DE3781055T2

DE3781055T2 - Cyclische dihydroxyverbindungen.

Info

Publication number: DE3781055T2
Application number: DE8787304879T
Authority: DE
Inventors: Stephen Colin Taylor; Michael Drysdale Turnbull
Original assignee: Imperial Chemical Industries Ltd
Current assignee: Syngenta Ltd
Priority date: 1986-06-19
Filing date: 1987-06-02
Publication date: 1993-03-25
Anticipated expiration: 2007-06-03
Also published as: DE3778431D1; EP0250122A3; DE3781055D1; ATE75257T1; EP0250122A2; GB8614925D0; USRE33307E; JPH089560B2; JPS633785A; EP0250122B1; JPS635044A; EP0253485A3; US4740638A; ATE79366T1; EP0253485A2; US4877740A; EP0253485B1

Description

Diese Erfindung betrifft neue cyclische Dihydroxyverbindungen und ein Verfahren zu ihrer Herstellung.
Bestimmte cis-1,2-Dihydroxycyclohexadiene sind bei der Herstellung von neuen Polymeren brauchbar. In unserer Europäischen Patentschrift Nr. 76606 B offenbaren wir ein Verfahren zur Herstellung solcher Dihydroxycyclohexadiene aus aromatischen Verbindungen unter Verwendung von Mutantenstämmen der Art Pseudomonas putida, insbesondere von Mutanten der P. putida-Stämme NCIB 11767 und NCIB 11680. Das Enzym, das die Reaktion katalysiert, die in dieses Verfahren einbezogen ist, ist eine Aromaten-Dioxygenase, die eine Reaktion zwischen bestimmten aromatischen Verbindungen und Sauerstoff, beispielsweise die nachstehende Reaktion zwischen Benzol und Sauerstoff, katalysiert.
Wenn Stämme wie z. B. P. putida NCIB 11767 und NCIB 11680 mit Aromaten gefüttert werden, häufen sich die Dihydroxycyclohexadien-Verbindungen nicht an, weil sie schnell über Brenzcatechine weiter zu Produkten des Zwischenstoffwechsels oxidiert werden. Wir beschreiben jedoch in unserer Europäischen Patentschrift 76606, wie Mutanten dieser Mikroorganismen hergestellt werden können, die nicht fähig sind, die Dihydroxycyclohexadiene zu oxidieren, und diese Verbindungen häufen sich infolgedessen an, wenn solche Mutanten aromatischen Substraten ausgesetzt werden. Einige dieser Mutanten müssen in Gegenwart von Benzol oder Toluol vermehrt werden, wenn die Aktivität des Enzyms Aromaten-Dioxygenase, das benötigt wird, um Aromaten in Dihydroxycyclohexadiene umzuwandeln, zu induzieren ist. Einige dieser Mutanten sind konstitutiv für das Enzym, das die Erzeugung der Dihydroxycyclohexadiene verursacht ("konstitutive Stämme"). Diese konstitutiven Stämme benötigen keine vorausgehende Enzyminduktion durch Benzol oder Toluol, um Dihydroxycyclohexadiene zu erzeugen.
In der Europäischen Patentanmeldung 250122, die dieselbe Priorität wie diese Anmeldung beansprucht, offenbaren wir ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von Zellen von Pseudomonas putida, die ein Enzym enthalten, das fähig ist, eine aromatische oder substituierte aromatische Verbindung in eine entsprechende cyclische Dihydroxyverbindung umzuwandeln, die einen 1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-dien-Ring enthält, bei dem Zellen eines ersten Mutantenstammes von Pseudomonas putida (wie nachstehend definiert) in einem Nährmedium vermehrt werden, das eine von Benzol und Toluol verschiedene Induktorverbindung enthält, die eine Induktion des Enzyms verursacht, das fähig ist, die aromatische oder substituierte aromatische Verbindung in die entsprechende cyclische Dihydroxyverbindung umzuwandeln, und die selbst kein Substrat für das erwähnte Enzym ist.
Alternative Verfahren zur Herstellung von cyclischen Dihydroxyverbindungen aus Aromaten, die in der Literatur beschrieben sind, schließen die ein, die von D.T. Gibson u. a., Biochemistry 9, 1970, 1626-1630, beschrieben werden.
Das Verfahren unserer Europäischen Patentschrift 76606 B ermöglicht besonders in dem Fall, daß es unter Verwendung von Mikrobenzellen durchgeführt wird, die durch das Verfahren der Stammanmeldung der vorliegenden Anmeldung hergestellt worden sind, die Erzielung von Umwandlungen aromatischer Verbindungen unter Erzeugung einiger interessanter, neuer cyclischer Dihydroxyverbindungen.
Wir stellen gemäß der vorliegenden Erfindung Verbindungen zur Verfügung, die die allgemeine Formel
haben, worin R eine -C-Trihalogenid- oder -O-Phenyl-Gruppe ist.
Eine bevorzugte Verbindung gemäß der Erfindung ist die, bei der R-CF&sub3; ist.
Ferner stellen wir gemäß der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer cyclischen Dihydroxyverbindung mit der allgemeinen Formel
worin R eine -C-Trihalogenid-, -O-Alkyl- oder -O-Phenyl-Gruppe ist, bereit, bei dem eine entsprechende substituierte aromatische Verbindung mit der allgemeinen Formel:
und eine Energiequelle einem Stamm, der ein erster Mutantenstamm oder ein konstitutiver Mutantenstamm von Pseudomonas putida (beide wie nachstehend definiert) ist, in einem Medium, das ein geringes oder kein Wachstum von Zellen des Stammes aufrechterhält, zugeführt werden.
Wenn die bevorzugte Verbindung der Erfindung durch das Verfahren der Erfindung herzustellen ist, ist R in der substituierten aromatischen Verbindung -CF&sub3;.
Der erste Mutantenstamm ist ein Stamm von Pseudomonas putida, (a) in dem ein Enzym induziert werden kann, das eine aromatische oder substituierte aromatische Verbindung in eine entsprechende cyclische Dihydroxyverbindung umwandeln kann,
(b) der nicht fähig ist, auf Benzol oder Toluol zu wachsen, und
(c) der von einem Stamm von P. putida abgeleitet ist, der fähig ist, auf Benzol oder Toluol zu wachsen.
Die konstitutive Mutante wird aus dem ersten Mutantenstamm von P. putida hergestellt und ist für ein Enzym, das eine aromatische oder substituierte aromatische Verbindung in eine entsprechende cyclische Dihydroxyverbindung umwandelt, konstitutiv.
Der erste Mutantenstamm ist vorzugsweise von dem P. putida-Stamm NCIB 11680 oder NCIB 11767, der bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torrey Research Station, Aberdeen, Schottland, GB, hinterlegt worden ist, abgeleitet.
Beispiele geeigneter Energiequellen für das Verfahren der Erfindung schließen Alkohole wie z. B. Ethanol, Carbonsäuren wie z. B. Essigsäure und Kohlenhydrate wie z. B. Glucose ein. Bevorzugte Energiequellen sind Ethanol und Essigsäure.
Stämme, die als erste Mutantenstämme bei der Methode oder dem Verfahren der Erfindung sehr geeignet sind, können hergestellt werden, indem Pseudomonas putida NCIB 11680 oder vorzugsweise Pseudomonas putida NCIB 11767 unter Mutationsbedingungen dafür behandelt wird, um Mutantenstämme zu erhalten, die nicht mehr fähig sind, Toluol oder Benzol als alleinige Kohlenstoffquelle für das Wachstum zu verwerten, und die, wenn sie in einem flüssigen Medium vermehrt werden, das als Kohlenstoffquelle Brenztraubensäure in Gegenwart von Toluol enthält, eine Substanz absondern, die ein UV-Absorptionsmaximum bei 265 nm hat. Diese Mutation kann durch chemische und/oder physikalische Mittel bewirkt werden. Chemische Mutation kann beispielsweise durch Behandlung des Mikroorganismus mit N-Methyl-N'-nitrosoguanidin bewirkt werden, z. B. wie es von Ornston, Journal of Biological Chemistry, 1966, Band 241, Seiten 3800-3810, beschrieben wird. Physikalische Mutation kann durch elektromagnetische Strahlung, z. B. UV-Licht, bewirkt werden.
Der konstitutive Mutantenstamm für die Verwendung bei dem Verfahren der Erfindung wird zweckmäßigerweise hergestellt, indem der erste Mutantenstamm von Pseudomonas putida NCIB 11767 unter Mutationsbedingungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, behandelt wird, um Stämme zu erhalten, die nach dem Wachstum in Abwesenheit einer aromatischen Verbindung die Fähigkeit zur Erzeugung von cyclischen Dihydroxyverbindungen aus aromatischen Verbindungen haben. Die Auswahl geeigneter konstitutiver Stämme aus dem Produkt der Mutationsbehandlung kann dadurch erleichtert werden, daß die Zellen nach der Mutation auf einem festen Agarmedium vermehrt werden, das als Kohlenstoffquelle Brenztraubensäure oder Glucose enthält. Nach dem Wachstum können die Kolonien auf den Agarplatten mit einer Lösung von Brenzcatechin in Wasser besprüht werden, wobei Kolonien von Zellen, die schnell gelb/grün werden, für ein Enzym, das Brenzcatechin in 2-Hydroxymuconaldehydsäure umwandelt, konstitutiv sind [Nozaki, Topics in Current Chemistry (English Review) 1979, Band 78, Seiten 145-186]. Dieses Enzym katalysiert einen der Schritte beim oxidativen Abbau von Benzol in Pseudomonas putida NCIB 11680 oder Pseudomonas putida NCIB 11767, und wir haben gefunden, daß es in seiner Expression mit dem Enzym verbunden ist, das Benzol in die cyclische Dihydroxyverbindung umwandelt. Deshalb sind die Zellen, die beim Einwirken von Brenzcatechin grün werden, der gewünschte konstitutive Stamm.
Der konstitutive Mutantenstamm kann für Katabolit-Repression durch Kohlenstoffquellen wie z. B. Glucose und Casein-Aminosäuren empfänglich sein. Verbesserte konstitutive Stämme, die für eine solche Katabolit-Repression nicht empfänglich sind, können mittels weiterer Mutation der konstitutiven Stämme durch Behandlungen, wie sie vorstehend beschrieben wurden, erhalten werden. Die verbesserten konstitutiven Stämme können aufgefunden werden, indem Kolonien der konstitutiven Stämme, die einer Mutationsbehandlung unterzogen worden sind, auf einem Agarmedium vermehrt werden, das als Kohlenstoffquellen eine Mischung von Glucose und Casein-Aminosäuren enthält, wobei die Kolonien, die beim Einwirken von Brenzcatechin gelb/grün werden, den verbesserten konstitutiven Stamm enthalten.
Wenn die erste Mutante durch das Verfahren der Europäischen Patentanmeldung 250,122 hergestellt wird, können Zellen des Mutantenstammes in herkömmlichen Nährmedien (die derart modifiziert worden sind, daß sie eine Induktorverbindung enthalten) durch ein kontinuierliches, diskontinuierliches oder Fed-batch- Verfahren vermehrt werden.
Das Nährmedium, in dem erste Mutantenstämme für die Verwendung in dem Verfahren der Erfindung vermehrt werden können, besteht aus einer wäßrigen Mineralsalzlösung und einer geeigneten Kohlenstoffquelle. Die Kohlenstoffquelle kann beispielsweise Essigsäure, Glucose oder Ethanol sein. Die Konzentration der Kohlenstoffquelle kann über einen weiten Bereich variieren, liegt jedoch im allgemeinen zwischen 1% (Masse/Masse) und 20% (Masse/Masse). Während der Wachstumsperiode muß Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gas vorhanden sein. Die Temperatur des Mediums während der Wachstumsperiode kann beträchtlich variieren, liegt jedoch normalerweise in dem Bereich von 25 ºC bis 35 ºC. Der pH des Mediums wird während des Wachstums in dem Bereich von 5,5 bis 8,0 und vorzugsweise bei 6,5 bis 7,5 gehalten. Die Größe der Kultur kann beträchtlich variieren, beispielsweise zwischen 1,5 und 500 Litern.
Auf die Wachstumsperiode folgend werden die Zellen bei dem Verfahren der Erfindung verwendet. Die Zellen können geerntet werden, beispielsweise durch Zentrifugation oder Flockung, oder sie können direkt bei dem Verfahren der Erfindung verwendet werden. Falls die Zellen geerntet werden, werden sie in einer Mineralsalzlösung, die kein bedeutendes Zellwachstum aufrechterhält, z. B. in Phosphat- oder Pufferlösungen, oder in einem Nährmedium, das von herkömmlicher Art ist, jedoch von einem oder mehr als einem essentiellen Element nichts oder wenig enthält, wieder suspendiert. Die Konzentration der wieder suspendierten Zellen beträgt typischerweise 1 bis 30 Gramm Trockenmasse pro Liter. Die Zellen werden bei einer Temperatur von 20ºC bis 40 ºC gehalten, und der pH wird zwischen 6,5 und 8,5 gehalten. Der Zellsuspension wird Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gas zugesetzt, so daß die Sauerstoffspannung bei einem - Wert gehalten wird, der mehr als 1% des Sättigungswertes beträgt. Eine geeignete Energiequelle wird der Zellsuspension derart zugeführt, daß die Konzentration der Energiequelle bei einer geeigneten Konzentration, vorzugsweise zwischen 0,05% (Masse/Masse) und 0,5% (Masse/Masse), gehalten wird.
Die substituierte aromatische Verbindung kann der Zellsuspension als Dampf in dem Strom von Sauerstoff oder sauerstoffhaltigem Gas zugesetzt werdend wird jedoch, wenn sie flüssig ist, vorzugsweise als Flüssigkeit zugesetzt.
Die Zugaberate der substituierten aromatischen Verbindung zu der Kultur des Mutantenstammes bei dem Verfahren der Erfindung beträgt typischerweise etwa 0,5 bis 10 Gramm pro Gramm Trockenmasse der Zellen pro Stunde. Die Zugaberate der Energiequelle kann während der Umwandlung variieren, liegt jedoch typischerweise in dem Bereich von 0,1 bis 2,0 Gramm pro Gramm Trockenmasse der Zellen pro Stunde. Die produktive Lebensdauer der Zellsuspension liegt typischerweise zwischen 5 und 50 Stunden. Nach dieser Periode werden die Zellen durch Zentrifugieren und/ oder Flockung entfernt. Der überstehenden Flüssigkeit können frische Zellen zugesetzt werden, und das Verfahren kann wiederholt werden. Am Ende des Verfahrens enthält die überstehende Flüssigkeit pro Liter typischerweise zwischen 10 und 50 Gramm einer Verbindung der Erfindung.
Die neuen cyclischen Dihydroxyverbindungen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt worden sind, werden vorzugsweise aus der wäßrigen Reaktionsmischung durch Lösungsmittelextraktion mit einem geeigneten polaren Lösungsmittel extrahiert. Beispiele für polare Lösungsmittel, die verwendet werden können, schließen unter anderem Ethylacetat, Diethylether und Methylenchlorid ein. Die Anwendung kontinuierlicher Extraktionsverfahren wird in höherem Maße bevorzugt. Wir schließen jedoch die Möglichkeit nicht aus, daß beispielsweise das wäßrige Medium nach Abtrennung der Zellen eingedampft und der Rückstand in einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. Methanol, Ethanol oder Methylenchlorid, gelöst wird.
Die Dihydroxyverbindungen, die durch das Verfahren der Erfindung hergestellt worden sind, können in Derivate davon, z. B. Acetat, Benzoat, Pivalat, Carbonat, umgewandelt werden, wobei diese Derivate in Polymere und Copolymere davon umgewandelt werden können.
Die neuen Verbindungen der Erfindung können verwendet werden, um Phenole und Brenzcatechine herzustellen, die als Zwischenprodukte bei der Herstellung von Arzneimitteln, Herbiziden und Insektiziden oder als chirale Synthone, aus denen beispielsweise bestimmte Naturprodukte synthetisiert werden können, brauchbar sind.

Nährmedien, die bei der Herstellung von Mutanten und in Beispielen verwendet werden

1. Bauschop-Elsdon-Medium, wie es in Journal of General Microbiology, 1960, Band 23, Seiten 457-469, beschrieben wird.
2. Flüssiges Luria-Medium, wie es in "Experiments in Molecular Genetics" von J.H. Miller, publiziert von Cold Spring Harbor Laboratories, New York, 1972, beschrieben wird.

Herstellung von Mutantenstämmen von Pseudomonas putida NCIB 11767 für die Verwendung bei der vorliegenden Erfindung

Pseudomonas putida NCIB 11767 wurde in flüssigem Luria-Medium bis zur frühen exponentiellen Wachstumsphase vermehrt. Die Zellen wurden durch Zentrifugieren geerntet und in einer Konzentration von 0,2 Gramm Zelltrockenmasse pro Liter in 20 mL eines 0,025 m Citronensäure-Natriumcitrat-Puffers, pH 5,5, der 1 mg N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (NTG) enthielt, wieder suspendiert. Nach 45 Minuten bei 30 ºC wurden die Zellen durch Zentrifugieren geerntet, zweimal mit Bauschop-Elsdon-Medium gewaschen und dann über Nacht bei 30 ºC in diesem Medium, das 0,3% (Masse/Vol.) Natriumpyruvat enthielt, vermehrt. Nach Reihenverdünnung wurden Zellen auf einem Bauschop-Elsdon-Medium-Agar, der 0,3 mmol Natriumpyruvat/L enthielt, ausplattiert und in 1- Liter-Farbdosen, die in einem Glasfläschchen jeweils 0,5 mL Benzol enthielten, inkubiert. Nach 3 Tagen bei 30 ºC wurden 144 vermutete Mutanten, d. h., Kolonien mit einem Durchmesser von weniger als 0,5 mm, abgenommen und wieder auf einem Bauschop- Elsdon-Medium-Agar, der 0,2% (Masse/Vol.) Natriumpyruvat enthielt, vermehrt.
90 dieser Mutanten wurden in einer Flüssigkultur auf die Erzeugung einer bei 260 nm absorbierenden Verbindung aus Benzol geprüft. Eine Mutante, die eine überstehende Flüssigkeit lieferte, die bei 260 Nanometern ein maximales Absorptionsvermögen von 37 zeigte, wird nachstehend zur Vereinfachung als Mutantenstamm B bezeichnet.

Herstellung konstitutiver Stämme aus Mutante B

Das zur Mutagenese angewandte Verfahren war wie vorstehend beschrieben. Nach Behandlung mit NTG wurden die gewaschenen, verdünnten Zellen auf einem Bauschop-Elsdon-Medium-Agar, der 10 mmol Natriumpyruvat/L enthielt, ausplattiert. Nach zwei Tagen bei 30 ºC wurden die Kolonien mit einer Lösung von Brenzcatechin in Wasser (0,5 mol/L) besprüht, und die Kolonien, die nach 5 Minuten gelb/grün wurden, wurden ausgewählt. Aus einer Gesamtzahl von 1,8·10&sup5; gescreenten Kolonien wurden 35 gelb/grüne Kolonien ausgewählt. Jede von diesen wurde über Nacht in 16 mL Bauschop-Elsdon-Medium, das 0,3% (Masse/Vol.) Natriumpyruvat enthielt, vermehrt. Zellen wurden geerntet und in 10 mL eines 0,025 m Kaliumphosphatpuffers, pH 7,8, der 0,4% (Vol./Vol.) Ethanol enthielt, wieder suspendiert. Diese Kulturen wurden über Nacht in 250-mL-Erlenmeyer-Kolben - jeweils in Gegenwart von 0,5 mL Toluol - inkubiert. Überstehende Flüssigkeiten wurden nach dieser Zeit auf bei 265 nm absorbierende Verbindungen geprüft. Eine konstitutive Mutante, die bei 265 nm ein Absorptionsvermögen von 250 lieferte, wurde ausgewählt und wird nachstehend zur Vereinfachung als Mutantenstamm C bezeichnet.
Der Mutantenstamm C wurde bei 30 ºC in 20 mL flüssigem Luria- Medium bis zur frühen exponentiellen Wachstumsphase vermehrt, und nach dem Ernten wurden Zellen in 40 mL 0,1 m MgSO&sub4;·7 H&sub2;O wieder suspendiert. Ein aliquoter Teil von 5 mL wurde in einer Glas-Petrischale 45 Sekunden lang einer UV-Bestrahlung mit einer Dosis von 1,6 uW/cm² · 100 unterzogen. Die Zellen wurden dann im Dunklen in fünf aliquoten Teilen (20 mL) Bauschop-Elsdon-Medium, das 10 mmol Natriumpyruvat/L enthielt, vermehrt.
Nach 2 Tagen bei 30 ºC wurden die Kulturen einer Reihenverdünnung unterzogen und auf Bauschop-Elsdon-Medium, das 75 mmol Glucose/L und 1% (/Masse/Vol.) vitaminfreie Casein-Aminosäuren (von Difco Ind., Detroit, Michigan, USA) enthielt, ausplattiert und weitere 2 Tage lang bei 30 ºC inkubiert. Die Kolonien wurden dann wie vorstehend beschrieben mit Brenzcatechin besprüht, und gelb/grüne Kolonien wurden ausgewählt. Aus einer Gesamtzahl von 4·10&sup4; gescreenten Kolonien wurden 10 ausgewählt und über Nacht in 10 mL Bauschop-Elsdon-Medium, das 75 mmol Glucose/L und 1% (Masse/Vol.) Casein-Aminosäuren enthielt, bei 30 ºC vermehrt. Zellen wurden geerntet und wie vorstehend in Phosphatpuffer, der Ethanol enthielt, wieder suspendiert und in Gegenwart von 0,5 mL Toluol bei 70 ºC wie vorstehend beschrieben bestrahlt. Es wurde eine konstitutive Mutante, die durch Katabolit-Repression weniger beeinflußt wurde als Mutante C, ausgewählt, die bei 265 nm ein Absorptionsvermögen von 61,2 lieferte. (Mutantenstamm C lieferte unter identischen Bedingungen ein Absorptionsvermögen von 15,6). Diese Mutante wird nachstehend zur Vereinfachung als Mutantenstamm D bezeichnet.
Die Erfindung wird durch das folgende Beispiel erläutert.

BEISPIEL

Herstellung von cis-1,2-Dihydroxy-3-trifluormethylcyclohexa- 3,5-dien durch das Verfahren der Erfindung.
Die Mutante D wurde über Nacht bei 30 ºC unter Schütteln in 200 mL Bauschop-Elsdon-Medium, das 1% (Masse/Vol.) Natriumpyruvat enthielt, vermehrt. Die 200-mL-Kultur wurde dann verwendet, um 10 Liter eines Mediums zu beimpfen, das konzentrierte Phosphorsäure (2,2 g·L&supmin;¹), mgSO&sub4;·7 H&sub2;O (0,8 g·L&supmin;¹), K&sub2;SO&sub4; (0,45 g·L&supmin;¹), (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; (5 g·L&supmin;¹), FeSO&sub4;·7 H&sub2;O (0,04 g·L&supmin;¹), CuSO&sub4;·5 H&sub2;O (1 mg·L&supmin;¹), MnSO&sub4;·4 H&sub2;O (5 mg·L&supmin;¹) und CaCO&sub3; (65 mg·L&supmin;¹) enthielt und mit 4 m Natriumhydroxid auf pH 6,8 eingestellt war. Dieses wurde mit 500 U/min gerührt und bei 28 ºC gehalten, und ¼ Vol. Luft/Vol./min wurde zugesetzt. Glucose wurde aus einer 40%igen (Masse/Vol.) konzentrierten Lösung mit einer Rate von 1 g·L&supmin;¹ h&supmin;¹ zugesetzt, und der pH wurde durch automatisches Titrieren mit 4 m NaOH bei 6,8 gehalten. Alle Lösungen wurden vor der Verwendung sterilisiert, indem sie 1 Stunde lang bei 121 ºC im Autoklaven behandelt wurden.
Die Zelldichte in dem Fermenter betrug nach 16 Stunden 5 g·L&supmin;¹. 5 Litern der Kultur wurden 20 mL absolutes Ethanol zugesetzt. Der pH wurde auf 7,3 erhöht, und die Temperatur und die Rührgeschwindigkeit wurde bei 28 ºC bzw. 500 U/min gehalten. Es wurde ¼ Vol. Luft/Vol./min zugesetzt. Der Kultur wurde 1,1,1-Trifluortoluol als Flüssigkeit mit einer Rate von 12 mL·h&supmin;¹ zugesetzt. Nach 2,5 h und 3,5 h wurden weitere aliquote Teile Ethanol von 10 mL und 7,5 mL zugesetzt. Nach 7 h wurde der Fermenterinhalt zentrifugiert (10.000 g für 30 min), und die überstehende Flüssigkeit wurde zurückbehalten. Diese wurde unter Vakuum mittels eines Rotationsverdampfers bei 60 ºC von 5 L auf 0,5 L eingeengt und dann 24 h lang kontinuierlich mit 2 L Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridlösung wurde unter Vakuum auf 200 mL eingeengt, und Pentan wurde in einer Menge zugesetzt, die ausreichte, um Kristallisation zu bewirken. Die Kristalle (34 g) wurden durch Filtrieren gesammelt und unter Vakuum getrocknet.
NB: cis-1,2-Dihydroxy-3-trifluormethylcyclohexa-3,5-dien hat die Strukturformel
Das Produkt hatte die folgenden Eigenschaften:

1. Schmelzpunkt

90 - 91,5 ºC (nicht korrigiert)

2. CH-Elementaranalyse für C&sub7;F&sub3;O&sub2;

Erwartet Gefunden
C 46,67 46,9
H 3,92 4,0

3. Infrarot (Hauptbanden)

νmax (Flüss.film) 3340 (-OH), 1662, 1600 (c=c), 1310, 1275, 1175, 1110, 1000 und 800 cm&supmin;¹. 4. NMR
w H (CDCl&sub3;, ppm von TMS) 4,0 und 4,25 (2H, breite (Singuletts, H&sub1; und H&sub2;), 6,0 (2H, Multiplett, H&sub5; und H&sub6;), 5,05 und 5,25 (2H, breite Singuletts, -OHs) und 6,6 (1 H, Multiplett, H&sub4;)
w C (CDCl&sub3;, chemische Verschiebung von TMS) 62,6 (C2), 69,7 (C1), 120,3 (C5), 124,5 (C3 JC-F 29H&sub2;), 127,3 (C4, SC-F 6,5 H&sub2;), 127,3 (-CF&sub3;, JC-F 271 H&sub2;) und 138,5 (C6).

5. Massenspektroskopie

Mol.-Ion bei m/z 180, Fragmente bei 162, 151, 143 und 134.

Claims

1. Verbindungen mit der allgemeinen Formel:

worin R eine -C-Trihalogenid- oder -O-Phenyl-Gruppe ist.

2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R -CF&sub3; ist.

3. Verfahren zur Herstellung einer cyclischen Dihydroxyverbindung mit der allgemeinen Formel:

worin R eine -C-Trihalogenid- oder -O-Phenyl-Gruppe ist, bei dem eine entsprechende substituierte aromatische Verbindung mit der allgemeinen Formel:

und eine Energiequelle einem Stamm, der sich in einem Medium befindet, das ein geringes oder kein Wachstum von Zellen des Stammes aufrechterhält, zugeführt werden, wobei der Stamm

ein erster Mutantenstamm von Pseudomonas putida ist,

(a) in dem ein Enzym induziert werden kann, das eine aromatische oder substituierte aromatische Verbindung in eine entsprechende cyclische Dihydroxyverbindung umwandeln kann,

(b) der nicht fähig ist, auf Benzol oder Toluol zu wachsen, und

(c) der von einem Stamm von P. putida abgeleitet ist, der fähig ist, auf Benzol oder Toluol zu wachsen, oder ein daraus hergestellter Stamm ist, der für ein Enzym, das eine aromatische oder substituierte aromatische Verbindung in eine entsprechende cyclische Dihydroxyverbindung umwandelt, konstitutiv ist.

4. Verfahren nach Anspruch 3, bei dem die substituierte aromatische Verbindung und das Produkt Formeln haben, bei denen R -CF&sub3; ist.

5. Verfahren nach Anspruch 3 oder Anspruch 4, bei dem die Energiequelle Ethanol oder Essigsäure ist.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 5, bei dem der erste Mutantenstamm von Pseudomonas putida, Stamm NCIB 11680 oder NCIB 11767, abgeleitet ist.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 6, bei dem die Konzentration der Zellen in dem Medium in dem Bereich von 1 bis 30 Gramm Trockenmasse pro Liter liegt.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, bei dem die Temperatur in dem Bereich von 20 ºC bis 40 ºC liegt.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 8, bei dem der pH des Mediums in dem Bereich von 6,5 bis 8,5 liegt.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 9, bei dem dem Medium Sauerstoff oder ein sauerstoffhaltiges Gas zugeführt wird, um die Sauerstoffspannung darin bei einem Wert zu halten, der mehr als 1% des Sättigungswertes beträgt.