auf den pH-Wert 6,25 und die Temperatur 58° C eingestellt und unter Rühren 6 Stunden bei diesen Bedingungen gehalten. Die Suspension wurde sodann auf Raumtemperatur abgekühlt und filtriert, wodurch ein zellfreier Extrakt erhalten wurde. Dieser wurde unter Verwendung eines Rotationsverdampfers auf das 1Ofache konzentriert. 383 g des konzentrierten zellfreien Extrakts wurden in einen Kolben gegeben und die Temperatur auf TC erniedrigt. Unter Rühren wurden 255 g Aceton zugesetzt, wodurch ein Niederschlag gebildet wurde. Nach 15 Minuten wurde der Niederschlag durch Zentrifugierung mit 2000 Upm entfernt und durch Suspendierung in Wasser und Zentrifugieren 2mal mit Wasser extrahiert. Die das Enzym enthaltende wäßrige Lösung wurde kontinuierlich gegen 37,3 I Wasser von entmineralisiertem Wasser von 3° C dialysiert. Das Dialysat wurde auf 136 g konzentriert und sodann lyophilisiert, wodurch 15,Jg eines gereinigten Glukose-Isomerase-Präparats mit einer Aktivität von 14,400 GIU/g erhalten wurden.

Es wurden zwei Isomerisierungsgemische mit der nachstehenden Zusammensetzung bereitet:

3,0 m Glukose

0_:001 m Kobaltchlorid

0,005m Magnesiumchlorid

Es wurde eine genügende Menge des gereinigten Glukose-Isomerase-Präparats zugesetzt. um

11,4 GIU/g Glucose zu erzielen. Zu dem einen dieser Isomerisierungsgemische wurde genügend Nairiumbisulfit zugesetzt, um das Gemisch hinsichtlich dieses Salzes 0,005 m zu machen (0,096% SOj). Die Gemische wurden bei einem pH-Wert von 6,5 und bei 70^cC unter Stickstoffatmosphäre gehalten. Am Beginn der Isomerisierung wurden aliquote Teile entnommen und nach 20.

44 und 92 Stunden wurden die Fruktos-- und die Farbe bestimmt. Die Ergebnisse dieser Versuche sind in Tabelle V zusammengestellt. In der Tabelle V sind auch die restlichen Glukose-Isomerase-Aktivitäten bei den verschiedenen Zeiten der Probeabnahme gezeigt. Die

ϊο restlichen Enzymaktivitäten der Tabelle V wurden folgendermaßen bestimmt:

Es wurde eine Testlösung hergestellt, indem 25 ml des Isomerisats mit 25 ml einer Vorratslösung versetzt wurden, die bezüglich der Glucose 3 m, bezüglich des Natriummaleatpuffers beim pH 6,5 0,2 m, bezüglich des Magnesiumsulfats 0,02 m und bezüglich des Kobaltchlorids 0,001 m war. Die Testlösung wurde in eine Polarimeterzelle (20 mm Weg), die mit einem Wassermantel versehen war, gebracht Durch den Mantel wurde heiBes Wasser geleitet, um die Bestandteile der Zelle bei 70⁰C zu halten. Die Zelle wurde in ein Bendix automatisches Polarimeter gebracht, das mit einer Registriervorrichtung versehen war. Die Geschwindigkeit der Veränderung der optischen Drehung wurde bestimmt Aus der Geschwindigkeit der Änderung der optischen Drehung wurde die Geschwindigkeit der Bildung der Fruktose (VA, die durch die restliche Glukose-Isomerase katalysiert wurde, berechnet. Die

15

restliche Enzymaktivität pro g der Trockensubstanz (E/C), die in dem Isomerisat enthalten war, wurde sodann nach der folgenden Gleichung errechnet:

E/C, =

Vj{K_s + C-F(I- KJK,)) (C, + C₁)

C_ak_{(C-F(+ 1/XJ)(C₁)

V₁ = Geschwindigkeit der Fruktosebildung in Mol Γ¹ h-'.

C = Gesamtkonzentration der Glukose und der Fruktose in MoI pro Liter.

F — Konzentration der Fruktose in Mol pro Liter.

C₄ = Konzentration der Trockensubstanzen ,₅ (g/ml) in der Testlösung.

k_f = eine Pseudo-Erster-Klasse-Geschwindigkeits-Konstante für das Aufbrechen des Enzym - Glykose - Komplexes zu Enzym plus Fruktose (entspricht 0,012 Mol Fruktose Liter"¹, h~\ GIU"¹ bei einein pH von 6,5 und 70⁰C).

Tabelle V

K₉ =

Γ =

Michaelis-Konstante für das Substrat

(0,580 m Glukose bei einem pH von 6,5

und 70⁰C).

Michaelis-Konstante für das Produkt

(0,936m Fruktose bei einem pH von

6,55 und 70⁰Q.

Scheinbare Gleichgewichtskonslante für

die Reaktion (1.094 bei 70° C).

Konzentration der Trockensubstanz

(g/ml) im Isomerisat.

Konzentration der Trockensubstanz

(g/ml) in der Vorratslösung.

Aus der Tabelle V wird ersichtlich, daß von den zu den lsomerisaten gegebenen 20 GIU/g 99 und 98% in den O-Zeit-Proben, wie sie nach der obigen Arbeitsweise gemessen wurden, erhalten wurden. Am Ende der 80 Stunden hielt das Isomerisat, das das Sulfitsalz enthielt 29% der ursprünglichen Enzymaktivität bei, während die Probe ohne Sulfitzusatz nur mehr 13% restliche Aktivität hatte.

NaHSOj Isomerisierung %

Zeit

Fruktose

(Stunden)

Farbe

Verhältnis	Restliche
Enzym zu	Aktivität
Trocken-
sub. im
Isomeris.	(% der zu
(GIU/g)	gegebenen)
19,8	99
15,6	78
9,8	49
2,6	13
19,6	98
16,2	81
11,1	56
5,7	29

keine	0
keine	20
keine	44
keine	92
0,005 m	0
0,005 m	20
0,005 m	44
0,005 m	22

0,0 30,3 43,4 48,5

0,0 29,1 44,3 50,1

132

514

318 030 117/3

Claims (3)

Patentansprüche:

1. Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose zu Fructose in einer Glucose enthaltenden, in einem pH-Bereich von etwa 6 bis etwa SJ5 und bei einer Temperatur von etwa 45 bis etwa 80° C gehaltenen wäßrigen Lösung, dadurch gekennzeichnet, daß man die Isomerisierung in Gegenwart eines wasserlöslichen Salzes der schwefligen Säure in einer Menge, die einen SOrGehalt in der Lösung von etwa 0,02 bis etwa 03 Gew.-%, bezogen auf den Gehalt an Trockensubstanz, entspricht, durchführt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses mit einer Sulfit-Menge durchführt, die einem SOrGehalt in der Lösung von 0,03 bis 0.08 Gew.-% entspricht

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man dieses in Gegenwart von MagneshnnsuiP.i und/oder Magnesäumbisuifit durchführt.