DE3784792T2

DE3784792T2 - Biochemisches verfahren.

Info

Publication number: DE3784792T2
Application number: DE8787201286T
Authority: DE
Inventors: John Antony Schofield
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1986-07-08
Filing date: 1987-07-07
Publication date: 1993-06-24
Anticipated expiration: 2007-07-08
Also published as: EP0252567B1; CA1280706C; BR8703460A; EP0252567A2; EP0252567A3; US4863861A; DE3784792D1

Description

Die vorliegende Erfindung bezeiht sich auf ein biochemisches Verfahren zur Herstellung von Brenzcatechinen und/oder Dihydrodiolen.
Die mikrobielle Oxidation von Benzol ist gut bekannt. Beispielsweise ist aus den Arbeiten von Gibson et al., Biochemistry, 7(7), 1968, S. 2653; und Biochemistry, 9(7), 1970, S. 1631, bekannt, daß der Organismus Pseudomonas putida Benzol und bestimmte substituierte Benzole zu ihren entsprechenden Dihydrodiolen, Brenzcatechinen und weiteren Abbauprodukten metabolisieren kann. Für Benzol wird angenommen, daß der Metabolismus einer Enzym-katalysierten Reaktionssequenz folgt, worin Benzol durch eine Dioxygenase in cis-1,2-Dihydroxy-cyclohexa-3,5-dien (manchmal als "cis-Benzolglykol" oder "Benzoldihydrodiol" bezeichnet) umgewandelt wird, das unter der Einwirkung einer Dioldehydrogenase in Brenzcatechin umgewandelt wird, welches enzymatisch in weitere Abbauprodukte übergeführt wird. Es wird angenommen, daß ein ähnlicher Ablauf für einen Toluol-Metabolismus unter Anwendung von Pseudomonas putida auftritt (Gibson et al., Biochemistry, 9(7), 1970, S. 1627).
Obgleich die Dihydrodiole und Brenzcatechine nützliche Produkte darstellen würden, hat es sich jedoch als schwierig erwiesen, die Reaktion so zu steuern, daß eine ausreichende Ausbeute der gewünschten Verbindung als ein Reinprodukt erhalten wird. Das europäische Patent Nr. 76 606 beschreibt einen Versuch zur Schaffung eines effizienten Verfahrens zur Herstellung nützlicher Produkte.
Es wurde nun eine spezielle Kohlenstoffquelle gefunden, die eine überraschend wirksame und billige Produktion von nützlichen Produkten ermöglicht.
Demgemäß schafft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Brenzcatechins und/oder einer einen 1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien-Ring aufweisenden Verbindung, welches Verfahren ein Vermehren eines Stammes von Pseudomonas putida in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle umfaßt, wobei der Mikroorganismus zur Umwandlung von Benzol, Fluorbenzol oder Trifluormethylbenzol in das Brenzcatechin und/oder die einen 1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien-Ring enthaltende Verbindung befähigt ist; sowie ein Zuführen der entsprechenden aromatischen Verbindung zu dem Mikroorganismus umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle eine Melasse ist.
Die Melasse kann eine Rohrzuckermelasse, eine Rübenzuckermelasse, Maismelasse, Zitrusfruchtmelasse, Hirsekornmelasse, Sorgomelasse oder Holzmelasse sein. Derartige Produkte werden in Kirk-Othmer, "Encyclopedia of Chemical Technology", 2. Aufl., Interscience Publishers, New York, unter dem Stichwort "MOLASSES" in Band 13, Seiten 613 bis 633, beschrieben. Vorteilhafterweise ist die Melasse eine Rohrzuckermelasse oder eine Rübenzuckermelasse. Rohrzuckermelassen umfassen erste Melasse, zweite Melasse, End- oder Restmelasse, Raffineriemelasse, high-test-Melasse und distillers' solubles. Rübenzuckermelassen umfassen Endmelassen, Abfallmelasse und Steffen's-Abfall.
Rohrzuckermelasse ist die am meisten bevorzugte Melasse, und die am leichtesten verfügbare Form von Rohrzuckermelasse in großen Mengen ist End- oder Restmelasse.
Der Erfolg von Melasse im Verfahren gemäß der Erfindung ist besonders überraschend, weil ein Zucker wie Glucose (die einen Bestandteil der Melasse darstellt) als ein Enzymsynthese-Repressor wirkt und bei Einsatz als Kohlenstoffquelle im vorstehenden Verfahren einen sehr niedrigen Produktionsgrad an den gewünschten Verbindungen ergibt. Da Melasse ein verhältnismäßig billiges Material darstellt, hat es als Kohlenstoffquelle kommerzielle Vorteile.
Die als Einsatzmaterial verwendete Verbindung kann Benzol sein, was zur Bildung von Brenzcatechin und/oder cis-1,2-Dihydroxy-cyclohexa-3,5-dien führt. Ein bevorzugtes Ausgangsmaterial ist jedoch Fluorbenzol, das zur Bildung von 3-Fluorbrenzcatechin und/oder cis-1,2-Dihydroxy-3-fluorcyclohexa-3,5-dien führt, bei denen es sich um nützliche Zwischenprodukte für die Herstellung von beispielsweise Pharmazeutika und fluororganischen Agrochemikalien handelt. Die chemische Herstellung von 3-Fluorbrenzcatechin ist schwierig, und diese Substanz ist teuer. Ein weiteres geeignetes Ausgangsmaterial ist Trifluormethylbenzol.
Der speziell ausgewählte Mikroorganismus wird natürlich vom gewünschten Produkt abhängen. Es sind verschiedene Mikroorganismen verfügbar, die vorwiegend ein Brenzcatechin, insbesondere ein Dihydrodiol, oder ein Gemisch bilden können. Der optimale Mikroorganismus wird natürlich auch in Abhängigkeit von der als Einsatzmaterial gewählten aromatischen Verbindung variieren.
Ein bevorzugter Mikroorganismus, der Benzol, Fluorbenzol oder Trifluormethylbenzol als Ausgangsmaterial verarbeiten kann, ist jener, der mit Wirkung vom 6. Dezember 1985 bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, Aberdeen, Scotland, deponiert worden ist und die numerische Bezeichnung NCIB 1219O erhalten hat und hier als "P.putida NCIB 12190" bezeichnet wird. Weiterhin sind Mutaten dieses Mikroorganismus sehr nützlich. Weitere besonders geeignete Mikroorganismen sind jene, die im europäischen Patent Nr. 76 606 beschrieben sind, beispielsweise Mutanten von Pseudomonas putida NCIB 11767 oder Pseudomonas putida NCIB 11680.
In der paralleleln Anmeldung (Referenz K 1033) werden Pseudomonas putida NCIB 12190 und deren Mutanten beschrieben und beansprucht. Bestimmte dieser Mikroorganismen sind für die benötigten Enzyme in der Herstellung von bestimmten Brenzcatechinen und/oder Dihydrodiolen konstitutiv.
Pseudomonas putida NCIB 12190 wurde aus einer Bodenprobe, die aus dem Erdreich innerhalb der Shell Raffinierie in Pernis, Rotterdam, entnommen worden war, isoliert.
Mutante Stämme von Pseudomonas putida NCIB 12190, die zum Ansammeln von cis-Dihydroxycyclohexadien oder Brenzcatechin oder ihren fluorierten Analoga befähigt sind, wenn sie in Gegenwart von Benzol oder Fluorbenzol vermehrt werden, können nach einem Auswahlverfahren erhalten werden, das ein Mutieren von Psuedomonas putida NCIB 12190 durch chemische oder physikalische Mittel, ein Wachsenlassen der mutierten Bakterien in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle, ein Einwirkenlassen der vermehrten Bakterien auf Benzol oder Fluorbenzol und ein Auswählen jener mutierten Stämme von Pseudomonas putida umfaßt, die cis-Dihydroxycyclohexadien oder Brenzcatechin oder ihre fluorierten Analoga angesammelt haben.
Es können geeignete Komponenten des Mediums, das für die biochemisch katalysierte Oxidation einer aromatischen Verbindung verwendet wird, ausgewählt werden, um die Umwandlung zu den gewünschten Produkten zu optimieren und den Abbau zu Muconsäure und zu weiteren Abbauprodukten zu minimieren. Ein geeignetes Medium ist ein Stickstoff-freies Salzmedium, für das nachstehend ein Beispiel angegeben wird.
Aus der resultierenden Fermentationsbrühe können die gebildete Verbindung bzw. die gebildeten Verbindungen nach allen geeigneten Methoden gewonnen werden, wie durch Lösungsmittelextraktion, oder durch Adsorption an granulierte Kohle, gefolgt von einem Strippen mit einem geeigneten Lösungsmittel und von einer weiteren Reinigung, wie sie in Abhängigkeit vom beabsichtigten Gebrauch des Produktes erforderlich sein kann.
Nach einem weiteren bevorzugten Merkmal kann, insbesondere bei einem Arbeiten mit Benzol als Ausgangsmaterial, ein Proteinsynthese-Inhibitor in die Kultur eingebracht werden, um die Synthese von Abbauenzymen zu inhibieren und solcherart die Ansammlung von Produkten im Reaktionsgemisch zu steigern. Ein bevorzugter Proteinsyntheseindhibitor ist Chloramphenicol, doch können andere bakteriostatische Antibiotika, wie Tetracyclin, verwendet werden, die ein Enzymwachstum inhibieren, die im Verfahren eingesetzten Zellen aber nicht abtöten. Die Notwendigkeit, einen Proteinsyntheseinhibitor zu verwenden, hängt vom Ausgangsmaterial und von der Leichtigkeit ab, mit welcher die Abbaustufen über die gewünschten Produkte hinaus auftreten können. Während die Verwendung eines derartigen Inhibitors bei Einsatz von Benzol als Ausgangsmaterial bevorzugt wird, ist dies im Falle von Fluorbenzol als Ausgangsmaterial nicht erforderlich.
In bevorzugten Ausführungsformen des vorstehend beschriebenen Verfahrens ist keine Induktion von Enzymen notwendig, um eine Kultur zu ergeben, die das gewünschte Produkt produzieren kann. Das Anfangswachstum unter Verwendung von Kohlenstoffquellen wie Benzol und Toluol wird somit vermieden, was den Reaktoraufbau vereinfachen kann, weil keine Fermenter benötigt werden, die zur Vermeidung des Entweichens von Benzol geeignet sind. Darüber hinaus wird das Vorliegen von unerwünschten Chemikalien im Reaktionsgemisch vermieden.
Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Colorimetrische Bestimmung von cis-Dihydroxycyclohexadienen und Brenzcatechinen.

Es wurde die Methode nach Freistad et al., Analytical Chemistry 41, 1969, Seiten 1750-1754, angewendet. Die auf Brenzcatechine zu testenden Lösungen wurden mit einem gleichen Volumen an 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazon-hydrochlorid (0,05 % Gew./Vol. in Wasser) und mit einem gleichen Volumen an Cerammoniumsulfat (0,2 % Gew./Vol. in 0,4 % Gew./Vol. Schwefelsäure) vermischt. Gegebenenfalls wurde nach einigen wenigen Minuten ein Borat-NaOH-EDTA-Puffer zugesetzt, wie von Freistad et al. beschrieben. Die Intensitäten der entwickelten Farben wurden visuell verglichen oder in alternativer Weise spektrophotometrisch bei 520 nm gemessen. Unter diesen Bedingungen entwickeln cis-Dihydroxycyclohexadiene keine Farben. Eine zweite Probe jeder Testlösung wurde daher mit Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure vor dem Farbtest angesäuert, um die Dihydroxycyclohexadiene quantitativ in Phenole überzuführen. Der Unterschied an Farbintensität zwischen den angesäuerten und den nicht angesäuerten Proben ist ein Hinweis auf den Gehalt an Dihydroxycyclohexadienen.

Verwendete Medien

Die Zusammensetzungen von zwei der in den folgenden Beispielen verwendeten Wachstumsmedien sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben.
ASM - Minimalsalzmedium
NFSM - stickstofffreies Salzmedium Tabelle 1: Mengen je Liter

Zusammensetzung der TK/3-Spurenelementelösung:

Diese enthielt je Liter die folgenden Komponenten:
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O (O,288 g); MnSO&sub4;.4H&sub2;O (O,224 g); H&sub3;BO&sub3; (O,O618 g); CuSO&sub4;.5H&sub2;O (O,1248 g); Na&sub2;MoO&sub4;.2H&sub2;O (O,O484 g); CoCl&sub2;.6H&sub2;O (O,O476 g); KJ (O,O83 g); 1M H&sub2;SO&sub4; (1 ml).

Weitere verwendete Wachstumsmedien waren:

dYT-Medium ----- 16 g Bacto-Trypton
1O g Bacto-Hefeextrakt
5 g NaCl/l
Hefeextraktmedium (YEM) 1O g Dinatriumsuccinat.6H&sub2;O
2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4;
3 g/l Hefeextrakt (Difco)
O,4 g/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O
O,O4 g/l Bacto-Pepton in 25 mM Kaliumphosphatpuffer End-pH 7,O.

Dünnschichtchromatographie (TLC)

Wäßrige Proben (5ul) wurden auf Merck-Kieselgel 60 F254-Platten laufen gelassen, die mit n-Propanol-Wasser-Ameisensäure 90:10:1 (Vol./Vol.) entwickelt wurden. Der Dihydroxycyclohexadien-Gehalt wurde unter kurzwelligem UV-Licht sichtbar gemacht und das Brenzcatechin wurde durch Besprühen mit 2,6-Dichlorchinon-4-chlorimid (2% in Ethanol) detektiert.

Gaschromatographie (GC)

Wäßrige Proben (0,5 ul) wurden an einer flexiblen 25 m Hewlett-Packard Siliciumdioxid-Kapillarsäule von hoher Kapazität, beschichtet mit 5% Phenylmethylsilikon, unter Verwendung von Helium als Trägergas chromatographiert. Die Säule wurde auf 130ºC gehalten, und die eluierten Verbindungen wurden mit einem Flammenionisationsdetektor bestimmt.

Beispiel 1 - Herstellung von NTG-Mutanten von P.putida NCIB 12190

Pseudomonas putida NCIB 1219O wurde über Nacht bei 3OºC in dYT-Medium vermehrt. Von der Kultur wurden Unterkulturen 1/2O in 1O ml frischem dYT angesetzt und weitere 4 Stunden lang inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren geerntet, in NFSM gewaschen und nochmals durch Zentrifugieren geerntet,bevor sie in NFSM (3 ml) resuspendiert wurden und die optische Dichte bei 600 nm auf 3,O eingestellt wurde.
Ein 1 ml-Aliquot wurde bei 3OºC 15 Minuten lang in einem "Eppendorf"-Rohr inkubiert und dann wurde NTG (N-Methyl-N'-nitro- N-nitrosoguanidin, 5 mg/ml in Dimethylsulfoxid) zugesetzt, um 5O ug/ml zu ergeben. Der Inhalt des Rohres wurde kurz gemischt und 15 Minuten bei 3OºC inkubiert. Die Mutation wurde durch Abkühlen in Eis, Zentrifugieren und dreimaliges Waschen in O,85%iger NaCl-Salzlösung gestoppt. Die Bakterien wurden in Salzlösung verdünnt und O,1 ml-aliquote Anteile wurden auf 1OO ASM-Platten ausplattiert, die jeweils O,O5% Natriumsuccinat enthielten. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 3OºC inkubiert.
Nach dem Inkubieren waren auf den Platten kleine "Mikro"-Kolonien sichtbar, da der Succinatgehalt nur für ein kleines Ausmaß des Wachstums ausreichte. Die Platten wurden dann 24 Stunden lang bei 3OºC Benzoldampf ausgesetzt, was zu einer großen Varietät von auf den Platten sichtbaren Koloniengrößen führte. In einem ersten Selektionsverfahren wurden kleine Kolonien auf den Platten (die wegen ihres Unvermögens, auf Benzol zu wachsen, klein sind) (2O bis 3O/Platte) unter Verwendung steriler Cocktailspießchen aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Titertek) mit einem Gehalt an 5O ul ASM + O,5 % Natriumsuccinat je Vertiefung verteilt. Die Platten wurden über Nacht bei 3OºC in einem verschlossenen Kasten inkubiert, um eine Verdampfung zu verhindern, und die Mikrotiterplatten wurden auf quadratische (12O mm) Platten aus handelsüblichem Nährager (Oxid, für Kontrollversuche) unter Verwendung einer Repliziervorrichtung mit 96 Spitzen repliziert. Die Agarplatten wurden über Nacht inkubiert und die Mikrotiterplatten wurden 3 Stunden lang Benzoldampf ausgesetzt. Die anschließende Prüfung erfolgte nach der oben beschriebenen colorimetrischen Methode. Jene Mutanten, die die intensivste Farbe entwickelten, wurden für ein weiteres Testen ausgewählt.
Die Organismen-Kandidaten aus dem Anfangsauswahlverfahren wurden als gereinigte Kulturen auf Agarplatten erhalten und in 1,5 ml eines ASM-Mediums überimpft (ergänzt mit einem Spurenelementgemisch, Fe²&spplus; 20 uMol und Natriumsuccinat 5 g/l). Die Kulturen wurden über Nacht in schräg rotierenden Teströhrchen bei 30ºC vermehrt, zentrifugiert, die Überstände wurden verworfen und die Zellen wurden in 0,25 ml ergänztem ASM in Teströhrchen resuspendiert, die nahezu horizontal in einem Tank mit Benzoldampf auf einer Rüttelplattform bei Raumtemperatur angeordnet waren.
Nach einer bestimmten Benzol-Einwirkungszeit (üblicherweise 3 und/oder 5 bis 6 Stunden) wurden zwei 0,5 ml-Proben aus jeder Kultur zum Farbtesten nach der oben beschriebenen colorimetrischen Methode entnommen. Zu einer dieser Proben wurden 10 ul 5M HCl zugefügt, um etwa vorliegendes cis-Dihydroxycyclohexadien in Phenol überzuführen. 5 ul-Proben wurden an Luft belassen, und am nächsten Tag wurde eine End-Dünnschichtprobe genommen.
Zu Vergleichszwecken wurden in jeden getesteten Ansatz zwei Kulturen von Wildtyp-P.putida NCIB 12190 einbezogen, wobei zu einer dieser beiden Kulturen vor der Einwirkung von Benzol Chloramphenicol (0,1 mg/ml) zugesetzt worden war. Die Farben und TLC-Flecken wurden verglichen und auf einer 8-Punkte-Skala von - bis +++ bewertet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 angeführt. Es wurde eine gute Reproduzierbarkeit gefunden. TABELLE 2 3 h Benzoleinwirkung 5-6 h Benzoleinwirkung Mutante Farbtest TLC (nächster Tag) + Säure ohne Säure Dien Brenzcatechin KONTROLLEN Chloramphenicol CIS-DIHYDROXYCYCLOHEXADIEN-PRODUZENTEN NTG-Mutante TABELLE 2 (Fortsetzung) 3 h Benzoleinwirkung 5-6 h Benzoleinwirkung Mutante Farbtest TLC (nächster Tag) + Säure ohne Säure Dien Brenzcatechin BRENZCATECHIN-PRODUZENTEN NTG-Mutante

Beispiel 2 Verwendung des NTG-Mutanten F in der Herstellung von 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-dien unter Einsatz von Melasse als Kohlenstoffquelle

Ein YEM entsprechendes Medium, mit dem Unterschied, daß es kein Succinat enthielt (pH 7,0; 8 Liter), wurde mit 240 g Zuckerrohrmelasse ergänzt und mit einer Schüttelkolbenkultur von NTG-Mutant F beimpft. In das gerührte Gemisch (500 UpM) wurde Luft mit einer Geschwinigkeit von 500 ml/min während 20 h eingeführt. Während der letzten 16 h Vermehrungsdauer wurde dem Fermenter eine Lösung von Zuckerrohrmelasse (500 g/l) und Ammoniumsulfat (50 g/l) in 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) mit einer Geschwindigkeit von 40 ml/h zugeführt. Der pH-Wert der Brühe wurde durch Zugabe von 10%igem wäßrigem Natriumhydroxid mittels eines Überwachungssystems auf etwa 7,0 gehalten.
Nach 20 h Inkubation wurden 5 l Brühe entnommen und der Rest wurde mit 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 5 l) mit einem Gehalt an 5 g Ammoniumsulfat verdünnt. Das Gemisch wurde belüftet (750 ml/min; 600 UpM) und 0,2 ml Fluorbenzol wurden zugesetzt. Eine Lösung von 250 g/l Rohrzuckermelasse und 25 g/l Ammoniumsulfat in 25 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) wurde in einer Menge von 40 ml/h zugesetzt, und Fluorbenzol wurde in einer Menge von 50 ul/min zugefügt. Die Lufteinspeisung und das Rühren wurden so eingestellt, um eine positive Sauerstoffspannung (etwa 30 %) aufrecht zu erhalten. Nach 5 h wurde die Lufteinspeisung auf 800 ml/min erhöht und weitere 15 h auf diesem Wert gehalten.
Das Produkt erreichte einen Wert von über 9 g/l und wurde durch Absorption an Kohle aus der Brühe isoliert. Die Elution der Kohle mit Ether/Methanol ergab das Produkt 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5- dien (46 g).

Beispiel 3 (zum Vergleich)

Verwendung des NTG-Mutanten F in der Herstellung von 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-dien unter Einsatz von Succinat als Kohlenstoffquelle

8 Liter YEM wurden in einem Rührfermenter mit einer 20 Stunden Schüttelkolbenkultur von NTG-Mutant F beimpft, der auf dem gleichen Medium gezüchtet worden war (5O ml). Der Organismus wurde unter den Belüftungsbedingungen von 5OO ml). Der Organismus wurde unter den Belüftungsbedingungen von 5OO Umdrehungen je Minute und 5OO ml Luft je Minute 19 Stunden lang bei kontinuierlicher Einspeisung von konzentrierter Nährquelle (32O g Dinatriumsuccinat und 64 g Ammoniumsulfat in 1 Liter O,O25 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,2) mit 4O ml/Stunde gezüchtet. Der Sauerstofftransfer wurde durch Erhöhen der Rührergeschwindigkeit auf 55O Umdrehungen je Minute und der Belüftungsrate auf 7OO ml Luft/Minute während 3O Minuten gesteigert und dann auf die Parameter 5OO Umdrehungen je Minute: 6OO ml Luft/Minute; Sauerstoffgleichgewichtsspannung 3O % anfangsgesättigte Luft eingestellt.
Das Fluorbenzol wurde mit einer Pumpe (Gilson Modell 3O2) mit 5O ul/min zudosiert (Gleichgewichtskonzentration in der Reaktion 1OO bis 125 mg/l). Vor der Reaktion wurde die optische Dichte mit 3,11 bestimmt, entsprechend einem Trockenzellengewicht von 3,9 g/l. Die Produktion von 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-dien wurde gaschromatographisch füberwacht und die Konzentration erreichte nach 24 Stunden 2,8 g/l, verglichen mit über 9 g/l in Beispiel 2.
Das Produkt wurde auf granulierter Kohle absorbiert und von der Kohle durch Extraktion mit einem Gemisch aus Diethylether und Methanol (Volumenverhältnis 4:1) in einer Soxhlet-Vorrichtung gewonnen. Das Verdampfen des Lösungsmittels hinterließ einen Feststoff, der aus einem Gemisch aus Diethylether und Pentan umkristallisiert wurde und farblose Nadeln vom F. 73 bis 74ºC (Zersetzung) ergab.
UV-Spektrum (H&sub2;O):λmax 259 nm (&epsi;315O).
Zirkulardichroismus: (H&sub2;O):λmax 255 nm (Δ&epsi;- 1,9).
Massenspektrum: m/z 13O (15%, M&spplus;), 112 (65 %), 84 (1OO %).
¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;): δ5,88 (1H, mult, J = 1O, 6,5, 6, 2 Hz; 5-C-H), 5,71 (1H, dd, J = 1O, 3 Hz; 6-C-H), 5,6O (1H, dd, J = 11, 6,5 Hz; 4-C-H), 4,51 (1H, br.mult, J = 6, 3,2 Hz; 1-C-H), 4,29 (1H, tr, J = 6, 6 Hz; 2-C-H), 2,4O (2H, br.s, O-H) ppm.

Beispiel 4 Herstellung von cis-1,2-Dihydroxy-3-trifluormethylcyclohexa- 3,5-dien

50 ml eines Mediums, das YEM entsprach, in dem jedoch Succinat durch Melasse mit 30 g/l ersetzt worden war, wurde mit pseudomonas putida NCIB 12190 beimpft und in 250 ml-Kolben 17 h lang bei 30ºC auf einer Schüttelvorrichtung inkubiert. 0,1 ml Benzotrifluorid wurden zugesetzt, und der Kolben wurde dann verschlossen und weiter auf der Schüttelvorrichtung bei 30ºC inkubiert. Die GLC zeigte das Vorliegen von 0,62 g/l des gewünschten Produktes.

Beispiel 5 Herstellung von cis-1,2-Dihydroxy-3-trifluormethylcyclohexa- 3,5-dien

Die Vorgangsweise von Beispiel 4 wurde unter Verwendung von 12,7 g/l Melasse wiederholt. Die Endkonzentration des gewünschten Produktes lag bei 0,55 g/l

Beispiel 6 (Vergleichsbeispiel)

Herstellung von cis-1,2-Dihydroxy-3-trifluormethylcyclohexa-3,5-dien

Die Methode der Beispiele 4 und 5 wurde wiederholt, unter Verwendung von 10 g/l D-Glucose anstelle von Melasse als Kohlenstoffquelle. Es wurden nur 0,04 g/l des gewünschten Produktes produziert.

Beispiel 7 Herstellung von cis-1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien

Eine 50 ml-Schüttelkolbenkultur des NTC-Mutanten F, gezüchtet während 18 h auf einem Medium, das
Melasse 14 g/l
Hefeextrakt 3 g/l
Ammoniumsulfat 2 g/l
Magnesiumsulfatheptahydrat 0,4 g/l
Bactopepton 0,04 g/l
in 25 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,2, enthielt, wurde zum Beimpfen von 7,5-8 l eines Mediums verwendet, das in 25 mM Kaliumphosphat, pH 7,2,
150 g Rohrzuckermelasse
24 g Hefeextrakt
16 g Ammoniumsulfat
3,2 g Magnesiumsulfatheptahydrat
0,32 g Bactopepton
enthielt.
Die Kultur wurde über Nacht bei 400 UpM vermehrt, während Luft mit 400 ml/min zugeführt wurde. Die Temperatur wurde auf 30ºC geregelt und der pH-Wert wurde durch Zusatz von verdünntem Ammoniak (1:3,880 Wasser), je nach Bedarf, auf 7,0 ± 0,1 gehalten. Während der Wachstumsperiode, die 16 h dauerte, wurde eine Einspeisung von Melasse (200 g/l) und Ammoniumsulfat (50 g/l) mit 40 ml/h vorgenommen. Nach dieser Periode wurde die Einspeisung abgebrochen und die Kultur aktiviert, indem die Rührergeschwindigkeit und die Belüftungsrate auf 600 UpM und 500 ml/min während 45 min angehoben wurden. Sobald diese Phase abgelaufen war, wurde die Einspeisung von Melasse und Ammoniumsulfat im gleichen Ausmaß (40 ml/h) wieder aufgenommen, und Benzol wurde der gerührten Kultur in einem zwischen 50 und 150 ul/min variierenden Ausmaß zugeführt. Die Luftzufuhr und die Rührergeschwindigkeit wurden zwischen 1000 und 500 ml/min bzw. 800 und 600 UpM variiert, um eine Spannung von gelöstem Sauerstoff auf 30-50% Sättigung aufrecht zu erhalten. Bei einem auf 50-100 mg/l gehaltenen Anteil an gelöstem Benzol stieg unter diesen Arbeitsbedingungen die Anhäufung von cis-Benzolglykol auf 6,3 g/l in 24 h, wie gaschromatographisch gemessen wurde.
Pseudomonas putida NCIB 1219O wurde von der NCIB wie folgt charakterisiert und identifiziert:
Die Versuche wurden bei 25ºC ausgeführt und das Wachstum erfolgte auf einem LAB M Nährager, soferne nichts anderes angegeben ist.

Zellmorphologie:

Nach 24 stündigem Wachstum bei 3OºC auf Succinatagar, übertragen auf Nährbrühe + O,75 Gew.-% Agar, zeigten sich die Zellen im Phasenkontrast bei 63Ofacher Vergrößerung als kleine kurze Stäbe oder Kokken in Clustern.

Grammnegativ

Sporen -
Beweglichkeit +

Morphologie der Kolonien

Nach 48stündiger Vermehrung sind die Kolonien rund, gleichmäßig, ganz, glatt, opak, mäßig konvex, gebrochen weiß und kleiner als 1 mm im Durchmesser.

Wachstum auf Glucose - Pepton - Wasser -Zucker

37ºC +
41ºC -
Katalase +
Oxidase, Kovacs +
O - F-Glucose Oxidativ
"O-F Glucose" wurde unter Anwendung des Oxidations-Fermentations-Mediums von Hayward und Hodgkiss, J. Gen. Microbiol. 26 (1961) 133 - 14O, ergänzt mit 1 Gew.-% filtersterilisierter D-Glucose, ausgeführt. Eine Probe wurde beimpft und 14 Tage lang inkubiert.
Pseudomonas Putida NCIB 1219O kann in bequemer Weise auf Schrägnähragar bei 4ºC oder als gefriergetrocknetes Material gelagert werden.

Claims

1. Verfahren zur Herstellung eines Brenzkatechins und/oder einer einen 1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien-Ring aufweisenden Verbindung, welches Verfahren ein Vermehren eines Stammes von Pseudomonas putida in Gegenwart einer Kohlenstoffquelle umfaßt, wobei der Mikroorganismus zur Umwandlung von Benzol, Fluorbenzol oder Trifluormethylbenzol in das Brenzkatechin und/oder die einen 1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien-Ring enthaltende Verbindung befähigt ist; sowie ein Zuführen der entsprechenden aromatischen Verbindung zu dem Mikroorganismus umfaßt; dadurch gekennzeichnet, daß die Kohlenstoffquelle eine Melasse ist.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus Pseudomonas putida NCIB 12190 oder eine Mutante hievon ist.

3. Verfahren nach Anspruch 1, worin der Mikroorganismus eine Mutante von Pseudomonas putida NCIB 11767 oder Pseudomonas putida NCIB 11680 ist.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, worin die Melasse eine Zuckerrübenmelasse oder Rohrzuckermelasse ist.