JPH07506096A - シクロヘキサジエンのヒドロキシ誘導体 - Google Patents

シクロヘキサジエンのヒドロキシ誘導体

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JPH07506096A JP5515502A JP51550293A JPH07506096A JP H07506096 A JPH07506096 A JP H07506096A JP 5515502 A JP5515502 A JP 5515502A JP 51550293 A JP51550293 A JP 51550293A JP H07506096 A JPH07506096 A JP H07506096A
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Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 シクロへキサジエンのヒドロキシ誘導体本発明は、環状化合物及びその製造方法 に関する。この化合物は、農薬及び医薬品の分野における有用な中間体である。
一定のシス−１，２−ジヒドロキシシクロヘキサノエン類は、新規ポリマーの製 造に有用である。本発明者らのヨーロッパ特許明細書第７６６０６−Ｂ号で、本 発明者らは、シュードモナス・プチダ（ｐｕＬｉｄａ）種の突然変異株、特にＰ 、プチダ株ＮＣＩＢ　＋１７６７及びＮＣＩＢ　＋１６８０の突然変異体を用い る。芳香族化合物からかかるジヒドロキシンクロヘキサノエン類の製造方法を開 示している。この方法に含まれる反応を触媒する酵素は、一定の芳香族化合物と 酸素の間の反応、例えば、ベンゼンと酸素の間の以下の反応を触媒する芳香族ノ オキシＰ、プチダＮＣｌ３　１１７６７及びＮＣｌ３　１１６８０の如き株を芳 香族炭化水素と共に仕込んだ場合は、ノヒドロキシンクロへキサジエン化合物は 蓄積しない。というのは、それらはカテコール類を経由して中間代謝の生成物に 急速に酸化されるからである。しかしなから、本発明者らのヨーロッパ特許出願 第７６６０６−Ｂ号において、本発明者らは、芳香族炭化水素基質に曝したとき に、ジヒドロキシンクロヘキサノエン類を酸化しない結果としてこれらを蓄積す るこれら微生物の突然変異体をどのように作ることができるかを記載している。
これら突然変異体の幾つかは、芳香族炭化水素をジヒドロキシシクロへキサジエ ン類に転化するのに必要な芳香族ジオキシゲナーゼ酵素の活性が誘導されるべき である場合は、ベンゼン又はトルエンの存在下で増殖しなければならない。
我々のヨーロッパ特許第７６６０６−Ｂ号の方法は、特にヨーロッパ特許第２５ （ｌ１２２Ｂ号の方法により作った微生物細胞を用いて行う場合、芳香族化合物 の転化で、何らかの興味ある新規な環状ジヒドロキシ化合物が製造されるのが可 （式中、Ｒはアルキル又は置換アルキル基である。）の化合物及びＰ、プチダを 用いるかかる化合物の製造方法を開示している。
ＥＰ−Ａ−３６４１５２の方法は、環状ジヒドロキシ化合物を極端に低い温度条 件下（例えば、−７８℃）で結晶化させることを包含するか、これらは、例えば 、農薬又は医薬品の製造に用いる大社の化合物を製造するには、実用的又は経済 的ではない。
驚いたことに、本発明の新規化合物の製造は、本発明の方法によりそれほど難し くなくかつより経済的に行うことかできることが分かった。
本発明によれば、下式（＋）又は（■１）のシクロへキサジエン化合物が提供さ く式中、八はカルボン酸エステル又はＣＮであり；Ｒ′は式（１１）におｔ）で は低級アルキレンであり式（１）においてはメチレンであって、いずれも１又は ２以上の非干渉性置換基を任意に有し、Ｒ２は０又はＮ）！又はＮＲ’であり− Ｒ１はＣ１−１アルキルであり：Ｘは非干渉性置換基であり、Ｚは任意に置換さ れた５又は６員炭素環を含む任意の基であり；ｍは０又はｌであり；そしてｎは Ｏ〜３である。） 式（１）の化合物においては、Δは式−Ｃ（０）−０−Ｒを有するカルボン酸エ ステルであり、好ましい例はＲが直鎖状又は分枝状Ｃｌ−Ｃ１，アルキル、特に Ｃ１−４アルキル、例えば、メチル、エチル、ｎ−及び１ｓｏ−プロピル、ｎ− １ｉｓｏ−１ＳｅＣ−及びＬｅｒｔ−ブチルであるカルボン酸エステルである。
式（１）の化合物において、Ｒ１はメチレンであって、／１０ゲン、特にフッ素 、塩素、臭素及びヨウ素、Ｃ１−＆アルキル、特にメチル、エチル、ｎ−１ｉｓ ｏ−プロピル、ロー、１ｓｏ−１ｓｅｃ−及びｔｅｒＬ−ブチル、Ｃ２−、シク ロアルキル、特にシクロヘキシル、ＣＦ　３、ＣＮ５ＮＣｈ、フェニル又は以下 にＸについて定義した置換基でｌｉ！換されたフェニル、Ｃｏ！Ｒ（Ｒは上で定 義した通りである）、ＯＨ、ＯＲ’　、　ＳＨ，ＳＲ’、　Ｎ　）Ｉ　Ｒ″、　 ＮＲ’Ｒ″、　０、　ＮＯＨ，ＮＯＲ’、ＣＨＩ、ＣＲ’Ｈ及びＣＲ’Ｒ″を含 むｌ又は２以上の非干渉性！Ｉ置換基任意に置換されている。
式（１１）においてＲ１が低級アルキレンである場合、それは好ましくはＣ３− 。
アルキレン、特にメチレン又はエチレンである。Ｒ１は、ハロゲン、特にフッ素 、塩素、臭素及びヨウ素、Ｃ＋４アルキル、特にメチル、エチル、ｎ−１ｉｓｏ −プロピル、ロー、ｌ５Ｏ−１ｓｅｃ−及びＬｅｒｔ−ブチル、Ｃ５−ａシクロ アルキル、特にシクロヘキシル、ＣＦｚ、ＣＮ、Ｎｏｔ、フェニル又は以下にＸ について定義した置換基で置換されたフェニル、Ｃ（ｈＲ（Ｒは上で定義した通 りである）、ＯＨ，ＯＲ″、ＳＨ，ＳＲ’、ＮＨＲ”、ＮＲ’Ｒ”、０、ＮＨ， ＮＲ’、ＮＯＨ。
ＮＯＲ’、ＣＯｘ、ＣＲ’Ｈ及びＣＲ→Ｒ′を含む適当な非干渉性置換基で任意 に置換されている。
置換基Ｒ４は、ハロゲン、好ましくはフッ素又は塩素、アルコキシ、好ましくは Ｃ１−、アルコキシ、特にメトキシ、アルキルサルファイド、好ましくはＣＩ− ４アルキルサルフアイドで任意に直換された直鎖状又は分枝状０１〜Ｃ，アルキ ル、好ましくはメチル、エチル、ｎ−又は１ｓｏ−プロピル、ｎ−１ｉｓｏ−１ ｓｅｃ−１又はｔｅｒｔ−ブチルであるか又はＲ４は、アルキルカルボニル、好 ましくはＣ！−ａアルキルカルボニルである。
式（ｌｌ）のＲ２がＮＲ’である場合、Ｒ１は好ましくはメチル又はエチルであ る。
置換基Ｘは、好ましくはハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素及びヨウ素、Ｃ＋− 、アルキル、特にメチル、エチル、ｎ−１ｉｓｏ−プロピル、ｎ−１ＩＳＯ−１ ｓｅｃ−及びＬｅｒＬ−ブチル、Ｃ１−、シクロアルキル、ＣＦｓ、ＣＮ、ＮＯ ｘ、フェニル、ＣＯｙ　Ｒ’、０Ｈ１ＯＲ’、ＳＨ，ＳＲ’及びＮＲ’Ｒ’の群 から選ばれる。Ｒ４は先に定義した通りである。特に好ましいのは、少なくとも ｌ、好ましくはｌ又は２のＸ！を換基がフッ素である式（１）又は式（ＩＩ）の 化合物である。
Ｚが存在する場合、それは５又は６員炭素環であり、それは好ましくはベンゼン 又はベンゼン列の環である。それは飽和環、即ち、シクロベンチル又はシクロヘ キシルであってもよい。Ｚは、ハロゲン、特にフッ素、塩素、臭素及びヨウ素、 ＣＩ−ａアルキル、特にメチル、エチル、ｎ−１ｉｓｏ−プロピル、ｎ−１１ｓ Ｏ−１ｓｅｃ−及びＬｅｒＬ−ブチル、ＣＦ、、ＣＮ％Ｎｏ！、上でＸについて 定義した置換基で置換されたフェニル、ＣＯ，Ｒ’、０Ｈ１ＯＲ’、ＳＨ，ＳＲ ”及びＮＲ’Ｒ′の群から選ばれる置換基で任意に置換されていてもよい。Ｒ４ は先に定義した通りである。
特に好ましい本発明の化合物は、Ｚが存在しない化合物である。
式（１）に関して、特に好ましい化合物は、八が式−Ｃ（０）−０−Ｒ又はＣＮ であり１ｍが０又はｌであり；Ｒ１かハロゲン、Ｃ４−、アルキル、ＣＦ３、Ｃ Ｎ、Ｎｏｔ、フェニル又は上でＸについて定義した置換基で置換されたフェニル 、ＣＣｈＲｌＯＨ，ＯＲ’、５ＨＳＳＲ’、ＮＨＲ’、Ｎ　Ｒ’　Ｒ’、０、Ｎ ０Ｈ１ＮＯＲ″、ＣＨ，、ＣＲ’　Ｈ及びＣＲ’Ｒ’で任意に置換されたメチレ ンであり、Ｘがハロゲン、ＣＩ−＠７／１ｚ−１−／Ｌ、、ＣＦｓ、ＣＮ、ＮＣ ｈ、７　エニー　ル、Ｃ（ｈＲ４、ＯＨ，０１（″、５ＨＳＳＲ’、ＮＲ’Ｒ’ の群から選ばれ、Ｒ４は上で定義した通りであり、モしてｎか０〜３である化合 物である。
式（１１）に関して、特に好ましい化合物は、Ｒ’かハロゲン、ＣＩ−ｓアルキ ル、ＣＦｚ、ＣＮ、Ｎｏｔ、フェニル又は上でＸについて定義した置換基で置換 されたフェニル、Ｃ０ＩＲ１ＯＨ，ＯＲ’、ＳＨ，ＳＲ’、Ｎ　ＨＲｔ、ＮＲ’ Ｒ’、０、ＮＨ，ＮＲ’、ＮＯＨ，ＮＯＲ’、ＣＨ，、ＣＲ’Ｈ及びＣＲ’Ｒ’ で任意に置換されたメチレンであり、Ｒ２がＯであり、Ｘかハロゲン、ＣＩ−、 アルキル、ＣＦｆｆ、ＣＮ、ＮＯ２、フェニル、Ｃｏ！Ｒ″、０Ｈ１ＯＲ″、Ｓ Ｈ，ＳＲ’、ＮＲ’Ｒ’の群から選ばれ；Ｒｔは上で定義した通りであり；そし てｎがＯ〜３である化合物である。
特に好ましいのは、ｍかｌであり、八が式−Ｃ（０）−０−Ｒであり、ＲがＣｌ −４アルキルであり、Ｒ１かＣＨ２又はＣＨＯＨであり、ＲｔがＯであり、そし てｎが０であるか又は少なくともｌのＸかハロゲンである式（＋）及び（ＩＩ） の化合物である。
更に特に好ましい式の化合物は、ｍか０であり、Ａが式−Ｃ（０）−０−Ｒであ り、Ｒがメチル又はエチルであり、モしてｎが０であるか又は少なくともｌのＸ かハロゲンである化合物である。
上で定義した式（１）及び（１１）の化合物は光学活性であり、そのエナンチオ マーは本発明の好ましい化合物である。例えば、Ｒ’がＣＨｔでありｎが０であ るジオールについては、過剰の２Ｒ１３Ｓエナンチオマーがある。その酸素は好 ましくはシス配置で環に結合している。この化合物上のＸ置換基が同一であれば 、カーノ・インボルド・プレローグＲ，Ｓ命名法を変更してもよいが、当業者に はかかる化合物が２Ｒ，３Ｓ一般的配置に準拠することが明らかであろう。
本発明は、対応するベンゼン列化合物基質を酵素的にヒドロキシル化することを 含む段階により該化合物を製造する方法を提供する。その酵素、つまり芳香族ジ オキシゲナーゼをそのままか又は誘導若しくは構成的なそれを保持する宿主微生 物の助けによって用いてもよい。かかる宿主微生物の１つは、ウニゲスト（Ｗｅ ｇｓＬ）　らによりＢｉｏｃｈｅｔ　Ｊ、　１９Ｂ１．　１９４．６７４−６８ ４に記載されたクロリダゾン（ｃｈｌｏｒｉｄａｚｏｎ）分解性細菌のいずれか の１種である。好ましい宿主微生物は、例えば、我々のＥＰ−Ａ−７６６０６又 はＥＰ−Ａ−２５０１２２に記載されたシュードモナス・プチダの株である。
他の適当な宿主は、芳香族ジオキシゲナーゼ酵素の遺伝子が導入された細菌であ る。かかる宿主は、Ｐ、プチダ又は他のシュードモナス属、又は有機物の酸化に ついて既に知られている微生物（例えば、ノカルジア属）又はより離れた微生物 、例えば、大腸菌であってもよい。この方法は、微生物に、対応するベンゼン列 化合物、酸素及びエネルギー源を供給することを含む。
本発明の更なる側面によれば、芳香族ジオキシゲナーゼが導入された微生物に、 対応するベンゼン列化合物、酸素及びエネルギー源を供給することを含む式（■ ）及び（１１）の化合物の製造方法が提供される。
適当なエネルギー源の例には、エタノールの如きアルコール、ピルビン酸の如き カルボン酸、及びグルコースの如き炭水化物が含まれる。
Ｐ、プチダのこの株は、好ましくはベンゼン又は置換ベンゼン又は前記ジヒドロ キシ化合物上で増殖することかできず、ベンゼン又はトルエン上で増殖できるＰ 、プチダの株から誘導される。
それは、例えば、英国スコツトランド１アバデイーンにあるナシヨナル・コレク ション・オブ・マリン・アンド・インダストリアル・バクテリア、トウレイ・リ サーチ・ステーノヨンに寄託したＰ、プチダ株ＮＣＩＢ　１１６８０及びＮＣＩ Ｂ　１１７６７から誘導した第１突然変異株内の誘導芳香族ジオキシゲナーゼ酵 素の生成物であってもよい。
非常に適する第１突然変異株は、Ｐ　プチダＮＣｌ３　１１６８０又は好ましく はＰ　プチダＮＣＩＢ　１１７６７を突然変異条件下で処理して、トルエン又は ベンゼンを増殖用の炭素の単独供給源として用いることはできないが、炭素供給 源としてピルビン酸を含有する液体培地中でベンゼン又はトルエンの存在下で増 殖させた場合にそれぞれ２６０又は２６５ｎｍでＵＶ吸収ピークを有する物質を 分泌する株を選択することによって調製することかできる。この突然変異は、例 えば、オルンストン（ＯｒｎｓＬｏｎ）、　ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏ ｇｉｃａｌ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、　１９６６゜Ｖｏｌｕｍｅ　２４１　ｐ、３ ８００−３８１０に記載された、例えば、Ｎ−メチル−Ｎ−ニトロソ−Ｎｏ−ニ トログアニジン（ＮＴＧ）での処理による化学的手段によって行ってもよい。ま た、電磁線、例えば、ＵＶ光により物理的突然変異を行ってもよい。
酵素を構成的に産生ずるならば、その株を更なる突然変異により前記第１突然変 異体から誘導することかできる。
構成的突体変異株は、第１突然変異株（特にＰ、プチダＮＣＩＢ　１１７６７第 １突休変異株）を突然変異条件下で処理して、芳香族化合物の不存在下で増殖さ せた後に芳香族化合物から環状ジヒドロキシ化合物を生産する株を選択すること によって適当に調製される。例えば、突然変異後の細胞をピルビン酸又はグルコ ースを炭素供給源として含有する固体寒天上で増殖させ、該寒天プレート上のコ ロニーにカテコール水溶液を噴霧してもよい。急速に黄／緑に変色するコロニー か、カテコールを２−ヒドロキシムコン酸半アルデヒドに転化する酵素について 構成的である（ノザキ（Ｎｏｚａｋｉ）、　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｃｕｒｒｅｎ ｔ　Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ　（ＥｎｇｌｉｓｈＲｅｖｉｅｗ）　１９７９．　Ｖｏ ｌｕｍｅ　７ｇ、　ｐ、１４５−１８６）　。この酵素は、Ｐ、プチダＮＣＩＢ 　１１６８０及びＰ、プチダＮＣＩＢ　１１７６７内でのベンゼンの酸化的分解 の数工程のうちの１工程を触媒し、その発現においてベンゼンを環状ジヒドロキ シ化合物に転化する酵素に関連している。
構成的突然変異株が、グルコースの如き炭水化物炭素供給源上で、例えば、カザ ミノ酸の存在下で増殖する場合、異化抑制を受けにくい好ましい株は、更なる突 然変異によって得ることができる。かかる株は、例えば、炭素供給源としてグル コースとカザミノ酸の混合物を含有する寒天培地上でこの突然変異した構成法の コロニーを増殖させることによって検出することができる。カテコールに曝すと 黄／緑に変色するコロニーは、改良された構成法を含む。
これら構成法の調製は、我々のＥｌ’−Ａ−２５３４８５により詳細に記載され ている。
第１突然変異細胞を、連続式のバッチ又はフエットパッチ（ｆｅｄ−ｂａＬｃｈ ）法として従来の増殖培地中で増殖させることができる。
株を増殖させることのできる培地は、無機塩水溶液及び炭素供給源、例えば、ピ ルビン酸グルコース又はエタノールを含む。炭素供給源の濃度は、一般に１〜２ ０％（ｗ／ｗ）である。増殖期間中、酸素が存在しなければならない。増殖期間 中の培地の温度は、普通、２５℃〜３５℃である。培地のｐＨは、増殖中５．５ 〜８．０、好ましくは６．５〜７．５の範囲内に保持する。培養の大きさは、例 えば、１．５〜２０００００リツターであってもよい。
ジオキシゲナーゼ酵素を誘導する場合、誘導化合物、例えば、ベンゼン又は置換 ベンゼン又はより適するものとしてシクロヘキサン、シクロヘキサノール、シス −１，２−ジヒドロキシンクロヘキサ−３，５−ジエン、フラン、チオフェン、 ベンゾフラン、シクロヘキサジエン、クマリン及びメシチレンの１又は２以上が 存在してもよいつ特に好ましい誘導化合物は、ピリジン及びメチル置換ピリジン である。誘導を１を越える段階で、例えば、ベンゼンで第１誘導をそして例えば ピリジンで第２誘導を行ってもよい。
増殖期間後、細胞をヒドロキシル化段階に用いる。細胞は、例えば、遠心分離又 はフロキュレーションによって採取しても直接に用いてもよい。採取する場合は 、それらを有意な細胞増殖を支援しない無機塩溶液中、例えば、ｌ又は２以上の 必須成分を欠いているか又は僅かしか含有していないリン酸緩衝液中に再懸濁す る。典型的には、再ｇＡ濁細胞の濃度は、リッター当たり１〜３０ｇ乾燥重量で ある。細胞を２０℃〜４０℃に保持し、ｐＨを６．５〜８．５に維持する。酸素 圧力が飽和状態の１％を越えて保持されるように酸素を細胞懸濁液に供給する。
細胞懸濁液に供給されるエネルギー源は、好ましくは０．０５〜０．５％（Ｗ／ Ｗ）の濃度に維持する。
基質は、それが固体である場合は不活性溶媒中の溶液として、又はそれが酸の場 合は塩として、又はそれが液体の場合はそのままの液体として細胞懸濁液に供給 してもよい。ラクトン化合物が必要な場合は、酸及びエステルの混合物を、でき れば不活性溶媒と共に添加してもよい。
培養物への基質の添加速度は、典型的には、細胞のｇ乾燥重量当たり約０．５〜 １０ｇ／ｈである。エネルギー源の添加速度は転化の間に変動するが、典型的に は、細胞のｇ乾燥重量当たりＯ，１〜２．０ｇ／ｈである。細胞懸濁液の生産力 半減期は、典型的には、５〜５０時間である。この時間が経過した後、細胞を遠 心分離及び／又はフロキュレーションによって除去する。新鮮な細胞をその上澄 み液に添加してその操作を繰り返してもよい。操作の終了時には、上澄み液は、 典型的にはリッター当たりｌＯ〜１００ｇの生成物を含有している。
環状ジヒドロキシ化合物は、好ましくは、溶媒抽出によって水性反応混合液から 抽出する。抽出溶媒の例には、酢酸エチル、メチルイソプロピルケトン及び塩化 メチレンが含まれる。連続抽出操作を用いてもよい。また、細胞分離後の水性培 地を濃縮して、残渣を例えばメタノール、エタノール又は塩化メチレンに溶解し てもよい。残渣中に何らかの残留酸がある場合は、冷却、緩衝化又は乾固の如き 予防手段を講じて触媒反応を阻止すべきである。次いで、好ましくは、有機塩基 、例えば、トリエチルアミン又はピリジンの如き３級アミンを添加すべきである 。
本発明の化合物の製造方法の特に有利な点は、式（１）の化合物が室温で結晶化 によって式（ＩＩ）の化合物に転化することである。
かくして、本発明は、式（１）のシクロへキサジエン化合物を次のように転化す るｌ又は２以上の更なる段階も提供する：（ａ）対応する式（ＩＩ）のラクトン 化合物に：（ｂ）対応する式（Ｖ）のカルボン酸又はその塩に：（ｃ）対応する アリールボロネート（ａｒｙｌｂｏｒｏｎａＬｅ）化合物に。
転化（ａ）は、触媒員の酸の存在下で行われ、室温で又はエステル若しく（よニ トリルをゆっくり加熱することにより起こる。この酸、例えば、ｐ−トルエンス ルホン酸、安息香酸、硫酸又はリン酸は、反応が更なる介入なし番二進行する場 合には残渣中に存在しても、又は追加してもよい。
転化（ｂ）は、式（＋）のエステル又は式（ＩＩ）のラクトン化合物をアルカＩ Ｊ、例えば、ナトリウム又はカリウムの水酸化物又は炭酸塩で処理することによ り行うことができる。生成した塩を酸性にしてカルボン酸を得てもよ＋１１力毫 、酸も脱水を触媒して式（Ｖｌｌ）の芳香族化合物を生成するので、これ１注意 して行わな（すればならない。
転化（ｃ）は、我々のＥＰ−Ａ−３７９３００に記載されて−）る。
式（１）、（１１）及び（Ｖ）の化合物を更なる工程にお−）で式（Ｖｌ）の対 応するクマラノンに転化してもよい。この転化は、酸性にする力１又ｉｔ加熱脱 水するか又はその両方によって行うことができる。用いる酸は、好ましくＧｔポ ＋３＋Ｊン酸である。好都合な反応速度にするには、通常、１４０℃以上、例え ｉｆｌ　１８０℃までの温度が必要である。脱水は、固体に適用しても、例えば 、メシチレンの如き上の温度範囲で沸点を有する液体の溶液に適用してもよ０゜ かくして、本発明の更なる側面においては、弐ｍ）：の化合物の製造方法であっ て、（ａ）芳香族ジオキシゲナーゼ酵素力毫導入されている微生物に、対応する ベンセンタ１１化合物、酸素及びエネルギー源を供給することによって、式（１ ）又は（１１）の化合物を製造すること；及び（ｂ）（ａ）の生成物を酸性にす るか又は熱分解するかして式（Ｖｌ）の化合物を生成することを含む方法が提供 される。
式（１）又は（ＩＩ）の化合物を、酵素的又は化学的方法によって、例えば、遷 移金属触媒（特に金属パラジウム又は白金）により、できれば、酸化体、例えば 、フェリシアン化カリウム、又は水素化可能化合物、例えば、シクロヘキセンの 如き水素受容体の存在下で、対応するカテコール又はヒドロキシクマラノンに転 化することができる。
式（Ｖｌｌ）の化合物は、酸で処理することにより式（＋）又は（Ｖ）の化合物 から直接的に又はアルカリで処理することにより式（Ｖｌ）から間接的に生成さ せることかできる。充分なアルカリを用いれば、フェノール性ＯＨも中和される 。
酸性にすると閉環が容易に起こるので、式（Ｖｌｌ）のフリーのカルボン酸を作 ることは通常行えない。
かくして、本発明は、特に、微生物学的ヒドロキシル化を行った後に脱水して芳 香族化することにより、対応するフェニルアルカン酸から式（Ｖｌｌ）の２−ヒ ドロキシフェニルアルカン酸の塩を製造する方法であって、（ａ）対応するフェ ニルアルカン酸を３５℃未満の融点を有するエステル（ＩＩ＋）に転化し； （ｂ）生成したエステル（ＩＩ＋）を該微生物学的処理に供し：（Ｃ）生成した ヒドロキシル化エステル（１）を溶媒抽出により回収し。
（ｄ）該ヒドロキシル化エステル（１）をエステル交換により閉環し；（ｅ）生 成したラクトン（ＩＩ）を脱水し；（「）該ラクトン（１■）をアルカリで処理 することによって開環して塩（Ｖｌｌ）を得： （ｇ）要求されるカチオンが工程（ｆ）におけるアルカリに用いられていない場 合には、生成した塩（Ｖｌｌ）をかかるカチオンを有する塩に転化することを特 徴とする方法を提供する。
本発明の方法の更に有利な点は、２−ヒドロキシフェニルアルカン酸の製造にそ れか特に有用であることである。ウニゲストら（Ｂｉｏｃｈｅ園、　Ｊ、　１９ Ｂ１．１９４゜６７４−６８４）によれば、フェニル酢酸はジヒドロキシ酸に直 接ヒドロキシル化できる。しかしなが呟それら方法は、出発原料が低水溶性の固 体であるので固体又は塩として添加しなければならず、かくして、計量に困難性 があるか又は無関係な原料を導入する点で不都合である。更に、その生成物も塩 であるため、水不溶性溶媒による抽出に非常に不都合な分配係数を有する。その カルボン酸塩を水から単離する通常の方法は、酸性にして水不溶性溶媒に抽出す る方法であろう。本発明では、酸性化は生成物の望ましくない芳香族化をもたら す（転化ａ又はｂ）。
本発明の化合物は、医薬品及び農薬の製造の有用な中間体である。従って、本発 明の更なる側面においては、上で定義した式（１）及び（１１）の化合物の、対 応するラクトン、アリールボロネート、カルボン酸又はその塩、クマラノン、ヒ ドロキシクマラノン、−価フエノールカルボキシレート、２−ヒドロキシフェニ ルアルカン酸及びその塩、カテコール類の製造における中間体としての使用、及 び任意に農薬又は医薬品の製造における前記中間体のいずれかの使用が提供され る。実施例を参照することによって、本発明を更に説明する。実施例において、 ＮＭＲは核磁気共鳴スペクトルであり、ＭＳはマススペクトルであり、〔α〕。
は旋光度であるくボラルトロニツク・ユニバーサル・マシーン（Ｐｏｌａｒｔｒ ｏｐｉｃＵｎｉｖｅｒｓａｌ　ｍａｃｈｉｎｅ）を用いて測定した）。
ｌ　Ｊｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｇｅｎｅｒａｌ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、　１ ９６０．　Ｖｏｌｕｍｅ　２３．　ｐ、４５７−４６９に記■■ れたバウシＥ１７ブ・アンド・エルスドンス（Ｂａｕｓｃｈｏｐ　ａｎｄ　Ｅｌ ｓｄｏｎ’ｓ）。
２　コールド・スプリング・ハーバ−・ラボラトリーズ、ニューヨークにより１ ９７２年に公表されたミラーＵ、　Ｈ，Ｍｉｌｌｅｒ）による“ＩＩ！ｌｌｅｒ ｉｍｅｆｌＬｓ　ｉｆｆＭｏｌｅｃｕｌａｒ　ＧｅａｅＬｉｃｓ’に記載されル リア・リキュード（Ｌｕｒｉａ　１ｉｑｕｉｄ）。
去あｍリソへ！を Ｐ、プチダ株ＮＣＩＢ　１１７６７を初期対数増殖期まで培地２中で増殖した。
細胞を遠心分離により採取して、リッター当たり０．２ｇ乾燥細胞重量の濃度で 、１ｍｇのＮＴＧを含有する２０ｍＬの２５ｍＭクエン酸−クエン酸ナトリウム 緩衝液（ｐＨ５，５）中に再懸渇した。４５分後、３０℃で遠心分離により細胞 を採取し、培地ｌで２回洗浄してから、０．３％Ｗ／Ｖピルビン酸ナトリウムを 含有するこの培地中で３０℃で一晩増殖した。順次希釈してから、０．３　ｍＭ 　（０，０３３％ｗ　／　ｖ　）ピルビン酸ナトリウムを含有する培地１寒天上 に細胞をプレートし、それぞれがバイアル中に０．５ｍＬベンゼンを含有する１ リツターの錫製容器内でインキュベートした。３０℃で３日経過した後、直径が ０．５ｍｍ未満の１４４コロニーを剥ぎ取って、０．２％Ｗ／Ｖピルビン酸ナト リウム培地ｌ寒天上で再増殖した。これらが“第１突然変異体”であった。
ジオキシゲナーゼの ９０のこれら突然変異体を、２６０ｎｍで吸収を有する化合物がベンゼンから生 成したかどうかについて、培地２＋ピルビン酸ナトリウム中でスクリーニングし た。２６０ｎｍで最大吸収３７の上澄み液をもたらした突然変異体を以下で突然 変異体Ｂという。
Ｃの−（成・） Ｐ、プチダ株ＮＣＩＢ　１１７６７を増殖して先のバラブラフにおけるようにＮ ＴＧ処理した。このＮＴＧ処理細胞を洗浄し、希釈し、そして１．８Ｘ１０’コ ロニーの培地ｌ寒天＋ｌ　ＯｍＭ　（０，０１１％Ｗ／Ｖ）ピルビン酸ナトリウ ム上にプレートした。３０℃で２日経過した後、コロニーにカテコール水溶液（ ０，５モル濃度）を噴霧して、５分後に黄／緑に変色した３５を選択して、１６ ｍＬの培地１　＋０．５％Ｗ／Ｖピルビン酸ナトリウム中で一晩増殖した。細胞 を採取して０゜４％Ｗ／ｖエタノールを含有する１０ｍＬの２５ｍＭリン酸緩衝 液（ｐＨ７，８）中に再懸濁した。それぞれに０．５ｍＬ）ルエンが存在する２ ５０ｍＬコニカルフラスコ中でこれら培養液を一晩インキユベートした。２６５ 　ｎｍで吸収を有する化合物について上澄み液を試験した。２５０の吸光度を示 す構成的突然変異体Ｃを選択した。
然　Ｄの・　（成・） 突然変異体りを２０ｍＬの培地２中で３０℃で初期対数増殖期まで増殖し、採取 後に、細胞を４０ｍＬの０．１モル濃度Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４７Ｈ＊　Ｏに再懸濁し た。５ｍＬをガラス製ペトリ皿中で４５秒間１．６μＷ／ｃｍ”ｘ　１００の線 量でＵＶ照射した。次いで、細胞を暗所で５ｘ２０ｍＬの培地１＋ｌ　ＯｍＭ　 （０，０１１％Ｗ／Ｖ）ピルビン酸ナトリウム中で増殖させた。
且４田動駐」ニム ３０℃で２日経過した後、培養液を順次希釈して、４Ｘ１０’コロニーの培地ｌ 寒天＋７５ｍＭグルコース及び１％Ｗ／Ｖビタミン不含カザミノ酸（ディフコ（ Ｄｉｒｃｏ）社から、デトロイト　ミシガン、ＵＳＡ）上にプレートして、更に ２日間３０℃でインキュベートした。次いで、コロニーにカテコール水溶液（０ ，５モル濃度）を噴霧して、ｌＯの黄／緑変色コロニーを選択し、１０ｍＬの培 地１＋７５ｍＭグルコース及び１％Ｗ／Ｖカザミノ酸中で一晩３０℃で増殖した 。
細胞を採取して、上で行ったようにリン酸緩衝液＋エタノール中に再懸濁し、先 に記載したように０．５ｍＬ）ルエンの存在下で２８℃でインキュベートした。
異化抑制により突然変異体Ｃよりも害されていない、２６５　ｎｍで６１．２の 吸光度を示す構成的突然変異体りを選択した（突然変異体Ｃは吸光度１５．６） 。突然変異体りは、シュードモナス・プチダＵＶ−４としても知られている。
叉施困土 倉底王土二ム ２５ｇ乾燥細胞重量の新鮮な高活性細胞を含有する突然変異体り培養液を、３ｇ ／Ｌのエタノールを含有する５Ｌのリン酸カリウム緩衝ｍ（ｐＨ７，５）に添加 した。この溶液に時折自動的に苛性アルカリを添加することにより２８℃でｐＨ ７，５に維持し、空気を吹き込んで激しく攪拌することによって２０％０！飽和 状態に維持した。酢酸メチルフェニル液体をそのままこの溶液にＩｇ／Ｌ／ｈで １０時間かけてゆっくりと添加した。ＵＶ２６５吸光度の上昇がこの時間を通し て見られた。反応の終了時に、細胞を遠心分離により分離して沈殿物を捨てた。
上澄み液を減圧蒸留により４０℃で１．５％〜ｌＯ％ｗ／ｖ溶液に濃縮した。こ の濃縮液（この時点で０．７ＳＬ）に０．７５ｗ／ｖ当量のＭｇ３０．７ＨｔＯ を添加して生物デブリ物質を沈降させた。この溶液を濾過して、濾液をそれ自体 の容量の酢酸エチルで３回抽出した。この酢酸エチル溶液を全溶媒が留去するま で濃縮した。
生成物は淡褐色オイルで、ｌ−メトキシカルボニルメチレン−２，３−シス（２ Ｒ，３Ｓ）−ジヒドロキシ−３，５−シクロへキサジエンであった。
室温で数分か経過した後、発熱を伴って結晶化した。生成した固体をｎ−ヘキサ ンで磨り潰し、濾取しそして風乾した。’ＨＮＭＲ及びマススペクトルにより、 化合物７３−ヒドロキシーンスージヒドロクマラン−２−オン（■１）と２Ｒ。
３Ｓ−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロフェニル酢酸（Ｖ）（１，５ｇ；収率３ ０％）の４：１ｗ／ｗ混合物であるという特徴が明らかになった。
７Ｓ−ヒドロキシ−シス−ジヒドロクマラン−２−オン’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ＄ ）δ：　４．６５　（ｌ）Ｉ、　ｔ）；　５．０２　（ＬＨ，ｄｄ、　Ｊ＝３１ １ｚ）；　３．３０　（２Ｈ。
ｄｄ、Ｊ＝２２．５Ｈｚ）；　６．０　（２８，ｍ）；　５．９０　（ＩＨ，ｍ ）。
１３Ｃ（ＣＤＣ１，）δ：６４．３；　８１．６；　１３６．５；　１２５．６ ；　１２Ｂ、７；　１１４．９．２８．３．１６４．４゜Ｍ　Ｓ　ｍ／ｓ　：　 １５２　；　１２４と９５においてフラグメント２Ｒ，３Ｓ−ジヒドロキシ−２ ，３−ジヒドロフェニル酢’ＨＮＭＲ（ＣＤＣＩ、）　δ：　５．０２　（ｉｌ ｌ）；　４．５７　（ＩＨ，ｄｄ、　Ｊ’５Ｈｚ）；　２．６５　（２Ｈ，ｓ） ；６．０　（２Ｈ，鵬）；　５．８　（ＩＩｌ、ｍ）　。
”Ｃ（ＣＤＣＩ３）　δ：６Ｂ、ｌ；　８２．０；　１６．１．１１２．０；１ ２０．３．３３．０９．１？４．３゜工　Ｃ・２−クマラノンの一製 （ａ）Ｉｇの工程すの生成物をメシチレンに溶解して、１６５℃に３０分間加熱 し、放冷して水で抽出することにより単離してから、酢酸エチル中に戻した。２ −クマラノン（Ｖｌ　）を単離した（０．８ｇ、収率９ｏ％）。
（ｂ）別に、Ｉｇの工程すの生成物を固体のまま１５０”Ｃに加熱して２−クマ ラノンＣＶＩ　）を生成させた。
（ｃ）Ｉｇの１程すの生成物を１５０”ｃでポリリン酸で処理して２−クマラノ ン（Ｖｌ　）を収率７０％で生成させた。
２：Ａ成スキーム ２０ｇ乾燥細胞重量の新鮮な高活性細胞を含有する突然変異体り培養液を、４ｇ ／Ｌのエタノールを含有する４Ｌのリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，５）に添加 した。この溶液に時折自動的に苛性アルカリを添加することにより２８℃でｐＨ ７，５に維持し、空気を吹き込んで激しく攪拌することによって２０％Ｏｘ飽和 状態に維持した。安息香酸メチルをそのままこの溶液にｏ、２５〜０．５ｇ／Ｌ ／ｈで８時間かけてゆっくりと添加した。ｔＪＶ２６５吸光度の上昇が見られ、 基質安息香酸メチルの蓄積がないことがこの時間を通してＧＬＳにより示された 。反応の終了時に、細胞を遠心分離により分離して沈殿物を捨てた。上澄み液を 減圧蒸留により２０℃で０．５％〜１０％ｗ／ｖ溶液に濃縮した。この濃縮液（ この時点で２００ｍＬ）に０．７５ｗ／ｖ当量のＭｇ５Ｏ−７Ｈ２０を添加して 生物ダブリ物質を沈降させた。この溶液を濾過して、濾液をそれ自体の客員の酢 酸エチルで３回抽出した。この酢酸エチル溶液を全溶媒が留去されるまで濃縮し た。生成物はオイルで、２Ｒ，３Ｓ−ジヒドロキシ−２，３−ジヒドロ安息香酸 メチル（９ｇ）であった。収１は１６ｇ（０，１１７モル）安息香酸メチルを基 準として４５％であった。
’　ＨＮ　Ｍ　Ｒ（ＣＤＣＩｉ　３００ＭＨｚ）　δ：３．０　（２ｔ１．　ｂ ｒｓ、　ＤＨ）；　３．８５　（３Ｈ，ｓ、　ＯＭｅ）；４．５２　（１８，ｄ Ｌ、　Ｊ＝６．４．２．２）；　４．６２　（ＩＨ，ｄ、　Ｊ＝６．４）−６， １３（ＩＨ，ｄｄｄ。
Ｊ＝９．６．５．５，２．２）；　６．２５　（ＩＨ，ｄ■、Ｊ＝９．６）；　 ７．１　（ＩＨ，ｄ、Ｊ＝５．５）ＭＳ　ｍ／ｓ　（ＣＩ）：　１７０　（Ｍ” ）（ａ〕−＝　÷５８．７　＠（ｃ＝１．　ＣＬＣｈ）補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成　６年　９月１３■創

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．下式（Ｉ）又は（ＩＩ）のシクロヘキサジエン化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｉ）（式中、Ａはカルボン酸又はＣＮであり；Ｒ１は式（ＩＩ）においては低 級アルキレンであり式（Ｉ）においてはメチレンであって、いずれも１又は２以 上の非干渉性置換基を任意に有し；Ｒ２はＯ又はＮＨ又はＮＲ３であり；Ｒ３は Ｃ１−４アルキルであり；Ｘは非干渉性置換基であり；Ｚは任意に置換された５ 又は５具炭素環を含む任意の基であり；ｍは０又はしであり；そしてｎは０〜３ である。） ２．Λが式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒ（式中、ＲはＣ１−１０アルキルである）である 、請求項１の式（Ｉ）のシクロヘキサジエン化合物。 ３．Ｒ１が−ＣＨ２−、−ＣＨ２ＣＨ２−又は−ＣＨＯＨである、請求項１又は ２のシクロヘキサジエン化合物。 ４．ｍが０である、請求項１又は２のシクロヘキサジエン化合物。 ５．Ｒ２がＯである、請求項１又は３の式（ＩＩ）のシクロヘキサジエン化合物 。 ６．式（Ｉ）又は（ＩＩ）においてＺが存在しない、請求項１〜５のいずれかの シクロヘキサジエン化合物。 ７．Ａが式−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−Ｒであり；ＲがＣ１１０アルキルであり；Ｒ１がハ ロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ２−６シクロアルキル、ＣＦ２、ＣＮ、ＮＯ２、 置換基Ｘで任意に置換されたフェニル、ＣＯ２Ｒ、ＯＨ、ＯＲ４、ＳＨ、ＳＲ４ 、ＮＨＲ４、ＮＲ４、Ｒ４、Ｏ、ＮＯＨ、ＮＯＲ４、ＣＨ２、ＣＲ４Ｈ及びＣＲ ４Ｒ４で任意に置換されたメチレンであり；Ｒ４がハロゲン、アルコキシ又はア ルキルサルファイドで任意に置換されたＣ１−６アルキルであるか、又はＲ４が Ｃ２−６アルキルカルボニルてあり；Ｘがハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３ 、ＣＮ、ＮＯ２、フェニル、ＣＯ２Ｒ４、ＯＨ、ＯＲ４、ＳＨ、ＳＲ４及びＮＲ ４Ｒ１の群から選ばれ；ｎが０〜３であり、そしてＺが任意にベンゼン基である 、請求項１の式（Ｉ）のシクロヘキサジエン化合物。 ８．Ｒがメチルであり、ｍが１であり、Ｒ１がＣＨ２又はＣＨＯＨであり、そし てｎが０であるか又はｎが０より大きいときほ少なくとも１のＸがハロゲンであ る、請求項７のシクロヘキサジエン化合物。 ９．ｍが（１であり、Ｒがメチルであり、そしてｎが０であるか又はｎが０より 大きいときは少なくとも１のＸがハロゲンである、請求項１又は７のシクロヘキ サジエン化合物。 １０．Ｒ１がハロゲン、Ｃ１−６アルキル、Ｃ３−６シクロアルキル、ＣＦ２Ｃ Ｎ、ＮＯ２、置換基Ｘで任意に置換されたフェニル、ＣＯ２Ｒ（ＲはＣ１−６ア ルキルである）、ＯＨ、ＯＲ４、ＳＨ、ＳＲ４、ＮＨ、ＮＲ４、ＮＨＲ４、ＮＲ ４Ｒ４、Ｏ、ＮＯＨ、ＮＯＲ４、ＣＲ４Ｈ及びＣＲ４Ｒ４で任意に置換されたＣ １−４アルキルであり；Ｒ２がＯ、ＮＨ又はＮＲ３であり；Ｒ２がメチル又はエ チルであり；Ｒ４がハロゲン、アルコキシ又はアルキルサルファイドで任意に置 換されたＣ１−６アルキルであるか、又はＲ４がＣ２−６アルキルカルボニルで あり：Ｘがハロゲン、Ｃ１−６アルキル、ＣＦ３、ＣＮ、ＮＯ２、フェニル、Ｃ Ｏ２Ｒ４、ＯＨ、ＯＲ４、ＳＨ、ＳＲ４及びＮＲ４Ｒ４の群から選ばれ；ｎが０ 〜３であり、そしてＺが任意にベンゼン基である、請求項１の式（ＩＩ）のシク ロヘキサジエン化合物。 １１．Ｒ１が−ＣＨ２−又は−ＣＨＯＨであり、Ｒ２がＯであり、そしてｎが０ であるか又はｎか０より大きいときは少なくともｉのＸかハロゲンである、請求 項１０のシクロヘキサジエン化合物。 １２．下式（Ｉ）又は（ＩＩ）のシクロヘキサジエン化合物。 ▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼ （Ｉ）（式中、Ａはカルボン酸エステル又はＣＮであり；Ｒ１は式（ＩＩ）にお いては低級アルキレンであり式（Ｉ）においてはメチレンであって、いずれも１ 又は２以上の非干渉性置換基を任意に有し；Ｒ２はＯ又はＮＨであり；Ｘは非干 渉性置換基であり；そしてｎは０〜３である。）１３．２Ｒ，３Ｓエナンチオマ ーである、請求項１〜１２のいずれかのシクロヘキサジエン化合物。 １４．芳香族ジオキシゲナーゼ酵素が導入された微生物に、対応するベンゼン列 化合物、酸素及びエネルギー源を供給することを含む式（Ｉ）及び（ＩＩ）：▲ 数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）▲数式、化学式、表等があります▼（ Ｉ）（式中、Ａはカルボン酸エステル又はＣＮであり；Ｒ１は１又は２以上の非 干渉性置換基を任意に有する低級アルキレンであり；Ｒ２はＯ又はＮＨ又はＮＲ ３であり；Ｒ３はＣ１−４アルキルであり；Ｘは非干渉性置換基であり；Ｚは任 意に置換された５又は６員炭素環を含む任意の基であり；ｍは０又は１であり； そしてｎは０〜３である。）のシクロヘキサジエン化合物の製造方法。 １５．反応の二次生成物が、Ａが−ＣＯＯＨである式（Ｉ）の化合物である、請 求項１４の方法。 １６．エネルギーの供給源がエタノール又はグルコースである、請求項１３の方 法。 １７．第１突然変異株がシュードモナス・プチダ株ＮＣＩＢ１１６８０又はＮＣ ＩＢ１１７６７である、請求項１３又は１４のいずれか１項の方法。 １８．式（ＶＩ）： ▲数式、化学式、表等があります▼（ＶＩ）の化合物の製造方法であって、（ａ ）芳香族ジオキシゲナーゼ酵素が導入されている微生物に、対応するベンゼン列 化合物、酸素及びエネルギー源を供給することによって、式（Ｉ）又は（ＩＩ） ：▲数式、化学式、表等があります▼（ＩＩ）▲数式、化学式、表等があります ▼（Ｉ）（式中、Ａはカルボン酸エステル又はＣＮであり；Ｒ１は１又は２以上 の非干渉性置換基を任意に有する低級アルキレンであり；Ｒ２はＯ又はＮＨ又は ＮＲ１であり：Ｒ３はＣ１−４アルキルてあり；Ｘは非干渉性置換基であり；Ｚ は５又は６員炭素環を含む任意の基であり；ｍは０又は１であり；そしてｎは０ 〜３である。）の化合物を製造すること；及び（ｂ）（ａ）の生成物を酸性にす るか又は熱分解するかして式（ＶＩ）の化合物を生成することを含む方法。 微生物学的ヒドロキシル化を行った後に脱水して芳香族化することにより、対応 するフェニルアルカン酸から式（ＶＩＩ）：▲数式、化学式、表等があります▼ （ＶＩＩ）（式中、Ｒ１は１又は２以上の非干渉性置換基、を任意に有する低級 アルキレンであり；Ｘは非干渉性置換基であり；Ｚは５又は６員炭素環を含む任 意の基であり；ｍは０又は１であり：そしてｎは０〜３である。）の２−ヒドロ キシフェニルアルカン酸の塩を製造する方法であって、（ａ）対応するフェニル アルカン酸を３５℃未満の融点を存する対応するエステルに転化し； （ｂ）生成したエステルを該微生物学的処理に供し；（ｃ）生成したヒドロキシ ル化エステルを溶媒抽出により回収し；（ｄ）該ヒドロキシル化エステルをエス テル交換により閉環し；（ｅ）生成したラクトンを脱水し； （ｆ）該ラクトンをアルカリで処理することによって開環して対応する２−ヒド ロキシフェニルアルカン酸の塩を得；そして任意に（ｇ）生成した塩を要求され るカチオンを有する塩に転化することを特徴とする方法。 ２０．請求項１〜１２で定義した式（Ｉ）及び（ＩＩ）の化合物の、対応するラ クトン、アリールボロネート、カルボン酸又はその塩、クマラノン、ヒドロキシ クマラノン、一価フェノールカルボキシレート、２−ヒドロキシフェニルアルカ ン酸及びその塩、カテコールの製造における中間体としての使用、及び任意に農 薬又は医薬品の製造における前記中間体のいずれかの使用。
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