DE2032490A1

DE2032490A1 - Verfahren zur Fraktionierung von ölhaltigen Samen

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Publication number: DE2032490A1
Application number: DE19702032490
Authority: DE
Inventors: Samuel Eugene Wilhngboro Smythe Carl Vincent Moorestown N J Faithjun William Thomas Warminster Steigerwald Ronald Bert Levittown Pa Sherba, (V St A )
Original assignee: Rohm and Haas Co
Current assignee: Rohm and Haas Co
Priority date: 1969-07-02
Filing date: 1970-07-01
Publication date: 1971-01-07
Also published as: US3640725A

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Abtrennung von Nährst off komponenten aus Sojabohnen oder anderen ölhaltigen Samen unter Verwendung enzymatischer Proteinhydrolyse. Reine, ganze Sojabohnen werden zerkleinert, auf etwa 90 - 14O° C erhitzt und dann durch Zugabe von weiterem Wasser gekühlt* Ein proteolytisches Enzym, das vorzugsweise von einem Aepergillus oder Bacillus sp. stammt, wird zu dem Schlamm zugesetzt, der dann auf eine Inkubationstemperatur von 25 - 75 C gehalten wird, bis das Protein ausreichend hydrolysiert ist. Der faserförmige Feststoffanteil wird dann aus dem Schlamm entfernt und ist brauchbar als Beifuttermittel. Die Ölphase kann dann aus dem flüssigen Anteil des Schlammes entfernt werden, beispielsweise durch Abtrennung einer wässrigen Phase von einer ölhaltigen Phase in einer Sahne»trennvorrichtung. Die wässrige nase wird dann auf einen pH-Wert von etwa 4,5 angesäuert, um

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isoelektrisches Protein auszufällen, das beispielsweise durch Zentrifugieren gewonnen werden kann* Um das Hauptprodukt dieses Verfahrene, das Sojaprotein-hydrolysat, zu erhalten, wird die verbleibende wässrige Phase erwünschtermaßen durch herkömmliche Verdampfungsmethoden konzentriert, auf einen im

neutralen
wesentlichenVpH-Wert eingestellt und dann getrocknet, wie beispielsweise durch Sprühtrocknung oder Lyophilisieren· Stattdessen kann die wässrige Phase, die Protein und/oder Proteinhydro Iy sat enthält, auch als Grundlage für ein Nährgetränk verwendet werden.

Die Erfindung betrifft eine enzymatische MethodeVzur Fraktionierung von Sojabohnen oder anderen ölhaltigen Samen, sowie die dabei erhaltenen Produkte.

Protein und speziell Protein von Nährstoffqualität sind in vielen Gebieten der Veit knapp. Zwei bestimmte Versuche wurden unternommen, tun dieses Problem zu lösen.

Erstens unternahm man ständig Bemühungen, um neue Proteinquellen zu erschließen. Das zweite und wirksamere Mittel bemüht sich darum, das zur Verfügung stehende Protein verwertbar zu machen. Die Erfindung betrifft di® letztere Aufgabenstellung.

Sojabohnen sind ausgezeichnete Proteinquellen» Eine wesentliche Schwierigkeit beeteht jedoch darin, dam Protein,, öl und andere Komponenten daraix« asu extrahieren. Felglioh wurden zahlreiche Verfahren entwickelt, um 'di® verschiedenen Kompo-

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nenten von Sojabohnen und Sojabohnenderivaten zu trennen. Abgesehen, daß diese Verfahren etwas unvollständig sind, neigen sie jedoch auch dazu, kompliziert und teuer zu sein.

Beispielsweise werden nach einem Verfahren des Standes der Technik die gesamten rohen Sojabohnen über Nacht in Wasser eingeweicht, um so ihre Schalen zu verlieren. Nach dem Einweichen wird die Flüssigkeit abgegossen, und die Sojabohnen werden mechanisch von den Schalen befreit. Die resultierenden geschälten Sojabohnen werden dann zu Flunken verarbeitet, und das Öl wird entweder durch Auspressen oder durch Lösungsmittelextraktion gewonnen. Nach dem Rösten der Flocken können diese gemahlen werden und sind dann Sojamehl oder Sjjaschrot. Wechselweise können die Flocken in Wasser eingeweicht werden, um einiges von dem verfügbaren Protein zu extrahieren. Eine solche wässrige Proteinlösung wird allgemein als Sojamilch bezeichnet und kann in dieser Form als Nährstoff benutzt werden. Als andere Alternative kann der pH-Wert der Sojamilch auf etwa k_t5 eingestellt werden, um daraus das Protein an dessen isoelektrischem pH-Wert auszufällen. Dieses isolierte Sojaprotein oder "isoelektrisches Protein" (nachfolgend als XSP bezeichnet) kann durch Filtrieren oder ähnliche Maßnahmen isoliert werden.

Sollte es erwünscht sein, das Protein löslich zu machen, wäre eine zusätzliche Bearbeitung erforderlich. Im allgemeinen würde diese darin bestehen, das Isolierte Protein mit Alkali zu behandeln. Dieses Verfahren ist jedoch etwas unerwünscht, besonders wenn das resultierende Protein als Nahrungsmittel

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oder Nahrungsmittelzusatz benutzt werden solle Alkalische Behandlung zerstört oftmals bestimmte wesentliche Aminosäuren, die in dem Protein vorhanden sind,, wodurch die Mähr stoff eigenschaft en verschlechtert werden. Außerdem ist eine solche alkalische Behandlung oftmals unwirtsehaftlichjund das daraus resultierende Protein, besitzt oft Eigenschaften, wie schlechten Geruch, die das Produkt ungeeignet für eine zufriedenstellende Benutzung als Nahrungemittel machen.

Wechselweise wurden in der Technik Verfahren vorgeschlagen, bei denen ISP der Wirkung von Enzymen, wie Papain oder dergleichen ausgesetzt wird, um ein hydrolysiertes Proteinprodukt zu erzeugen.

Bs sei jedoch festgestellt, daß die durch wässrige Extraktion wie oben beschrieben hergestellte Sojamilch nicht so nahrhaft ist, wie sie sein könnte. Dies ist auf die Tatsache zurückzuführen, daß wesentliche Mengen des verfügbaren Proteins beim Einweichen in Wasser nicht extrahiert werden. Stattdessen wird dieses Protein oftmals als Abfallmaterial weggeworfen.

Die Zeichnung ist ein Blockdiagramm einer bevorzugten Ausführungsform des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung.

Die vorliegende Erfindung kann bei der Fraktionierung und Gewinnung von Protein aus irgendeinem der verschiedensten ölhaltigen Samen verwendet werden. Besonders vorteilhaft 1st dieses Verfahren mit ölhaltigen Samen, wi© BaumwolleAmen, Rapseamen, Sonnenblumenkernen und Sesamsamen. Gegenwärtig

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ist die sun meisten bevorzugte Anwendung der Erfindung jedoch die Behandlung von Sojabohnen.

Nachfolgend wird das Verfahren nach der vorliegenden Erfindung speziell unter Bezug auf Bedingungen für Behandlung von Sojabohnen beschrieben, obwohl es klar ist, daß Abwandlungen der Zeiten, Temperaturen und Konzentrationen vom Fachmann vorgenommen werden können, um optimale Ergebnisse auch dann zu erzielen, wenn andere ölhaltige Samen bei dem vorliegenden
Verfahren verwendet werden.

Gemäß der vorliegenden Erfindung sind Sojabohnen oder andere ölhaltige Samen, die dem Verfahren unterzogen werden, zu reini-

gen und als Ganzes zu verwenden. Obwohl bei bekannten Verfahren zur Trennung der Komponenten von Sojabohnen und anderen ölhaltigen Samen mit einer damit aus einem Stück bestehenden Schale üblich ist, die Bohnen vor der Behandlung zu schälen, ist bei dem vorliegenden Verfahren ein solches Schälen nicht nötig. Die Zerkleinerungsstufe ist ausreichend, um die Bohnen für die weitere Bearbeitung nach dieser Erfindung vorzubereiten, und somit wird die komplexe mechanische Stufe des Schälens vorteilhafterweise ausgeschaltet. Natürlich könnten
die Bohnen, wenn erwünscht, geschält und dann dem vorliegenden Verfahren unterzogen werden, wobei in diesem Fall die als Stufe 5 (elehe unten) erhaltenen Feststoffe von wesentlich
anderer Eigenschaft wären.

Stufe 1

Die Bohnen werden zerkleinert, d. h. gemahlen, zersohnltten,

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zerstoßen oder geflockt usw., um die wirksame Oberfläche auf ein Maximum zu vergrößern. Wenn beispielsweise Sojabohnen dieser Stufe gemahlen werden, sind die Teilchen erwünschtermaßen im Bereich von 10 - 100 Maschen.

Stufe 2

Die zerkleinerten Bohnen werden bei einer Temperatur in der Nähe des Siedepunktes oder oberhalb desselben, vorteilhaftterweise bei etwa 90 - 14O° C und vorzugsweise bei etwa 120° C mit Dampf behandelt. Beispielsweise wird die Behandlung ein oder mehrere Minuten fortgesetzt, wobei die Zeit von der Temperatur und der Menge des gewünschten extrahierbaren Proteins abhängt. Bei einer Temperatur von 120° C wird das Erhitzen erwünschtermaßen etwa 5 - 15 Minuten fortgesetzt. Bei niedrigeren Temperaturen erfolgt das Erhitzen erwünschtermaßen länger, und bei höheren Temperaturen kann die Erhitzungsstufe kürzer sein.

Aus der Erhitzungsstufe nach der vorliegenden Erfindung ergeben sich verschiedene Vorteile. Die Wirksamkeit der Proteinextraktion wird verbessert, in solchen ölhaltigen Samen, wie Sojabohnen, vorliegender Trypsininhibitor wird inaktiviert, der Geschmack wird verbessert und dl@ Möglichkeit einer Verunreinigung vermindert. Ein© mögliche Erklärung der Verbesserung in der Protelnextraktionswirkaamkeit, die nur als eine Hypothese und nicht beschränkend angeführt wird, ist die, daß die Erhitzungsstufe die inaer® tertifir» Struktur dos Proteins aufbricht und gestattet, daß die; Meeromolekiil© sich aufwickeln

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und so der nachfolgenden Wirkung der enzymhaltigen Lösung ausgesetzt werden. Außerdem wird angenommen, daß das Erhitzen die Zellen der ölhaltigen S_amen aufbricht und gestattet, daß die zerkleinerten Teilchen schneller ihren Inhalt abgeben*

Stufe 3

Die in der Hitze behandelte Masse wird auf Inkubatlonetemperatur abgekühlt, wie beispielsweise durch Zugabe von Kühlwasser.

Die Gesamtmenge des während des E_rhitzens und/oder Kühlen· zugesetzten Wassers liegt erwünschtermaßen zwischen etwa dem 2-fachen und 20-fachen des Gewichts der gemahlenen Bohnen.

Wenn erwünscht, kann weiteres Wasser zugesetzt werden, doch ergibt sich daraus^mallgemelnen kein wirtschaftlicher Vorteil. Vorzugsweise wird die zugesetzte Wassermenge auf einem Minimum gehalten, um die nachfolgende Handhabung der wässrigen Lösungen zu erleichtern und die Verwendung einer minimalen Enzymmengä zu gestatten, um in Stufe 4 die erwünschte Enzymkonzentration zu erhalten. So ist es bevorzugt, nicht mehr als 10 Teile und vorzugsweise zwischen etwa 3 und 8 Teilen Wasser je Teil Sojabohnen zu verwenden.

In der Tat ist die Fähigkeit, eine wirksame Proteinextraktion bei diesem hohen Feststoffgehalt zu bekommen, ein wesentlicher Vorteil des vorliegenden Verfahrens.

In der Praxis kann etwa die Hälfte des gesamten Wassers während

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des Erhitzens (Stufe 2) und der Rest während des Kühlens (Stufe 3) zugegeben werden, obwohl natürlich diese Mengenverhältnisse weitgehend variiert werden können« Stattdessen können auch trockene Bohnen erhitzt und gekühlt werden und das Wasser in einer anschließenden Stufe zugegeben werden.

Stufe 'k

Die proteolytieche Enzymzusammensetzung wird dann zu dem Schlamm zugesetzt, der ausreichend lange auf Inkubationstemperatur und Inkubations-pH gehalten wird, um den erwünschten Hydrolysegrad zu erhalten.

Obwohl im wesentlichen jode proteolytische Zusammensetzung bei dem Verfahren nach der vorliegenden Erfindung verwendet werden könnte, ist es bevorzugt, Proteasen von Bakterienoder Pilzursprung zu verwenden. Vorteilhafterweise können die Bakterienproteaeen von einem Staam der Gattung Bacillus, wie B. subtills, B. mycoides, B. amyloliquifaclens, B* cereus, ψ B. maoerans, B. megaterium, B* sphaericus, B. circulana, usw. hergeleitet werden. Ein besonders bevorzugter Bazillus für die Herstellung von nach der Erfindung brauchbarer Protease ist B. eubtllis.

Wechselweise kann auch eine Protease von Pilzursprung verwendet werden. Diese kann sich von einer Rohkultur von Asperglllus und erwünschtermaßen von A. flavus-orzyae und Λ. niger herleiten.

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Zahlreiche Stämme und Mutationen von Bacillus- und Aspergillusorganismen, die für die Gewinnung von einem Verfahren der Erfindung verwendbarer Enzyme brauchbar sind, stehen durch die öffentlichen KuItürSammlungen, wie die American Type Culture Collection in Rockville, Maryland, zur Verfügung. Verschiedene Methoden zur Züchtung von Mikroorganismen und zur Gewinnung von Enzymen daraus sind in der Technik wohl bekannt·

Bakterielle und Pilzproteasen mit Nahrungsmittelreinheit, die für die Verwendung bei dem vorliegenden Verfahren geeignet sind, stehen in großem Umfang zur Verfügung· Solche Zusammensetzungen sind beispielsweise Rhoxyme-P-53-Konzentrat und Protease 56, die sich von Bakterien herleiten, Rhozyme-P-11-Konzentrat und Rhozyme-41-Konzentrat, die sich von Pilzen herleiten und alle von der Rohm and Hass Company, Philadelphia vertrieben werden.

Die Aktivität der bei dem Verfahren der vorliegenden Erfindung brauchbaren proteolytischen Enzyme kann nach der von L. A. Underkofler in J.A.O.A.C., 44 (2), Seite 344 (1?61), berichteten Testmethode bestimmt werden. Gemäß dieser Testmethode wird ein Enzym so definiert, daß es eine Aktivität von 1.000 Hämoglobineinheiten (HE) je Gramm besitzt, wenn 11,18 mg desselben in 5 Stunden bei 40° C und einem pH-Wert von 4,7 eine Steigerung des löslichen Stickstoffs von 5»00 mg aus 0,417 C Hämoglobin ergeben. Dies entspricht einer Löslichmachung von etwa dem 3-fachen des Gewichtes von Hämoglobin unter diesen Bedingungen.

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Andere Methoden zur Bestimmung proteolytischer Aktivität sind beispielsweise die Verminderung der Viskosität einer wässrigen Gelatinelösung, gemessen in Gelatineviskositätseinheiten (gve) und die Verminderung der Viskosität einer wässrigen Leimlösung! gemessen in Proteaeeleimeinheiten (PLE).

Kleinere oder restliche enzymatisch^ Aktivitäten können auch
bestimmt werden· Beispielsweise kann die peotinolytische Aktivität auf der Grundlage einer Reduktion der Viskosität von
Apfelbreiextrakt, gemessen als Apfelbreieinheiten (ABE), oder von Citrus-pectin, gemessen in Citruselnhelten (CE) bestimmt
werden. Die diastatische· Aktivität kann durch die Verminderung der Stärke-Jodfarbe des Reaktionsproduktes bestimmt werden, gemessen in bakteriellen Amylaseeinheiten (BAS) gemäß
J. Affler. Dyestuff Rep. 56-7 (Juli 1962) oder in Sandstedt,
Kneen and Blish (SKB)-Einheiten gemäß Cereal Ghem., J_6, Seite 712 (1939). Die lipolytische Aktivität kann durch die Hydrolyse von Olivenöl gemäß General Services Administration (GSA), Lipase Method B, Interim Federal Specification P-C-OO^JfOb
(GSA-FSS) vom 20. Februar 1963 bestimmt werden. Beschreibungen dieser Testmethoden stehen bei Rohm and Haas Company,
Industrial Chemical Dept., Philadelphia, Pa. I9105 zur Verfügung.

Vorzugsweise haben die bei dem vorliegenden Verfahren verwendeten SnzymBusaiimene et Bungen, maximal© Aktivität bei neutral®)*! oder leicht saurem oder alkalischem pH, da es bequem ist₀ den pH-Wert des Inkubationsfenisohes auf diesem

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allgemein etwa pH 6,5, zu halten. Der pH der Inkubationabrühe kann jedoch im Bereich von etwa pH 5 - 9»5 liegen und beträgt vorzugsweise etwa 5t5 - 8» wobei schädliche Nebenreaktionen
nicht auftreten.

Die Inkubation»temperatur muß natürlich niedriger sein als die, bei der das Enzym entaktiviert wird, und sie muß ausreichend hoch sein, damit die Hydrolyse mit einer annehmbaren Geschwindigkeit abläuft, d. h. zwischen etwa 25 und 75° C. Vorzugsweise wird die Inkubation zwischen etwa kO und 65 C durchgeführt. In diesem letzteren Bereich verläuft die Hydrolyse
wirksam, wobei die Möglichkeit mikrobieller Verunreinigungen auf ein Minimum herabgesetzt wird.

Von der Inkubationsbrühe können periodisch Proben abgenommen werden, um zu bestimmen, ob der erwünschte Hydrolysegräd erreicht wurde.

Vollständige Hydrolyse wird zum Zweoke der vorliegenden Erfindung als die Bedingung definiert, unter der in Stufe 7 keine merkliche Menge an ISF produziert wird und mit kalter Trichloressigsäure indem Produkt der Stufe 7 kein merklicher
Niederschlag erhalten wird. Beispielsweise bei einer Temperatur von 5° C kann, wenn 10 g einer proteolytischen Enzymzusammensetzung (Gesamtaktivität» 7.500 PGBj 625.000 HE) zu 1 kg gemahlener Sojabohnen in 11 kg Schlamm zugesetzt werden, die Inkubation zu einem Zustand vollständiger Hydrolyse in
8 Stunden oder weniger erreicht werden. Die relative Ausbeute an erhaltenem ISP kann durch Verwendung von weniger

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Enzym oder einer Ensymzusammensetzung mit anderer Aktivität oder durch Inkubation bei niedrigerer Temperatur und/oder während kürzerer Zeit erhöht werden. Durch Variation dieser Bedingungen sowie des pH-Wertee kann die Gesamtkonzentration usw., die Natur des Produktgemisches derart geändert werden, daß man beispielsweise wesentliche Mengen an ISP und/oder wesentliche Ausbeuten an löslichem Protein erhält, das in kalter Trichloressigsäure ausfällt. Somit beeinflussen die Inkubationsbedingungen direkt die Menge und Natur des Proteinmaterials in jeder der proteinhaltigen Fraktionen.

Obwohl es allgemein Praxis ist, eine Enzymzusammensetzung zu verwenden, die sich von einem einzelnen Organismus herleitet, um maximale proteolytische Aktivität des erwünschten Typs zu erhalten, schließt die vorliegende Erfindung wechselweise auch den Gedanken ein, Enzymgemische zu verwenden. Solche Gemische können Enzyme umfassen, die proteolytische Aktivität «maxima bei verschiedenen pH-Werten besitzen, und diese Enzyme können sich von Bakterien, Pilzen und anderen Quellen herleiten. Man sollte beim Vermischen verschiedener Enzyme Sorgfalt anwenden, da in einigen Fällen eines dazu neigen kann, das andere zu entaktivieren, was wahrscheinlich durch gegenseitige Zersetzung verursacht wird. Außerdem können auch wechselweise mit Vorteil andere als proteolytische Enzymzusammensetzungen verwendet werden, die einen wesentlichen Aktivitätsgrad enthalten.

Beispielsweise ist es erwünscht, dön Stachyose- und Raffinose-Gehalt von Sojabohnenprodukten auf ein Minimum herabzusetzen,

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um die durch bakterielle Fermentation im Darm verursachten Blähungen auf einem Minimum zu halten. Somit kann man erwünschtermaßen in dem Enzymgemisch eine Carbohydrase, wie sie in der deutschen Patentanmeldung P 19 01 00^.9 vom 9. Januar 1969 beschrieben ist, verwenden, und auf den Inhalt dieser Anmeldung wird hier Bezug genommen. Eine solche Enzymzusammensetzung ist ale Diastase 80 bei Rohm and Haas Co., Philadelphia, Pa. erhältlich. Wechselweise ist es bevorzugt, eine Carbohydrase1 wenn überhaupt, in einer späteren Stufe des Verfahrens zuzusetzen, wie nachfolgend beschrieben ist.

Die Zugabe von Lipase entweder selbst oder im Gemisch mit Carbohydrase führt zu einer Teilhydrolyse der Lipide zu Fettsäuren. Diese Wirkung vermindert die Menge einer leicht

.. sie

abtrennbaren Olfraktion, doch ftigt\^5u den anderen Produktfraktionen eine leicht verdauliche Fettkomponente hinzu«

Die Zugabe eines Enzyms mit Cellulaseaktivität kann auch erwünscht sein, um eine erhöhte Zerstörung der Zellwände zu erhalten und zusätzliche Zuckermengen in dem Endprodukt zu bekommen.

Nach der Inkubation kann die Enzymzusammensetzung gegebenenfalls durch weiteres Erhitzen entaktiviert werden* Die Zelt und Temperatur hängt von der Natur der Enzymzusammensetsung ab, wobei einige temperaturbeständiger sind als andere. Bei einer Zusammensetzung, die beispielsweise eine leicht entaktivierbare Protease enthält, kann die Entaktivierung beim Erhitzen auf etwa 75° C während etwa einer Stunde stattfinden.

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¹ BAD ORIGINAL

Dies ist jedoch völlig wahlfrai, insofern als die fortgesetzte Anwesenheit von aktiveW) Enzym das weitere Arbeiten nach der Erfindung nicht merklich beeinträchtigt.

Stufe 5

Nach der Inkubation werden die Feststoffe von dem Schlamm beispielsweise durch Filtration durch ein Sieb mit Öffnungen, die bezüglich der Größe der in Stufe 1 gewonnenen Teilchen in geeigneter Weise ausgewählt sind, abgetrennt. Wenn beispielsweise in Stufe 1 Sojabohnen zu Teilchen von etwa 20 Maschen vermählen wurden, kann ein 100-Maschen-Sieb verwendet werden, um eine wirksame ABtrennung zu erreichen. Gegebenenfalls kann die Filtration beschleunigt werden, indem man eine Korbzentrifuge oder eine andere derartige Einrichtung verwendet.

Wenn das zur Abtrennung der Feststoffe verwendete Verfahren nicht ausreicht, um die feinsten Teilchen zu entfernen, dann kann eine weitere Behandlung, wie Zentrifugieren, angewendet werden, wenn die Anwesenheit solcher feiner Feststoffteilchen in den Endprodukten nicht erwünscht ist.

Die so abgetrennten faeerförmigen Feststoffe können erwünschtermaßen getrocknet und als Tierfuttermittelzusatz benutzt werden, der rohe Fasern, Protein und etwas öl enthält.

Normalerweise würde das Verfahren ausgeführt, tu» einen festen Rückstand asu produzier©^ der weniger als etwa 10^-das ur-

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sprünglich in den Sojabohnen enthaltenen Proteins enthält, obwohl stattdessen auch faserförmige Feststoffe mit einem höheren Proteingehalt gewonnen werden können, wie beispielsweise zu Tierfutterzwecken oder zur Rückführung der Feststofffraktion zu einer anderen Inkubationsstufe für eine weitere Behandlung,

Das flüssige Produkt der vorliegenden Stufe kann mit oder ohne weitere Bearbeitung beispielsweise als eine vollfette Sojamilch verwendet werden. Stattdessen kann es folgendermaßen weiterbehandelt werden:

Stufe 6

Der bei der vorausgehenden Stufe erhaltene flüssige Anteil wird leicht in eine Ölphase und eine wässrige Phase getrennt. Die Phasentrennung kann durchgeführt werden, indem man lediglich den flüssigen Anteil absitzen läßt, doch in der Praxis wird die Trennung erwünschtermaßen erleichtert, indem man eine Apparatur, wie eine Zentrifuge oder vorzugsweise eine Sahnetrenneinrichtung verwendet, wie sie üblicherweise in Molkereien benutzt wird. Stattdessen kann für die Abtrennung der Ölfraktion auch eine Gegenetromlösungsmittelextraktion oder ein anderes in der Industrie bekanntes Mittel verwendet werden.

Die abgerahmte Ölphaee umfaßt im wesentlichen das rohe Sojabohnenöl. Das Lecithin und andere Phospholipide, Triglycerlde und kleinere Komponenten dieser Phase können mit herkömmlichen Methoden fraktioniert werden. Gagebenenfalle kann die wässrige

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Phase, die Protein, hydrolysiertes Protein und Kohlenhydrate umfaßt, ale Grundlage für ein Nährgetränk benutzt werden.

Wenn eine Enzymzusammensetzung, die eine Lipase enthält, in Stufe k verwendet wird, sind auch einige Fettsäuren in dieser Phase vorhanden. Stattdessen kann ein Teil der Ölphase zu

der wässrigen Phase zugesetzt werden, um ein Getränk mit dem erwünschten Fettgehalt herzustellen. Die Lösung kann gegebenenfalls an diesem Punkt mit einer Carbohydrase behandelt werden, um den Gehalt Blähungen erzeugender Zucke^/in dem Getränk zu vermindern. Erwünschtermaßen wird der pH-Wert des Produktes auf etwa 6 - 7»5 eingestellt..

Wechselweise kann es erwünscht sein, das restliche Protein aus den Hydrolyseprodukten in der wässrigen Lösung mit den folgenden Stufen abzutrennen.

Stufe 7

Die wässrige Phase der vorausgehenden Stuf© wird auf etwa pH 4,5 niit einer in Nahrungsmitteln zugelassenen Säur©, wie beispielsweise Milchsäure, angesäuert, um das restliche isoelektrische Protein (ISP) auszufällen, das dann duroh Filtration oder vorzugsweise durch Zentrifugieren abgetrennt werden kann. Das feuchte feste Produkt kann dann gegebenenfalls sprühgetrocknet werden.

Obwohl das ISPeines der Produkte der vorliegenden Erfindung ist, soll es jedoch nicht das Hauptprodukt darstellen. Viel-

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mehr soll die Proteolyse der Stufe h ein Maximum an Sojaproteinhydrolysat (nachfolgend als SPH bezeichnet) liefern,das nicht an dem isoelektrischen Punkt ausgebildet wird. Nach bekannten Verfahren zur Herstellung von SPH wird da· Protein zunächst mit herkömmlichen Methoden, die nachfolgend beschrieben sind, von den Sojabohnen isoliert und dann in einer getrennten Stufe hydrolysiert. Bei dem vorliegenden Verfahren dagegen wird das ISP während dieser Stufe als Feststoff gewonnen, und das vorher durch enzymatisch« Wirkung gebildete SPH bleibt in Lösung.

Stufe 8

Wenn es erwünscht ist, das SPH als trockenes Produkt oder konzentrierte Lösung zu gewinnen, wird das Zentrifugat der vorausgehenden Stufe gegebenenfalls auf einen pH-Wert von etwa 6 bis 7,5 eingestellt und dann erwünschtermaßen durch herkömmliche Verdampfungsmethoden, wie durch Schnellverdampfung, 3-stufige Verdampfung, umgekehrte' Osmoseabtrennung usw., konzentriert. Gegebenenfalls erfolgt die pH-Einsteilung in Stufe 9.

Stufe 9

Die SPH-Lösung, vorzugsweise aus Stufe 8, doch gegebenenfalls aus Stufe 7 unter Weglassung von Stufe 8, kann dann der Sprühtrocknung oder stattdessen einer Lyophilisierung, einer LuftechUtteltrocknung, Hitzetrocknung uew. unterworfen werden, um da* SPH in fester Form zusammen mit Kohlenhydraten und anderen lösliohen Materlallen su gewinnen·

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Die folgenden Beispiele von Laborverfahren dienen der Erläuterung einiger Alternativmethoden zur Durchführung des Verfahrens nach der vorliegenden Erfindung. Die in den folgenden Beispielen verwendeten verschiedenen Enzymzusammensetzungen sind in Tabelle I zusammengestellt*

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Tabelle I

Enzymzusammensetzungen

Zusammensetzung Enzymatische Hauptaktivität Gemessene proteolytische
Aktivität

Gemessene andere Aktivität

	Gewonnen	aus B.
	subtilis
O
O
to
OO
	P
	Gewonnen	aus A.
	oryzae
co

Neutrale B_akterienprotease, beschrieben von McConn et al in J. Biol. Chem. Seite 3706 (1964) 62.5ΟΟ HE
5IO.OOO GVE (pH 7,0)

PLE
298.ΟΟΟ GVE (pH 4,7)

Pectinolytisch; O ABE
unter 30 CE

Diastatisch: 2.9OO BAE

Neutrale und alkalische A. oryzae-Proteasen. Venig der Säureprotease. Siehe Bergkvist, Acta. Chem. Scand. JJ, Seite 1521 (1963). Liefert starke Hydrolyse, doch gemessen nach freigesetztem Aminostickstoff, die Hydrolyse zu den einzelnen Aminosäuren ist bei weitem nicht vollständig.

194.OOO HE

PLE
3O9.OOO GVE (pH 4,7)

Pectinolytisch t 110 ABE
140 CE

Diastatisch: 460 BAE
613 SKB

Lipolytischt 4,2 GSA (pH 6,0)

Tabelle I (Fortsetz.)

Zusammensetzung Enzymatisch« Hauptaktivität Gemessene proteolytische
Aktivität

Gemessene andere Aktivität

gewonnen aus A. oryzae

Große Menge der A. oryzae-Säureprotease sowie neutrale und alkalische Protease. Siehe Bergkvist, wie oben. 3O5.OOO HE

275.OOO GVE (pH 7,0)

PLE
167.000 GVE (pH k,7)

Pectinolytischt 0 ABE
123 CE

Diastatisch:

155
183

BAE
SEB

O O CO CO CO

C Carbohydrase. Hydrolysiert gewonnen aus A. Saccharid, das CC-1,6-niger und/oder /Ö-1,2-Bindung

enthält. Siehe USA Patentanmeldung Serial No. 725 497 vom 30. April 1968. unter 5 PLE

53O Carbohydrase-Einheiten

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Beispiel 1

10 g Kanrich-Sojabohnen Nr. 1 mit einem Gehalt von 38,0$ Protein, 16,73$ Öl und 6,4$ Feuchtigkeit wurden zu Teilchen von 20 Maschen vermählen und dann zu 50 ml Wasser zugegeben, in einem Autoklaven 5 Minuten auf 121° C erhitzt und sodann gekühlt. Nunmehr wurden weitere 50 ml Wasser zusammen mit einer Enzymzusammensetzung zugegeben, die proteolytische und Carbohydrase-Aktivitat enthielt. Der Schlamm wurde 8 Stunden bei 50 C und einem Umgebungs-pH von 6,3 inkubiert und dann durch ein 100-Maschen-Sieb filtriert. Der faserartige Rückstand (i) auf dem Sieb wurde mit Wasser gewaschen, bis die aufgefangene Lösung 100 ml betrug, dann wurde der Rückstand (i) in einem Ofen bei 50 C getrocknet.

Die Lösung wurde dann mit 10.000 Umdrehungen je Minute eine Minute lang zentrifugiert, und das Zentrifuget wurde decantiert. Der Rückstand wurde mit 10 ml Wasser gewaschen und erneut zentrifugiert. Der gewaschene Rückstand (2) wurde in einem Exnikkator getrocknet.

Das decantierte Zentrlfugat enthielt öl, das durch Filtration unter der Schwerkraft durch ein Whatman-Papier Nr. 1 gewonnen wurde· Nach dem Trocknen wurde das Papier erschöpfend mit Petroläther extrahiert. Das in dem Papier bleibende Protein (3) wurde bestimmt. Der Petroläther wurde dann verdampft und ließ ein öl zurück, dessen Gewicht bestimmt wurde. Man fand, daß 38$ de· öl·· unter Verwendung «In·· Gemisches der Enzymzusammensetzungen B und C extrahiert wurden und dasei

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50,3$ unter Verwendung d©r entsprechenden Gewichtsmengen der Enzymzusammensetzungen P und C extrahiert wurden.

Das FiItrat (h) wurde dann angesäuert (pH 4,5)» um irgendwelches zurückgebliebenes ISP auszufällen, doch wurde keine Ausfällung erhalten. Das Filtrat wurde dann mit einem gleichen Volumen 10biger Trichloressigääiare-von k° C vereinigt, und es trat kein sichtbarer Niederschlag auf.

Die Proteinmenge der verschiedenen Fraktionen wurde durch Kjeldahl-Stickstoffanalyse unter Verwendung eines Umrechnungsfaktors von 6,25 bestimmt, wie in Tabelle II gezeigt ist.

Tabelle II Gesamter Feststoff- und Proteingehalt verschiedener Fraktionen

O O CO OO OO

CD

Enzymzu s amnen set zung (siehe Tabelle i)	B (100 mg) -f	• C (15 mg)	P (100 mg) η	• C (15 mg)
	Gewicht	Proteinge halt	Gewicht	Proteinge halt
Faserartiger Rück stand auf dem Sieb (i)	2,^0 g	0,500 g	2,60 g	0,536 g
Zentrifugat (2)	1,50 g	0,563g	0,922 g	0,236 g
Filterpapierrück stand (3)	0,082 g	0,082 g	0,075 g	0,075 g
Filtrat /"Feststoffe/ (²O	^,93 g	2,400 g	5,27 g	2,590 g
	8,91 g	3,5^5 _g	8,87 g	3,^37 g

to

VyJ

CD NJ CD

Beispiel 2

10 g der Sojabohnen des Beispiels 1 wurden zu Teilchen von 20 Maschen vermählen und dann zu 100 ml Wasser zugesetzt, in einem Autoklaven 15 Minuten auf 121 C erhitzt und sodann gekühlt. Ein Gemisch der Enzyme B und P wurde zugesetzt, und der Schlamm wurde zwei Stunden bei kO C und einem pH-Wert von 6,5 inkubiert und sodann durch ein 100-Maschen-Sieb filtriert und der Rückstand auf dem Sieb wurde mit Wasser gewaschen, bis 100 ml Piltrat (a) aufgefangen waren.

Das FiItrat wurde dann zentrifugiert, und das Zentrifugat wurde durch Whatman-Papier Nr. 1 filtriert, um die Ölphase zu entfernen. Das Filtrat wurde dann auf pH k_t5 augesäuert und so ein Niederschlag (b) gebildet.

Die Proteinmenge in den verschiedenen Fraktionen wurde wie in Beispiel 1 bestimmt und ist in Tabelle XII zusammengestellt. Obwohl 0,28 g mehr Protein aus den Bohnen extrahiert wurden, wenn das Enzymgemisch verwendet wurde, ist ersichtlich, daß nur 0,836 g ISP im Vergleich mit 2,72 g ISP ohne Enzymverwendung gebildet wurden. Daraus ist zu folgern, daß eine wesentlich größere Menge des extrahierten Proteins zu SPH löslich gemacht wurde, wenn die Enzymzusammensetzung verwendet wurde.

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Tabelle III Prozente extrahiertes Protein und gebildetes ISP

O (O

Ott

o>

Ensyazusaamensetzung (siehe Tabelle i)	(b)	B (100 mg) + P	(100 mg)	S	Kontröllprobe (kein Enzym)
Proteingehalt des FiItrats (a)	3,30	e	3,02 g
	86,9*		79,5#
Fraktion des aus den Bohnen in das FiItrat extrahierten Proteins (a)	1,79	S	5,^6 g
Niederschlag bei pH 4,5 (b)	0,836	2,72 g
Proteingehalt des Niederschlags Z-ISPZT

to

TO CD GO·

CD:

-26- 203249Ό

Beispiel 3

In diesem Beispiel wurde Molino-Sojamehl der El Molino Mills, Alhambra, Californien, verwendet. Dieses Produkt ist ein leicht geröstetes, vollfettes Sojamehl mit einer Teilchengröße von etwa 40 Maschen, das aus geschälten Hill- oder Lee-Sojabohnen gewonnen wurde.

10 g des Sojamehls mit einem Proteingehalt von 44,1$ wurden zu 100 ml Wasser zugesetzt. Das Gemisch wurde in einem Autoklaven 15 Minuten auf 121° C erhitzt und dann auf 40° C abgekühlt. Eine Enzymzusammensetzung mit einer Aktivität von 216 PLE wurde zu dem Gemisch zugegeben, das dann bei 40 C und einem pH-Wert von 6,4 zwei Stunden unter Rühren in einem Kreiseldrehkolben mit 275 Umdrehungen je Minute inkubiert wurde.

Nach der Inkubation wurde das Gemisch durch ein 100-Maschen-Sieb filtriert, wodurch der feste Rückstand entfernt wurde. In diesem Falle enthielten die Feststoffe, wenn überhaupt, nicht viel faserartiges Schalenmaterial, da Mehl aus geschälten Bohnen verwendet wurde. Durch Waschen des Rücketandes mit Wasser wurde das Filtratvolumen auf 100 ml gebracht. Das FiItrat wurde dann bei 8»000 Umdrehungen je Minut© zur Entfernung feiner Teilchen zentrifugiert.

Der gesamt© Proteingehalt des Zeiatrifugats (a) wurde durch S tickst off analyse naeh Kjeldahil bestimmt» Der Ü«#QndiungiS-

war 6,25· Die zweite Zeile der Tabelle IV zeigt diese Werte als Prozentsätze des ursprünglich in dem Sojamehl enthaltenen Proteins, d. h. 4,41 g.

Das Zentrifugat wurde dann auf einen pH-Wert von etwa 4,5 angesäuert, und das isoelektrische Protein wurde durch Filtration entfernt. Das restliche proteinhaltige Material, d. h. SPH, bestimmt nach der Methode von Kjeldahl, ist in der dritten Zeile der Tabelle IV aufgezeichnet. Die letzte Zelle der Tabelle IV zeigt den Prozentsatz des gesamten extrahierten Proteins, repräsentiert durch das Hydrolysat.

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Tabelle IV

co 00 OO NJ

Extraktion und Hydrolyse von Protein aus Sojamehl durch Enzymzusammensetzungen mit

äquivalenten proteolytischen Aktiv!tätsverten ,

Enzymzusammensejtzung (siehe Tabelle i)	B (288 mg)	P (328 mg)	H (473 mg)	Kontrollprobe (kein Enzym)
Proteingehalt des Zentrifugats (a)	3,66 g	3,38 g	3,7^ g	2,85 g
Fraktion aus dem Sojamehl in das Zentrifugat (a) ex trahierten Proteins	83,0%	77,0%	85,0%	64,5%
So j apro teinhydroly- sat (SPH)	3,08 g	3,22 g	3,57 g	0,312 g
JA. Fraktion des extra hierten Proteins, er halten als SPH	84,2%	95,0%	95, ^%	11,0%

00

O CO

ro

CQ CD

Aus den Werten der Tabelle IV ist ersichtlich, daß ein grösserer Anteil des ursprünglich vorhandenen Proteins unter Verwendung des vorliegenden enzymatisehen Verfahrens extrahiert wird und daß das meiste (84 - 95%) des unter Verwendung von Enzymjex tränier ten Proteins in der Form von SPH vorliegt, während nur 11% des unter den gleichen Bedingungen aber ohne Enzym extrahierten Proteins SPH sind. Es kann weiterhin festgestellt werden, daß man variierende Ergebnisse erzielt, selbst wenn die proteolytische Aktivität jeder Zusammensetzung 216 PLE betrug. Daraus ist zu schließen, daß man die relativen Mengen an gewonnenem SPH im Vergleich mit ISP durch Variieren der Natur der verwendeten Enzymzusammensetzung variieren kann, selbst wenn die verwendete gemessene Aktivität konstant gehalten wird.

Beispiel k

10 g Kanrlch-Sojabohnen Nr. 1 wurden auf 20 Maschen vermählen, zu 100 ml Wasser zugesetzt und 20 Minuten auf der Vorbehandlungstemperatur gehalten, gekühlt und dann unter Rühren in einem Kegeldrehkolben mit 275 Umdrehungen je Minute zwei Stunden bei kO° C inkubiert. Der Schlamm wurde dann durch ein 100-Maschen-Sieb filtriert, und der Rücketand wurde mit Wasser gewaschen, bis man 100 ml Flüssigkeit (a) erhalten hatte. Die Flüssigkeit wurde mit Milchsäure auf einen pH-Wert von k_t5 angesäuert, und durch Zentrifugieren wurde ISP gewonnen. Da· SPH enthaltende Zentrifugal und die Flüssigkeit (a) wurden auf Proteinetick·toff nach der Methode von Kjeldahl analysiert. Die Ergebnisse, auegedrückt als Fraktion de· extrahierten Protein· und Fraktion de· ale SPH ex-

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trahierten Proteins sind in Tabelle V zusammengestellt.

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Tabelle V Wirkung des Vorerhitzens auf die enzymatische Extratkion aus Sojabohnen

O O CO OO OO

Vorbehandlungs temperatur	Raumtemperatur	Kontroll probe (keine)	50° C	B (100 mg)	Kontroll probe (keine)	9C	B (100 mg)	Kontrο11 probe (keine)
EnzymsBu s ammen s β t - zung (siehe Tabelle i)	B (100 rag)	60,5%	62,7%	59,0%	66,6%	58,05t
Fraktion des aus den Bohnen in die Flüssigkeit (a) extrahierten Pro teins	62,7%	10,5%	26,2%	10,5%	^9,5%	6,6%
Fraktion des als SPH extrahierten Proteins	28,2%

Vorbehandlungstemperatur

121° C

Enzymzusammensetzung B (siehe Tabelle i) (IOO mg)	Kontrollprobe (keine)
Fraktion des aus den Bohnen in die Flüssig- _,. _o-^ keit (a) extrahierten ' * Proteins	68,2%
Fraktion des als SPH 6^ 2fL extrahierten Proteins '	17,4*

CO

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Beispiel 5

10 g drüsenloser Baumvollsamen mit einem Gehalt von 37»' Protein wurdeiyku Teilchen von 10 Maschen vermählen. 50 ml Wasser wurden zu diesen gemahlenen Baumwolleamen zugegeben, und der Schlamm wurde 10 Minuten auf der Vorbehandlungstemperatur gehalten. 50 ml Wasser und die Enzymzusammensetzung wurden dann zu dem Schlamm zugesetzt, der zwei Stunden bei kO C in einem Kreiseldrehkolben mit 275 Umdrehungen je Minute inkubiert wurde. Der Schlamm wurde dann durch ein 100-Maschen-Sieb filtriert, und der Rückstand wurde mit Wasser gewaschen, bis die Filtratmenge 100 ml betrug. Das Filtrat (a) wurde nach der Methode von Kjeldahl bezüglich Stickstoff analysiert.

Das Filtrat (a) wurde dann bei 10.000 Umdrehungen je Minute während einer Minute zentrifugiert, und das Zentrifugat (b) wurde bezüglich Stickstoff, analysiert. Die Ergebnisse, ausgedrückt als Proteingehalt, sind in Tabelle VI aufgezeigt.

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ο O CO OO CO ro

σ> m CD

Tabelle VI

Extraktion von Protein aus Baumwollsamen

Vorbehandlungs temperatur	Raumtemperatur	B 100 mg)	P (100 mg)	Kontroll probe (keine)	121° C	B (100 mg)	P (100 mg)	Kontroll probe (keine)
Enzymzu s aminen set- zung (siehe Tabelle I)	2,26 g	2,25 g	2,13 g	2,90 g	2,63 g	1,12 g
Proteingehalt des Filtrate (a)	59,7%	59,5%	56,4%	76,6%	69,6%	29,5%
Fraktion des aus den Baumwollsamen in das Filtrat (a) extrahierten Pro teins	1,31 g	1,31 g	0,976 g	2,43 g	1,98 g	0,863 g
Proteingehalt des Zentrifugats (b)	S α 3^,7%	34,7%	25,8%	64,3%	52,4%	22,8%
Anteil des Protein des Filtrats (a) i] dem Zentrifugat (b

\j3

ro

CD 00

CD CD

Aus Tabelle VI ist klar ersichtlich, daß man nach der Methode der vorliegenden Erfindung eine wirksamere Trennung von Protein in löslicher Form aus Baumwollsamen erhält.

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Fraktionierung ölhaltiger Samen, dadurch gekennzeichnet, daß man die zerkleinerten ölhaltigen Samen auf eine Temperatur von wenigstens etwa dem Siedepunkt von Wasser erhitzt, einen Schlamm dieser zerkleinerten Ölsamen und einer Enzymzusammensetzung mit proteolytischer Enzymaktivität bei einer Temperatur und einem pH-Wert, bei denen Proteolyse erfolgt, bei denen aber die Enzymaktivität nicht entaktiviert wird, inkubiert, und den festen Rückstand von dem flüssigen Anteil des Inkubationsgemisches abtrennt, wobei das flüssige Produkt einen wesentlichen Anteil des Proteingehalts der ölhaltigen Samen enthält.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die zerkleinerten ölhaltigen Samen auf eine Temperatur zwischen etwa 90 und ikO^Q C erhitzt.

3· Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Inkubation des Schlammes bei einer Temperatur zwischen etwa 25 und 75 P und bei einem pH-Wert zwischen etwa 5 und 9_f5 durchführt.

h. Verfahren nach Anspruch 1_t dadurch gekennzeichnet, daß man als Enzymzusammensetzung ein proteolytisch.es Enzym von Pilz- oder Bakterienursprung oder Gemische hiervon verwendet.

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5. Verfahren nach Anspruch. h_t dadurch gekennzeichnet, daß man als proteolytisches Enzym von Pilzursprung ein solches von Aspergillus und von Bakterienursprung ein solches von Bacillus verwendet.

6. Verfahren nach Anspruch k_t dadurch gekennzeichnet, daß man eine Enzymzusammensetzung verwendet, die außerdem
eine Carbohydrase, Lipase oder Cellulase umfaßt«

7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem wenigstens einen Teil der Ölphase von dem Rest des flüssigen Produktes abtrennt und so ein hohes Ölsamenöl und ein proteinhalt!ges_f in der Hauptsache wässriges flüssiges Gemisch gewinnt.

8. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als ölhaltige Samen Sojabohnen verwendet.

9· Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man auf eine Teilchengröße zwischen etwa 10 und 100
Maschen zerkleinerte Sojabohnen verwendet.

10. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem wenigstens einen Teil der Ölphase von dem Rest des flüssigen Produktes abtrennt und so rohes So jabohnenöl und ein proteinhaltiges, in der Hauptsache aus wässriger Flüssigkeit bestehendes Gemisch gewinnt.

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11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß man die Ölphase von der wässrigen Phase des flüssigen Produktes unter Gewinnung von rohem Sojabohnenöl und einer proteinhaltigen wässrigen Phase abtrennt.

12. Verfahren nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem den pH-Wert der wässrigen Phase bis zu dem isoelektrischen Punkt des darin enthaltenen Proteins einstellt und den isoelektrischen Niederschlag von der restlichen Lösung abtrennt. .

13. Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß man außerdem die restliche Lösung unter Gewinnung von Sojaproteinhydrolysat trocknet.

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