JPS633785A - 細胞の製造 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ３、〔発明の詳細な説明〕 本発明は環状ジヒドロキシ化合物製造用の生化学的方法
において有用である細菌細胞の製造に関するものである
。

いくつかのシス１，２−ジヒドロキシシクロへキサジエ
ンは新規ポリマーの製造において有用である。我々の欧
州特許明細書Ａ７６６０６において。

我々にシュードモナス・プチダ種の突然変異体。

特にＰ、プチダ菌株の突然変異体（ＮＣＩＢ１１７６７
お工びＮＣＩＢ１１６８０　＞ｙ：！：使って芳香族化
合物からその種のジヒドロキシシクロへキサジエン？製
造する方法ｌ開示している。この方法に含まれる反応を
触媒する酵素は芳香族ジオキシゲナーゼであり、こ八は
ある種の芳香族イと金物と酸素との間の反応、例えば、
ベンゼンと酸素の間の反応を触媒する。

Ｐ、プチダＮＣＩＢ１１７６７およびＮＣＩＢ１１６８
０のような菌株が芳香族と一緒に養われるとき、ジヒド
ロキシシクロへキサジエン１と合物は、そ几らが中間的
代諭の生成物ヘカテコールを経て急速にさらに酸１とさ
几るので、蓄積することがない。しかし、我々の欧州特
許明細書７６６０６においては、これらの微生物の突然
変異体であってジヒドロキシシクロへキサジエンｔぼ北
することができず、従ってその結果、その種の突然変異
体を芳香族基質へ露゛出するときにジシクロへキサジエ
ンが蓄積される突然変異体、がいかにして生成されるか
が記述されている。これらの突然変異体のいくつかハ、
芳香族ｔジヒドロキシシクロへキサジエンへ転＋１：、
するのに必要とｇｎる芳香族ジオキシゲナーゼの活性ｌ
誘発させるべき場合には、ベンゼンまたはトルエンの存
在下において増殖させねばならない。突然変異体のうち
のあるものは、ジヒドロキシシクロへキサジエンの生成
ｔひきおこ丁酪素について構成性（ｃｏｎｓｔｉｔｕｔ
ｉｖｅ）　　である（「構成性菌株（ｃｏｎｓｔｉｔｕ
ｔｉｖｅ　５ｔｒａｉｎ月）。これらの構成性菌株はジ
ヒドロキシシクロへキサジエンを生ｇさせるためのベン
ゼンまたはトルエンニよる前板っての酵素誘導を必要と
しない。

しかし、突然変異体の両タイプともにジヒドロキシシク
ロへキサジエンを生成きせるのに用いるときに欠点ンも
っている。微生物増殖中にベンゼンまたはトルエンある
いは類似酵素基質を用いることに、これらの１ｔＳ合物
の揮発性、可燃性、および貧弱な水溶性のｔめに、常に
実施可能であるわけではない。その上、ジヒドロキシシ
クロへキサジエン生成物に誘導期間中に生じ、１０ｒｎ
Ｍ７こえろ濃度で存在するかもしれず、従って潜在的に
。

同一培養によってその後生成されるがもし几ない異なる
ジヒドロキシシクロへキサジエンを汚染する。これらの
誘導物質の存在下における増殖にまた。ジヒドロキシシ
クロへキサジエンを際化し従ってそれの上で増殖する能
カン再ひ獲得し九復珊変異体菌株にとって好適である。

こｎｒｚ連続培養において特におこりや丁い。構成性突
然変異体に連続培養における成長にとって理想的ではな
く。

なぜならば、その糧の培養においては構成的表現型が失
なわれる傾向があるからである。

本発明により、我々は芳香族化合物または置換芳香族化
合物ｔ１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−
ジエン環ン含む相当環状ジヒドロキシ化合物へ転１とす
ることができる酵素ｌもクシュードモナス・プチダの細
胞の装造方法ｌ提供するが、その方法は、芳香族１６合
物または置換芳香族化合物を相当する環状ジヒドロキシ
化合物へ転化し得る酵素゛の誘導ンひきおこしかつ自ら
は上記酵素のための基質ではない誘導物質（ベンゼンま
たはトルエン以外の）を含む培養培地の中で、シュード
モナス・プチダ（以後で定義するとおりの）の突然変異
体菌株の細胞ン増殖させることから成る。

本発明の方法において生成される細胞は、我々の欧州特
許７６６０６Ｂの方法により、あるいに文献（例えば、
ギブソｙＤ、Ｔ、らの、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ。

ヱ、１９７０．１６２６−１６３０　）に記載の別の方
法により、芳香族から環状ジヒドロキシ化合物を製造す
るための微生物触媒として使用してよい。

本発明の方法によって生皮すれる微生物細胞は広い範囲
の芳香族および置換芳香族化合物を相当する環状ジヒド
ロキシ化合物へ転１とするのに使用してよい。好ましく
は、芳香族または置換芳香族化合物は単環式であり、し
かし、複式環、例えばナフタレンおよびビフェニルから
成っていてもよい。置換芳香族化合物は１個まｔは１個
以上の置換基をもつ。可能性のある置換基はアルキル基
、例えばメチルまたはエチル、ビニル基、例えば窒素、
硫黄またはハロゲン原子を含む有機基、および、ハライ
ド基を含む。本発明の方法によって虫取される細胞によ
って転化され得る特定の芳香族および置換芳香族化合物
はベンゼン（シス−１，２−ジヒドロキシシクロヘキサ
−３，５−ジエンへ転Ｉｔｓ）、クロロベンゼン、トル
エン、フルオロベンゼン、ベンジルアルコールおよびナ
フタレンン含む。

本発明の方法によって生皮される細胞に一般式ンもつ化
合物ｔつくる転化において使用して工〈。

式中、Ｒｉ−Ｃトリハライド、−〇アルキルあるいに一
〇フェニル基であり、これに我々の分割特許願申におい
て特許請求されており、特定的には、Ｒが−ＣＦ、であ
る＋Ｃ合物である。

本発明の方法において用いられろ突然変異体菌株にシュ
ードモナス・プチダの菌株であり：（ａ）　　その中で
、芳香族または置換芳香族化合物Ｚ相当するジヒドロキ
シ化合物へ転ＩＩＳできる酵素が誘導されることができ
。

（ｂ）　　そｎｈベンゼンまたはトルエン上で増殖でき
ず。

（Ｃ）　　そｎはベンゼンま７’ｊｉ）ルエン上で増殖
できるＰ、プチダの菌株から誘導される。

好ましクハ、この突然変異菌株は、英国スコツトランド
、了バーディーンの、ＮａｔｉｏｎａｌＣｏｌｌｅｃｔ
ｉｏｎ　ｏｆ　　Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ　　Ｂａｃｔｅ
ｒｅｒｉａ。

Ｔｏｒｒｅｙ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ　５ｔａｔｉｏｎ　に
おいて保存されｔＰ、プチダ菌株ＮＣＩＢ１１６８０ま
たはＮＣＩＢ１１７６７から誘導される。

本発明の方法において誘導物質化合物として適当である
化合物は、シクロヘキサン、シクロヘキサノール、シス
１，２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン
、フラン、チオフェン、ベンゾフラン、シクロ−へキサ
ジエン、クマリンおよび１．３．５−トリメチルベンゼ
ンン含む。しかし最も有効な誘導物質１と合物、従って
好ましく用いられろものは、ピリジンおよびいくつかの
関連化合物、轡に、ピリジンおよび置換ピリジンであり
、特別に適当である化合物はピリジンおよびメチル置換
ピリジン、例えばα−ピコリンおよびβ−ピコリンであ
る。好ましい誘導物質化合物は水と混和し、限定された
揮発性と可燃性をもっている。

好ましくは誘導物質化合物は培養培地中Ｖｃｏ、ｏｉｍ
Ｍから２飾（の範囲の濃度で含ま几る。

本発明の方法における突然変異体としてきわめて適当で
ある菌株に、シュードモナス・プチダＮＣＩＢ１１６８
０−！たμ好喧しくはシュードモナス・プチダＮＣＩＢ
１１７６７　Ｙ突然変異発生条件下で処理して、欧州特
許４７６６０６８に記載のとおりに単独の増殖用炭素源
としてトルエンまたげベンゼン？もはや利用できない突
然変異株を得ることによってつくってもよい。

本発明の方法において、突然変異菌株の細胞に連続式９
回分式あるいに供給式・バッチ（ｆｅｄ−ｂａｔｃｈ）
式の技法として、便利な増殖培地（銹導物質＋ＦＳ合物
を含むよう変性されている）の中で増殖させてよい。Ｃ
の方法に連続式培養において細胞ケ増殖させるのに最も
価値がある。

使用する増殖培地にいずれかの適当な炭素源と鉱物塩水
溶液とから成っていてよい。炭素源に例えば、　酢ｍ　
、グルコースまたはエタノールであってよい。炭素源ａ
度に広い範囲にわたって変えることができるが、−膜内
には１％（１！量／重合）と２０％（重ｔ／重量）の間
にある。嶽素ま７ｃに酸素含有ガスに増殖期間中存在せ
ねばならない。

増殖期間中の培地温度にかなり変ってもよいが、通常は
２５℃から６５℃の範囲にある。培地のｐＨに増殖中、
５．５から８．０の範囲、好ましく　Ｈ６，５から７５
の範囲に保たれる。培養の大きさにかなりの程度に１例
えば１．５１と５００１の間で変ることができる。

増殖期間に続いて、細胞は欧州特許／１６７６６０６Ｂ
に記載のとおりに転１ヒを実施するのに使用することが
できる。

本発明の方法において生成される微生物細胞を使りて生
成させることができる他の環状ジヒドロキシＩｔｓ合物
のうちのあるものは、薬、除草剤、および殺虫剤の製造
用中間体として、あるいは例えばある種の天然産物が合
成されろキラルシンソン（ｃｈｉｒａｌ　５ｙｎｔｈｏ
ｎ）　　として有用であるフェノール類およびカテコー
ル類Ｙｇ造するのに用いることができる。

突然変異体の調装および実施例の中で使用する増殖培地 １、ハクショップ拳エルストンの培地 Ｉｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂ
ｉｏｌｏｇＬ１９６０゜２３巻、　４５７−４６９頁に
記載のとおりのもの、２、ルリア液状培地 Ｊ、Ｈ，ミラーによる＠Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔｓ　ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｇｅｎｅｔｉｅｓ”（１９７２年
、コールド・スプリング・ハーバ−研究所（二ニーヨー
ク）発行〕の中で記載のとおり。

ア液状培地中で初期指数的成長相まで増殖させた。

細胞ン遠心分離によって収獲し、１ｍ、９ＯＮ−メチル
−Ｎ／−二トローＮ−二トロソーグアニジン（ＮＴＧ）
Ｙ含むｐ　Ｈ５，５の２５ミリモル濃度のクエン酸−ク
エン酸ナトリワム緩衝液の２５ｆｆｉｒ中で、乾燥細胞
重量０．２ｆｌ／ｌの濃度で懸濁させた。４５分後６０
℃において、細胞を遠心分離によって収穫シ、バクショ
ップ・エルストン培地で以て２回洗滌し、次に、この培
地中で一晩、０．３％（重量／容積）のピルビン酸ナト
リウムχ含むときに３０℃において増殖させ友。連続稀
釈を施こしたのち、細胞Ｙ０．３ミリモル濃度のピルビ
ン酸ナトリクムン含むバクショップ・エルストン培地寒
天上に置き、管壜中で０．５Ｒｔのベンゼンを各々含有
する１１のペイント缶（ｐａｉｎｔ　ｔｉｎ）の中で保
温した。６口径６０℃において１４４個の将来性のある
突然変異体、丁なわち、０．５ｉｎより小さい直径のコ
ロニーを抜出し、０．２％（重量／容積）ピルビン酸ナ
トリウムのバクショップ・エルストン培地寒天上で再増
殖させｔｏ こ几らの突然変異体の９０個’ａ’、２６０ｎｒｎにお
いて吸収をもつ１ｔＳ合物をベンゼンからつくるために
液状培養において選別した。２６０ナノメートルにおい
て６７の最大吸収をもつ上澄液を与えた一つの突然変異
体を以後に便宜上突然変異体菌株Ｂとよぶ。

本発明に以下の実施例によって例証さｎる：実施例１ 本実施例は、ベンゼンおよびトルエンをベンゼンシス−
グリコール（シス１，２−ジヒドロキクシ９口へ１−−
３．５−　ジエン）およヒドルエンシス−りＩＪコール
（シスｉ＊２−ジヒドロキシー３−メチルシクロヘキサ
−３，５−ジエン）へそｎぞ几転化する論議中の酵素に
対する基質でないイし合物のある範囲のものｔ使って、
本発明の方法による突然変異体Ｂ中での芳香族酸化の誘
発を例証するものである。

突然変異体ＢＹ、０．３％（重量／容積）のピルビン酸
ナトリウムと最終濃度１ｍＭの可能性のある誘導物質化
合物のある範囲のうちの一つとを含む５０１１！／のバ
クショップ・エルストン培地の５０ｄの中で、６０℃に
おいて一晩増殖させ几。増殖後、各培養株を遠心分離に
よって収獲し、０．４％ＣＭ量／容積）のエタノールを
含むｐＨ７，８の燐酸塩緩衝液のｌ０ＪＩＪ？の中で乾
燥重量０．５ｇ／ｌの濃度へ懸濁させた。各フラスコの
中央のくぼみ（ｗｅｌｌ）の中に０．５縦のトルエンを
入れ、フラスコ’Ｉ’ｍとうしながら３０℃で保温し九
〇　１８時間後、各フラスコ中のトルエンシス−クリコ
ール生ｇ−Ｊｉ’Ｙ測定した（表１）。潜在的誘導物質
に、ピルビン際単独上ｔｔは誘導物質としてのトルエン
と一緒で、誇導質を存在させずに増殖させた細胞におい
て見らｎる量エリも著しく多食のトルエンシス−グリコ
ールを明らかに生成させた。特に、シクロヘキセン、シ
クロヘキサジエン、ピリジン、フラン。

１．３．５−トリメチルベンゼンに丁べて、ピルビン戯
単独まｔはｌ　ａｔのトルエン共存の場合エリも著シく
多いトルエン・シス−グリコール’Ｙ与、ｔた。

ピリジンｌ用いろときの最適効果ｉ（１，０ｍＭの濃度
において見られｔｏ 表　　　１ 実施例 本実施例は連続培養における誘導物質としてビリジンケ
使用することの例証である。突然変異体Ｂ”Ｙ２Ｏ２ば
の連続培養装置で、ｐＨ７，０，温度３０℃、攪拌速度
５００ｆ−において、バラショップ・エルストン培地と
０．３％（重量／重量）のピルビン酸ナトリウムおよび
０．５ｍＭのピリジンとの中で増殖させた。０．１ｈ−
’の稀釈率を使つｔ０時間間隔を置いて、試料？連続培
養装置から取出し、実施例１：同［、）ルエンからのト
ルエン・シス−グリコールの生成について検定した。少
なくとも３６０　時間ノ間、　Ｍ　胞ｎ　トルエンシス
−グリコールを生成する能力を保持し、トルエンン誘導
物質として用いろ場合におこるような野生型の表現型へ
のその集団の復滞に存在しなかった。結果を表２に示す
。

表　　　２

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、芳香族化合物または置換芳香族化合物を１，２−ジ
   ヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン環を含む相
   当環式ジヒドロキシ化合物へ転化することができる酵素
   をもつ￥シュードモナス・プチダ￥の細胞を製造する方
   法であつて、 ￥シュードモナス・プチダ￥の突然変異体菌株（後で定
   義するとおりの）の細胞を、芳香族化合物または置換芳
   香族化合物を相当する環式ジヒドロキシ化合物へ転化す
   ることができる酵素の誘導をおこさせかつ自らはその酵
   素のための基質ではない誘導物質化合物（ベンゼンまた
   はトルエン以外の）を含む培養培地の中で、増殖させる
   ことから成る、方法。 ２、突然変異体菌株が￥シュードモナス・プチダ￥菌株
   ＮＣＩＢ１１６８０またはＮＣＩＢ１１７６７の突然変
   異体である、特許請求の範囲第１項に記載の方法。 ３、誘導物質化合物が水と混和性である、特許請求の範
   囲第１項または第２項に記載の方法。 ４、誘導物質化合物がピリジンまたは置換ピリジンであ
   る、特許請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載
   の方法。 ５、誘導物質化合物がピリジン、α−ピコリン、あるい
   はβ−ピコリンである、特許請求の範囲第４項に記載の
   方法。 ６、誘導物質化合物がシクロヘキサン、シクロヘキサノ
   ール、ベンゼン−シス−グリコール、フラン、チオフエ
   ン、ベンゾフラン、シクロヘキサジエン、クマリン、あ
   るいは１，３，５−トリメチルベンゼンである、特許請
   求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。 ７、誘導物質化合物が培養培地中で０．０１ｍＭから２
   ｍＭの範囲の濃度で含まれる、前記特許請求の範囲各項
   のいずれかに記載の方法。 ８、培養培地が１％から２０％（重量／重量）の範囲の
   濃度の炭素源を含む、前記特許請求の範囲各項のいずれ
   かに記載の方法。 ９、２５℃から３５℃の範囲の温度と５．５から８のｐ
   Ｈにおいて実施する、前記特許請求の範囲各項のいずれ
   かに記載の方法。