DE1902935A1

DE1902935A1 - Verfahren zur Extraktion von Protein aus proteinhaltigen Stoffen

Info

Publication number: DE1902935A1
Application number: DE19691902935
Authority: DE
Inventors: Kraskin Kenneth Stanford
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1968-02-27
Filing date: 1969-01-22
Publication date: 1969-09-25
Also published as: FR1598025A; ES364117A1; GB1256149A; IT942043B; BR6906617D0; OA03001A; NL6902869A

Description

RECHTSANWALT! 01 |_a_

DR. JL'R. DI"L-CHEM. WALTH BEIl * '* ^ϋ3Π<

ALFRED HOEPPENER

DR. JUR. DIPL.-CH2M. H.-J. WOLFF

DR. JUR. HANS CIiR. BEIL

FRANKFURTAM MAIN-HOCHS? ADELONSIRASSE 58

Unsere Nr. 15228

Rohm & Haas Company
Philadelphia, Pa., V.St.A.

Verfahren zur Extraktion von Protein aus proteinhaltigen Stoffen.

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Extraktion von Protein aus proteinhaltigen Stoffen, wobei man diese Stoffe mit einem bakteriellen Enzympräparat in Berührung bringt, durch welches Protein extrahiert werden kann. Derartige hierzu anwendbare Verfahren und Enzympräparate sind besonders zur Extraktion von Protein aus Sojabohnen und Sojabohnenderivaten, insbesondere entfetteten Sojabohnenderivaten, wie z.B. Sojabohnenflocken, geeignet. Das auf diese Weise gewonnene Protein läßt sich nicht nur als Nahrungsmittel oder als Nahrungsmittelersatz, sondern auch zu zahlreichen industriellen Zwecken ver wenden.

In vielen Ländern der Welt herrscht ein großer Mangel an Protein von hohem Nährwert. Deshalb ist man im steigenden Maße darum bemüht, solche neuen Proteinquellen und rationellere Verfahren zu,finden, mit denen sich ein solches Protein extrahieren und der Technik zur Verfugung stellen läßt.

Proteinquellen sind proteinhaltige Stoffe, wobei im Rahmen vorliegender Erfindung der Ausdruck "proteinhaltige Stoffe"

909839/0924

"² 1902335

jede tierische oder pflanzliche Substanz, die extrahierbare Proteine enthält, bedeutet. Typische Beispiele hierfür sind Sojabohnen, Limabohnen, Luzernen, Reis, Weizen, Mais, Erbsen, Kokosnüsse, Erdnüsse, Leinsamen, Baumwollsamen, Rübsamen oder Fischderivate u. dgl.. All diese Stoffe sind als Protein quellen geeignet und können als Nahrungsmittel oder als Nahrungsmittel ersatz für Menschen und Tiere verwendet werden. Darü_berhinaus ist ein solches Protein für viele industrielle Zwecke von Bedeutung . Beispielsweise wird Protein regelmäßig bei Klebstoffen, Papierüberzügen, bei der Papiersortierung (paper sizing), bei Farben, Kunststoffen oder bei der Leder herstellung u.dgl. verwendet. Daher stellt jedes Mittel, durch welches Protein von derartigen Substanzen isoliert und leichter zugänglich gemacht wird, ein wichtiger und bedeutender fe technischer Fortschritt dar.

Vorliegende Erfindung -weist einen solchen Fortschritt auf. Insbesondere werden nun neue enzymatische Gemische mit einer erheblichen Aktivität zur Proteinextraktion sowie ein wirtschaftliches Verfahren zur Verwendung derartiger Gemische zur Verfugung gestellt, mit dem man die aus solchen protein haltigen Stoffen gewinnbare Proteinmenge erhöhen kann.

Von den verschiedenen vorstehend erwähnten proteinhaltigen Substanzen werden Sojabohnen als Proteinquellen besonders bevorzugt. Wie es bei den meisten dieser Stoffe der Fall ist, muß das Protein von dem nicht-prot einhaltig en Teil getrennt fc werden, damit es sich am besten verwerten läßt. Bei Sojabohnen können diese nicht proteinhaltigen Bestandteile, bezogen auf das Gesamtgewicht der Sojabohne, bis zu 60 Gew.?io betragen. Trotzdem sind Sojabohnen als hochwertige Proteinquelle anzusehen, da sie auf relativ kargem Boden unter Erzielung ziemlich hoher Energie angebaut werden können. Aus diesem Grunde wurden schon zahlreiche kommerzielle Verfahren zur Extraktion von Protein aus Sojabohnen und Sojabohnenderivaten erfunden.

Unter "Sojabohnenderivaten" soll im Sinne vorliegender Erfindung jede Art von Gemisch, Lösung oder Emulsion oder

909839/092 4

jedes vollfette oder entfettete Substanzgemisch u. dgl. verstanden werden, aus dem sich eine bestimmte Menge verwertbaren Proteins erhalten läßt, wobei dieses Protein aus Sojabohnen gewonnen wurde, oder von ihnen abstammt. Dabei sind Kickstände aus der Sojamilchherstellung, vollfettes oder entfettetes Mehl, Schrot, Kuchen oder Flocken von Sojabohnen typische Sojabohnenderivate .

Wie vorstehend erwähnt, gibt es zahlreiche kommerzielle und andere Methoden zur Extraktion von Protein aus Sojabohnen und Sojabohnenderivaten. Allerdings sind diese Verfahren in der Regel meistenteils auf Ausbeuten von nur 40 bis 60 %, bezogen auf das verwertbare Protein, beschränkt. Demgegenüber wird durch die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verfugung gestellt, mit dem sich die Proteinausbeute aus proteinhaltigen Stoffen, insbesondere aus Sojabohnen und Sojabohnenderivaten um 10 bis 35 $ oder mehr steigern läßt. Folglich lassen sich unter Anwendung des vorliegenden Verfahrens leicht Proteinausbeuten von 95 f> oder mehr erzielen.

Erfindungsgemäß werden höhere Proteinausbeuten dadurch erzielt, daß ein proteinhal tiger Stoff mit Extractase A-2 als Sxtraktionsmittel bei einer für die Proteinextraktion aus solchen Stoffen wirksamen Konzentration in Berührung gebracht wird.

Unter "Extractase A-2" versteht man hierbei ein bak terielles Enzympräparat, durch welches sich eine größere Menge Protein, das von dem proteinhaltigen Material getrennt wird, erhalten läßt. Ein solches Enzympräparat ist weiterhin dadurch gekennzeichnet, daß es a) wasserlöslich, b) nicht äialysierbar und c) durch Zugabe von Ammoniumsulfat oder Alkohol aus der wässrigen Lösung ausfällbar ist, d) von einem bakteriellen Organismus abstammt und e) fähig ist, aus einem proteinhaltigen Stoff im Vergleich zu der Proteinmenge, die hieraus unter gleichen Bedingungen durch bloße wässrige Extraktion erhältlich ist, mehr Protein zu extrahieren.

Im Rahmen dieser Erfindung wird die Protein-Extraktionsaktivität einer Extractase A-2 in Extractase-A-2-Einheiten

909839/0924

ausgedrückt. Eine Extractase-A-2-Einheit ist das Gewicht des Enzympräparates durch, das, - zusätzlich, zu der durch, wässrige Extraktion ohne Enzym erhaltenen Proteinmenge - 1,0 g isoelektrisch ausgefälltes Protein pro 100 g entfettete Soja flocken freiwerden. Eine derartige Bestimmung der Protein extraktionsaktivität läßt sich wie folgt darstellen:

Gewicht des Proteins Gewicht des

(in g) aus einer Enzym- Proteins (in g)

extraktion aus einer wäss-

Extractase-A-2- rigen Extraktion Einheiten/g

Gewicht (in#) des verwendeten Enzympräparates

In der Regel werden solche Enzympräparate vorzugsweise von Bazillus-Kulturen sowie deren verschiedenen Stämmen und Varianten abgeleitet. Typische Bazillus-Arten sind "beispielsweise: B. subtilis, B. mycoides, B. amyloloquifaciens, B. cereus, B. macerans, B. megaterium, B. sphaericus oder B. circulans.

Als Organismus für die Produktion von Extractase A-2 wird der Bacillus subtilis "besonders "bevorzugt. Er läßt sich leicht züchten und produziert ein Enzympräparat mit einer hohen Proteinextraktionsaktivität. Außerdem lassen sich zahlreiche Stämme des Organismus von anerkannten Kulturhinter legungsstellen, Universitäten od. dgl. leicht beschaffen. Der B. subtilis und die anderen Organismen, die Extractase A-2 bilden können, werden entweder in flüssiger Submerskultur oder in Oberflächenkultur auf einem Medium gezüchtet, das aus einer verwendbaren Energiequelle, aus assimili si erbarem Kohlenstoff und Stickstoff besteht. Natürlich können alle anderen normalerweise verwendeten wachstumsfördernden Faktoren und Mineralsalze oder deren Kombination in einem solchen Kulturmedium ebenfalls enthalten sein.

Typische Medien können der bekannte Mhrbouillon nach Difco sowie Gemische aus Saccharose, Dextrose, Maltose, Maisstärke, Sojamehl, Gelatine, Fleisch, Knochen, Fischabfall, Blut, Mononatriumphosphat, Monoammoni umpho sphat,

909839/0924

Magnesiumsulfat, Oalciumcarbonat oder mit stark proteinhaltigen Nährmitteln verstärkten Melassen enthalten. Während Maisstärke und Sojamehl oder andere proteinhaltige Sojabohnen derivate als Bestandteile des Kulturmediums besonders geeignet sind, lassen sich zahlreiche andere proteinhaltige Substanzen, wie z.B. Maismehl, Eübsamenmehl, Erdnüsse od. dgl. ebenfalls gut verwenden. Ein besonders wirksames flüssiges Submersmedium besteht aus 0,5 bis 6,0 ⁰Jo Gelatine, 5 bis 15 $ Maisstärke, 0,1 bis 1,0 f> Monoammoniumphosphat und aus 0,2 bis 0,6 $ Galciumcarbonat.

Vorzugsweise besteht das Medium aus 2 bis 4 $> Gelatine, 8 bis 10 $> Maisstärke, 0,3 bis 0,6 ^σ/> Monoammoniumphosphat

und 0,4 bis 0,5 % Calciumcarbonat. _M

Salze, wie z.B. Mononatrium-, Kalium- oder Ammoniumphosphat u. dgl. sind im allgemeinen, bezogen auf das Gesamtgewicht des Mediums, von 0,001 bis 5 $> und vorzugsweise von 0,1 bis 2^ in derartigen Kulturmedien enthalten. Diese Salze eignen sich besonders dazu, einen schnellen Anstieg des pH-Wertes während des Wachstums des Organismus zu verhindern. Durch diese Steuerung des pH-Wertes wird die schnelle Bildung des Enzympräparates mit einer relativ hohen Aktivität der Proteinextraktion bis zu einem gewissen Grad gesteigert. Durch Zugabe von Kohlehydraten läßt sich ein übermäßiger Anstieg des pH-Wertes während der Enzymbildung ebenfalls verhindern. Typische Kohlehydrate sind dabei Melassen, Stärke, saure oder enzymatisch modifizierte Stärke, Saccharose oder deren Kombina- ' tionen.

Der Bereich des pH-Wertes kann im Kulturmedium während der Enzymproduktion ziemlich groß sein. Es wurde jedoch gefunden, daß sich dann Enzympräparate mit einer relativ hohen Aktivität der Proteinextraktion erhalten ließen, wenn der pH-Wert der Kultur während des Wachstums des Organismus in dem Bereich von 4,5 bis 8,5, vorzugsweise von 5,5 bis 7,5> liegt.

Gleichfalls ist zur Erzielung einer optimalen Ausbeute an Extractase A-2 ein Temperaturbereich von 20 bis 35 C,

909839/092 4

vorzugsweise von 30 bis 35 C, für die wachsende Kultur erforderlich. Wie vorstehend erwähnt, sind Abweichungen möglich; dies kann aber dazu führen, daß die Ausbeute und die Aktivität der auf diese Weise gewonnenen Enzyme beeinträchtigt wird.

Die maximale Enzymbildung wird innerhalb von 48 bis 96 Std, erhalten und hängt natürlich von solchen Faktoren wie den speziellen gezüchteten Organismen, der G-esamtkonzentration der Fährstoffe, dem pH-Wert, der Temperatur, der Belüftung, dem Rühren od. dgl. ab. Allerdings kann der Wachstumszyklus unter den erwähnten bevorzugten Bedingungen auf 18 Std. oder weniger verringert werden. Im allgemeinen ist es nicht nachteilig, wenn der Organismus unter den beschriebenen Bedingungen mehr als 96 Stunden aufbewahrt wird. Es ist jedoch fast immer von wirtschaftlichem Vorteil, die Enzympräparate so bald wie möglich nach Beendigung des Produktionszyklus zu ernten. Der Fachmann kann jede bekannte Methode dazu verwenden, um die Beendigung des Produktionszyklus zu bestimmen. Gegebenenfalls kann in regelmäßigen Abständen die Proteinextraktionsaktivität der Rohkultur in Extractase-A-2-Einheiten mit den vorstehend beschriebenen Methoden bestimmt werden. Das Enzym sollte dann geerntet werden, wenn die Proteinextraktionsaktivität ungefähr ihren höchsten Wert erreicht hat.

Im allgemeinen sind zur Züchtung der betreffenden Organismen auf Oberflächenkulturen im wesentlichen die gleichen Temperatur- und pH-Wert-Bedingungen erforderlich wie für flüssige Submerskul türen. Das bei einer Oberflächenkultur verwendete Medium unterscheidet sich jedoch in der Regel etwas von dem Medium einer flüssigen Submerskultür. Beispielsweise wird das Medium vorzugsweise aus entfetteten Sojaflocken, Maisstärke und Wasser bestehen. Flüssige Extrakte dieses Mediums für die Oberflächenkultur weisen selbstverständlich eine Proteinextraktionsaktivität nach dem Wachstum des Organismus auf.

Es stehen zahlreiche Verfahren zur Verfügung, die nach Beendigung des Wachstumszyklus zur Konzentration des Enzympräparat es aus der Rohkultur verwandt werden können. Bei einem typischen Konzentrationsverfahren wird das Wasser durch Sprüh-

909839/0924

trocknen, Vakuumkonz ent ration, Lyophilisierung oder durch Trocknen auf einem inerten Träger, wie z.B. Laktose, anorganische Salze, Kieselgur oder deren Kombinationen, aus den ganzen Kulturen oder aus den filtrierten Rohkulturen entfernt. Andererseits lassen sich die vorliegenden Enzympräparate mit Alkohol und Amaoniumsulfat ausfällen. Mit letzterem Verfahren lassen sich Produkte von verhältnismäßig hohem Reinheitsgrad erzielen, die sich durch eine Ausfällung unter Kühlung noch erhöhen läßt. Da die hier offenbarten Enzympräparate in einem großen Maße bei der Herstellung von Nahrungsmitteln oder nahrungsmittelartigen Stoffen verwandt werden können, wird diese erhöhte Reinigung eher bevorzugt. Natürlich ist es nicht unbedingt erforderlich, die Enzympräparate von der Rohkultur zu trennen, da sie auch in dieser Form wirksam verwendet werden können. Die Trennung und der Reinheitsgrad hängen in hohe» Maß von der Verwendung ab, für welche die Enzympräparate bestimmt sind.

Die Extractase A-2 enthaltenden Verbindungen werden im allgemeinen durch Kombination eines solchen Enzympräparates mit inerten oder im wesentlichen inerten Trägern hergestellt. Unter "Träger" soll hierbei jede Substanz oder Kombination von Substanzen verstanden werden, mit denen das Enzympräparat gelöst, verdünnt, dispensiert , verteilt oder diffundiert werden kann, ohne daß seine Wirksamkeit wesentlich beeinträchtigt wird. Wieviel von dem Enzympräparat mit einem Träger in jedem Gemisch kombiniert wird, hängt von der gewünschten Proteinextraktionsaktivität ab. Im allgemeinen enthalten solche Gemische, bezogen auf das Gesamtgewicht des Gemisches, 1 bis 99 Gew.$>, vorzugsweise 5 bis 25 Gew.#, Extractase A-2.

Ein typisches Gemisch kann dadurch hergestellt werden, daß Extractase A-2 mit Alkohol aus einer in der vorstehend beschriebenen Weise erhaltenen Rohkultur ausgefällt wird. Dieser Niederschlag, d.h. die Extractase A-2, wird dann Laktose einverleibt, so daß er 10 # des Gesamtgewichtes eines solchen Gemisches ausmacht. Dieses enzymatische Gemisch läßt sich dann leicht zur Extraktion von Protein aus proteinhaltigen Stoffen, wie z.B. entfetteten Sojaflocken, verwenden.

909839/0924

Wie vorstehend erwähnt, wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren ein proteinhaltiger Stoff mit einer solchen Menge Extractase A-2 in Berührung gebracht, die für eine Ectraktion des Proteins desselben wirksam ist. In der Regel wird dieses Verfahren vorzugsweise in einer wässrigen Lösung durchgeführt. Die Menge des bei einer solchen Lösung verwendeten Wassers hängt von den zu behandelnden Substraten, d.h. dem proteinhaltigen Stoff, ab. In den meisten Fällen wird nur eine minimale Menge Wasser verwendet, d.h. nur die Menge, die zur völligen Lösung des gesamten Proteins in der zu behandelnden Substanz ausreicht. Gewöhnlich schwankt dies von 5 bis 30 Gew.-Teilen Wasser zu 1 Gew.-Teil proteinhaltigem Material. Vorzugsweise beträgt das Verhältnis Wasser zu proteinhaltigem-Material 10:1.

P Die Menge der in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendeten Extractase-A-2 verändert sich, natürlich nicht nur mit der Proteinextraktionsaktivität, sondern zusätzlich zu den jeweiligen Verfahrensbedingungen auch mit dem zu behandelnden proteinhaltigen Material.

Es wurde gefunden, daß pro Gramm proteinhaltigen Materials etwa 0,01 bis 300, vorzugsweise 0,1 bis 50, Extractase-A-2-Einheiten des Enzympräparates zur Proteinextraktion benötigt werden. Allerdings können je nach den verschiedenen Verfahrensbedingungen etc. auch weniger als 0,01 Extraetase-A-2-Einheiten des Enzympräparates pro Gramm proteinhaltigem Material verwendet werden. Gleichfalls kann es in manchen Fällen erforderlich sein, ψ mehr als 300 Extractase-A-2-Einheiten zur Extraktion des gewünschten Proteins zu verwenden. Jeder^ Fachmann wird die genaue Menge von Extractase-A-2 bestimmen können, die unter den jeweils gegebenen Bedingungen benötigt wird.

Im allgemeinen wird das Verfahren bei einem pH-Wert von etwa 4,8 bis 8,8, vorzugsweise etwa 6,5 bis 7,5» durchgeführt. Je nach dem zu behandelnden proteinhaltigen Material und dergleichen können in dieses verschiedene Substanzen zur Einstellung und Beibehaltung des pH-Wertes einverleibt werden. Zu diesen Substanzen gehören beispielsweise Ammoniumsulfat, Ammoniumhydroxyd, Hatriumhydroxyd, Natriumcarbonat, Salzsäure,

909839/0924

Schwefelsäure, Essigsäure, Milchsäure, Adipinsäure od. dgl.. Es ist ebenfalls sehr wünschenswert, die Temperatur während der Berührung der wasserigen lösung des proteinhaltigen Materials mit dem Enzympräparat in einem Bereich von etwa 20 bis 6O⁰C, vorzugsweise bei etwa 50° bis 40⁰C, zu halten. Gewöhnlich geht das Extraktionsverfahren bei höheren !Temperaturen und unter leichtem Bühren schneller vonstatten. Allerdings verändert sich die Zeit für jede spezifische mit dem vorliegenden Verfahren durchgeführte Proteinextraktion in Abhängigkeit von dem proteinhaltigen Material, der Enzymkonzentration und den anderen vorstehend erwähnten Bedingungen. Meistens sind für eine zufriedenstellende Proteinextraktion mindestens 5 Minuten und im allgemeinen eine Stunde oder mehr erforderlich. Unter den bevorzugten Bedingungen läßt sich die Proteinextraktion innerhalb von 15 bis 30 Min. durchführen.

Gregebenenfalls kann auf die vorstehend beschriebene Enzymextraktion eine zweite Stufe folgen, d.h. nach der ersten Proteinextraktion bei einem pH-Wert von 4,8 bis 8,8 wird der pH-Wert der Lösung des proteinhaltigen Materials auf 9 oder höher eingestellt und so lange beibehalten, bis die zusätzliche Proteinextraktion beendet ist. Dies erfordert etwa die gleiche Zeit wie die erste enzymatische Extraktion. Bei dieser zweiten Stufe wird der pH-Wert mit Hilfe von Laugen, wässerigem Ammoniak, alkalischen Puffern, wie z.B. zweibasisches Kaliumphosphat und dergleichen eingestellt.

Nach Beendigung des Extraktionsverfahrens, die sich mit der Proteinanalyse nach Kjeldahl feststellen läßt, kann das Protein nach einem der dem Fachmann bekannten Verfahren gewonnen werden. Meistenteils wird dabei das Protein ausge fällt, nachdem die Lösung mit genießbaren Säuren auf den isoelektrischen Punkt des Proteins eingestellt wurde. Beispielsweise läßt sich das Protein der Sojabohne bei einem pH-Wert von etwa 4,5 bis 4,6 isoelektrisch ausfällen. Genießbare Säuren, wie Milch- und Essigsäure sind für eine derartige Senkung des pH-Wertes besonders geeignet. Das Protein kann beispielsweise aber auch durch Filtrieren, Zentrifugieren, Sprühtrocknen, Lyophilisieren, Dekantieren , Destillieren od.

909839/0924

- IO -

dgl. isoliert werden. Natürlich hängt die Wahl des jeweiligen Verfahrens zum großen Teil von dem Verwendungszweck des Endproduktes ab.

Wie vorstehend erwähnt, ist das erfindungsgemäße Verfahren vornehmlich zur Proteinextraktion aus Sojabohnenflocken, insbesondere entfetteten Sojabohnenflocken geeignet. Solche Sojabohnenflocken sind wesentliche Proteinquellen. Außerdem lassen sie sich leicht herstellen und sind im allgemeinen in dieser Form als Ware zu erhalten. Sojabohnenflocken werden hergestellt, indem man die Sojabohnen schält, schabt und anschließend trocknet. Entfettete Flocken werden im wesentlichen auf die gleiche Art hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Flocken zuerst getoastet werden und das Öl dann durch Hexan-™ extraktion entfernt wird. Selbstverständlich sind solche Verarbeitungsweisen der Sojabohne dem Fachmann wohlbekannt.

In ähnlicher Weise ist das erfindungsgemäße Verfahren zur Proteingewinnung aus den festen proteinhaltigen Rückständen der Sojamilchgewinnung ebenfalls sehr gut geeignet. Zur Gewinnung von Sojamilch werden die ganzen rohen Sojabohnen eine Nacht in Wasser eingeweicht, dann getrocknet und geschält. Die geschälten Sojabohnen werden dann gemahlen, mit Wasser extrahiert und filtriert. Auf diese Weise wird eine Sojavollfettmilch mit etwa 60 bis 70 <$o des vorhandenen Proteins gewonnen. Der verbliebene proteinhaltige Rückstand kann dann nach dem erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden, um so einen großen " Teil des verbliebenen ungelösten Proteins weiter zu extrahieren. Wenn nötig, kann aus der wässrigen Proteinextraktion aus Sojabohnen oder sogar aus den nicht gemahlenen Sojabohnenflocken Sojamilch hergestellt werden. Trotzdem läßt sich das Protein in dem anfallenden Rückstand zu jedem Zeitpunkt während der Sojamilchherstellung nach dem erfindungsgemäßen Verfahren extrahieren.

Die nachstehenden Beispiele dienen dem besseren Verständnis der Erfindung und einiger seiner Ausführungsformen; sie sollen die Erfindung jedoch nicht einschränken.

909839/0924

Beispiel 1: Submerse Gewinnung von Extractase-A-2 in Sohüttelkolben.

100 ecm aliquote Mengen eines wässrigen Mediums aus 2 % Gelatine, 10 <fo Maisstärke, 0,4 $ Monoammoniumphosphat und 0,4 # Calciumcarbonat wurden in I-Liter-Weithalserlenmeyer kolben gegeben, die mit 3 Milchfilterscheiben verschlossen waren.

Nach 30 minütiger Sterilisation des Mediums bei 1,05 atü wurden die Kolben abgekühlt und mit einer wässrigen Suspension einer Kultur von Bacillus subtilis, die 18 Std. lang auf einem Nähragar nach Difco gezüchtet wurde, bis zu einer Endkonzentration von 2 fo geimpft. Die Kolben wurden dann auf einer Schüttelvorrichtung mit 260 U/min, und einem Exzenter von 5f72 cm bei 35° bis 37°C und einer relativen Feuchtigkeit von 50 io inkubiert. Der Anfangs-pH-Wert betrug 7. Nach 72 Stunden wurden die Kulturen aus der Schüttelmaschine genommen und auf ihre Proteinextraktionsaktivität geprüft. Dies wurde wie folgt vorgenommen:

100 g entfettete Sojabohnenflocken wurden in 1000 ml Leitungswasser gegeben. Dieser Lösung wurden 1,0 g der vorstehend präparierten ganzen Kultur zugegeben. Die Reaktion fand 30 Min. lang unter Mischen auf einer Schüttelmaschine von 275 U/min, und einer Amplitude von 1,27 cm bei einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 40 G statt. In der gleichen Weise wurde eine Lösung aus entfetteten Sojabohnenflocken und Wasser, aber ohne Zugabe der Kultur hergestellt. Die Lösung wurde dann den gleichen Bedingungen unterworfen, d.h. sie wurde 30 Min. lang bei einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 40 G gemischt. Danach wurde der unlösliche Rückstand beider Lösungen durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,147 mm abfiltriert.

Das FiItrat wurde mit Milchsäure (85 %) auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt und dann zentrifugiert. Das ausgefällte Protein wurde getrocknet und gewogen. Dann wurde die Protein-

909839/0924

extraktionsaktivität des Extractase-A-2-Enzympräparates, d.h. der ganzen Kultur, in Extractase-A-2-Einheiten berechnet.

Berechnung der Proteinextraktionsaktivität in Extractase-A-2-Einheiten:

Gewicht des isoelektrischen Proteins der

Sojabohne aus der wässrigen Enzymextraktion; 27 g

Gewicht des isoelektrischen Proteins der Sojabohne aus der Wasserextraktion 22 g

Unterschied 5 g

Extractase-A-2-Einheiten/g = Gewichtsunterschied ₌ 5 _ ^_n

Gewicht des Enzym- 1,0 Präparates

Folglich beeaß die ganze Kultur der Extractase A-2 eine Proteinextraktionsaktivität von 50 Extractase-A-2-Einheiten.

Ein Konzentrat der Extractase Δ-2 wurde durch Ausfällung mit Alkohol erzielt. Die Konzentration wurde dadurch erreicht, daß der ganzen vorstehenden Kultur bei 4 C/3 Volumen Äthanol unter Rühren zugegeben wurden. Auf diese Weise wurde das Konzentrat der Extractase A-2 ausgefällt. Es wurde durch Filtrieren aufgefangen und dann bei 30 bis 35 G im Vakuum getrock- ψ net; danach war es zur Lagerung oder zum Gebrauch geeignet.

Beispiel 2:

In 1.000 ecm Leitungswasser wurden 100 g entfettete Sojabohnenflocken gegeben. Dieser Lösung wurden dann 0,1 g des mit Alkohol ausgefällten, nach Beispiel 1 hergestellten Konzentrates der Extractase A-2 zugegeben. Die Lösung wurde sodann 15 Min. lang auf einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 40 G gehalten, wobei sie mit einer Schüttelvorrichtung von 275 U/min, und einer Amplitude von 1,27 cm gemischt wurde. Unmittelbar danach

909839/0924

■"■&"-

wurde das Reaktionsgemisch mit 5 n NaOH auf einen pH-Wert von 9 eingestellt und weitere 15 Minuten umgesetzt. Nach der Reaktion wurde der unlösliche Rückstand durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,147 mm abfiltriert. Das FiItrat wurde mit Milchsäure (85 #) zur Ausfällung des Proteins auf einen pH-Wert von 4»5 eingestellt. Nach dem Zentrifugieren wurde das Protein getrocknet und gewogen. Das auf diese Weise erhaltene Protein wurde ait der in einem Kontrollversuch erhaltenen Menge verglichen, welcher auf die gleiche Weise, jedoch ohne Zugabe von Extractase A-2, durchgeführt wurde.

Gewicht des unter Verwendung des Enzympräparats erhaltenen isoelektrischen Proteins . 37 g

Gewicht des ohne Verwendung des Enzympräparats erhaltenen isoelektrischen Proteins 23 g

Beispiel 3t

In 1000 ecm Wasser wurden 100 g vollfette Sojabohnen suspendiert, die so gemahlen waren, daß sie durch ein Sieb mit einer lichten Maschenweite von 0,833 mm gingen. Dieser Lösung wurde 1 g des mit Alkohol ausgefällten, in Beispiel 1 hergestellten Extractase A-2-Konzentrats zugegeben. Nach Zugabe dieses Enzympräparates wurde die Lösung 2 Std. lang unter gelindem Rühren auf einen pH-Wert von 8,8 und einer Temperatur von 37⁰G gehalten. Danach wurde die Lösung zur Entfernung der unlöslichen Rückstände durch ein Tuch (cheesecloth) filtriert. Das auf diese Weise erhaltene PiItrat wurde nach der Kjedahl-Methode auf Protein analysiert. Die Menge dos mit diesem Verfahren erhaltenen Proteins wurde mit der Proteinmenge eines Kontrollversuchs verglichen, der unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Zugabe von Extractase A.-2 durchgeführt wurde.

Gewicht des unter Verwendung von Extractase A-2 26,9 g erhaltenen Proteins;

909839/0924

Gewicht des ohne Verwendung von

Extractase A-2 erhaltenen Proteins; 17,5 g

Beispiel 4:

In 1000 ecm Leitungswasser wurden 100 g entfettete Sojabohnenflocken gegeben. Dieser Lösung wurden 1,0 g der in Beispiel 1 hergestellten Extractase A-2 zugegeben. Dieses Gemisch wurde sodann 30 Min. lang unter leichtem Rlhren bei einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 40⁰G umgesetzt. Danach wurde die Lösung zur Entfernung des unlöslichen Rückstands durch ein Tuch (cheesecloth) filtriert. Dieser unlösliche Rückstand mit einem Gewicht von 32 g wurde dann in 100 ecm Wasser gegeben, dem 1,0 g des nach Beispiel 1 hergestellten Extractase-A-2-Konzentrats zugegeben wurden. Diese Lösung wurde 30 Min. lang auf einem pH-Wert von 6,8 und einer Temperatur von 40 C gehalten. Dann wurde der unlösliche Rückstand wiederum mit einem Tuch (cheesecloth) filtriert. Das auf diese Weise erhaltene Filtrat wurde mit Milchsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt, um das Protein isoelektrisch auszufällen. Auf diese Weise wurden aus dem Rückstand 6,36 g isoelektrisches Protein gewonnen, im Vergleich zu 5,7 g Protein, die erhalten wurden, wenn man einen derartigen Rückstand unter den gleichen Bedingungen, jedoch ohne Extractase A-2, mit Wasser behandelte.

Beispiel 5:

In der gleichen Weise wie in Beispiel 1 wurden verschiedene 1-Liter-Weithalserlenmeyerkolben, die einen Nährbouillon nach Difco enthielten, mit den Kulturen der nachstehenden Organismen geimpft: Bacillus subtilis, Bacillus mycoides und Bacillus megaterium. Diese Kolben wurden dann 66 Stunden auf einer Schüttelmaschine mit 260 U/min, und einem Exzenter von 5,72 cm bei einer Temperatur von 35° - 37°G und einer relativen Feuchtigkeit von 50 °/a inkubiert. Anschließend wurden die ganzen Kulturen aus der Schüttelvorrichtung genommen und wie in Beispiel 1 auf ihre Proteinextraktionsaktivität geprüft.

909839/0924

Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle aufgeführt: Organismus Extractase A-2-Einheiten/g

Bacillus subtilis 16

Bacillus mycoides 17

Bacillus megaterium 26

909839/0924

Claims

'- 16 - Patentansprüche:

1. Verfahren zur Extraktion von Protein aus proteinhaltigen Stoffen, wobei man den proteinhaltigen Stoff mit einer zur Proteinextraktion aus diesem Stoff ausreichenden Menge eines Enzympräparates in Berührung· bringt, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzympräparat verwendet, das a) wasserlöslich,

b) nicht dialysierbar und c) durch Zugabe von Ammoniumsulfat oder Alkohol aus der wässrigen Lösung ausfällbar ist, d) von einem bakteriellen Organismus abstammt und das e) fähig ist, aus einem proteinhaltigen Stoff, im Vergleich zu der Protein menge, die hieraus unter gleichen Bedingungen durch bloße wässrige Extraktion erhältlich ist, mehr Protein zu extrahieren.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man es in wässeriger Lösung durchführt.

3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man eine wässerige Lösung verwendet, die aus 5 bis 30 G-ew.-Teilen Wasser pro 1 Gewichtsteil proteinhaltigem Stoff besteht.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzympräparat verwendet, das eine Proteinextraktionsaktivität von 0,01 bis 300 Extraetase-A-2-Einheiten pro Gramm besitzt.

5. Verfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet,

daß man ein Enzympräparat verwendet, das eine Proteinextraktionsaktivität von 0,1 bis 50 Extractase-A-2-Einheiten pro Gramm besitzt.

6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzympräparat verwendet, das von einem Bazillus abstammt.

909839/0924

7. Verfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzympräparat verwendet, das vom Bacillus subtilis, Bacillus mycoides, Bacillus amyloliquifaciens, Bacillus cereus, Bacillus macerans, Bacillus megaterium, Bacillus sphaericus oder Bacillus circulans abstammt.

8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man es bei einem pH-Wert von etwa 4,8 bis 8,8 und einer Temperatur von etwa 20° bis 60 G durchführt und gegebenenfalls den pH-Wert anschließend auf 9 oder mehr einstellt.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der pH-Wert bei etwa 6,5 bis 7,5 und die Temperatur bei etwa 30° bis 40°0 gehalten wird.

10. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man als proteinhaltigen Stoff Sojabohnen oder Sojabohnenderivate verwendet.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man als Sojabohnenderivat entfettete Sojabohnenflocken verwendet.

12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Enzympräparat verwendet, das unter Erzielung eines G-emisches mit einem Träger kombiniert ist.

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Gemisch verwendet, das zu 5 bis 25 ^a/° aus dem Enzympräparat besteht.

Für Rohm & Haas Company

Rechtsanwalt 909 8 3 9/092A