Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzaniu zeaksantyny na drodze hodowli drobnoustroju z ro¬ dzaju FUuobacter, produkujacego ten pigment.Bardziej szczególowo drobnoustrój hoduje sie na podlozu, zawierajacym przynajmniej jeden weglo¬ wodan, jako zródlo przyswajalnego wegla, przynaj¬ mniej jedno zródlo przyswajalnego azotu aminowe¬ go, zawierajace wolne aminokwasy, oraz sole mi¬ neralne, oligoelemcnty i witaminy.Zólty pigment, znany jako zeaksantyna lub 3,3'- -dwiihydroksy-fJ-karoten, mozna wykorzystac np. jako dodatek do pasz dla drobiu, w celu wzmocnie¬ nia zóltego zabarwienia skóry tych zwierzat albo zintensyfikowania barwy zóltek ich jaj. Zwiazek jest takze uzyteczny jako barwnik, np. w przemy¬ sle kosmetycznym i spozywczym.Synteza pigmentów przez niektóre drobnoustroje, a zwlaszcza synteza pigmentów karotenoidowych przez bakterie z rodzaju Flavobacter, jest zjawis¬ kiem znanym. Wykorzystanie biosyntezy do wytwa¬ rzania tego rodzaju pigmentów na skale przemyslo¬ wa okazalo sie jednak zadaniem trudnym, z uwagi na ich niska zawartosc. Uzyskiwane wydajnosci stwarzaja koniecznosc stosowania bardzo wielkich objetosci podlozy hodowlanych, jesli ma sie otrzy¬ mac wieksze ilosci pigmentu.Wiadomo równiez, ze do podloza mozna dodac sole mineralne, oligoclementy i witaminy, jak rów¬ niez inne substancje, wzmagajace wzrost drobno¬ ustrojów i wytwarzanie produktów ich metaboliz- mu. Jednakze od czasu zainteresowanie sie wy- twaizaniem zeaksantyny, nawet uzycie najbogat¬ szych podlozy hodowlanych nie dawalo wyników, które uzasadnialyby zastosowanie tych podlozy do otrzymywania zeaksantyny na skale przemyslowa.Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania zeaksantyny na drodze biosyntezy, umozliwiajacy uzyskanie znacznych wydajnosci tego pigmentu bez szczególnego wzrostu kosztów procesu.Sposób wytwarzania zeaksantyny wedlug wyna¬ lazku, poprzez hodowle drobnoustroju z rodzaju Fkwcbacter, wytwarzajacego ten pigment, w sro¬ dowisku odzywczym, zawierajacym przynajmniej jeden weglowodan, jako zródlo przyswajalnego we¬ gla, przynajmniej jedno zródlo przyswajalnego^azo¬ tu aminowego, zawierajace wolne aminokwasy, oraz sole rftineralne, oligoelementy i witaminy polega na tym, ze sklad medium modyfikuje sie przez dodawanie 0,1 — 1 ug/ml korzystnie 0,1 — 0,3 ug/ml pirydoksyny oraz co najmniej jednego z dwuwar¬ tosciowych jonów metalu, takiego jak Fe++, Col f, Mot+ i Mn-,l w ilosci 0,001 — 0,1 mola lub przez dodanie 0,1 — 1 ug/ml pirydoksyny, co najmniej jednego dwuwartosciowego jonu metalu, takiego jak Fe**, Co'*, Mof+ i Mn,l w ilosci 0,001 —0,1 mola oraz co najmniej jednego zawierajacego siar¬ ke aminokwasu, takiego jak metionina, cystyna lub cysteina w ilosci 100 — 200 ug/ml.Sposób wedlug wynalazku umozliwia uzyskanie wyzszych wydajnosci pigmentu, w stosunku do wy- 9331)7...'¦• 3 dajncsci, uzyskiwanych w procesach konwencjonal¬ nych. Wzrost wydajnosci, uzyskiwanych w sposo¬ bie wedlug wynalazku, w stosunku do wydajnosci w procesach konwencjonalnych, moze wyniesc na¬ wet 200%. -Wzrost wydajnosci wplywa oczywiscie na znaczne zmniejszenie kosztów produkcji.W sposobie wedlug wynalazku zródlem przyswa¬ jalnego wegla moze byc glukoza lub sacharoza w ilosci 0,1 — 15% wagowych podloza hodowlanego, natomiast zródlem przyswajalnego azotu aminowe¬ go moze byc wyciag drozdzowy i/lub namok kuku¬ rydziany i/lub hydrolizat bialkowy, w ilosci 0,1 — 8% wagowych podloza. Do podloza mozna takze do¬ dac siarczan magnezowy w ilosci 0,1 — 2% wago¬ wych. Wszystkie wyzej wymienione substancje roz¬ ciencza sie np. wedi\ wodociagowa, do zrównowaze¬ nia bilansu do 100%.Z kolei tak przygotowany roztwór odzywczy za¬ szczepia sie drobnoustrojem z rodzaju Flavobacter, wytwarzajacym zeaksantyne. W sposobie wedlug wynalazku drobnoustrój z rodzaju Flavobacter jest drobnoustrojem, wyselekcjonowanym z bakterii te¬ go rodzaju oraz mutantów takich drobnoustrojów.Proces fermentacji mozna prowadzic z mieszaniem i napowietrzeniem, przy odpowiednich wartosciach pH i temperaturach oraz przez okresy czasu, nie¬ zbedne do wytworzenia znacznej ilosci ze&ksanty- ny wewnatrz komórek drobnoustroju. Z t olei, po ewentualnym zatezeniu, brzeczke hodowlana mozna wysuszyc. Zeaksantyne mozna wyekstrahowac i ko¬ mórek przy pomocy polarnego rozpuszczalnika or¬ ganicznego, takiego jak aceton i alkohol et;;Iowy, albo rozpuszczalnika, zawierajacego chlor, takiego jak chloroform.Po oddzieleniu od podloza hodowlanego przez odwirowanie, dekantacje lub filtracje, biomase mozna wykorzystac takze bezposrednio jako doda¬ tek do paszy dla drobiu.Zaobserwowano okolo 10% wzrost stezenia ze¬ aksantyny w tak wytworzonej biomasie, oraz 20% wzrost samej biomasy, co odpowiada okolo 30% wzrostowi wydajnosci zeaksantyny w stosunku do wydajnosci, uzyskanej w hodowli tego samego drobnoustroju na konwencjonalnym podlozu od¬ zywczym., Nizej przeanalizowano poszczególne dodatki po¬ zywki o zmodyfikowanym skladzie, stosowanej w sposobsr wedlug wynalazku.W przypadku nadmiernej zawartosci pirydoksy- ny w podlozu obserwuje sie efekt, hamujacy wzrost. CJczywiste Jest jednak, ze nikt nie doda nie¬ uzasadnionej ilosci pirydoksyny, lecz poprzestanie na ilosci '^efektywnej, takiej jak np. jakakolwiek ilosc w podanych wyzej zalecanych granicach.Warto til nadmienic, ze podobne zjawisko stymu¬ lacji wytwarzania zeaksantyny przez drobnoustrój z rodzaju Flavobacter obserwowano takze w przy¬ padku dodania do wyjsciowego roztworu odzyw¬ czego przynajmniej jednego z dwuwartosciowych jonów metali, takich jak Fe++, Co+\ Mnlt, i Md^4, przynajmniej jednego z aminokwasów za¬ wierajacych siarke, takich jak metionina, cystyna i cysteina, albo wreszcie przynajmniej jednego z wyzej wymienionych jonów metali i przynajmniej jednego z wyzej wymienionych aminokwasów, za- 4 wierajacych siarke. Zjawisko to przejawia sie we wzroscie wydajnosci zeaksantyny rzedu 150% w stosunku do wydajnosci, uzyskiwanej przy hodowli tego samego drobnoustroju na konwencjonalnym » podlozu odzywczym.W jednej z realizacji sposobu wedlug wynalazku sklad podloza ^modyfikuje sie przez dodanie przy¬ najmniej jednego z dwuwartosciowych jonów me¬ tali, takich jak Fe<+, Co^, Mn^ i Mo"* \ przy czym w celu unikniecia efektu hamujacego rozwój, ilosc wyzej wymienionych dodanych jonów metali, tj. ilosc przynajmniej jednego z jonów dodanych do podloza, takich jak Fe4\ Co++, Mn• ' i Mo*\ ogranicza sie do poziomu, nie przekraczajacego is 0.2M, Wyzej wymienione jony metali korzystnie jest dodac w ilosci 0,0005—0,1M, a zwlaszcza w ilos¬ ci 0,001—0,05M. Jony te mozna dodac w postaci rozpuszczalnych- soli, takich jak np. siarczan lub chlorek zelazawy, chlorek kobaltu, molibdenian sc- dowy lub siarczan manganu.W jednej z odmian tej realizacji sklad podloza modyfikuje-sie dalej przez dedanie przynajmniej jednego aminokwasu, zawierajacego siarke, takiego jak metionina, cystyna i cysteina, przy czym w ce- as lu unikniecia efektu hamujacego, ilosc wyzej wy¬ mienionego dodanego aminokwasu, zawierajacego siarke, tj. ilosc metiortiny i/lub cystyny i/lub cyste¬ iny, dodanej do medium, ogranicza sie do wartosci, nie przekraczajacej 1 mg/ml. Wyzej wymieniony, aminokwas, zawierajacy siarke mozna dodac do podloza w ilosci 50 — 500 ug/ml, a szczególnie ko¬ rzystnie w ilosci 100 — 200 ug/ml. Korzystnie doda¬ je sie jon melalu, taki jak Fe* \ oraz aminokwas, taki jak metionina.Ustalono, ze pobudzenie wytwarzania zeaksanty¬ ny przez dodanie pirydoksyny do kultury drobno¬ ustroju z rodzaju Flavobacterjest znacznie wieksze w przypadku, gdy do podloza doda sie równiez wy¬ zej wymienione stymulanty. Obydwa efekty sly- 40 mulacyjne kumuluja sie i przejawiaja we wzroscie wydajnosci zeaksantyny okolo 200% w stosunku do wydajnosci, uzyskanej przy hodowli tego same¬ go drobnoustroju na podlozu konwencjonalnym.Udzial wzrostu wydajnosci, który jest skutkiem 45 wzrostu stezenia zeaksantyny w biomasie, przewa¬ za nad udzialem wydajnosci wskutek przyrotu sa¬ mej biomasy, który jest zaledwie rzedu 10%.Sposób wedlug wynalazku ilustruje sie nastepu¬ jacymi przykladami. 50 Przyklad I. Przygotowuje sie podloze hodo¬ wlane o nastepujacym skladzie: Glukoza 3% Hydrolizat kazeiny (trypton) 1% Wyciag drozdzowy 1% 55 Siarczan magnezowy 0,5% Woda wodociagowa do zrównowazenia do 100% Takie podloze rozlewa sie do flaszek, sterylizuje przez 20 minut w temperaturze 120°C, a nastepnie chlodzi do 25°C. Wartosc pH podloza po stery liza¬ no cji wynosi 7,3. Z kolei podloze zaszczepia sie przez wprowadzenie mutanta, rasy ATCC nr 21588 z ro¬ dzaju Flavobacter, uzyskanego w sposób podany w opisie patentowym RFN nr 2252364. Hodowle tego drobnoustroju na wymienionym podlozu pro- tó wadzi sie przez 48 godzin w temperaturze 25°C,5 33397 6 przy-czym podloze ciagle sie napowietrza przez wstrzasanie flaszek na wstrzasarkaeh obrotowych, wirujacych z predkoscia 200 obrotów/minute. Z ko¬ lei biomasa oddziela sie przez odwirowanie, uzys¬ kujac 10.3 g suchego materialu na 1 litr brzeczki ¦fermentacyjnej.Ilosc zeaksantyny, zawartej w komórkach, ozna¬ cza sie przez wyekstrahowanie pigmentu, a na¬ si epnie zmierzenie gestosci optycznej wyciagu. W celu uzyskania wyciagu przygotowuje sie zawiesi¬ ne komórek w 5 ml roztworu chlorku sodowego, do której dodaje sie taka sama objetosc acetonu.Po kilkuminutowym wstrzasaniu mieszanine fil¬ truje .sie. Gestosc optyczna przesaczu mierzy sie w spektrofotometrze przy dlugosci fali 450 nm.Ilosc zeaksantyny oznacza sie przez porównanie zmierzonej gestosci optycznej z krzywa wzorcowa, uzyskana przez pomiar gestosci optycznej szeregu roztworów, zawierajacych rózne ilcsci czystej zeak¬ santyny.W ten sam sposób przeprowadza sie ekstrakcje i pomiar gestosci optycznej szeregu próbek z tej samej hodowli, po czym oblicza sie srednia arytme¬ tyczna uzyskanych wyników liczbowych. Tak ozna¬ czona ilosc zeaksantyny, zawartej w komórkach, albo stezenie wlasciwe, wzrasta do 6,1 mg na 1 gram masy komórkowej, co odpowiada wydajnoscj zeaksantyny, równej 62,4 ug na 1 ml brzeczki. Do¬ kladnosc tych wyników wynosi 3—5%.Nastepujace dalej przyklady podane sa w postaci tabeli. Substancje dodana do podloza, jak równiez jej ilosc, mozna znalezc w kolumnie, zatytulowanej „sposób postepowania**. Ilosc ta wyrazona jest w ug pirydoksyny i/lub omawianego aminokwasu na 1 litr podloza, a w przypadku jonów, jako, ich steze¬ nie molowe w podlozu. Kolumna, zatytulowana ,.zeaksantyna", pokazuje ilosc uzyskanej zeaksanty¬ ny w ug na 1 ml brzeczki. Kolumna zatytulowana „masa komórkowa" podaje ilosc suchego materialu w gramach, uzyskanego z 1 litra brzeczki. Wreszcie kolumna, zatytulowana „stezenie wlasciwe',, poda¬ je ilosc zeaksantyny, zawartej w wytworzonych komórkach, w mg na 1 gram suchego materialu.W kazdym przypadku operacje przeprowadza sie w sposób, opisany w przykladzie i. Operacje, w której do podloza dodaje sie pirydoksyne, przepro¬ wadza sie bezposrednio po sterylizacji. Operacje, w której do podloza dodaje sie omawiany dwuwar- tosciowy jon metalu i/lub aminokwas, przeprowadza sie bezposrednio przed zaszczepieniem lub przed sterylizacja. Wartosci liczbowe, dotyczace wydaj¬ nosci masy komórkowej i zeaksantyny, podane sa ? taka sama dokladnoscia, jak w przykladzie I, tj. z dokladnoscia ± 3—5d/o. Stanowia one srednie arytmetyczne z wyników, uzyskanych dla 3—6 pró¬ bek jednej i tej samej hodowli.W celu wykazania, ze wynik procesu nie zalezy od szczególnego skladu podloza lub od dzialania pojedynczego mutanta, w ostatnich przykladach zmieniono podloze wyjsciowe i stosowany typ ino- kulum. Tak wiec np. w przykladzie IX wyjsciowe* podloze zawiera 2% wyciagu drozdzowego i !•/• tryptonu, a w przykaldzie X — l°/o wyciagu i 2% tryptonu.Nr przy¬ kladu I II III IV V VI VII VIII IX X XI Tabeli Sposób postepowania dodatek (dodatki! brak pirydoksyna FeH < ilosci /«g ml | M 0.2 0,01 pirydoksyna | 0,2 Fe** 1 o,01 pirydoksyna j 0,2 j metionina | 120 Fe * l metionina pirydoksyna Fe+ + metionina _ pirydoksyna Fe+ + metionina pirydoksyna Fe+ + metionina pirydoksyna Fe+ + metionina pirydoksyna Fe+ + metionina 120 0,2 120 0,5 120 , 0,2 120 0,2 120 0.2 120 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 0,01 i 1 Zeaksan- ! tyna ' 1 /'gnfl ! 62,4 1 83,8 i 109.6 130,4 97.6 154.7 187.4 126 178,5 175.8 183,7 i Masa j komórkowa gl i • 10.3 | 12.7 ' 13.4 ! 11,6 1. 7.2 6,9 11,4 11,3 11.3 ,9 11,2 ¦ - Stezenie wlasciwe I mg;g 1 6,1 6.6 8,2 11,2 13,5 22,4 16,4 11,2 ,8 16,1 16,4 17 93397 8 Zastrz ezcnia patentowe 1. Sposób wytwarzania zeaksanlyny poprzez ho¬ dowle drobnoustroju z rodzaju Flayobacter, produ¬ kujacego zeaksantyne, w srodowisku odzywczym, zawierajacym co najmniej jeden weglowodan, wol¬ ne aminokwasy, sole mineralne, oligoelementy i wi¬ taminy, znamienny tym, ze stosuje sie srodowisko odzywcze o zawartosci 0,1 — 1 ug/ml pirydoksyny oraz co najmniej jednego z dwuwartosciowych jo¬ nów metalu, takiego jak Fe+\ Co++, Mo+ + i Mnl+, w ilosci 0,001 — 0,1 mola. 2. Sposób wedlug zastrz. 1, znamienny tym, ze pirydoksyne stosuje sie w ilosci 0,1 — 0,3 ug/ml. 3. Sposób wytwarzania zeaksantyny poprzez ho¬ dowle drobnoustroju z rodziny Flavobacter, produ¬ kujacego zeaksantyne, w srodowisku odzywczym, zawierajacym co najmniej jeden weglowodan, wol¬ ne aminokwasy, sole mineralne, oligoelementy i witaminy, znamienny lym, ze stosuje sie srodo¬ wisko odzywcze o zawartosci 0,1 — 1 ug/ml piry¬ doksyny, co najmniej jednego dwuwartosciowego jonu metalu, takiego jak Fe++, Co++, Mo'*, i Mn+4, w ilosci 0,001 — 0,1 mola oraz co najmniej jednego zawierajacego siarke aminokwasu, takiego jak metionina, cystyna lub cysteina, w ilosci 100 - 200 iig/ml. 4. Sposób wedlug zastrz. 3, znamienny lym, ze jeko jon metalu stosuje sie Fe++ , a jako amino¬ kwas metionine.Prac. Poligraf. UP PRL naklad 120+18 * PL PL