DE2108125C3

DE2108125C3 - Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose in Lävulose

Info

Publication number: DE2108125C3
Application number: DE19712108125
Authority: DE
Inventors: Robert Paul LaGrange IH. Cory (V.StA.)
Original assignee: CPC International Inc., Englewood Cliffs, N.J. (V.StA.)
Priority date: 1970-02-19
Filing date: 1971-02-19
Publication date: 1978-02-16

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose in Lävulose, bei dem eine glucosehaltige Lösung der Einwirkung eines Glucoseisomerase-Enzympräparats ausgesetzt wird.

Verfahren zur Umwandlung von Dextrose in Lävulose sind bereits bekannt, z. B. die Isomerisierung mit Hilfe einer Enzymzubereitung (vgl. US-PS 50 228), unter Verwendung von Xyloseisomerase (vgl. »Science«, Band 125, Seiten 648 und 649), oder mittels Mikroorganismen, z. B. Streptomyces phaechromogenes (vgl. »Chemical Abstracts«, 68 [1968], Nr. 86143 η). ₆,

Es ist auch bereits bekannt, die Bildung von durch Oxidationsreaktionen entstehenden Nebenprodukten dadurch zu vermindern, daß die enzymatische Isomerisierung in Gegenwart eines im Reaktionsraum gelösten Reduktionsmittels erfolgt, wobei dann zwangsläufig der in der Enzymlösung gelöste Sauerstoff durch Einleiten eines Inertgases vermindert werden muß, um die Oxidation des Reduktionsmittels zu vermindern. Verwiesen sei in diesem Zusammenhang auf die Japan. Fatentveröffentlichung 27 712/69, wo die Verwendung von Eisen(II)-tartrat als Reduktionsmittel und von Stickstoff als Inertgas beschrieben wird. Die Verwendung von Reduktionsmitteln bringt jedoch zahlreiche Nachteile .nit sich, da diese zusammen mit ihren Umwandlungsprodukten in Lösung bleiben und das Isomerisierungsprodukt verunreinigen, so daß zeit- und kostenaufwendige zusätzliche Reinigungsoperationen erforderlich sind.

Bei der aus »Chemisches Zentralblatt« (1969), Nr. 33, Zitat Nr. 1708 bekannten Isomerisierung von Dextrose zu Fruktose mit Hilfe von Alkali wird zur Verhinderung der Oxidation von Glucose in einem geschlossenen Leitungssystem gearbeitet. Die alkalische Isomerisierung ist jedoch der enzymatischen weit unterlegen, da sie nicht so leicht steuerbar ist und unerwünschte Nebenreaktionen auftreten.

Der vorliegende Erfindung liegt die Erkenntnis zugrunde, daß dann, wenn die enzymatische Isomerisierung unter nichtoxydierenden Bedingungen durchgeführt wird, eine wesentlich intensivere Isomerisierung möglich ist und Isomerisierungsprodukte mit weitaus vorteilhafteren Eigenschaften und geringerem Psicosegehalt als bei den bekannten Verfahren resultieren.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, daß man aus der glucosehaltigen Lösung Sauerstoff verdrängt und die Lösung während der enzymatischen Isomerisierung unter nichtoxydierenden Bedingungen hält und ein lävulosehaltiges Isomerisierungsprodukt gewinnt, das, jeweils bezogen auf Trockensubstanz, mindestens 30 und insbesondere 40 bis 45 Gew.-% Lävulose und weniger als 2Gew.-% Psicose enthält und das gegebenenfalls einer Raffination unterworfen wird.

Das erfindungsgemäße Verfahren ist mit allen Typen von Glucoseisomerase-Enzympräaaraten durchführbar, die aus einer Vielzahl der verschiedensten mikrobiologischen Quellen stammen können. Die Eigenschaften dieser Enzympräparate, z. B. ihr pH-Optimum, ihr Temperatur-Optimum, die erforderlichen Metallionen, ihre Michaelis-Konstante sowie der Mechanismus der Lävulosebildung, scheinen jeweils etwas verschieden zu sein, doch ist das erfindungsgemäße Verfahren mit allen bekannten Glucoseisomerase-Enzympräparaten durchführbar.

Die Isomerisierung kann in der Weise erfolgen, daß das Enzympräparat einer Zuckerlösung, z. B. einem Glucose enthaltenden Sirup, in löslicher Form zugesetzt wird. Es ist auch bekannt, derartige Enzymzubereitungen, insbesondere im Hinblick auf eine kontinuierliche Verfahrensdurchführung, in unlöslicher Form zu verwenden. Die vorliegende Erfindung kann für alle deratigen Verfahrensweisen Anwendung finden.

Stickstoff und Argon sind besonders geeignete Gase für das Einstellen und Aufrechterhalten der nichtoxydierenden Bedingungen. Verwendbar sind ferner z. B. auch Xenon, Wasserstoff, Methylchlorid, Freon-Erzeugnisse (halogenierte Kohlenw asserstoffe). Kohlenmonoxid, Helium, Krypton, Butan, Propan, Methan, Äthan, Schwefelwasserstoff, Stickstoffoxid und Äthylen. Auch Kohlendioxid kann benutzt werden, doch wirft es das Problem der Aufrechterhaltung des pH-Wertes auf.

Andererseits sollten Chlor und andere gasförmige Halogene vermieden werden, weil sie mit dem Enzym reagieren.

Die erfindungsgemäß erzielbaren Vorteile sind vom wirtschaftlichen Standpunkt aus von außerordentlicher Bedeutung. Üblicherweise wird bei der Isomerisierung, z.B. der Isomerisierung eines 95-D.E-Stärkehydrolysats, zur Erzeugung eines Isomerisierungsproduktes mit einem Gehalt von 40 bis 45% Lävulose, ein deutlicher Verlust an Enzymaktivität beobachtet Wird jedoch erfindungsgemäß Luft (Sauerstoff) ausgeschlossen, z. B. dadurch, daß man durch das Isomerisierungsgemisch gasförmigen Stickstoff hindurchsprudeln läßt so wird der Verlust an Enzymaktivität verringert

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung näher erläutern. Alle Teil- und Prozentangaben beziehen sich auf Gewicht wenn nichts anderes angegeben ist und die Angaben entsprechen dem tatsächlichen Gehalt sofern nicht ausdrücklich gesagt ist daß sie sich auf Tockensubstanz oder eine andere Basis beziehen.

Beispiel 1

Isomerisierung eines Stärkehydrolysats mit

95 D.E. unter Verwendung einer

Glucoseisomerase-Enzymzubereitung aus einem

Streptomyces-Stamm

A. Entwicklung der Impfmasse

Einnige 500-ml-Erlenmeyerkolben, die mit je 100-ml-Mengen eines sterilen Mediums der in Tabelle I angegebenen Zusammensetzung beschickt waren, wurde mit Sporen einer Schrägkultur von Streptomyces olivochromogenes ATCC 21114 beimpft. Der pH-Wert des Kulturmediums wurde vor der Sterilisation mit Natriumhydroxid auf 7,1 eingestellt. Nach dem Beimpfen wurden die Kolben 60 Stunden lang bei einer Temperatur im Bereich von etwa 28 bis etwa 30° C auf einer Schüttelmaschine hin und her bewegt.

Tabelle I

Bestandteile

Verwendete
Mengen

Xylose
Maisstärke
Maisquellwasser
Magnesiumsulfat
(MgSO₄ · 7H₂O)
Cobaltchlorid
(CoCI₂ · 6H₂O)
Destilliertes Wasser

5,0 g

40,0 g

5,0 g

0,24 g
1000 ml

B. Herstellung der Enzymzubereitung

Je 10 ml wurden aus den Kolben mit der Impfmasse entnommen und dafür verwendet, um 1000-ml-Hinton-Erlenmeyerkolben anzuimpfen, die jeweils 200 ml eines sterilen Mediums der folgenden Zusammensetzung enthielten (Tabelle II):

Tabelle!!

Bestandteile

Verwendete
Mengen

Xylose
Maisstärke

10,0 g
10,0 g

Verwendete
Mengen

S Maisquellwasser Brauereihefe-Extrakt Magnesiumsulfat (MgSO₄ · 7H₂O) Cobaltchlorid ίο (CoCl₂-OH₂O) Destilliertes Wasser

40,0 g

0,5 g

0.24 g 1000 ml

Vor dem Sterilisieren wurde das pH mit Natriumhydroxid auf 7,1 eingestellt Die beimpften Kolben wurden 48 Stunden lang bei einer Temperatur im Bereich von etwa 28° C und etwa 3O⁰C auf einer Schüttelmaschine gedreht

Bei der Herstellung der beiden oben beschriebenen Medien kann Xylan-Hydrolysat anstelle von Xylose mit im wesentlichen ebenso guten Ergebnissen verwendet werden. Das Hydrolysat ist eine preiswerte Xylosequelle.

C. Gewinnung der Enzymzubereitung

Nach der Fermentation wurde der Inhalt der Kolben vereinigt. Die Flüssigkeit wurde bei der lOOOOfachen Schwerkraft 15 Minuten lang zentrifugiert Dann wurde die Zellmasse abgetrennt und zur Lagerung eingefroren.

Für die Verwendung wurde die Zellmasse oder ein

bestimmter Teil davon mit destilliertem Wasser auf ihr Originalvolumen verdünnt, und die Zellen wurden darin erneut suspendiert. Nach der Wiederherstellung wurde ein Gehalt von 1,67 Einheiten je ml bei der Untersuchung nach der weiter unten beschriebenen Methode ermittelt. Die Zellsuspension wurde dann entweder als solche wie weiter unten beschrieben verwendet, oder sie wurde in eine lösliche Form überführt, wie ebenfalls weiter unten beschrieben wird.

D. Überführung der Zellsuspension in
löslicher Form

Ein Teil der Zellsuspension, die aus gefrorener ase wiederhergestellt war, wurde 24 Stunden lang bei etwa 25° C mit kristallisiertem Lysozym (General Biochemical, 3mal umkristallisiert, 4 Mikrogramm je ml) behandelt. Das in Lösung gebrachte Enzym wurde dann an DEAE-Cellulose (Diäthylaminoäthylcellulose [500 Einheiten je Gramm Cellulose]) adsorbiert.

Die DEAE-Cellulose wurde dann mit 0,2molarer Natriumchloridlösung gewaschen, die sehr geringe Mengen des adsorbierten Enzyms aufnahm. Dann wurde die Cellulose mit 0,35molarer Natriumchloridlösung eluiert, die den größten Teil der Isomeraseaktivität aufnahm.

Die resultierende Enzymzubereitung, eine Lösung von Glucoseisomerase, enthielt 20 Einheiten je ml.

E. Bestimmung der Isomerase-Aktivität

Das Untersuchungsverfahren schloß eine spektrophotometrische Bestimmung der aus der Glucoselösung

unter standardisierten Bedingungen gebildeten Ketose ein.

Es wurde eine Stammlösung folgender Zusammensetzung hergestellt:

Tabelle HI

Tabelle IV
Standardisiertes Substrat

Bestandteile

Verwendete Mengen

O₁ImOLMgSO₄-7 H₂O

0,0ImOLCoCl₂-OH₂O

lmol. Phosphat-Puffer,

Wasserfreie D-Glucose

Destilliertes Wasser

1 ml
!ml

0,5 ml

1,44 g

um ein Gesamtvolumen

von 7,5 ml zu

ergeben

Die Enzymzubereitung wurde zunächst so weit verdünnt, daß sie von 1 bis 6 Isomerase-Einheiten je ml enthielt.

Die enzymatische Isomerisierung wurde in der Weise durchgeführt, daß 1 ml der Enzymzubereitung zu 3 ml der Stammlösung gefügt wurde und die Mischung 30 Minuten lang bei 60° C inkubiert wurde. Nach Beendigung der Inkubation wurde eine Menge von 1 ml mit 9 ml einer 0,5 N-Perchlorsäure inaktiviert. Die inaktivierte Menge wurde dann auf ein Gesamtvolumen von 250 ml verdünnt. Zum Vergleich wurde als Kontrolle eine reine Glucoselösung herangezogen und 1 ml der Enzymzubereitung durch 1 ml Wasser zu Beginn der Inkubationszeit ersetzt.

Dann wurde die Ketose durch eine Cystein-Schwefelsäure-Methode bestimmt. Dabei wird eine Isomerase-Einheit als die Menge Enzymaktivität definiert, die erforderlich ist, um unter den beschriebenen Isomerisierungsbedingungen 1 Mikromol Lävulose je Minute zu bilden.

F. Isomerisierungsproze3

Um den Erfindungsgedanken zu erläutern, wurde ein Standardsubstrat hergestellt und bei jedem der folgenden Isomerisierungsversuche verwendet. Dieses Substrat wurde entsprechend Tabelle IV angesetzt.

Bestandteile

Verwendete Mengen

95-D.E.Stärkehydrolysat

Cobalt(ll)-chlorid

Magnesiumsulfat

60 g/i 00 ml (Trockenbasis) Menge ausreichend, um das Substrat 0,001 molar zu machen

Menge ausreichend, um das Substrat 0,01 molar zu machen

Dieses standardisierte Substrat wurde dann in den folgenden Beispielen einem einheitlichen Isomerisierungsprozeß unterworfen, so daß die erhaltenen Ergebnisse vergleichbar sind.

Die Substratmenge, die der enzymatischen Isomerisierung unterworfen werden sollte, wurde in einem doppelwandigen Gefäß auf 70⁰C gehalten. Das pH wurde bei etwa 6,25 gehalten, wenn erforderlich durch Zusatz geringer Mengen einer gesättigten Natriumbicarbonatlösung. Während der Isomerisierung wurde das Substrat durch einen magnetischen Rührstab gerührt.

Die für das Standardsubstrat verwendete Menge Enzymaktivität betrug 0,6 Einheiten/Gramm, bezogen auf Trockensubstanz. Bei Verwendung der Enzymzube-

reitung in löslicher Form wurden 7,2 ml Enzymitubereitung für je 400 ml des standardisierten Substrates verwendet.

Vergleichsweise wurden bei verschiedenen Isomerisierungsversuchen einige verschiedene Gase verwendet. Bei jeder Isomerisierung wurde das Gas durch ein einfaches Kapillarrohr in das Isomerisierungsgemisch eingeleitet. Die eingeleitete Menge war ausreichend, um in dem Gemisch einen Rühreffekt zu erzielen und über dem Gemisch eine Gasatmosphäre zu schaffen.

Nach dem beschriebenen Verfahren wurden Isomerisierungsversuche unter Einleiten von Gas durchgeführt, bei denen das Gas Luft, Stickstoff und Argon war. Vergleichsweise wurde die Isomerisierung unter Verwendung der gleichen Apparatur und des gleichen Verfahrens aber ohne Einleitung von Gas durchgeführt. Die während der verschiedenen Versuche gemachten Beobachtungen sind in der Tabelle V zusammengestellt worden.

Tabelle V

Wirkung verschiedener Gase auf die Ketosebildung

Zum Einleiten verwendetes Gas Isomerisierungszeit in Stunden % Isomerisierung des 95 D.E.-Stärkehydrolysats

Luft

Stickstoff
Argon
Keins

zu Ketose	44	67	zu Lävulose
21	20,2	21,2	67
14,7	28,2	35,2	19,7
17,5	29,0	36,4	33,4
15,5	27,0	30,0	34,3
17,3		28,4

Wie die Daten in Tabelle V zeigen, hat der Ausschluß von Luft (Sauerstoff) das Ergebnis, das durch die Menge der verw endeten Enzymzubereitung eine größere Menge Ketose gebildet wird.

L.ie Zahlen zeigen außerdem, daß es auf die nichtoxydierenden Bedingungen, oder — mit anderen Worten — auf den Ausschluß von Luft (Sauerstoff) zurückzuführen ist, wenn dieser Effekt beobachtet wird.

Dabei ist zu berücksichtigen, daß Argon und Stickstoff Bestandteile der Luft sind, und dies ist ein Grund, weshalb diese Gase für die bevorzugte Ausführungsform ausgewählt wurden.

Die Menge Lävulose in dem Isomerisat wurde durch quantitative Papierchromatographie ermittelt. Wie die Zahlen zeigen, ist die gebildete Menge Lävulose im allgemeinen direkt proportional der gesamten Ketosemenge. In manchen Fällen ist es ausreichend, die schnellere und einfachere Bestimmung der Ketosen durchzuführen, um einen Anhaltspunkt für die gebildeten Lävulosemenge zu erhalten. Unter bestimmten Isomerisierungsbedingungen, wie weiter unten in Beispiel IV beschrieben wird, wird jedoch eine beträchtliche Menge Psicosc, eine andere Ketohexose, gebildet, so daß unter diesen Bedingungen die Bestimmung der gesamten Ketosen keine genauen Rückschlüsse auf die gebildeten Lävulosemenge zuläßt.

G. Farbeigenschaften der Isomerisate

Die beiden Sirupe, die nach einer Isomerisierung von 67 Stunden unter Verwendung von Luft und Stickstoff zum Einleiten erhalten worden waren, wurden hinsicht-

Tabelle VI

lieh des Gehaltes an Farbkörpern untersucht. Um diese Analyse durchzuführen, wurden für jeden Sirup die vollständigen Spektren im sichtbaren Bereich beobachtet.

Im Bereich von 700 bis 3CO nm war die optische Dichte des isomerisierten Sirups, der unter Einleiten von Luft hergestellt war, etwa 2,5mal größer als die des isomerisierten Sirups, der unter Einleiten von Stickstoff hergestellt war. Der unter Einleiten von Luft hergestellte Sirup enthielt deshalb etwa 2,5mal mehr Farbstoffkörper als der unter Einleiten von Stickstoff erhaltene Sirup.

Obwohl die Menge an Reinigungsmittel und die Kosten zum Entfärben eines Sirups nicht proportional verlaufen mit der Menge an gebildeten Farbstoffkörpern, besteht zwischen diesen beiden Größen eine positive Beziehung. Sofern man das Isomerisierungsgemisch frei von Luft (Sauerstoff) hält, wird ein isomerisierter Sirup erhalten, der sich wirtschaftlicher raffinieren läßt

Über die Absorption von 1/10-Verdünnungen der beiden Sirupe bei Verwendung von destilliertem Wasser als Verdünnungsmittel wird in Tabelle Vl berichtet.

Sirup, hergestellt unter Einleiten von

Wellenlängen in Nanometern

Absorption von '/ίο-Verdünnungen 700 650 600

550

450

400

360

Stickstoff	0,02	0,03	0,03	0,04	0,05	0,09	0,14	0,30
Luft	0,04	0,05	0,07	0,10	0,15	0,29	0,45	0,80

H. Bildung von Säure während der Isomerisierung

Während des Verlaufs der Isomerisierung wurde beobachtet, daß die Probe, die unter Einleiten von Luft isomerisiert wurde, etwa 5mal soviel der gesättigten Natriumbicarbonatlösung erforderte, um das pH bei 6,25 zu halten, als die unter Einleiten von Stickstoff und Argon erhaltenen Proben. Bei der Isomerisierung der Probe, die ohne Einleiten eines Gases hergestellt wurde, war eine mittlere Menge Natriumbicarbonatlösung erforderlich, um ihren pH-Wert zu halten; die Menge war etwa 2- bis 3mal so groß wie bei der unter Einleiten von Stickstoff oder Argon durchgeführten Isomerisierung. Die Menge an benötigtem Natriumbicarbonat ist der Menge Säure, die während der Isomerisierung gebildet wird, direkt proportional.

Als praktische Auswirkung ergibt sich, daß zum vollständigen Demineralisieren etwa 2- bis 5mal mehr Ionenaustauscher-Kapazität benötigt wird, wenn die Isomerisierung unter atmosphärischen Bedingungen durchgeführt wird, als es der Fall sein würde, wenn die Isomerisierung im wesentlichen unter Ausschluß von Luft (Sauerstoff) durchgeführt wird. Das erfindungsgemäße Verfahren hat deshalb den weiteren Vorteil, daß es hinsichtlich der Raffination wirtschaftlich ist

Beispiel 2
Verwendung verschiedener Streptomyces-Stämme

Eine Streptomyces-Art wurde aus einer Bodenprobe isoliert Der Stamm ist identifiziert durch die Eigentumsbezeichnung CRY-19. Dieser Organismus produziert ein rosa Pigment und unterscheidet sich deutlich von dem Stamm S. olivochromogenes, der in Beispiel 1 verwendet wurde.

Der Stamm wurde entsprechend der in Beispiel 1 beschriebenen Technik für die Gewinnung einer Enzymzubereitung in zellularer Form verwendet.

Die Enzymzubereitung wurde dann in zellularer Form entsprechend den in Beispiel 1 beschriebenen Bedingungen für die Durchführung von zwei Isomerisierungen verwendet Bei dem einen Versuch wurde Stickstoff eingeleitet Bei einem zweiten Versuch wurde kein Gas eingeleitet, aber das Isomerisierungsgemisch wurde der Atmosphäre ausgesetzt Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle VII zusammengestellt worden.

Die Ergebnisse zeigen, daß der Ausschluß von Luft von der Berührung mit dem Isomerisierungsgemisch eine allgemeine Wirkung auf GIucoseisomerase-Enzymzubereitungen hat und daß es sich dabei nicht einfach um eine selektive Wirkung auf die von S. olivochromogenes erzeugte Glucoseisomerase-Enzymzubereitung handelt

Tabelle VII

Zum Einleiten
verwendetes Gas

Isomerisierungszeit in Stunden

% Isomerisierung des 95 D.E.-Stärke-

hydrolysats zu Ketose

42

66

Stickstoff
Keins

213
213

33,5
303

39,7
34,1

Beispiel 3

Vergleich einer zellularen Enzymzubereitung mit
einer Enzymzubereitung in löslicher Form

Es wurden vier Isomerisierungsversuche entsprechend den in Beispiel 1 angegebenen allgemeinen

B09B07/1B5

ίο

Bedingungen unter Verwendung von entsprechend Beispiel 1 hergestellten Enzymzubereitungen durchgeführt Der Zweck war die Durchführung eines Vergleichs zwischen einer zellularen Enzymzubereitung und einer Enzymzubereitung einer zellularen in löslicher Form. Bei allen Versuchen betrug die verwendete Enzymmenge 0,6 Einheiten/Gramm, bezogen auf Trockensubstanz. Tabelle VIII berichtet über die Ergebnisse.

Tabelle VIII	Eingeleitetes Gas	Isomerisierungszeit in Stunden °/o Isomerisierung eines 95 D.E.-Stärkehydrolysats zu Ketose 18 42	66	90
Art der Enzymzubereitung	N₂ keins N₂ keins	19,8 30,5 19,2 29,2 25,7 36,6 23,6 32,7	38,6 33,7 41,4 35,3	40,9 37,4
Suspendierte Zellen Suspendierte Zellen Lösliche Form Lösliche Form

Wie die Ergebnisse zeigen, führt die Enzymzubereitung in löslicher Form zu einer höheren Anfangswirksamkeit der eingesetzten Enzymmenge als eine Enzymzubereitung, in der suspendierte Zellen als Enzymquelle verwendet werden. Jedoch sind beide Formen einer Enzymzubereitung für das erfindungsgemäße Verfahren gleich gut geeignet.

Wie die Erfahrung zeigt kommt es häufig vor, daß die Enzymzubereitung in löslicher Form eine geringere Wirksamkeit zeigt als die Enzymzubereitung in zellularer Form, wenn da» Isomerisierungsgemisch der Atmosphäre ausgesetzt wird (d. h, wenn Sauerstoff anwesend ist und mit dem Enzym in Berührung treten kann). Eine hierfür vorgeschlagene Erklärung läuft darauf hinaus, daß das Enzym innerhalb der Zellen weder für die Glucose zur Verfügung steht, die isomerisiert werden soll, noch für den Sauerstoff, wie es der Fall ist, wenn das Enzym in löslicher Form vorliegt.

Die Ergebnisse der vorliegenden Versuche zeigen auch, daß die Wirkung der Aufrechterhaltung nichtoxydierender Bedingungen sich zeigt, nachdem der Isomerisierungsprozeß einige Stunden fortgeschritten ist, im allgemeinen etwa 24 Stunden oder mehr.

Beispiel 4
Einstellung der günstigsten pH- und Temperaturwerte

Unter Verwendung in Beispiel 1 beschriebener Technik wurden drei weitere Isomerisierungsversuche durchgeführt, wobei in jedem Versuch eine Enzymzubereitung des zellularen Typs benutzt wurde, deren Herstellung in Übereinstimmung mit Beispiel 1 erfolgte. Bei allen Versuchen wurde Stickstoff eingeleitet, um Luft auszuschließen und über dem Isomerisierungsgemisch eine inerte Atmosphäre zu erzeugen.

Nach einer Isomerisierungszeit von 66 Stunden wurden Proben genommen. Die Werte für Psicose und Lävulose wurden durch quantitative Papierchromatographie erhalten.

Die durch quantitative Papierchromatographie ermittelten Werte für Lävulose schließen die Mannose, Sorbose und Tagatose ein, die vorhanden sein können,

Tabelle IX

da es auf Dapierchromatographischem Wege nicht möglich ist, zwischen diesen vier Zuckern zu unterscheiden. Für quantitative Bestimmungen ist eine säulenchromatographische Trennung der vier Komponenten möglich, aber die Methode der Säulenchromatographie ist nicht für Routineuntersuchungen geeignet, wie sie für industrielle Verfahren erforderlich sind. Zwischen der Bildung von Psicose und der drei Hexosen Mannose, Sorbose und Tagatose besteht aber eine gegenseitige Abhängigkeit. Allgemein gesprochen zeigt ein hoher Psicosewert eine geringe Sirupqualität an, d. h., er ist ein Indikator für das Vorhandensein von Hexosen, die keine Glucose oder Lävulose sind.

Die bei den drei Isomerisierungsversuchen erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle IX zusammengestellt

Temp. °C

Enzymmenge*) Ketose

Psicose

Lävulose

9/1	7,0	65	1,00	39,4	4,4	41,2
9/2	7,0	65	0,77	38,6	1,7	38.1
9/3	6,25	70	O30	383	0,8	39,5

*) Menge Enzymzubereitung, Einheiten/Gramm.

Aus den Ergebnissen der Tabelle DC lassen sich einige wichtige Schlußfolgerungen ableiten.

Aus den Ergebnissen des Versuches 9/1 ist zu ersehen, daß der Prozentgehalt an Ketose nicht gleich der Summe der Prozentgehalte an Psicose und Lävulose ist Da der Prozentgehalt an Ketose, bestimmt nach dem in Beispiel 1 beschriebenen Verfahren, nur mit einer Abweichung von ±5% genau ist (entsprechend ±2%

11 12

absolut bei 40% Ketose), ist die Differenz zwischen dem an Enzymaktivität beobachtet werden. Wenn jedoch

angeführten Ketose-Wert von 39,4% und 45,6% für die Luft (Sauerstoff) ausgeschlossen wird, beispielsweise

Summe der angeführten Werte für Lävulose und dadurch, daß man gasförmigen Stickstoff durch das

Psicose wesentlich größer. Der Grund ist darin zu sehen, Isomerisierungsgemisch hindurchsprudeln läßt, wird der

daß sich einige der Aldohexosen papierchromatogra- 5 Verlust an Enzymaktivität verringert,

phisch nicht von der Lävulose trennen lassen. Diese Der verminderte Verlust an Enzymaktivität erlaubt

Tatsache ist insofern von Bedeutung, weil in der die Erzeugung einer gewünschten Menge Lävulose

Literatur im allgemeinen empfohlen wird, ein pH von unter Verwendung einer geringeren Menge einer

7,0 oder höher während der Isomerisierung anzuwen- gegebenen Enzymzubereitung als es möglich wäre,

den und die Temperatur auf 65° C oder höher 10 wenn nicht unter Luftausschluß gearbeitet wird,

einzustellen, weil man der Ansicht war, daß die Außerdem wird der Anreiz größer, eine Enzymzuberei-

Enzymzubereitung unter diesen Bedingungen eine tung in löslicher Form zu verwenden, weil weniger

höhere Aktivität aufweist. Obwohl dies den Tatsachen Enzymaktivität verloren geht. Darüber hinaus ist die

zu entsprechen scheint, ist die höhere Enzymaktivität Technik, Luft auszuschließen, ein nicht kostspieliges

bei höheren pH-Werten unglücklicherweise mit einer 15 Verfahren, um die Stabilisierung der Enzymzubereitung

stärkeren Bildung von Nebenprodukten verbunden. zu erreichen.

Bei den Versuchen 9/2 und 9/3 wurde annähernd die Außerdem können im Hinblick auf die größere

gleiche Menge Enzymzubereitung angewendet. Bei Enzymstabilität mildere Bedingungen bei der Isomeri-

beiden Versuchen wurde etwa die gleiche Menge sierung angewendet werden, was zur Bildung geringerer

Ketose gebildet, jedoch bei dem höheren pH des 20 Mengen Nebenprodukte führt, die im allgemeinen

Versuchs 9/2 war die gebildete Menge Psicose (und unerwünscht sind. Ein Maximum an Ketose-Lävulose-

deshalb auch anderer Nebenprodukte) deutlich höher. Bildung wird mit einem Minimum an Bildung von

Einer der wichtigen Vorteile, der dadurch erreicht Nebenprodukten erreicht. Durch die Anwendung

wird, daß die Isomerisierung unter Bedingungen milderer Bedingungen für die Isomerisierung wird die

durchgeführt wird, bei denen Luft ausgeschlossen ist, 25 Bildung von Farbstoffkörpern herabgesetzt, so daß die

kann darin gesehen werden, daß die Enzymzubereitung, erhaltenen Produkte in Übereinstimmung mit der

obwohl das pH irn sauren Gebiet liegt, ausreichend vorliegenden Erfindung leichter und weniger aufwendig

lanfee genug stabil bleibt, um eine wesentliche zu raffinieren sind, um ein Erzeugnis bestimmter

Isomerisierung von Glucose zu Lävulose zu erreichen, Qualität zu erhalten. Auf diese Weise ist es möglich,

ohne daß eine stärkere Bildung von Nebenprodukten 30 lävulosehaltige Erzeugnisse mit einem Gehalt von 30%

stattfindet. und mehr Lävulose herzustellen, die weniger als 2%

Wie weitere erfindungsgemäß durchgeführte Versu- Psicose aufweisen und weniger Raffinationsmittel

ehe zeigen, werden die Vorteile der Verwendung einer erfordern.

inerten Atmosphäre in einer großen Zahl von Die größere Wirksamkeit, die durch die Anwendung

Produktionsversuchen ebenso erzielt wie bei den 35 der Erfindung erreicht wird, erlaubt es, entweder die

Versuchen im laboratoriumsmäßigen Maßstab, die in Isomerisierungszeit zu verkürzen oder mit einer

den vorangehenden Beispielen beschrieben worden geringeren Menge Enzymzubereitung auszukommen,

sind. um einen bestimmten Lävulosegehalt zu erreichen.

Wie darüber hinaus weitere Versuche im Rahmen der Ein weiterer wichtiger Vorteil des Verfahrens zeigt

Erfindung ergeben haben, ist die Verwendung einer 40 sich darin, daß die Aufrechterhaltung nichtoxydierender

inerten Atmosphäre ebenso wirksam bei der Isomerisie- Bedingungen offensichtlich die für die Isomerisierung

rung von Lösungen reiner kristallisierter Dextrose, so erforderliche Menge Kobalt herabsetzt. Dies kann

daß der schützende Effekt nicht auf die Isomerisierung hinsichtlich der Kosten während der Isomerisierung und

von Stärkehydrolysat-Sirupen begrenzt ist. insbesondere während der nachfolgenden Raffination

Obwohl Stickstoff und Argon oben besonders als 45 vorteilhaft sein.

geeignete Gase für das Einrichten und Aufrechterhalten Alle diese beobachteten Wirkungen und Vorteile der

der nichtoxydierenden Bedingungen erwähnt worden Erfindung führen dazu, daß das Endprodukt wirtschaftli-

sind, können auch andere Gase, wie beispielsweise eher hergestellt werden kann.

Xenon, Wasserstoff, Methylchlorid, Freon-Erzeugnisse Es ist anzunehmen, daß diese Vorteile erzielt werden

(halogenierte Kohlenwasserstoffe), Kohlenmonoxid, 50 können, wenn das Verfahren mit Glucoseisomerase-Zu-

Helium, Krypton, Butan, Propan, Methan, Äthan, bereitungen jeder bekannten Herkunft durchgeführt

Schwefelwasserstoff, Stickstoffoxid und Äthylen, ver- wird. Ohne einer bestimmten Theorie den Vorzug zu

wendet werden. Auch Kohlendioxid kann benutzt geben, ist anzunehmen, daß der Schutz der Enzymzube-

werden, aber es wirft das Problem der Aufrechterhai- reitung vor der Einwirkung von Sauerstoff für die

tung des pH-Wertes auf. Andererseits sollten Chlor und 55 erreichten Vorteile verantwortlich ist Der Grund

andere gasförmige Halogene vermieden werden, weil hierfür mag in einer verstärkten Stabilität der

sie mit dem Enzym reagieren. Enzymzubereitung hinsichtlich ihrer Aktivität zu suchen

Die Vorteile, die durch die Anwendung der sein.

vorliegenden Erfindung erreicht werden, sind vom In den vorstehenden Beispielen und in der Beschreiwirtschaftlichen Standpunkt aus von außerordentlicher 60 bung ist die Erfindung im Hinblick auf spezielle Bedeutung. Üblicherweise kann bei der Durchführung Ausführungsformen beschrieben worden. Selbstvereiner Isomerisierung, wie beispielsweise bei der ständlich schließt der Erfindungsgedanke weiterer Isomerisierung eines 95-D.R-Stärkehydrolysats zur Modifikationen ein. Durch die Beispiele wird die Herstellung eines isomerisierten Gemisches mit einem Erfindung nur erläutert aber nicht begrenzt
Gehalt von 40 bis 45% Lävulose, ein deutlicher Verlust 65

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur enzymatischen Isomerisierung von Glucose in Lävulose, bei dem eine glucosehaltige Lösung der Einwirkung eines Glucoseisomerase-Enzympräparats ausgesetzt wird, dadurch gekennzeichnet, daß man aus der glucosehaltigen Lösung Sauerstoff verdrängt und die Lösung während der enzymatischen Isomerisierung unter nichtoxydierenden Bedingungen hält und ein lävulosehaltiges Isomerisierungsprodukt gewinnt, das, jeweils bezogen auf Trockensubstanz, mindestens 30 und insbesondere 40 bis 45 Gew.-% Lävulose und weniger als 2Gew.-% Psicose enthält und das gegebenenfalls einer Raffination unterworfen wird.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die nichtoxydierenden Bedingungen durch kontinuierliches Durchleiten eines Inertgases durch die glucosehaltige Lösung während der enzymatischen Isomerisierung aufrecht erhält.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als Inertgas Stickstoff oder Argon verwendet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die enzymatische Isomerisierung bei einem pH-Wert von etwa 6,25 bis 7 und einer Temperatur von etwa 60 bis 70⁰C durchführt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert durch Einverleiben von Natriumbicarbonat in die glucosehaltige Lösung steuert.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Glucoseisomerase-Enzympräparat verwendet, das aus einem Streptomyces-Mikroorganismus, insbesondere Streptomyces olivochromogenes, gewonnen ist.

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als glucosehaltige Lösung ein Stärkehydrolysat mit einem D.E.-Wert von etwa 95 und als Enzympräparat ein solches mit Glucoseisomerase in unlöslicher Form verwendet und die enzymatische Isomerisierung von Glucose in Lävulose kontinuierlich durchführt.

8. Lävulosehaltiges Isomerisierungsprodukt mit _4S einem Gehalt von mindestens 30 und insbesondere 40 bis 45Gew.-% Lävulose und weniger als 2 Gew.-% Psicose, jeweils bezogen auf Trockensubstanz, hergestellt nach Ansprüchen 1 bis 7.

50