JPS63137686A - カテコール類の微生物製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、カテコール類の微生物製造法に関するもので
ある。

たとえばシュードモナス・プチダ（Ｐａｅｕｄｏｍｏｎ
ａｓｐｕｔｉｄａ　）のような成る種の微生物がベンゼ
ンおよび成る種の他の分解生成物を代謝する能力はギプ
ソン等、バイオケミストリー、第７（７）巻。

（／デ４１ｒ）、第２６５３頁およびバイオケミストリ
ー、第９（７）巻（／？りＯ）、第１６３／頁の論文か
ら知られている。九とえば、代謝は下式の酵素触媒反応
順序にし九がうと思われる： この代謝経過にしたがい、ベンゼン（１：Ｒ＝Ｈ）はジ
オキシゲナーゼによってｃｉｍ　−／＃、、２−ジヒド
ロキシ−シクロヘキサ−３，３−ジエン（Ｉｆ：Ｒ＝Ｈ
）（これはしばしばｒ　ｅｉｓ−ベンゼングリコール」
モジくは「ベンゼンジヒドロジオール」として知られる
）まで変換され、これはジオールデヒドロゲナーゼの作
用下でカテコール（１：Ｒ＝Ｈ）まで変換され、とのカ
テコールが酵素的に他の分解生成物まで変換される。Ｒ
がメチルである関連経路は、シュードモナス・プチダを
用いるトルエンの代謝についても生ずると思われる〔ギ
プソン等、バイオケミストリー、第９（り）巻、（／９
りＯ）、第７６＝７頁〕。

ａｉｍ　−／＊２−ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３、
Ｓ−ジエン環を有する式（ＩＩ）の化合物の微生物学的
製造はティラーによシ記載されており（米国特許第１Ａ
、３０ζｇコツ号）、この場合Ｐ、プチダの突然変異株
を用いる。ギプソン等、バイオケミストリー、第１２Ｃ
ｇ）巻（／９’７３）、第１ＳコＯ頁は、エチルベンゼ
ンで増殖させたＰ、プチダの菌体フリーの抽出物を用い
て、Ｒがエチルである式（Ｉｆ）の化合物からカテコー
ル生成物を得ることができることを示している。

カテコール類は生化学法によって得られる有用な生成物
である。しかしながら、上記（１）から（１）への酵素
触媒反応順序を制御して、式（ＩＩＩ）の化合物を産業
上利用しうる方法を与えるのに充分な収率で得るのは困
難であることが判明している。

本発明によれば、式（ＩＶ）： Ｒ４ Ｃ式中、Ｒ１およびＲ２はそれぞれ水素、ノ１０ダン。

シアノ、−ＣＯＯＨ（およびその誘導基、たとえば未置
換もしくは置換アミド）、アルキル、アリールおよびシ
クロアルキル（これらアルキル、アリールおよびシクロ
アルキル基は置換することができる）から選択される〕 のカテコールを製造するに際し、式（Ｖ）：Ｒ１ 〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記の意味を有する〕の化合
物をベンゼン代謝性微生物の突然変異株の適する培地に
おける培養物に供給し、前記突然変異株ｉ；ｉ　ｃ　ｉ
　ｔｒ−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼを含有す
ると共に式（ＩＶ）の所要のカテコールを蓄積すること
ができ、次いで式（ＩＶ）の化合物を回収することを特
徴とするカテコールの微生物製造方法が提供される。

好ましくは、必らずしも必要でないが、式（Ｖ）の化合
物は式（■）： Ｒ１ 〔式中、Ｒ１およびＲ２は上記の意味を有する〕の化合
物から、この式（Ｖｌ）の化合物をベンゼン代謝性微生
物の突然変異株の適する培地における培養物へ供給する
ととＫよって微生物法によっても得られ、前記突然変異
株はジオキシゲナーゼを含有すると共に式（Ｖ）の所要
のｃｉｇ　−／ｅ２−ジヒドロキシ−シフ四ヘキサ−３
，Ｓ−ジエンを蓄積することができる。式ｆｆ）の化合
物は、微生物を除去した後に生成物を単離することなく
、カテコール（ｆｆ）まで変換させるための本発明の方
法に直接使用することができる。或いは、式（ｖ）の化
合物は、ｃｉｍ−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼ
を含有する突然変異株へ供給する前に回収することもで
きる。

本明細書において特記しない限シ、全てのアルキル基は
好ましくは７〜６個の炭素原子を有し、シクロアルキル
基は好ましくは３〜６個の炭素原子を有し、またアリー
ル基は好ましくはフェニル基である。

上記式（ＩＶ）、（Ｖ）　オ！び（ｖＩ）　Ｋオｆｆル
Ｒ２ハ好ｔしくは水素である。Ｒ１は好ましくは水素、
ハロゲン、シアノ、アルキルおよびＣＸ３（ζこでＸは
ハロゲン、好ましくは弗素である）から選択される。

Ｒ１は好ましくは弗素であシ、得られる生成物は３−フ
ルオロカテコールである。３−フルオロカテコールは純
粋な化学手段では製造困難であり、したがって高価につ
く。これは、九とえば医薬品および有機弗素農薬の製造
における有用な中間体である。

（ｖ）からＣＰｉ）への変換およびさらに（Ｖ）から０
への微生物製造に適する突然変異株を得ることができる
現在好適なベンゼン代謝性微生物はＰ、プチダである。

好適な野性型微生物はスコツトランド。

アバディーン在、トリー・リサーチ・ステーション、ナ
ショナル・コレクション・オプーインダストリアル・バ
クテリアに／９ｇ！ｒ年／２月６日付けで寄託されかつ
受託番号ＮＣＩＢ　／２１９０が付与された微生物であ
り、本明細書において、これをｒ　Ｐ、ｆ　？　／　Ｎ
ＣＩＢ　／コ／９０　Ｊと称する。他の適する微生物は
米国特許第４４．　、！−Ｏｒ、　ｆｆ　２−号公報に
記載されたもの、すなわちシュードモナス・プチダＮＣ
ＩＢ　／／７４７およびシュードモナス・プチダＮＣＩ
Ｂ　／／６ＩｒＯを包含する。

（Ｖ）を（Ｖｌ）まで変換しかつａｉｍ−ベンゼングリ
コールデヒドロゲナーゼを含有する突然変異株は。

好ましくはシュードモナス・プチダの野性型菌株を化学
的もしくは物理的手段により突然変異させ、この突然変
異した細菌を炭素原の存在下に増殖させ、増殖し次細菌
をベンゼンもしくは置換ベンゼンに接触させかつカテコ
ールもしくはその置換同族体を蓄積したシュードモナス
・プチダの突然変異株を選択することからなる選択法に
よって得られる。同様に、（ＶＩ）を（Ｖ）まで変換し
かつジオキシゲナーゼを含有する突然変異菌株は、好ま
しくはＰ、プチダの野性型菌株を化学的もしくは物理的
手段によって突然変異させ、この突然変異した細菌を炭
素源の存在下で増殖させ、増殖した細菌をベンゼンもし
くは置換ベンゼンに接触させかつｅｉｓ−ジヒドロキシ
シクロへキサジエンもしくはその置換同族体を蓄積した
Ｐ、ｆチダの突然変異株を選択することからなる選択法
によって得られる。

必要に応じ、再選択法を行なって、（Ｖｌ）から（Ｖ）
への或いは（Ｖ）からＣＰＩ）への変換に用いる適当な
培養物を得ることもできる。

これら変換反応のための適する微生物を作成する際、こ
れら微生物を適する増殖培地にて増殖させ、次いで追加
栄養源を用いずに、たとえば７〜２時間にわたシさらに
増殖させる「再賦活」１福を行なうのが有利であると判
明した。さらに、（ロ）を（ＩＶ）　ｔで変換する際は
同容量の基質溶液を添加して培地を希釈するのが有利で
あることも判明した。

突然変異は、たとえば突然変異剤としてＮ−メｆ　／ｌ
／　−Ｎ’−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン（以下ｒ
　ＮＴＧ　Ｊと称する）を用いる化学手段によって行な
うことができる。たとえばコーアミノプリンモシくは３
−ブロモウラシルのよう表他の突然変異剤も用いること
ができる。さらに突然変異は、たとえば紫外線照射によ
る或いは他のイオン照射法を用いる物理的手段によって
行なうこともできる。

好適炭素源の例はコ・・り酸、フマル酸およびグリコン
酸でありて、好適にはたとえばコハク酸二ナトリウム、
フマル酸二ナトリウムおよびグリコン酸ナトリウムのよ
うな塩類、フラクトースおよびグリセリンである。他の
適する炭素源は蔗糖、ガラクトース、９ム糖およびクエ
ン酸塩を包含する。

増殖用の栄養培地は突然変異株の増殖に適する任意のも
のとすることができ、その例はコハク酸ナトリウムを含
有する最小塩培地である。

（Ｖ）から（ＩＶ）への変換に好適な突然変異株は、紫
外線照射によって得られる菌株であって、以下ＵＶ−突
然変異株Ａ、Ｂ、ＣおよびＤと称する。■から（Ｖ）へ
の°変換に特に好適な突然変異株はＮＴＧ−突然変異に
よって得られ、これを本明細書においてＮＴＧ突然変異
株Ｆと称する。

（Ｖ）から（ＩＶ）への変換或いは（Ｖｌ）からｆｆ）
への変換に好適な培地は、たとえば硫酸アンモニウムお
゛よび酵母抽出物と組合せた炭素源としてのコハク酸ナ
トリウムからなっている。他の適する炭素源はフマル酸
塩、グルコン酸塩、フラクトース。

グリセリン、蔗糖、ガラクトース、乳糖およびクエン酸
塩を包含する。

（Ｖ）から（ＩＶ）への変換に際し、培地は好ましくは
５％以下、よシ好ましくは一％以下の空気飽和に維持さ
れる。便利には、温度は７５〜３３℃の範囲であシ、好
ましくはＪｊ〜３０℃の範囲である。培地の−は好まし
くは６．３〜ＺＳの範囲、より好ましくは６．　ｇ　−
’７：　２の範囲である。培地における菌体の濃度は比
較的重要であシ、好ましくは０．３〜２ｇ乾燥重量／！
の範囲である。菌体濃度が高い（たとえば２１１／ｉｔ
もしくはそれ以上）場合、東る程度の過度の酸化も生じ
うろことが判明した。

所望の生成化合物は、得られた発酵培地から、たとえば
粒状木炭への吸着或いは溶剤抽出のような任意適当な手
段で回収することができる。

ｃｉｓ−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼを含有す
る突然変異株のための基質としてｅｌｌｌ　−／、２−
ジヒドロキシ−シクロヘキサ−３，５−ジエン化合物を
用いることによシ、生成物カテコールの良好な収率が得
られることを突き止めた。これは、式（Ｖｌ）の化合物
を基質として直接に用いて得られるような低い収率と対
照的である。たとえば上記ＵＶ−突然変異株Ａのよう々
突然変異株のための基質としてフルオロベンゼンを用い
る場合、僅か約０．６１１／ｌという生成物３−フルオ
ロカテコールの最適濃度が得られることを突き止めた。

これは、理論上ＵＶ−突然変異株Ａがフルオロベンゼン
を３−フルオロカテコールまで変換するのに必要す酵素
、すなわちフルオロベンゼンｔ３−フルオロ−ｃｉｍ−
ムコ−ジヒドロキシシクロヘキサ−３、Ｓ−ジエンまで
変換するためのジオキシゲナーゼと、３−フルオロカテ
コールまで変換するためのジオールデヒドロゲナーゼと
の両者を含有するという事実にも拘らず生ずるものであ
る。

他方、驚ろくことにフルオロベンゼンでなく３−フルオ
ロ−ａｉｍ　−／＃Ｊ−ジヒドロキシーシク四ヘキサ−
３，３−ジエンをＵＶ−突然変異株Ａのための基質とし
て用いるよう本発明にしたがってこの方法を段階的に行
々えは、３１／ｌより多い生成物３−フルオロカテコー
ルの濃度が得られる。

如何なる理論にも拘束されるものでないが、カテコール
類（たとえば３−フルオロカテコール）は（Ｖｌ）を＜
Ｖ＞へ変換させるのに必要なジオキシゲナーゼの作用を
阻止するが、（ｖ）を（ＩＶ）まで変換するのに要する
ジオールデヒドロゲナーゼを阻止し力いと思われる。こ
のことは予想することがでＩｆ、かつ上記ギプソン等に
よって行なわれ九代謝経路に関する初期の実験からは予
想できなかった。

以下、実施例により本発明をさらに説明する。

増殖培地 以下の実施例に用いる一種の増殖培地の組成を下記第１
表に示す。

ＡＳＭ　＝最小塩培地 ＮＦＳＭ　＝窒素フリーの塩培地 第　　／　　表 ／ｌ当りの量 ＡＳＭ　　　　　ＮＦＳＭ Ｎａ２ＨＰＯ４０，ざ１，１．１　　　７９ＫＨ２ＰＯ
４０，！；３／１１　　　３１１ＮＨ４Ｃ１Ｏ，！；３
！；Ｉ Ｋ２８０４　　　　　　　　　　　　　０．１７’ｌｌ
　　　　　　Ｏ，／りｕｐＭｇＳ０４−９１（２００，
０，３７１０，０，３りｌＣａＣｌ２・コＨ２００，０
０７３！；１１　　０．００７３！；１１ＴＫ３（Ｔ／
Ｅ）（下記参照）　　　／、０１１　　　　　　／、０
ゴＦ＠５ｏ４−７Ｈ２０ＣＯ，１Ｍ）　　　　０２１１
４１　　　　０．．１ｍ１ｐＨ１１，ｆｆ ＴＫ／、？微量要素溶液の組成： これは／１１当〕次の成分を含有した：ＺｎＳＯ４・７
Ｈ２０（（７，−２ｆｆｆｆｊ’）　：Ｍｎ５Ｏ４−ｌ
ＩＨ２０（Ｏ，，２２４Ｎ）　：Ｈ，ＢＯ，ＣＯ，ＯＡ
　１Ｉ／　）　：　ｃｕｓｏ４−！ｒＨ２ｏ　ＣＯ，１
２１１ｇ１　）　：Ｎａ２ＭｏＯ４−ｘ、ｏ　Ｃ０，０
４ｔｇ／ＩＩ　）　：　ＣａＣｌ２−ｇｎ２ｏ　Ｃ０，
０’１７１ａｌｌ　’）　：ＫＩ　（０，０ｇ３１　）
　：　１ｙｒＨ２ｓｏ４（／Ｉｔｌ）使用した他の増殖
培地は次の通シである：ｄＹＴ培地　・・・／６Ｉパク
ト・トリプトンｌＯｌパクト酵母抽出物 ！；ｌＮａＣ１／１ 酵母抽出 培地（ＹＥＭ）・・・／　０１１／ｌコハク酸二ナトリ
ウム・ＡＨ２０２１／Ｉｔ　（ＮＨ４）２Ｓｏ４ ３１１／ｌ酵母抽出物（ディフコ） Ｏ，グＩ　／　ｌ　ＭｇＳＯ４・７′Ｈ２Ｏ０，０ダ１
１／１１　　バクトーベプトン２！ｒｒｒＭ燐酸カリウ
ム緩衝液中、 最終ｐ）Ｉ　７．０ フリエスタッド等、アナリチカル・ケミストリー、第１
Ｉ／巻（／？ｌ、？　”）　、第１７！；０〜／り３ｔ
頁の方法を用いた。カテコールにつき試験すべき溶液を
同容積の３−メチルーコーペンゾテアゾリノンヒドラゾ
ン塩酸塩（水中０．０　ｊ’　ｗ／ｖ％）および同容積
の硫酸上リウムアンモニウム（０，４ｔ％φの硫酸中０
．２％Ｗ／マ）と混合し念。必要に応じ、フリエスタッ
ド等によシ記載されているように、数分後に硼酸塩−Ｎ
ａＯＨ−ＥＤＴＡ緩衝剤を添加した。発色した色の強度
を肉眼で比較するか、或い＃ｉ３コＯｎｍＫて分光光度
法によシ測定し念。ａｉｍ−ジヒドロキシシクロへキサ
ジエンはこれらの条件下で発色しない。し九がって、各
試験溶液の第一の試料を比色試験の前に硫酸もしくは塩
酸で酸性化して、ジヒドロキシシクロへキサジエンをフ
ェノールまで定量的に変換させた。酸性化した試料と酸
性化して危い試料とＫよシ与えられる色強度の差が、ジ
ヒドロキシシクロへキサジエンの含有量を示す。

ガスクロマトグラフィ（ＣＣ） 水性試料（０Ｊａｌ　）　’ｋ　！％−フェニルメチル
シリコンで被覆されたヒユーレット・／譬ツカード社製
の高さ２３ｍ容量の柔軟性シリカ毛細管カラムにてクロ
マトグラフにかけ、その際キャリャガストシてヘリウム
を用い念。このカラムを１３０℃に保ち、かつ溶出化合
物を火炎イオン化検出器によって検出した。

薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ） 水性試料（Ｓμｌ）をメルク社・キーゼルｒル３θ　Ｆ
２３グ型グレート上に施こし、９０：１０：／（ｖ／ｖ
）のｎ−プロ・ｆノール−水−蟻酸で展開し次。ジヒド
ロキシシクロへキサジエン含有量を短波長のＵＶ光の下
で肉眼観察し、かつａ、６−シクロルキノンーグークロ
ルイミド（エタノール中−％）を噴霧してカテコールを
検出した。

高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）これは、／３
ｃｌＲのスヘリソルブｓＩｒ、を型マイクロカラムを用
い、　０．　／　Ｉｌｌ　／　ｍｉｎでＩンデ輸送され
る２０　：　ｇＯφのメタノール：水および０．　／％
φの酢酸を用いて行なった。検出は、セシルＣＥ２／２
型分光光度計を用いて２２０ｎｍで行なった。

燐酸塩緩衝液（ｐ）１７）ＫおけるＰ、ｆチダＮＣｌＢ
１コ／９０の懸濁物Ｃ／Ｉｌｌ’）を栄養寒天板の上に
展延した。これらのプレートをクロマトルックスＵＶラ
ングを用いて３〜３０分間照射した。これらのプレート
を３０℃にてｌ晩培養し、次いで３θ℃のフルオロベン
ゼンの雰囲気中に入れ、かつさらに２’１時間培養した
。３’１個の生存コロニーを精製し、かつ振とうフラス
コ実験にてフルオロカテコールを蓄積するその能力につ
き試験した。フルオロカテコールはガスクロマトグラフ
ィーによって測定した。比較実験において、以下ＵＶ−
突然変異株Ａと称する７種の突然変異株は３〜グ時間で
０．１．Ｉｌｌｌのフルオロカテコールを蓄積し。

ＵＶ−突然変異株Ｂと称する第一の突然変異株は３〜ｌ
Ｉ時間で０．！；１，１／ｌを蓄積した。同じ条件下で
、野性菌株ＮＣＩＢ　／コｉｑｏはＯ，グ１１／ｌを蓄
積した。０．３〜０．ＡＩ／ｌおよび０．１，２１／７
３を蓄積する他の一種の菌株をも単離し、これらをＵＶ
−突然変異株ＣおよびＵＶ突然変異株りと称する。

シュードモナス曇グチ／　ＮＣＩＢ　／、２／９０をｄ
ＹＴ培地中にて３０℃で７晩増殖させた。この培養物を
ｌＯｄの新鮮ｄＹＴ中で／／２０にてサブ培養しかつさ
らに＋時間培養した。細菌を遠心分離によって回収し、
ＮＦＳＭで洗浄し、再び遠心分離によシ回収した後、Ｎ
ｒｓＭ（３ｍｇ）中に再懸濁させ、ＯＤＡＯＯｎｍを３
．０に調整した。

「エツインドルフ」管における／ａｌ量を３０℃にて７
３分間培養し１次いでＮＴＧ　（Ｎ−メチル−Ｎ′−二
トローＮ−ニトロソグアニジン！■／ジメチルスルホキ
シド／ｄ）を添加して５０μｍ１７ＩＬｔｌｌＣした。

エラ４ンドルフ管の内容物を簡単に混合し。

かつ３０″ｃＫて／！ｆ分間培養した。水中で冷却する
ことＫよシ突然変異を停止させ、遠心分離しかつ洗浄し
た（塩水−〇、ざ３％ＮａＣｌで３回）。この細菌を塩
水で希釈しかつその０．　／　ｄをそれぞれ０．０３％
のコハク酸ナトリウムを含む７００枚のＡＳＭ板の上に
塗抹した。これらのグレートを３０℃にてダｇ時間培養
した。

培養後、小さい「微小」コロニーがこれらのグレート上
に見られ、コハク酸塩の量は少量の増殖にのみ充分であ
った。次いで、これらのプレートをベンゼン蒸気に対し
３０℃にて一ダ時間露出させて、プレート上に見られる
広範な種類のコロニー寸法を与えた。初期の選択過程忙
おいて、プレート上の小さいコロニー（これらはベンゼ
ン上にて増殖する能力がないため小さい）Ｃ２０〜３０
個／クレート（枚）を、無菌カクテル棒を用いて穴／個
当シ５０μｌＡ８Ｍ＋０．！；％コハク酸ナトリウムを
含有する９６大のマイクロ測定板（タイターチク社）Ｋ
釣シ上げた。これらのプレートラ蒸発を防止するための
密封箱内にて３０℃で／晩培養し、かつマイクロ測定板
を市販栄養寒天（オキンイド、比較を与えるため）の正
方形（／２０＋！ＩＩ）グレート上へ９６鋭端反復装置
を用いて反復した。

寒天板を７晩培養し、かつマイクロ測定板をベンゼン蒸
気に３時間露出し念。次いで、上記の比色法によって分
析を行なった。最も強く発色する突然変異株を％ｃｉｍ
−ジヒドロキシシクロへキサジエンの蓄積および最良の
生産用の突然変異株の同定につきさらに試験するため選
択した。選択された最良の突然変異株を振とうフラスコ
培養によって試験し、かつ再び比色測定を行なった。比
較は、蛋白合成阻止剤としてクロラムフェニコールが添
加されている野性型Ｐ、グプチＨＣＩＢ　／、２／デθ
の培養物を用いて行なった（突然変異株にはクロラムフ
ェニコールを添加しなかった）。上澄液の確認ＨＰＬＣ
分析を行表った。

ＮＴＧを用いて突然変異させたＰ、ｆチダＮＣ４Ｂ１２
１９０の６８！の独立し次出発培養物のそれぞれからｉ
ｏｏ枚のグレートに接種して約１００，０００個のコロ
ニーを得、その／　３．！ｒ　００個をマイクロ測定板
忙釣シ上げ、かつ最初１１ＣＩ１．３！；個を発色試験
用に選択した。これらのうち、９０個をさらに発色試験
後に検査し、かつＰＬＯ分析および振とりフラスコ実験
を突然変異株の／１種につき行なった。

培養物をＡＳＭ　＋　０．　！ｒ％コハク酸ナトリウム
中で７晩増殖させ、遠心分離によシ回収し、洗浄しかつ
ＮＦＳＭ中に再懸濁させ次。培養物をベンゼンに露出さ
せ、かつ上澄液をカテコール或いはカテコール＋ｃｉｍ
−ジヒドロキシシクロへキサジエンにっき分析した。比
較試験には、野性型ｐ、ｆチダＮＣＩＢ　／ｌ／９０１
ｒ、用イ、クロラムフェニコール（／ｒｒｕ）／ｒＩＬ
ｔ’）をＮＦＳＭ培地に添加した。

カテコールを生成させえないがａｌｇ−ジヒドロキシシ
クロへキサジエンを蓄積した突然変異株の７種を選択し
、これをＮＴＧ−突然変異株Ｆと称する。この突然変異
株の結果を下記第２表に示す。

第　　−表 ００　！；２０　ｎｍ ２棒時間後　　７時間後　　　２１１２時間後　　７時
間後０．０４ｔＯ，０４０，２７０，！；’１ｇノのＹ
ＥＭを、同じ培地＜５ｏｒｎｔ＞に増殖させ九ＮＴＧ突
然変異株Ｆの２０時間振とりフラスコ培養物を有する攪
拌発酵装置に接種し次。この微生物を３０　Ｏｒｐｍか
つ！ｒ００ｔｄ空気／　ｍｉｎの通気条件下で７９時間
増殖させ、濃厚栄養物Ｃ３１０１１のコハク酸二ナトリ
ウムおよびＡ’ｌｌｉの硫酸アンモニウムを／ｌの０．
０．２　、！−Ｍ燐酸カリウム緩衝液（ｐＨ７，コ）に
溶解し念もの）をｔｉｔｏｍｔ７ｉ時間の割合で連続供
給した。攪拌速度を！；　ｊ　Ｏｒｐｍ　ｉで増大させ
かつ通気速度を７００１ｄ空気／　ｍｌｎまで３０分間
上昇させて酸素移動を増大させ、次いで！ｒ　００　ｒ
ｐｍ　：乙ＯＯｄ空気／　ｍｌｎ　４初期飽和空気の平
衡酸素濃度３０％の条件に設定し次。

フルオロベンゼンをポンプ（ギリンンモデル３０λ型）
によシＳＯμｌ／ｗｉｎで計量した（反応物における１
００〜／２！；Ｗ／ｌの平衡濃度）。反応に先立ち、光
学密度を３．９１／ノの乾燥菌体重量に相当する３、／
ｌとして測定した。３−フルオロ−ｅｌｓ−ムコージに
ドロキシシクロヘキサ−３，３−ジエン（Ｉ：Ｒ＝Ｆ）
の生産をガスクロマトグラフィーにより監視し、かつ濃
度は２４を時間後に２．ｇｌｌ／Ｉｔに達した。

この生成物を粒状化木炭に吸着させ、かつこの木炭から
ソックスレー装置でジエチルエーテルとメタノールとの
混液（ＩＩ　：　／　ｖ／ｖ　）を用いて抽出すること
によシ回収した。溶剤を蒸発させて固体を残し、これを
ジエチルエーテルとペンタントノ混液から再結晶化させ
て無色の針状結晶を得九。

ｍ、ｐ、７３〜７１（分解）。

ＵＶスペクトル（Ｈ２Ｏ）　：λ１ｎａＸコ！ｒ９ｎｒ
ｎｃｔ　３／！；０）円形二色性　　（Ｈ２Ｏ）　：λ
ｍａｘ　２に！ｒ　ｎｍ　（Δｇ　−／、？）質量スペ
クトルｒｒ４／ｚ　／　３０　（／　ｊ％、Ｍ＋）、／
／コ（Ａ、ｔ％）。

ｇ’ｌ　（１００％） ’Ｈ−ＮＭＲスペクトル（ｃＤｃｌｓ）　：δよｇ　ｇ
　（／　Ｈｌ　”　ルテ＋Ｊ＝１０　、６．！；　、　
４　、コＨｚ　：ｊ−Ｃ−Ｈ）　、ｊニア／（／Ｈ，ｄ
ｄ。

Ｊ　＝／　（７−ｊ　Ｈｚ　：　４−Ｃ−Ｈ）　、よ６
０　（／Ｈ、ｄｄ　、　Ｊ＝／／。

乙、！；　Ｈｚ　：　’ｌ−Ｃ−Ｈ）　ｅ　４’、！；
　／　（／　Ｈｇ　ｂｒｓ　マルｆ　＊　Ｊ＝ｌｓ　＊
Ｊ　、２Ｈｚ　：　／　−Ｃ−Ｈ）　ｅ　４’−２？　
（／　Ｈ、ｔ　ｒ　＃　Ｊ　ミロ−Ａ　Ｈｚ　：コーＣ
−Ｈ）　、　２．ｌＩＯ（コＨ＠　ｂｒ−ｓ　＊　Ｏ−
Ｈ）　ｐ−ｐ＊ｍ−フルオロカテコールへの変換 実施例１に記載したように作成した各種のＵＶ−突然変
異株Ａ、Ｂ、ＣおよびＤを振とうフラスコ中でコハク酸
ナトリウム７水塩（１０ｙ／ｌ　）と酵母抽出物（Ｊ　
ＩＩｌ　）と硫酸アンモニウム（２Ｉ／ｌ）と硫酸マグ
ネシウム６水塩（０，１１１１／Ｉｔ　）とバクトペデ
トン（０，０ＩＩＩ／ｌ　）とを微量金属と共に含有す
る培地にて約／、！；−１７１１”の乾燥画体重量の菌
体濃度まで／り時間増殖させた。３０ｄの培養物を含有
する２！；Ｏ１ｄ容積の各フラスコへ、予め凰離されか
つ精製されたＩＩ　Ｉ／７１の濃度に等しい３−フルオ
ロ−ｃｉｓ−ムコージζドロキシークロルヘキサ−３，
３−ジエンの試料を添加した。フラスコを振とり方式で
約３０℃にて培養し、酸素要求は多孔質密栓を介する空
気の侵入によって満たした。

その結果を下記第３表に示す。

（以下余白） 第　　３　　表 ７時間後０変換’７７、　　　９６　　　９３　　　９
０．！；オール％ ′２ダ時間後０変換　９ユク　　９７．７　　９１．’
ｌ　　　１００ジオール％ ３−フルオロカテコールの濃度は、制御された通気によ
シ充分な希釈率で操作して増大させうることが認められ
る。

実施例／に記載したと同様に作成したＵＶ−突然変異株
Ａを、酵母抽出物培地にてコＩ／ｌの乾燥重量の菌体濃
度まで増殖させた。次いで、この培養物を、−１１／Ｉ
ｔの硫酸アンモニウムを含有する２！ｊ；ｍＭ燐酸カリ
ウム緩衝液（ＰＨ１２）と／　ｆ、７　！；　ＩＩｌの
甘蔗糖蜜と３Ｉ／！の酵母抽出物と０．１１１／ｉｔの
硫酸マグネシウムと０．０１１１１／ｌのバクトイプト
ンとを含有しかつ結晶３−フルオロ−Ｃ１・−／、２−
シヒドロキシシクロヘキサ−３，３−ジエン（３，、！
！−１／ｌ　）が添加された糖蜜培地でｌ：ｌに希釈し
た。

次いで、培養物を含有するフラスコを振とう方式で約３
０℃にて培養し、酸素要求は多孔質フラスコ密栓を介す
る空気の侵入によって満なした。を時間後、ざ０％以上
のジオールが変換され、かつ培地中の３−フルオロカテ
コールの濃度は３．　／　ＩＩｌであった。

発酵装置におけるＹ）Ｊ　ｌｒＪ　Ｋ、同じ培地で３０
℃にて増殖させたＵＶ−突然変異株Ａの１６時間振とり
培養物３０１１１を接種した。この微生物を酸素制限の
条件下Ｃ２００ｒｐｒｎ、、３！ｒ０１Ｌｌ空気／ｍ１
ｎ）で７７時間増殖させ、その間酸素電極ではＯの読み
値を記録した。７７時間後、通気速度をｌＩｏ。

ｒｐｍ：！ｊ（７１１＋７空気／　ｍｉｎまで増大させ
て増殖を刺戟し、かつ１時間これを維持して乾燥重量Ｃ
０乙１１／Ｉｔ　（生存菌体数１．ｑｘｉＯ’ｍｌ）の
活発に増殖している培養物を得た。フルオロベンゼン（
１０ｄ）を添加しかつ通気を３コＯｒｐｍ：／ｇＱｒｔ
ｔｌ空気／ｍ１ｎｔで低下させ元。間隔的に排気ガス中
にてセンサ（カテロメータ）で調節しながら空気にフル
オロベンゼンを飽和させ、その際この化合物を含有する
バプラに通過させ、反応混合物中に約３００ｍ１ｉ／ｌ
のフルオロベンゼンの平衡濃度を維持した。３−フルオ
ロカテコール生成をＧＬＣによって監視し、かつ６時間
後に０．ダ５ｔｉ７ｔかつコグ時間後Ｋ　Ｏ，１，２１
１／ｌ　Ｋ達したと推定された。声は、Ｈ２ＳＯ４の自
動添加によって全体的にＺコに調節した。

シュードモナス・プチダＮＣＩＢ　１２１９０の特性化
シュードモナス・プチダＮＣＩＢ　１２１９０を次のよ
うにしてＮＣＩＢＫより特性化されかつ同定された：試
験はコ５℃で行ない、かつ増殖は特記しない限シＬＡＢ
　Ｍ栄養寒天上で行なった。

菌体の形態 コハク酸塩寒天上にて３０℃で２ｑ時間増殖させ、栄養
プロス十０．７！重量％寒天に移した後、４３０倍の携
専で位相差顕微鏡にょｂ観察し念ところ、菌体は小型の
短い棒状ま次は球菌の集団であった。

ダラム陰性 胞子− 運動性十 コロニーの形態 ダｇ時間の増殖後、コロニーは丸型、正常、完全、平滑
、不透明、僅かに凸状、オフホワイト色かつ直径１ｗｍ
未満であっ念。

３７０＋ ４／ｌニー カタラーゼ＋ 「０−Ｆグルコース」は、７重量％のフィルタ滅菌した
Ｄ−グルコースを補充したヘイワードおよびホジキスの
酸化−発酵培地〔ジャーナル・ゼネラル・マイクロバイ
オロジー、第２６巻（／９Ａ／）、第１３３−／ｌＩＯ
頁〕を用いて行なつ念。試験管試料をｆｆｉ＋［、かつ
／１日間培養し九。

シュードモナス拳プチダＮＣＩＢ　１２１９０は栄養寒
天スラント上に＋℃にて、或いは凍結乾燥材料として便
利に貯鵞することができる。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）式（IV）： ▲数式、化学式、表等があります▼（IV） 〔式中、Ｒ＿１およびＲ＿２はそれぞれ水素、ハロゲン
   、シアノ、−ＣＯＯＨ（およびその誘導基）、アルキル
   、アリールおよびシクロアルキル（これらアルキル、ア
   リールおよびシクロアルキル基は置換することができる
   ）から選択される〕 のカテコールを製造するに際し、式（Ｖ）：▲数式、化
   学式、表等があります▼（Ｖ） 〔式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は上記の意味を有する〕の
   化合物をベンゼン代謝性微生物の突然変異株の適する培
   地における培養物に供給し、前記突然変異株はｃｉｓ−
   ベンゼングリコールデヒドロドゲナーゼを含有すると共
   に式（IV）の所要のカテコールを蓄積することができ、
   次いで式（IV）の化合物を回収することを特徴とするカ
   テコールの微生物製造法。
2. （２）Ｒ＿２が水素である特許請求の範囲第１項記載の
   方法。
3. （３）Ｒ＿１が弗素である特許請求の範囲第１項または
   第２項記載の方法。
4. （４）ｃｉｓ−ベンゼングリコールデヒドロゲナーゼを
   含有する突然変異株が、シュードモナス・プチダ、好ま
   しくはＰ．プチダ　ＮＣＩＢ　１２１９０の野性型菌株
   を突然変異させて得られた菌株である特許請求の範囲第
   １項、第２項または第３項記載の方法。
5. （５）突然変異株が紫外線照射によって得られた菌株で
   ある特許請求の範囲第４項記載の方法。
6. （６）コハク酸を含む培地で行なう特許請求の範囲第１
   項〜第５項のいずれか一項に記載の方法。
7. （７）式（Ｖ）の化合物が式（VI）： ▲数式、化学式、表等があります▼（VI） 〔式中、Ｒ＿１およびＲ＿２は特許請求の範囲第１項記
   載の意味を有する〕 の化合物からこの式（VI）の化合物をベンゼン代謝性微
   生物の突然変異株の適する培地における培養物に供給す
   ることにより微生物法によって得られた化合物であり、
   前記突然変異株がジオキシゲナーゼを含有すると共に式
   （Ｖ）の所要のｃｉｓ−１，２−ジヒドロキシシクロヘ
   キサ−３，５−ジエンを蓄積しうる特許請求の範囲第１
   項〜第６項のいずれか一項に記載の方法。
8. （８）式（Ｖ）の化合物を、ｃｉｓ−ベンゼングリコー
   ルデヒドロゲナーゼを含有する突然変異株へ供給するた
   め、生成物の単離なしにかつジオキシゲナーゼを含有す
   る微生物を除去した後に直接使用する特許請求の範囲第
   ７項記載の方法。
9. （９）ジオキシゲナーゼを含有する突然変異株が、シュ
   ードモナス・プチダ、好ましくはＰ．プチダＮＣＩＢ　
   １２１９０の野性型菌株を突然変異させて得られた菌株
   である特許請求の範囲第７項または第８項記載の方法。
10. （１０）ジオキシゲナーゼを含有する突然変異株が、突
    然変異剤としてＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロ
    ソグアニジンを用いる化学手段によって得られた菌株で
    ある特許請求の範囲第９項記載の方法。