JPH02150288A - 環式ジヒドロキシ化合物及びその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は新規な環式ジヒドロキシ化合物及びそれを製造
する方法に関する。

ある種のシス１，２−ジヒドロキシシクロへキサジエン
類は、新規重合体の製造に有用である。我々の欧州特許
明細書箱７６６０６　Ｂ号において、我々は、シュウト
モナスψプチダ（Ｐｓｃｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐｕｔｉｄ
ａ）種の突然変異株、殊にシュウトモナス令プチダＮ　
ＣＩ　Ｂ　Ｎ、７６７及びＮ　ＣＩ　Ｂ　１１６８０株
の突然変異体を用いて芳香族化合物から、そのようなジ
ヒドロキシシクロへキサジエンを製造する方法を開示し
ている。この方法に関与する反応の触媒作用をなす酵素
は、ある種の芳香族化合物と酸素との間の反応（例えば
下記のベンゼンと酸素との間の反応）の触媒作用をなす
アロマチック・ジオキシゲナーゼである。

シュウドモナス・プチダＮ　ＣＩ　Ｂ　１１７６７及び
Ｎ　ＣＩ　Ｂ　１１６８０株のような菌株が芳香族類と
一緒に供給された場合には、ジヒドロキシシクロへキサ
ジエン化合物類はさらに急速に酸化されて、カテコール
類を経て中間代謝生成物となってしまうので、ジヒドロ
キシシクロへキサジエン化合物類が蓄積しない。しかし
、我々の欧州特許明細書第７６６０８号においては、こ
れらの微生物の突然変異体であって、ジヒドロキシシク
ロへキサジエン類を酸化することができないものを作り
出す方法が開示されており、その結果としてそのような
突然変異体が芳香族基質に曝されたときにジヒドロキシ
シクロへキサジエン化合物が蓄積することが開示されて
いる。これらの突然変異体のうちのあるものは、もし芳
香族をジヒドロキシシクロへキサジエン類に転化するの
に必要とされるアロマチ・ツク・ジオキシゲナーゼ酵素
の活性が誘起されるべきならば、ベンゼンまたはトルエ
ンの存在下で生長（増殖）されなければならない。若干
の突然変異体は、ジヒドロキシシクロへキサジエン類の
生成を引き起す酵素について構成的である（「構成的突
然変異株」）。これらの構成的突然変異株は、ジヒドロ
キシ・シクロへキサジエン類を生成させるために、ベン
ゼンまたはトルエンによる前もっての酵素誘発を必要と
しない。

我々の欧州特許明細書第２５０１２２Ａ号において、我
々は、１．２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５ジ
エン環を含む対応する環式ジヒドロキシ化合物へ、芳香
族または置換芳香族化合物を転化しうる酵素を含むシュ
ウドモナス・プチダの細胞を生産するための改善された
方法を開示しているが、この方法は、シュウドモナス・
プチダの「第１突然変異株」　（以下で定義）の細胞を
、ベンゼンまたはトルエン以外の誘発（インジューサー
）化合物であって、芳香族または置換芳香族化合物を対
応する環式ジヒドロキシ化合物に転化しうる酵素を誘発
させ、それ自体はその酵素のための基負ではない誘発（
インジューサー）化合物を含む培養基中で、増殖させる
ことからなる。

文献に記載された別異の方法（芳香族化合物から環式ジ
ヒドロキシ化合物を製造する方法）としては、Ｄ、　Ｔ
、ギブソン（Ｇｉｂｓｏｎ）等によるｒＢｉｏｃｈｅｍ
ｉｓｔｒｙＪ　９　（１９７０）第１６２８〜１６３０
頁の方法がある。

欧州特許第７６６０６　Ｂ号の方法は、殊に欧州特許明
細書第２５０１２２号の方法で作られた微生物細胞を用
いる場合には、ある種の興味ある新規な環式ジヒドロキ
シ化合物を生成するように、芳香族化合物の転化を達成
しうる。我々の欧州特許第２５３４８５Ａ号明細書には
、多くのそのような新規化合物が記載されている。さら
に別の化合物が明細書には開示される。

本発明によれば、一般式 （Ｒはアルキル基または置換アルキル基である。）を有
する化合物が提供される。

Ｒが１〜４個の炭素原子を有する未置換アルキル基であ
ることが好ましく、Ｒがメチル基であるのが殊に好まし
い。この殊に好ましい化合物を以下ではベンジル・アセ
テート・シス・グリコールと称することがある。

さらに本発明によれば、一般式 （Ｒはアルキル基または置換アルキル基である。）を有
する環式ジヒドロキシ化合物を製造する方法であって： シュウドモナスやプチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐ
ｕｔｉｄａ）の第１突然変異株または構成的突然変異株
の細１泡の成長を全くまたはほとんど支持しない培地中
で、該第１突然変異株または構成的突然変異株に対して
、一般式 を有する対応置換芳香族化合物とエネルギー源とを供給
することからなる上記方法が提供される。

本発明の好ましい（前記）化合物を本発明方法により製
造しようとする場合に、置換芳香族化合物（原料）中の
Ｒは−ＣＨ３となる。

「第１突然変異株」は、シュウドモナス・プチダの菌株
であって： （ａ）　　芳香族または置換芳香族化合物を対応する環
式ジヒドロキシ化合物へ転化しうる酵素を誘起しうるち
のであり、 （ｂ）　　ベンゼンまたはトルエンで増殖（生長）しえ
ないものであり、そして （Ｃ）　　ベンゼンまたはトルエンで増殖（生長）しう
るシュウドモナス・プチダの菌株から誘導されるもので
ある。

「構成的突然変異株」は、シュウドモナス・プチダの第
１突然変異株から作られ、そして芳香族または置換芳香
族化合物を対応する環式ジヒドロキシ化合物へ転化する
酵素について構成的である。

好ましくは、第１突然変異株は、ナショナル・コレクシ
ョン番オブ・インダストリアル・アンド争マリンーバク
テリア（ＮＣＩ　Ｂ）　　（英国スコツトランドＡＢ９
　８ＤＧ、アバーディーン。

１３５アビイ”ｏ−ド、　　ＰＯＢＯＸ３Ｌ）に寄託さ
れているシュウトモナス拳プチダ（Ｐ、　ｐｕｔｉｄａ
）Ｎ　ＣＩ　Ｂ　１１８８０またはＮ　ＣＩ　Ｂ　１１
７６７菌株から誘導される。

本発明方法のために適当なエネルギー源の例としては、
エタノールのようなアルコール類、酢酸のようなカルボ
ン酸類、及びグルコースのような炭水化物類がある。好
ましいエネルギー源はエタノール及び酢酸である。

本発明の方法における第１突然変異株として非常に適当
な菌株は、シュウドモナス・プチダＮ　ＣＩ　Ｂ　１１
６８０または好ましくはシュウドモナス・プチダＮ　Ｃ
Ｉ　Ｂ　１１７６７をそれらのための突然変異化条件下
で処理して；トルエンまたはベンゼンを増殖のだめの唯
一の炭素源としてもはや使用することができず、かつト
ルエンの存在下に、ピルビン酸を炭素源として含む液体
培地中で増殖されるときに、２６５ｎｍにＵＶ吸収ピー
クを有する物質を作り出す突然変異株を得ることにより
、準備（製造）できる。この突然変異処理は、化学的及
び／または物理的手段により実施することができる。化
学的突然変異は、例えばオルンストン（Ｏｒｎｓｔｏｎ
）によって「ジャーナル・オブ・バイオロジカル・ケミ
ストリイＪ　　（１９６６年）第２４１巻第３８００〜
３８１０頁に記載されているように、例えばＮ−メチル
−Ｎ′−ニトロソグアニジンで微生物を処理することに
より実施できる。物理的突然変異は、電磁波照射例えば
ＵＶ線により実施できる。

本発明方法で使用するための構成的突然変異株は、前述
のように突然変異化条件下でシュウドモナス・プチダＮ
　ＣＩ　Ｂ　１１７６７の第１突然変異株を処理して；
芳香族化合物の不存在下で増殖した後には、芳香族化合
物から環式ジヒドロキシ化合物を生成させる能力を有す
る菌株を得ることにより、作ることができる。突然変異
処理の生成物からの適当な構成的菌株の選定は、突然変
異後の細胞を、炭素源としてピルビン酸またはグルコー
スを含む固体寒天培地で増殖することにより効率的に行
ないうる。増殖後に、寒天平板上のコロニイにカテコー
ル水溶液を噴霧し、このとき黄／緑色に迅速に変わる細
胞コロニイはカテコールを２−ヒドロキシムコニック会
セミアルデヒドに変える酵素について構成的である〔ノ
ザキ［トピックス・イン・カレント・ケミス）・リイ」
　（英語版）　１９７９年第７８巻第１４５〜１８６頁
］。この酵素は、シュウトモナスφブヂダＮ　ＣＩ　Ｂ
　１１６８０及びシュウドモナス・プチダＮ　ＣＩ　Ｂ
　１１７６７におけるベンゼンの酸化的分解（減成）中
の一工程に触媒作用をなすものであり、我々は、その酵
素がその表現形態において、ベンゼンを環式ジヒドロキ
シ化合物へ転化する酵素へ結合されることを発見した。

従って、これらのカテコールに触れて緑色に変る細胞は
、所望の構成的株である。

構成的突然変異株はグルコース及びカサミノ酸のような
炭素源により異化抑制を受は易いことがある。そのよう
な異化抑制を受は易くない改善された構成的菌株は、そ
の構成的菌株を前述の処理によりさらに突然変異させる
ことにより得られうる。改善された構成的菌株は、（再
度の）突然変異処理に付された構成的菌株のコロニイを
、グルコース及びカサミノ酸の混合物を炭素源として含
む寒天培地上で増殖させ、カテコール（噴霧）に触れた
ときに黄／緑色に変るコロニイを改善された構成的菌株
として検出できる。

第１突然変異株を、欧州特許明細書第２５０１２２号の
方法によって作るときに、突然変異体の細胞は、連続式
、バッチ式または補給バッチ式の方法で従来の増殖培地
（インジューサー化合物を含めるように改変したもの）
で増殖しうる。炭素源は、例えば、酢酸、グルコースま
たはエタノールであってよい。炭素源の濃度は広い範囲
で変りうるが、−殻内には１％（ｗ／ｖ）〜２０％（ｗ
／ｗ）の範囲である。

酸素または酸素含有ガスは増殖期間中に存在しなければ
ならない。増殖期間中の培地の温度は可成り変りつるが
、通常は２５〜３５°Ｃの範囲内である。

培地のｐｌは増殖中に５゜５〜８．０の範囲内に、好ま
しくは６．５〜７．５の範囲内に維持される。培養液の
量は可成り、例えば１．５〜５００ｇの間で変りうる。

増殖期間の次に、細胞は、本発明の方法において使用さ
れる。細胞は、例えば遠心分離または凝集法によって採
取することもでき、あるいは細胞は、本発明方法におい
て直接に（採取工程なしで）使用されてもよい。細胞が
採取される場合、細胞は、著しい細胞の増殖を支持しな
い無機塩溶液、例えば燐酸塩または緩衝溶液中に、ある
いは従来のものではあるが一つまたはそれ以上の必須元
素を全く含まないかほとんど含まない増殖培地中に再Ｍ
濁される。典型的には、再懸濁細胞の濃度は、１〜３０
ｇ（乾燥重量）／ρである。細胞は２０〜４０°Ｃの温
度に維持され、ｐＨは６．５〜８．５の間に維持される
。酸素または酸素含有気体を、酸素張力が飽和の１％よ
りも大きく保持されるように、細胞懸濁液に添加する。

適当なエネルギーを、エネルギー源の濃度が適切な濃度
値、好ましくは０．０５％（Ｗ／Ｗ）〜０．５％（Ｗ／
Ｗ）の間に維持されるように供給する。

置換芳香族化合物は、細胞懸濁液に対して、酸素または
酸素含有ガスの流れの中の蒸気の形で添加しうるが、好
ましくは、それが液体であるときには、液体の形で添加
される。

置換芳香族化物を、本発明の方法において突然変異体の
培養液へ添加する速度（単位時間当りの量）は、典型的
には約０．５〜１０ｇ／乾燥重量細胞ｇ／１時間（ｈｒ
）である。エネルギー源の添加速度は転化反応中に変動
してよいが、典型的には０．１〜２ｇ／乾燥重世細胞ｇ
／１時間（ｈｒ）の範囲内である。細胞懸濁液の生産的
寿命は、典型的には５〜５０時間である。この期間の後
に、細胞は遠心分離及び／または凝集法によって除去さ
れる。

新鮮な細胞を上澄液に添加し、方法工程を繰り返えすこ
とができる。本発明方法の終了時に、上澄液は典型的に
は、１ｇ当り１０〜５０ｇの本発明化合物を含む。

本発明方法により生産された新規な環式ジヒドロキシ化
合物は、好ましくは水性反応混合物から、適当な極性溶
剤を用いての溶剤抽出によって抽出される。使用しうる
極性溶剤の例としては、就中、酢酸エチル、ジエチルエ
ーテル及び塩化メチレン等がある。さらに好ましくは、
連続抽出法が用いられる。しかし本発明においては、例
えば細胞分離後に水性培地を蒸発して、残渣を適当な溶
剤例えばメタノール、エタノールまたは塩化メチレンに
溶解される方式も使用できる。

本発明の方法で作られるジヒドロキシ化合物は、それら
の誘導体、例えば酢酸エステル、安息香酸エステル、ピ
バリン酸エステル、炭素エステル等に変えることができ
、これらの誘導体はそれらの重合体または共重合体に変
〜えることができる。

本発明の新規化合物は、天然生成物類似体の合成のため
の出発原料として使用でき、例えばイノシトール類の類
似体の合成に使用できる（Ｓ、　Ｖ、レイ（Ｌｅｙ）及
びｌζスターンフィールド（Ｓｔｅｒｎｆｌｅｌｄ）の
「テトラヘドロン・レターズ」１９８８年参照〕。本発
明新規化合物は、従前に新しい天然生成物類似体を与え
ることができたものよりも、より広範囲の化学的選択事
項及び合成を可能とする。

１、［ジャーナル・オブーゼネラル・マイクロバイオロ
ジイＪ　　（１９６０年）第２３巻第４５７〜４６９頁
に記載の「バラスチョップ（Ｂａｕｓｃｈｏｐ）及びエ
ルストン（Ｅ　Ｉ　５ｄｏｎ）の培地」。

２、１９７２年ニューヨーク「コールド・スプリング・
ハーバ−・ラボラドリース」社発行のＪ、１１゜ミラー
（Ｍｌｌｌｅｒ）により「エクスベリメンツ・イン・モ
レキュラー・ジエネテックス」に記載されている「ルリ
ア（Ｌｕｒｉａ）　Ｊ液体培地。

シュウドモナス・プチダＮ　ＣＩ　Ｂ　１１７６７をす
朋指数段階まで「ルリア」液体培地中で増殖させた。細
胞を遠心分離によって採取し、１　ｍｇのＮメチル＝Ｎ
′−ニトロ−Ｎ−ニトロソ−グアニジン（Ｎ　Ｔ　Ｇ）
を含む２５ミリモル濃度のクエン酸−クエン酸ナトリウ
ム緩衝液（ｐＨ５，５）の２０ｍ１中に０．２ｇ乾燥細
胞重量／ｇの濃度で再懸濁させた。３０℃で４５分後、
細胞を遠心分離で採取し、［バラスチョップ及びエルス
トン」の培地で２度洗浄し、次いで、０．３％（Ｗ／Ｖ
）のピルビン酸ナトリウムを含むこの培地中で３０°Ｃ
において一晩増殖させた。

一連の稀釈の後、細胞をＯ，Ｓ　ミリモル濃度のピバリ
ン酸ナトリウムを含む「バラスチョップ及びエルストン
」の培地寒天上に移し、１ｇペイント缶（それぞれガラ
スびん中に０，５ｍｌのベンゼンを含む）中でインキュ
ベートした。３０℃で３日後、１４４の見込みのある突
然変異体、すなわち直径０．５ｍｍ以下のコロニイを拾
い出し、０．２％（ｗ／ｖ）のピルビン酸ナトリウム含
有「バラスチョップ及びエルストン」培地寒天上で再増
殖させた。

これらの突然変異体のうちの９０を、２６０止で吸収を
起こす化合物のベンゼンからの生成のための液体培養で
スクリーンした。２６０ｎｍにおいて３７の最大吸収度
をもつ上澄液を与えたｍ−つの突然変穴体を以下便宜」
二「突然変異株Ｂ」と称する。

突然変異株Ｂからの構成的菌株の調製 突然変異処理に用いた操作は前述のものであった。ＮＴ
Ｇでの処理後、洗浄され稀釈された細胞を、「バラスチ
ョップ及びエルストン」の培地寒天に１０ミリモル濃度
のピルビン酸ナトリウムを加えたものに平板接種した。

３０℃で２日後、コロニイにカテコールの水溶液（０，
５モル濃度）を噴霧し、５分後に黄／緑色に変色したも
のを選択した。スクリーニングされた合計１．８Ｘｌｏ
５のコロニイから、３５の黄／緑色コロニイを選択した
。これらのそれぞれを、「バラスチョップ及びエルスト
ン」の培地に０．３％（Ｗ／Ｖ）のピルビン酸すトリウ
ムを添加したちの１６ｍ１中で一晩増殖させた。細胞を
採取し、０．４％（Ｖ／Ｖ）のエタノールを含む２５ｍ
Ｍ燐酸ナトリウム緩衝Ｉ＆（ｐ１１７．８）１０ｍｌ中
に再懸濁させた。

これらの培養液（それぞれを２５０　ｍｌのコニカルフ
ラスコに入れて）をそれぞれ０．５ｍｌのトルエンの存
在下に一晩インキユベートした。各上澄液をこの時間経
過後に、２６５ｎｍで吸収する化合物の存否について試
験した。２６５ｎｍで２５０の吸収度を与えた構成的突
然変異体を選定した。これを以下便宜上「突然変異株Ｃ
」と称する。

突然変異株Ｃを、２０ｍ１のルリア液体培地中で３０℃
において早期指数段階まで増殖させ、そして採取後に細
胞を０．１モル４１ｙのＭｇ５０４７Ｈ２０溶液４０ｍ
１中に再懸濁させた。５１１１１の部分をガラス皿中で
４５秒間１．６ＵＷ／ｃＩ＃Ｘ１００の照射量でＵＶ照
射した。次いで細胞を、［バラスチョップ及びエルスト
ン」の培地に１０ミリモルのピルビン酸ナトリウムを添
加したちの２０ｍ１（５個）中で暗所で増殖させた。

３０℃において２日後、それぞれの培養液を一連の稀釈
に付し、「バラスチョップ及びエルストン」培地に７５
ミリモル濃度のグルコース及び１％（Ｗ／Ｖ）のビタミ
ン不含有カサミノ酸（米国ミシガン州デトロイトのＤｉ
ｆｃｏ社製）を添加したものに平板接種し、３０℃でさ
らに２日間インキュベートした。

次いでコロニイに、前述のカテコール液を噴霧し、黄／
緑色のコロニイを選択した。スクリーニングされた合計
４ＸＩＯ４のコロニイから、１０のコロニイを選択し、
「バラスチョップ及びエルストン」培地に７５ミリモル
のグルコース及び１％（Ｗ／Ｖ）のカサミノ酸を添加し
たちの１０ｍ１中で３０°Ｃにおいて一晩増殖させた。

細胞を採取し、前記のように燐酸塩緩衝液にエタノール
を添加したものに再懸濁し、前述のように０．５ｍｌの
トルエンの存在下で７０℃で照射した。異化抑制によっ
て突然変異株Ｃよりも弱い影響を受けた一つの構成的突
然変異体を選定した。このものは２Ｂ５ｎｍにおいて６
１．２の吸収度を与えた（突然変異株Ｃは同一の条件下
で１５．６の吸収度を生じた）。この突然変異体を以下
において便宜上「突然変異株Ｄ」と称する。

以下の実施例により本発明を説明する。

実施例 本発明の方法によるシス−３−（ヒドロキシメチル）−
３，５−シクロへキサジン−１，２−ジオルアセテート
エーテル（ベンジルアセテート−シス−グリコール）の
製造： 突然変異株りを、１％（Ｗ／Ｖ）のピルビン酸ナトリウ
ムを含む２００ｍ１の［バラスチョップ及びエルストン
」培地中で振とうしながら３０℃で一晩増殖させた。こ
の２００ｍ１の培養物を次いで１０ρの培地を接種する
のに用いた。この培地は、 濃　　燐　　酸　　　　　　　　　　　２．２ｇ／ΩＭ
ｇ５Ｏ・７Ｈ２００，８ｇ／１ に２ＳＯ４０，４５ｇ／Ω （ＮＨ４）２８０４　　　　　５　ｇ／ΩＦ　ｅ　Ｓ　
Ｏ４−７Ｈ２００，０４ｇ／ＩＩＣｕ　Ｓ　Ｏφ４　Ｈ
２０１ｍｇ／　ＲＭ　ｎ　Ｓ　０　　・４　Ｈ２０５ｍ
ｇ／ΩＣａ　Ｃ０３６５ｍｇ／ｉｌ を含み、４Ｍの水酸化ナトリウムでｐｌ！６．８に調節
されたものであった。これを５０Ｏｒｐｍで撹拌し、２
８℃に維持し、１／４ｖｖｍの空気を添加した。グルコ
ースを、４０％（ｖ／ｖ）濃度溶液からＩｇ／Ω／ｈｒ
の速度で添加し、ｐＨは４ＭＮａＯＨで自動滴定により
６．８に維持した。すべての溶液は使用前にオートクレ
ーブで１２１℃において１時間加熱殺菌した。

１６時間後、培養器中の細胞密度は５ｇ／Ωであった。

突然変異株りの細胞を遠心分離により採取した。

培養器中で、この細胞を４ｇの燐酸塩緩衝液中に再懸濁
させた。この緩衝溶液はＫＨ２ＰＯ４を６６ｇ／Ω　（
１０ｍｌ／１）及びＫ　　ＨＰＯ４を６６ｇ／Ω　（２
０ｍｌ／Ｎ）からなるものであり、ｐＨを７．３に調節
した。温度を２７．５℃に維持した。この細胞懸濁液の
ＢＯＯｎｍでの吸収度は１２ｍ２０単位の間であり、こ
れはほぼ５ｇ細胞乾燥重量／ｇに相当するものである。

培養液の撹拌は５００ｒｐＩｌｌで行なった。エタノー
ルを０．５％ｈ／ｖ）の濃度まで添加した。酢酸ベンジ
ルを培養液へ注入器から６ｍ／時の一定速度で添加した
。培養液中のエタノールの濃度はガスクロマトグラフ法
によって監視し、その濃度が２ｇ／Ω以下になったとき
には、−回当り５ｍｌのエタノール量を添加し調節した
。ベンジルアセテート−シス−グリコールの生成は、３
７５ｎｍにおける培養液の吸収度を測定することにより
監視した。３７５ｎｍにおける吸収度の上昇が停止゛し
たときに、培養液をｐＨＩＯとして、細胞を５０００Ｇ
での遠心分離で除去した。上澄液を減圧において６０℃
で蒸発させて２００〜２５０ｍ１の量とし、このフンセ
ントレートを２ｇのジクロロメタンで一晩連続抽出した
。ジクロロメタンを蒸発によって濃縮して油状物を得た
。この油状物に１０ｍ１のイソプロピルエーテルを添加
した。イソプロピルエーテルをデカンテーションで除き
、マイナス７８℃に冷却して、ベンジル−アセテート−
シス−グリコールの微細結晶を得た。

この生成物の３７５ｎｍにおけるモル消光係数の測定値
は７４００であり、これは培養液中１ρ当り９．３ｇの
ベンジル−アセテート−シス−グリコールの濃度を表わ
している。

（外４名）

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒはアルキル基または置換アルキル基である。）を有
   する化合物。 ２、Ｒが１〜４個の炭素原子を有する未置換アルキル基
   である請求項１記載の化合物。 ３、Ｒがメチル基である請求項２記載の化合物。 ４、一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｒはアルキル基または置換アルキル基である。）を有
   する環式ジヒドロキシ化合物を製造する方法であって： シュウドモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ　ｐ
   ｕｔｉｄａ）の第１突然変異株または構成的突然変異株
   の細胞の成長を全くまたはほとんど支持しない培地中で
   、該第１突然変異株または構成的突然変異株に対して、
   一般式 ▲数式、化学式、表等があります▼ を有する対応置換芳香族化合物とエネルギー源とを供給
   することからなる上記方法。 ５、エネルギー源がエタノールまたは酢酸である請求項
   ４記載の方法。 ６、第１突然変異株がシュウドモナス・プチダＮＣＩＢ
   １１６８０またはＮＣＩＢ１１７６７菌株から誘導され
   たものである請求項４〜５のいずれかに記載の方法。 ７、培地中での細胞濃度が１〜３０ｇ（乾燥重量）／ｌ
   である請求項４〜６のいずれかに記載の方法。 ８、温度が２０℃〜４０℃の範囲内である請求項３〜７
   のいずれかに記載の方法。 ９、培地のｐＨが６．５〜８．５の範囲内である請求項
   ４〜８のいずれかに記載の方法。 １０、培地に対して酸素または酸素含有ガスを供給して
   培地中の酸素張力を飽和の１％より高く維持する請求項
   ３〜９のいずれかに記載の方法。