DE3780261T2

DE3780261T2 - Mikrobische herstellung von brenzkatechinen.

Info

Publication number: DE3780261T2
Application number: DE8787202183T
Authority: DE
Inventors: Philip John Geary; John Ernest Hawes
Original assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Current assignee: Shell Internationale Research Maatschappij BV
Priority date: 1986-11-20
Filing date: 1987-11-09
Publication date: 1992-12-24
Anticipated expiration: 2007-11-10
Also published as: EP0268331A3; ATE78057T1; DE3780261D1; JPS63137686A; EP0268331A2; EP0268331B1; GB8627711D0

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung von Brenzcatechinen.
Aus den Arbeiten von Gibson et al, Biochemistry, 7(7), 1968, S. 2653; und Biochemistry, 9(7), 1970, S. 1631, ist bekannt, daß verschiedene Organismen wie Pseudomonas putida Benzol und bestimmte weitere Abbauprodukte metabolisieren können. Es wird angenommen, daß der Metabolismus der nachstehenden, enzymkatalysierten Reaktionsfolge entspricht:
Nach diesem metsbolischen Ablauf wird Benzol (I; R = H) durch eine Dioxygenase zu cis-1,2-Dihydroxy-cyclohexa-3,5-dien (II; R = H) (manchmal als "cis-Benzolglycol" oder Benzoldihydrodiol" bezeichnet) umgewandelt, das unter der Einwirkung einer Dioldehydrogenase in Brenzcatechin (III; R = H) umgewandelt wird, welches enzymatisch zu weiteren Abbauprodukten übergeführt wird. Es wird angenommen, daß ein verwandter Ablauf, in dem R methyl bedeutet, für den Toluolmetabolismus unter Anwendung von Pseudomonas putida auftritt (Gibson et al, Biochemistry, 9(7), 1970, S. 1627).
Die mikrobielle Herstellung von Verbindungen der Formel (II) mit einem Gehalt an einem cis-1,2-Dihydroxy-cyclohexa-3,5-dien-Ring wurde von Taylor (US-Patent 4 508 822) unter Anwendung mutierter Stämme von P. putida beschrieben. Gibson et al haben in Biochemistry, 12(8), 1973, S. 1520, gezeigt, daß zellfreie Extrakte von P. putida, die auf Ethylbenzol gezüchtet worden sind, zur Gewinnung eines Brenzcatechinproduktes aus einer Verbindung der Formel (II) benützt werden können, worin R für Ethyl steht.
Brenzcatechine würden nützliche Produkte darstellen, um sie nach einem biochemischen Verfahren zu erhalten. Es hat sich jedoch als schwierig erwiesen, die enzymkatalysierte Reaktionsfolge von (I) zu (III) so zu steuern, daß die Verbindungen der Formel (III) in genügender Ausbeute erhalten werden, um einen kommerziell lebensfähigen Prozeß zu ergeben.
Gemäaß der vorliegenden Erfindung wird ein mikrobielles Verfahren zur Herstellung eines Brenzcatechins der Formel (IV)
worin R&sub1; und R&sub2; jeweils unter Wasserstoff, Halogen, Cyano, -COOH (und Derivaten hievon), Alkyl, Aryl und Cycloalkyl ausgewählt sind (wobei die Alkyl-, Aryl- und Cycloalkylgruppen substituiert sein können), geschaffen, welches Verfahren das Einbringen einer Verbindung der Formel (V)
worin R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind, in eine Kultur eines mutanten Stammes eines Benzol-metabolisierenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, welcher mutanter Stamm eine cis-Phenylglycoldehydrogenase enthält und zur Ansammlung des angestrebten Brenzcatechins der Formel (IV) befähigt ist, und ein anschließendes Gewinnen einer Verbindung der Formel (IV) hieraus umfaßt.
Vorzugsweise, wenngleich nicht notwendigerweise, ist auch die Verbindung der Formel (V) durch ein mikrobielles Verfahren aus einer Verbindung der Formel (VI)
worin R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind, erhalten worden, indem die Verbindung der Formel (VI) in eine Kultur eines mutanten Stammes eines Benzol-metabolisierenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium eingebracht worden ist, welcher mutante Stamm eine Dioxygenase enthält und zur Ansammlung des angestrebten cis-1,2-Dihydroxy-cyclohexa-3,5-diens der Formel (V) befähigt ist. Die Verbindung der Formel (V) kann nach Abtrennung der Mikroorganismen, jedoch ohne Produktisolierung, direkt im erfindungsgemäßen Verfahren zur wandlung zum Brenzcatechin (IV) verwendet werden. In alternativer Weise kann die Verbindung der Formel (V) gewonnen werden, bevor sie zu dem die cis-Benzolglycol-Dehydrogenase enthaltenden mutanten Stamm zugefühft wird.
Soferne nichts Gegenteiliges angeführt ist, weist in dieser Beschreibung jede Alkygruppe vorzugsweise 1 bis 6 Kohlenstoffatome auf; jede Cycloalkylgruppe enthält vorzugsweise 3 bis 6 Kohlenstoffatome; und jede Arylgruppe ist vorzugsweise eine Phenylgruppe.
In den vorstehenden Formeln (IV),(V) und (VI) bedeutet R&sub2; vorzugsweise Wasserstoff. R&sub1; ist vorzugsweise unter Wasserstoff, Halogen, Cyano, Alkyl und CX&sub3; (worin X ein Halogen, vorzugsweise Fluor ist) ausgewählt. R&sub1; steht bevorzugt für Fluor, wobei das resultierende Produkt 3-Fluorbrenzcatechin ist. Die Verbindung 3-Fluorbrenzcatechin ist auf rein chemischem Wege schwierig herzustellen und ist daher kostspielig. Es stellt ein nützliches Zwischenprodukt in der Herstellung von beispielsweise pharmazeutischen Stoffen und Organo-Fluor- Agrochemikalien dar.
Der derzeit bevorzugte Benzol-metabolisierende Mikroorganismus, aus dem geeignete mutante Stämme zur Umwandlung von (V) zu (IV) und auch für die mikrobielle Herstellung von (V) aus (VI) erhalten werden können, ist P. putida. Ein bevorzugter Wildtypen-Mikroorganismus ist jener, der mit Wirkung vom 6. Dezember 1985 bei der National Collection of Industrial Bacteria, Torry Research Station, Aberdeen, Schottland, deponiert worden ist und die numerische Bezeichnung NCIB 12190 erhalten hat und hier als "P. putida NCIB 12190" bezeichnet wird. Weitere geeignete Mikroorganismen umfassen jene, die im US-Patent 4 508 822 beschrieben sind, nämlich Pseudomonas putida NCIB 11767 und Pseudomonas putida NCIB 11680.
Der mutante Stamm zur Überführung von (V) in (IV) und mit einem Gehalt an cis-Benzolglykol-Dehydrogenase wird vorzugsweise nach einem Auswahlverfahren erhalten, das ein Mutieren eines Wildtypenstammes von Pseudomonas putida durch chemische oder physikalische Mittel, ein Wachsenlassen der mutierten Bakterien in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle, ein Einwirkenlassen der vermehrten Bakterien auf Benzol oder ein substituiertes Benzol und ein Auswählen jener mutierten Stämme von Pseudomonas putida umfaßt, die Brenzcatechin oder dessen substituierte Analoga angesammelt haben. In gleicher Weise ist der mutante Stamm zur Umwandlung von (VI) in (V) mit einem Gehalt an einer Dioxygenase vorzugsweise nach einem Auswahlverfahren erhalten worden, welches ein Mutieren eines Wildtypenstammes von P. putida durch chemische oder physikalische Mittel, ein Wachsenlassen der mutierten Bakterien in Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle, ein Einwirkenlassen der vermehrten Bakterien auf Benzol oder ein substituiertes Benzol und ein Auswählen jener mutanten Stämme von P. putida umfaßt, die cis-Dihydroxycyclohexadien oder dessen substituierte Analoga angesammelt haben. Falls erforderlich kann eine Re-Selektion ausgeführt werden, um eine zur Umwandlung von (VI) in (V) oder von (V) in (IV) geeignete Kultur zu erhalten.
In der Herstellung geeigneter Organismen für die Umwandlungsreaktionen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, die Organismen in einem geeigneten Wachstumsmedium zu züchten, an das sich eine "Reaktivierungs"-Stufe anschließt, in dem kein weiteres Wachstum mit keinen zusätzlichen Nährstoffen stattfindet, beispielsweise während 1 bis 2 Stunden. Es hat sich auch als vorteilhaft herausgestellt, das Kulturmedium durch Zugabe eines gleichen Volumens einer Lösung des Substrates zu verdünnen, wenn (V) zu (IV) umgewandelt wird.
Die Mutationen können durch chemische Mittel ausgeführt werden, wobei als Mutationsmittel beispielsweise N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin (in der Folge als "NTG" bezeichnet) verwendet wird. Es können andere Mutationsmittel angewendet werden, wie 2-Aminopurin oder 5-Bromuracil. Die Mutation kann auch mit physikalischen Mitteln ausgeführt werden, beispielsweise durch Ultraviolettbestrahlung oder unter Anwendung anderer ionisierender Bestrahlungsmethoden.
Beispiele für bevorzugte Kohlenstoffquellen sind Bernsteinsäure, Fumarsäure und Gluconsäure, zweckmäßig in Form von Salzen, wie Dinatriumsuccinat, Dinatriumfumarat und Natriumgluconat, sowie Fructose und Glycerin. Weitere geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Saccharose, Galactose, Lactose und Citrate.
Das Nährmedium für die Vermehrung kann ein beliebiges, für das Wachstum der mutanten Stämme geeignetes Medium sein, wobei ein Beispiel hiefür ein Minimalsalzmedium mit einem Gehalt an Natriumsuccinat ist.
Für die Umwandlung von (V) zu (IV) bevorzugte mutante Stämme sind jene, die durch Ultraviolettbestrahlung ersten werden und als UV-Mutanten A, B, C und D bezeichnet werden, wie nachstehend beschrieben. Ein für die Uwandlung von (VI) zu (V) besonders bevorzugter Mutantenstamm wird durch NTG-Mutation erhalten und hier als NTG-Mutant F bezeichnet.
Ein bevorzugtes Medium für die Umwandlung von (V) in (IV) oder für die Überführung von (VI) in (V) umfaßt Natriumsuccinat als Kohlenstoffquelle, beispielsweise in Kombination mit Ammoniumsulfat und Hefeextrakt. Weitere geeignete Kohlenstoffquellen umfassen Fumarate, Gluconate, Fructose, Glycerin, Saccharose, Galactose, Lactose und Citrate.
Während der Umwandlung von (V) zu (IV) wird das Kulturmediun vorzugsweise auf nicht mehr als 5% Luftsättigung, stärker bevorzugt auf nicht mehr als 2 % Luftsättigung gehalten. Die Temperatur liegt zweckmäßig im Bereich von 15 bis 35ºC, vorzugsweise von 25 bis 30ºC. Der pH-Wert des Mediums liegt vorzugsweise im Bereich von 6,5 bis 7,5, stärker bevorzugt von 6,8bis7,2. Die Konzentration der Zellen im Medium ist verhältnismäßig kritisch und liegt vorzugsweise im Bereich von 0,5 bis 2 g Trockengewicht/Liter. Es wurde gefunden, daß bei hoher Konzentration an Zellen (beispielsweise 2 g je Liter und darüber) etwas Überoxidation eintreten kann.
Das gewünschte Produkt kann aus der gebildeten Fermentationsbrühe nach jeder geeigneten Methode gewonnen werden, wie Absorption an Kohlegranulat oder durch Lösungsmittelextraktion.
Es wurde gefunden, daß bei Verwendung einer cis-1,2-Dihydroxy-cyclo-hexa-3,5- dien-Verbindung der Formel (V) als Substrat für den cis-Benzolglykol-Dehydrogenase enthaltenden mutanten Stamm gute Ausbeuten an Brenzcatechinprodukt erhalten werden können. Dies steht im Gegensatz zu den schlechten Ausbeuten, die bei direkter Verwendung einer Verbindung der Formel (VI) als Substrat erzielbar sind. Beispielsweise wurde gefunden, daß bei Verwendung von Fluorbenzol als Substrat für einen mutanten Stamm, wie jenen, der als UV-Mutant A bezeichnet wurde, 0ptimalkonzentrationen an 3-Fluorbrenzcatechinprodukt von nur etwa 0,6 g/l erzielt werden können. Dies ist so, trotz der Tatsache, daß theroetisch der UV-Mutant A beide notwendigen Enzyme enthält, um Fluorbenzol in 3-Fluorbrenzcatechin überzuführen, das heißt die Dioxygenase zur Umwandlung von Fluorbenzol in 3-Fluor-cis-1,2-dihydrocyclohexa-3,5-dien sowie die Dioldehydrogenase zur Umwandlung zum 3-Fluorbrenzcatechin.
Überraschenderweise können anderseits bei Ausführung des Verfahrens in stufenweiser Folge gemäß der vorliegenden Erfindung, sodaß 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxy-cyclohexa-3,5-dien an Stelle von Fluorbenzol als Substrat für den UV-Mutant A verwendet wird, Konzentrationen an 3-Fluorbrenzcatechinprodukt von über 3 g/l erzielt werden.
Ohne durch eine Theorie gebunden sein zu wollen, wird angenommen, daß die Brenzcatechine, beispielsweise 3-Fluorbrenzcatechin, die Wirkung der zur Umwandlung von (VI) zu (V) benötigten Dioxygenase inhibieren können, wogegen sie die zur Umwandlung von (V) zu (IV) benötigte Dioldehydrogenase nicht inhibieren. Dies war nicht zu erwarten und konnte nicht aus den von Gibson et al, wie zuvor angegeben, ausgeführten Metabolismus-Anfangsversuchen vorhergesagt werden.
Die Erfindung wird nunmehr an Hand von Beispielen weiter beschrieben.

Wachstumsmedien:

Die Zusammensetzungen von zwei der in den folgenden Beispielen verwendeten Wachstumsmedien sind nachstehend in Tabelle 1 angegeben.
ASM - Minimalsalzmedium
NFSM - stickstofffreies Salzmedium Tabelle 1: Mengen je Liter
Zusammensetzung der TK/3-Spurenelementelösung:
Diese enthielt je Liter die folgenden Komponenten:
ZnSO&sub4;.7H&sub2;O (0,288 g); MnSO&sub4;.4H&sub2;O (0,224 g); H&sub3;BO&sub3; (0,0618 g); CuSO&sub4;.5H&sub2;O (0,1248 g); Na&sub2;MoO&sub4;.2H&sub2;O (0,0484 g); CoCl&sub2;.6H&sub2;O (0,0476 g); KJ (0,083 g); 1M H&sub2;SO&sub4; (1 ml).
Weitere verwendete Wachstumsmedien waren:
dYT-Medium ----- 16 g Bacto-Trypton 10 g Bacto-Hefeextrakt 5 g NaCl/l
Hefeextraktmedium (YEM) 10 g Dinatiumsuccinat.6H&sub2;O 2 g/l (NH&sub4;)&sub2;SO&sub4; 3 g/l Hefeextrakt (Difco) 0,4 g/l MgSO&sub4;.7H&sub2;O 0,04 g/l Bacto-Pepton in 25 mM Kaliumphosphatpuffer End-pH 7,0.

Colorimetrische Bestimmung von cis-Dihydroxycyclohexadienen und Brenzcatechinen:

Es wurde die Methode nach Friestad et al, Analytical Chemistry 41, 1969, S. 1750 - 1754 angewendet. Die auf Brenzcatechine zu testenden Lösungen wurden mit einem gleichen Volumen an 3-Methyl-2-benzothiazolinonhydrazonhydrochlorid (0,05 % Gewicht/Volumen in Wasser) und mit einem gleichen Volumen an Cerammoniumsulfat (0,2 % Gewicht/Volumen in 0,4 % Gewicht/Volumen Schwefelsäure) vermischt. Gegebenenfalls wurde nach einigen wenigen Minuten ein Borat-Na0H- EDTA-Puffer zugesetzt, wie von Friestad et al beschrieben. Die Intensitäten der entwickelten Farben wurden visuell verglichen oder in alternativer Weise spektrophotometrisch bei 520 nm gemessen. Unter diesen Bedinungen entwickeln cis-Dihydroxycyclohexadiene keine Farben. Eine zweite Probe jeder Testlösung wurde daher vor dem Farbtest mit Schwefelsäure oder Chlorwasserstoffsäure angesäuert, um die Dihydroxycyclohexadiene quantiativ in Phenole überzuführen. Der Unterschied an Farbintensität zwischen den angesäuerten und den nicht angesäuerten Proben ist ein Hinweis auf den Gehalt an Dihydroxycyclohexadienen.

Gas-Chromatographie (GC):

Wäßrige Proben (0,5 µl) wurden an einer flexiblen 25 im Hewlett Packard Siliziumdioxid-Capillarsäule von hoher Kapazität, beschichtet mit 5 % Phenylmethylsilicon, unter Verwendung von Helium als Träger,gaschromatographiert. Die Säule wurde auf 130ºC gehalten und die eluierten Verbindungen wurden mit einem Flammenionisationsdetektor bestimmt.

Dünnschichtchromatographie (TLC):

Wäßrige Proben (5 µl) wurden auf Merck-Kieselgel 50 F254-Platten laufengelassen, die mit n-Propanol-Wasser-Ameisensäure 90:10:1 (Volumen/Volumen) entwickelt wurden. Der Dihydroxycyclohexadiengehalt wurde unter kurzwelligem UV-Licht sichtbar gemacht und das Brenzcatechin wurde durch Besprühen mit 2,6-Dichlorchinon-4-chlorimid (2 % in Ethanol) detektiert.

Hochdruckflüssigkeitschromatographie (HPLC):

Diese wurde unter Verwendung einer 15 cm-Spherisorb S85 µ-Säule mit einem Lösungsmittel aus 20:80 V/V Methanol:Wasser plus 0,1 % V/V Essigsäure mit einer Strömunsgeschwindigkeit von 0,1 ml/min ausgeführt. Der Nachweis erfolgte bei 220 nm unter Anwendung eines Cecil CE 212-Spektrophotometers.

Beispiel 1: Herstellung eines Dioldehydrogenase enthaltenden UV-Mutanten von P. putida

Aliquote anteil (1 ml) einer Suspension von P. putida NCIB 12190 in Phosphatpuffer mit pH 7 wurden auf Nähragarplatten verteilt. Die Platten wurden unter Verwendung einer Chromatolox-UV-Lampe 5 bis 30 Minuten lang bestrahlt. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC inkubiert und dann in eine Fluorbenzolatmosphäre bei 30ºC gebracht und weitere 24 Stunden inkubiert. 34 überlebende Kolonien wurden gereinigt und auf ihr Vermögen zur Ansammlung von Fluorbrenzcatechin in Schüttelkolbenexperimenten getestet. Fluorbrenzcatechin wurde gaschromatographisch gepruft. In Vergleichsversuchen sammelte ein mutanter Stamm, nachfolgend als UV-Mutant A bezeichnet, in 3 bis 4 Stunden 0,68 g je Liter Fluorbrenzcatechin an, und ein zweiter mutanter Stamm, bezeichnet als UV-Mutant B, sammelte in 3 bis 4 Stunden 0,56 g /l an. Unter den gleichen Bedingungen akkumlierte der Wildstamm NCIB 12190 0,41 g je Liter. Zwei weitere Stämme, die 0,5 bis 0,6 g/l und 0,62 g/l akkumulierten, wurden ebenfalls isoliert und als UV-Mutant C und UV-Mutant D bezeichnet.

Beispiel 2: Herstellung von Dioxygenase enthaltenden NTG-Mutanten von P. putida:

Pseudomonas putida NCIB 12190 wurde über Nacht bei 30ºC in dYT-Medium vermehrt. Von der Kultur wurden Unterkulturen 1/20 in 10 ml frischem dYT angesetzt und weitere 4 Stunden lang inkubiert. Die Bakterien wurden durch Zentrifugieren geerntet, in NFSM gewaschen und nochmals durch Zentrifugieren geerntet,bevor sie in NFSM (3 ml) resuspendiert wurden und die optische Dichte bei 600 nm auf 3,0 eingestellt wurde.
Ein 1 ml-Aliquot wurde bei 30ºC 15 Minuten lang in einem "Eppendorf"-Rohr inkubiert und dann wurde NTG (N-Methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidin, 5 mg/ml in Dimethylsulfoxid) zugesetzt, um 50 µg/ml zu ergeben. Der Inhalt des Rohres wurde kurz gemischt und 15 Minuten bei 30ºC inkubiert. Die Mutation wurde durch Abkühlen in Eis, Zentrifugieren und dreimaliges Waschen in 0,85%iger NaCl-Salzlösung gestoppt. Die Bakterien wurden in Salzlösung verdünnt und 0,1 ml-aliquote Anteile wurden auf 100 ASM-Platten ausplattiert, die jeweils 0,05% Natriumsuccinat enthielten. Die Platten wurden 48 Stunden lang bei 30ºC inkubiert.
Nach dem Inkubieren waren auf den Platten kleine "Mikro"-Kolonien sichtbar, da der Succinatgehalt nur für ein kleines Ausmaß des Wachstums ausreichte. Die Platten wurden dann 24 Stunden lang bei 30ºC Benzoldampf ausgesetzt, was zu einer großen Varietät von auf den Platten sichtbaren Koloniengrößen führte. In einem ersten Selektionsverfahren wurden kleine Kolonien auf den Platten (die wegen ihres Unvermögens, auf Benzol zu wachsen, klein sind) (20 bis 30/Platte) unter Verwendung steriler Cocktailspießchen aufgenommen und in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Titertek) mit einem Gehalt an 50 µl ASM + 0,5 % Natriumsuccinat je Vertiefung verteilt. Die Platten wurden über Nacht bei 30ºC in einem verschlossenen Kasten inkubiert, um eine Verdampfung zu verhindern, und die Mikrotiterplatten wurden auf quadratische (120 mm) Platten aus handelsüblichem Nähragar (Oxoid, für Kontrollversuche) unter Verwendung einer Repliziervorrichtung mit 96 Spitzen repliziert. Die Agarplatten wurden über Nacht inkubiert und die Mikrotiterplatten wurden 3 Stunden lang Benzoldampf ausgesetzt. Die anschließende Prüfung erfolgte nach der oben beschriebenen colorimetrischen Methode. Jene Mutanten, die die intensivste Farbe entwickelten, wurden für ein weiteres Testen auf die Akkumulation von cis-Dilydroxycyclohexadien und zur Identifizierung der besten Mutanten für die Produktion ausgewählt. Die ausgewählten besten Mutanten wurden unter Anwendung von Schüttelkolbenkulturen getestet und die colorimetrische Bestimmung wurde wiederholt. Unter Anwendung einer Kultur von Wildtyp-P. putida NCIB 12190 wurden Kontrollversuche ausgefuhrt, unter Zusatz von Chloramphenicol als Proteinsyntheseinhibitor, obwohl kein Chloramphenicol zu den mutanten Stämmen zugesetzt wurde. An einigen Überständen wurden HPLC-Analysen zur Bestätigung ausgeführt.
Aus jeder der sechs unabhängigen Ausgangskulturen von P. putida NCIB 12190, die mit NTC mutiert worden waren, wurden 100 Platten beimpft, die etwa 100.000 Kolonien ergaben, von denen 13.500 in Mikrotiterplatten ausgesondert und 435 anfangs für das Farbtesten ausgewählt wurden. 90 von diesen wurden nach dem Farbtesten weiter überprüft und an 14 der Mutanten wurden TLC-Analyse- und Schüttelkolbenexperimente ausgeführt.
Die Kulturen wurden über Nacht in ASM plus 0,5 % Natriumsuccinat vermehrt, durch Zentrifugieren geerntet, gewaschen und in NFSM resuspendiert. Die Kulturen wurden der Einwirkung von Benzol ausgesetzt und die Überstände wurden auf Brenzcatechin oder Brenzcatechin plus cis-Dilydroxycyclohexadien analysiert. Für die Vergleichsversuche wurde Wildtyp-P. putida NCIB 12190 verwendet, unter Zusatz von 1 mg/ml Chloramphenicol zu dem NFSM-Medium.
Einer jener Mutanten, die kein Brenzcatechin bilden konnten, aber cis-Dihydroxycyclohexadien akkumulierten, wurde ausgewählt und als NTG-Mutant F bezeichnet. Die Ergebnisse dieses Mutanten sind in Tabelle 2 angeführt. Tabelle 2: Brenzcatechin Brenzcatechin plus cis-Dihydroxycyclohexadien

Beispiel 3: Verwendung des NTG-Mutanten F in der Herstellung von 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-dien unter Einsatz von Succinat als Kohlenstoffquelle.

8 Liter YEM wurden in einem Rührfermenter mit einer 20 Stunden-Schüttelkolbenkultur von NTG-Mutant F beimpft, der auf dem gleichen Medium gezüchtet worden war (50 ml). Der Organismus wurde unter den Belüftungsbedingungen von 500 Umdrehungen je Minute und 500 ml Luft je Minute 19 Stunden lang bei kontinuierlicher Einspeisung von konzentrierter Nährquelle (320 g Dinatriumsuccinat und 64 g Ammoniumsulfat in 1 Liter 0,025 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,2) mit 40 ml/Stunde gezüchtet. Der Sauerstofftransfer wurde durch Erhöhen der Rührergeschwindigkeit auf 550 Umdrehungen je Minute und der Belüftungsrate auf 700 ml Luft/Minute während 30 Minuten gesteigert und dann auf die Parameter 500 Umdrehungen je Minute; 600 ml Luft/Minute; Sauerstoffgleichgewichtsspannung 30 % anfangsgesättigte Luft eingestellt.
Das Fluorbenzol wurde mit einer Pumpe (Gilson Modell 302) mit 50 ul/min zudosiert (Gleichgewichtskonzentration in der Reaktion 100 bis 125 mg/l). Vor der Reaktion wurde die optische Dichte mit 3,11 bestimmt, entsprechend einem Trockenzellengewicht von 3,9 g/l. Die Produktion von 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxcyclohexa-3,5-dien (II; R = F) wurde gaschromatographisch überwacht und die Konzentration erreichte nach 24 Stunden 2,8 g/l.
Das Produkt wurde auf granulierter Kohle absorbiert und von der Kohle durch Extraktion mit einem Gemisch aus Diethylether und Methanol (Volumenverhältnis 4:1) in einer Soxhlet-Vorrichtung gewonnen. Das Verdampfen des Lösungsmittels hinterließ einen Feststoff, der aus einem Gemisch aus Diethylether und Pentan umkristallisiert wurde und farblose Nadeln vom F. 73 bis 74ºC (Zersetzung) ergab.
UV-Spektrum (H&sub2;O):λmax 259 nm (&epsi;3150).
Zirkulardichroismus: (H&sub2;O):λmax 255 nm (Δ&epsi;-1,9).
Massenspektrum: m/z 130 (15%, M&spplus;), 112 (65%), 84 (100 %).
¹H-NMR-Spektrum (CDCl&sub3;):δ 5,88 (1H, mult, J = 10, 6,5, 6, 2 Hz; 5-C-H), 5,71 (1H, dd, J = 10, 3 Hz; 6-C-H), 5,60 (1H, dd, J = 11, 6,5 Hz; 4-C-H), 4,51 (1H, br.mult, J = 6, 3, 2 Hz; 1-C-H), 4,29 (1H, tr, J = 6, 6 Hz; 2-C-H), 2,40 (2H, br.s, O-H) ppm.

Beispiel 4: Umwandlung von 3-Fluor-cis-1,2-dinydroxycyclohexa-3,5-dien in 3-Fluorbrenzcatechin unter Verwendung verschiedener UV-Mutanten

Die verschiedenen UV-Mutanten A, B, C und D, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurden in Schüttelkolben 17 Stunden lang in einem Natriumsuccinatheptahydrat (10 g/l), Hefeextrakt (3 g/l), Ammoniumsulfat (2 g/l), Magnesiumsulfathexahydrat (0,4 g/l) und Bactopepton (0,04 g/l), zusammen mit Spurenmetallen enthaltenden Medium bis zu einer Zellenkonzentration von annähernd 1,5 g/l Trockenzellgewicht vermehrt. In jeden Kolben von 250 ml Fassungsvermögen und mit einem Gehalt an 50 ml Kultur wurde eine Probe von zuvor isoliertem und gereinigtem 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-dien, entsprechend einer Konzentration von 4 g/l, zugesetzt. Die Kolben wurden im Schüttelmodus bei etwa 30ºC inkubiert, wobei der Sauerstoffbedarf durch das Eintreten von Luft durch den porösen Verschluß befriedigt wurde. Die Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle 3 angeführt. Tabelle 3: Dioldehydrogenase UV-Mutant Anfangsreaktionsgeschwindigkeit % Diol umgewandelt Konzentration von 3-Fluobrezcatechin
Es sei bemerkt, daß die Konzentration an 3-Fluorbrenzcatechin durch Arbeiten bei ausreichender Verdünnung mit kontrollierter Belüftung gesteigert werden kann.

Beispiel 5 Umwandlung von 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxy-cyclokexa-3,5-dien in 3-Fluorbrenzcatechin

Der UV-Mutant A, hergestellt wie in Beispiel 1 beschrieben, wurde auf Hefeextraktmedium bis zu einer Zellenkonzentration vo 2 g/l Trockengewicht vermehrt. Die Kultur wurde dann 1:1 mit einem Melassemedium verdünnt, das 25 mMol Kaliumphosphatpuffer pH 7,2 umfaßte und 2 g/l Ammoniumsulfat; 18,75 g/l Zuckerrohrmelasse; 3 g/l Hefeextrakt; 0,4 g/l Magnesiumsulfat und 0,04 g/l Bactopepton enthielt, mit einem Zusatz an kristallinem 3-Fluor-cis-1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-dien (3,5 g/l). Die die Kultur enthaltenden Kolben wurden dann im Schüttelmodus bei etwa 30ºC inkubiert, wobei der Sauerstoffbedarf durch Lufteintritt durch einen porösen Kolbenverschluß befriedigt wurde. Nach 8 Stunden waren mehr als 80% des Diols umgewandelt und die Konzentration an 3-Fluorbrenzcatechin im Medium betrug 3,1 g/l.

Vergleichsbeispiel: Verwendung des UV-Mutanten A in der Herstellung von 3-Fluorbrenzcatechin

8 l YEM wurden in einem Fermenter mit 30 ml einer 16 Stunden-Schüttelkultur des UV-Mutanten A, gezüchtet bei 30ºC auf dem gleichen Medium, beimpft. Der Organismus wurde 70 Stunden lang unter Sauerstoffriangelbedingungen (200 U je Minute, 350 ml Luft/min) vermehrt, während welcher Zeit an der Sauerstoffelektrode eine Nullablesung aufgezeichnet wurde. Nach 17 Stunden wurde die Belüftungsrate auf 400 Umdrehungen je Minute und 450 ml Luft/Minute erhöht, um das Wachstum anzuregen, und wurde eine Stunde lang aufrecht erhalten und führte zu einer aktiv wachsenden Kultur mit einem Trockengewicht von 0,6 g/l (1,9 x 10&sup9; lebende Zellen je ml). 10 ml Fluorbenzol wurden zugesetzt und die Belüftung wurde auf 320 Umdrehungen je Minute und 150 ml Luft/min zurückgenommen. In Intervallen, gesteuert von einem Sensor (Katherometer) im Abgas, wurde die Luft mit Fluorbenzol gesättigt, indem sie durch einen diese Verbindung enthaltenden Wäscher geführt wurde, unter Aufrechterhaltung einer Fluorbenzol-Gleichgewichtskonzentration von etwa 300 mg/l im Reaktionsgemisch. Die 3-Fluorbrenzcatechinbildung wurde gaschromatographisch überwacht und mit 0,45 g/l nach 6 Stunden und 0,62 g/l nach 24 Stunden geschätzt. Der pH-Wert wurde durch automatische Zugabe von Schwefelsäure konstant auf 7,2 gehalten.

Charakterisierung von Pseudomonas putida NCIB 12190

Pseudomonas putida NCIB 12190 wurde von der NCIB wie folgt charakterisiert und identifiziert:
Die Versuche wurden bei 25ºC ausgeführt und das Wachstum erfolgte auf einem LAB M Nähragar, soferne nichts anderes angegeben ist.

Zellmorphologie:

Nach 24 stündigem Wachstum bei 30ºC auf Succinatagar, übertragen auf Nährbrühe + 0,75 Gew.-% Agar, zeigten sich die Zellen im Phasenkontrast bei 630facher Vergrößerung als kleine kurze Stäbe oder Kokken in Clustern.

Grammnegativ

Sporen -
Beweglichkeit +
Morphologie der Kolonien
Nach 48stündiger Vermehrung sind die Kolonien rund, gleichmäßig, ganz, glatt, opak, mäßig konvex, gebrochen weiß und kleiner als 1 mm im Durchmesser.

Wachstum auf Glucose - Pepton - Wasser -Zucker

37ºC +
41ºC -
Katalase +
Oxidase, Konvacs +
O - F-Glucose Oxidativ
"O-F Glucose" wurde unter Anwendung des Oxidations-Fermentations-Mediums von Hayward und Hodgkiss, J. Gen. Microbiol. 26 (1961) 133 - 140,ergänzt mit 1 Gew.-% filtersteriliserter D-Glucose, ausgeführt. Eine Probe wurde beimpft und 14 Tage lang inkubiert.
Pseudomonas putida NCIB 12190 kann in bequemer Weise auf Schrägnähragar bei 4ºC oder als gefriergetrocknetes Material gelagert werden.

Claims

1. Mikrobielles Verfahren zur Herstellung eines Brenzcatechins der Formel (IV)

worin R&sub1; und R&sub2; jeweils unter Wasserstoff, Halogen, Cyano, -COOH (und Derivaten hievon), Alkyl, Aryl und Cycloalkyl ausgewählt sind (wobei die Alkyl-, Aryl- und Cycloalkylgruppen substituiert sein können), umfassend das Einbringen einer Verbindung der Formel (V)

worin R&sub1; und R&sub2; wie vorstehend definiert sind, in eine Kultur eines mutanten Stammes eines Benzol-metabolisierenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium, welcher mutanter Stamm eine cis-Phenylglycoldehydrogenase enthält und zur Ansammlung des angestrebten Brenzcatechins der formel (IV) befähigt ist, und ein anschließendes Gewinnen einer Verbindung der Formel (IV) hieraus.

2. Verfahren nach Anspruch 1, worin R&sub2; Wasserstoff bedeutet.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, worin R&sub1; Fluor bedeutet.

4. Verfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3, worin der eine cis-Phenylglycoldehydrogenase enthaltende mutante Stamm durch Mutieren eines Wildtypenstammes von Pseudomonas putida, vorzugsweise P. putida NCIB 12190, erhalten worden ist.

5. Verfahren nach Anspruch 4, worin der mutante Stamm durch Ultraviolettbestrahlung erhalten worden ist.

6. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin das Verfahren in einem Bernsteinsäure enthaltenden Medium ausgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Verbindung der Formel (V) durch ein mikrobielles Verfahren aus einer Verbindung der Formel (VI)

worin R&sub1; und R&sub2; wie in Anspruch 1 definiert sind, durch Einbringen der Verbindung der Formel (VI) in eine Kultur eines mutanten Stammes eines Benzol-metabolisierenden Mikroorganismus in einem geeigneten Medium erhalten worden ist, welcher mutante Stamm eine Dioxygenase enthält und zur Ansammlung des angestrebten cis-1,2-Dihydroxycyclohexa-3,5-diens der Formel (V) befähigt ist.

8. Verfahren nach Anspruch 7, worin die Verbindung der Formel (V) direkt zur Speisung des eine cis-Phenylglycoldehydrogenase enthaltenden mutanten Stammes ohne Produktisolierung verwendet wird, aber nach Abtrennung des eine Dioxygenase enthaltenden Mikroorganismus.

9. Verfahren nach Anspruch 7 oder 8, worin der eine Dioxygenase enthaltende Stamm durch Mutieren eines Wildtypenstammes von Pseudomonas putida, vorzugsweisse P. putida NCIB 12190, erhalten worden ist.

10. Verfahren nach Anspruch 9, worin der eine dioxygenase enthaltende mutante Stamm auf chemischem Wege unter Verwendung von N-Methyl-N'-nitro-N-nitroso-guanidin als Mutationsmittel erhalten worden ist.