KR20020048929A - 카로티노이드 색소의 제조방법 - Google Patents

카로티노이드 색소의 제조방법 Download PDF

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Abstract

여러 종류의 카로티노이드 화합물의 미생물학적 제조방법에 있어서, 생산하는 카로티노이드 화합물의 생성비율을 변환하는 방법을 제공한다. 배양시의 배양액의 용존산소 농도를 억제하여 아스타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논 및 아도니루빈 등의 카로티노이드 화합물의 생성비율을 변환시킨다.

Description

카로티노이드 색소의 제조방법{Process for Producing Carotenoid Pigments}
카로티노이드 화합물은 천연 색소로, 사료첨가물, 식품첨가물, 의약품 등으로 유용하다. 아스타크산틴은 양식어인 연어, 송어, 참돔 등의 체색의 개선효과가 있는 사료첨가물로, 또한 안전한 천연 식품 첨가물로 산업상의 가치가 높다. 또한, 아도니크산틴은 공업적 제조방법이 확립되어 있어 아스타크산틴과 마찬가지로, 사료첨가물, 식품첨가물, 의약품 등으로서의 용도가 기대된다. 또한, β-카로틴,은 사료첨가물, 식품첨가물, 의약품 등으로 사용되고, 칸타크산틴은 식품 첨가물, 사료첨가물, 화장품 등으로 사용되며, 제아크산틴은 식품첨가물, 사료첨가물 등으로 사용되고 있다. 또한, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 아도니루빈 등도 사료첨가물, 식품첨가물 등으로의 사용이 기대된다.이들 카로티노이드 화합물의 제조방법으로는 화학합성법, 미생물에 의한 생산방법, 천연물로부터의 추출법 등이 알려져 있고, 이미 아스타크산틴, 칸타크산틴, β-카로틴에 대해서는 화학합성법으로 수득된 것이 시판되고 있다.
아스타크산틴은 참돔, 연어, 송어 등의 어류 및 새우, 게, 가재, 크릴새우 등의 갑각류 등에 존재하고 있고, 이들로부터 추출할 수 있다. 또한, 아스타크산틴을 생산하는 미생물의 예로서는 적색효모 파피아 로도자이머(Phaffia rhodozyma), 브레비박테리움(Brevibacterium)속에 속하는 세균(참조: Journal of General and Applied Microbiology, 15:127, 1969), 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서, 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰 (Agrobacterium aurantiacum)(참조: 특개평 7-184688호 공보), 녹조류의 헤마토코커스 플루비어리스(Haematococcus pluvialis)(참조: Phytochemistry, 20:2561, 1981)가 알려져 있다. 또한, 화학합성법에서는 β-카로틴의 변환에 의한 방법(참조: Pure Appl. Chem., 57:741, 1985) 및 C15포스포늄염에서 합성하는 방법(참조: Helv. Chim. Acta, 64:2436, 1981)이 알려져 있다.
칸타크산틴은 어떤 종의 버섯(참조: Botanical Gazette, 112:228-232, 1950), 어류 및 갑각류 등에 존재하고 있는 것이 알려져 있다(수산동물의 카로티노이드, 니혼스이산가쿠카이시, 1978). 또한, 칸타크산틴을 생산하는 미생물의 예로는 브레비박테리움속에 속하는 미생물(참조: Applied and Environmental Microbiology, 55(10):2505, 1989), 로도코커스속에 속하는 미생물(참조: 특개평2-138996호 공보), 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국 특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서), 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)(참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58:1842, 1994)이 알려져 있다. 또는 화학합성법에서는 β-카로틴의 변환에 의한 방법(참조: J. Amer. Chem. Soc., 78:1427, 1956) 및 신규한 3-옥소-C15포스포늄염에서 합성하는 방법(참조: Pure Appl. Chem., 51:875, 1979)이 알려져 있다.
아도니크산틴은 금붕어나 잉어 등의 어류에 존재하는 것으로 알려져 있으나, 화학합성법에 의한 제조는 어려울 것으로 생각되고, 공업적 제조방법은 알려져 있지 않다. 아도니크산틴을 생산하는 미생물의 예로는 플라보박테리움속 (Flavobacterium), 알칼리게네스속(Alcaligenes), 슈도모나스속(Pseudomonas), 알테로모나스속(Alteromonas), 히포모나스속(Hyphomonas) 및 카리오파논속 (Caryophanon)에 속하는 미생물(참조: 특개평 6-165684로 공보), 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서), 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)(참조: Biosci. Biotechnol. Biochem., 58:1842, 1994)이 알려져 있다.
β-카로틴의 제조방법으로는 β-이오논(ionone)으로부터의 합성(참조: Pure Appl. Chem., 63(1):45, 1979), 당근, 고구마 호박 등의 녹황색 채소로부터의 추출(텐넨챠큐쇼쿠료 핸드북, 코우린, 1979, 텐넨챠큐쇼쿠료 헨슈이인카이편)이 알려져 있다. β-카로틴을 생산하는 미생물의 예로는 두나리엘라(Dunaliella)속 조류, 브랙슬리아(Blakeslea)속의 균류(참조: J. Appl. Bacteriol., 70:181, 1991), 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서), 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)(참조: FEMS Microbiology letters, 128:139, 1995)이 알려져 있다.
에키네논은 가시불가사리 등의 불가사리류, 참돔 등의 어류의 내장, 성게, 바다가재 등의 갑각류의 내장 등 천연물로부터 추출되고 있다. 또한, 에키네논을 생산하는 미생물의 예로는 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서), 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacterium aurantiacum)(참조: FEMS Microbiology Letters, 128:139, 1995)이 알려져 있다.
제아크산틴의 제조방법으로는 옥소이소보론의 부제환원으로 수득된 광학활성의 히드록시케톤을 원료로 이용하는 화학합성법(참조: Pure Appl. Chem. 63(1):45, 1991), 옥수수의 종자에서 추출하는 방법(생체색소, 1974, 아사쿠라쇼텐)이 알려져 있다. 제아크산틴을 생산하는 미생물의 예로는 플라보박테리움속 세균을 이용하는 방법(참조: Carotenoids in Microbial Technology, 2nd edn., Vol. 1:529-544, New York Academic Press), 새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서), 세균 아그로박테리움 오우란티아쿰(Agrobacteriumaurantiacum)(참조: FEMS Microbiology Letters 128:139, 1995)이 알려져 있다.
그러나, 전술한 화학합성법은 안전성이 확증되어 있지 않고, 미생물에 의한 생산에서는 생산성이 낮고 천연물에서의 추출에서는 비용이 너무 많이 드는 등의 문제점이 있었다. 예를 들면, 아스타크산틴의 제조에 있어서는 천연물의 크릴새우, 가재에서 추출하는 방법에 의한 제조에서는 함유량이 매우 적고, 추출이 어려워서 비용이 높다. 적색효모 파피아 로도자이머(Phaffia rhodozyma)는 증식속도가 느리고, 생산량이 적으며, 단단한 세포벽을 가지기 때문에 아스타크산틴의 추출이 어려운 등의 문제가 있기 때문에 공업화하기에는 문제점이 많다. 녹조류 헤마토코커스 플루비아리스(Haematococcus pluvialis)도 증식속도가 매우 느리고, 잡균오염이 일어나기 쉬우며, 추출이 어려운 등의 결점을 가지고 있기 때문에, 이 방법의 공업화에는 문제점이 많다.
새로운 속의 세균 E-396주(FERM BP-4283) 및 A-581-1주(FERM BP-4671)(참조: 특개평 7-79796호 공보, 특개평 8-9964호 공보, 미국특허 제 5,607,839호 명세서, 미국특허 제 5,858,761호 명세서)는 생산성이 높고, 증식속도가 빠르며, 추출이 용이한 등의 이점을 가지나, 이들은 여러가지의 카로티노이드 화합물 즉, 아스타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논 및 아도니루빈을 동시에 생성하기 때문에 이들의 생성비율이 배양할 때마다 변하여, 안정한 비율로 색소를 생성시키는 것이 어렵다. 이 때문에 생성된 색소혼합물을 동물 사료 등에서 색조개선제로 사용할 때의 색조효과가 불균일하게 되어 산업적 생산에 대한 장해가 되고 있다.
따라서, 일정한 비율의 카로티노이드 화합물을 안정하게 생산하는 제조방법이 추구되고 있다.
본 발명은 이러한 실상에 비추어 본 것으로, 그 목적은 카로티노이드 화합물의 생성비율을 억제함과 동시에, 그 특정 비율의 카로티노이드 화합물을 안정하게 생산하는 제조방법을 제공하는 것이다.
발명의 개시
본 발명의 발명자들은 상기 과제를 해결하기 위하여 여러가지로 검토한 결과, 카로티노이드를 생산하는 미생물의 배양에서 배양시의 배양액의 용존산소를 적당한 농도로 억제하여, 여러가지의 카로티노이드 화합물의 생성비율을 억제함과 동시에 그 특정 비율의 카로티노이드 화합물을 안정하게 생산할 수 있는 것을 발견하고, 본 발명에 도달하였다.
본 명세서는 본원의 우선권의 기초인 일본국 특허출원, 특원 2000-175124호의 명세서 및/또는 도면에 기재된 내용을 포함한다.
본 발명은 카로티노이드 화합물의 미생물학적 제조방법에 관한 것이다. 상세하게는 아스타크산틴(astaxanthin), 아도니크산틴(adonixanthin), β-카로틴(β-carotene), 에키네논(echinenone), 칸타크산틴(canthaxanthin), 제아크산틴 (zeaxanthin), β-크립토크산틴(β-cryptoxanthin), 3-히드록시에키네논(3-hydroxyechinenone), 아스테로이데논(asteroidenone), 아도니루빈(adonirubin) 등의 카로티노이드 화합물을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하에서는 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명의 방법에 있어서는 카로티노이드 화합물을 생산하는 미생물이 이용된다. 이러한 미생물로는 카로티노이드를 생산하는 세균, 효모, 균류 등을 예로 들 수 있다. 세균으로는 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 세균을 예로 들 수 있다. 구체적으로는 E-396주(FERM BP-4283), A-581-1주(FERM BP-4671) 또는 E-396주 또는 A-581-1주를 변이개량하여 수득될 수 있는 각종 변이주 및 이들 2주의 근접종을 예로 들 수 있다. 서열 번호 1의 DNA의 염기서열은 E-396주의 16S 리보좀 RNA에 대응하는 것이고, 서열번호 2의 DNA의 염기서열은 A-581-1주의 16S 리보좀 RNA에 대응하는 것이다.
종래의 운동성, 영양요구성, 당의 자화성 등에 기초한 분류에서 자연돌연변이에 의한 형질의 변화 때문에 잘 못 동정되는 경우도 있는 등의 문제점이 있기 때문에, 16S 리보좀 RNA의 염기서열의 상동성에 기초한 미생물의 분류가 근래 미생물의 분류의 방법의 주류가 되고 있다. 16S 리보좀 RNA의 염기서열의 상동성에 기초한 분류에서는 매우 유전적으로 안정한 16S 리보좀 RNA의 염기서열에 기초하기 때문에 신뢰도가 매우 높다. E-396주와 A-581-1주의 16S 리보좀 RNA의 염기서열의 상동성은 99.4%이고, 매우 근접한 주인 것으로 판명되었다. 따라서, 이들 균주는 카로티노이드를 생산하는 세균으로서 하나의 그룹을 형성하고 있다. E-396주, A-581-1 및 본 발명의 배양조건에 따라 효과를 발휘하는 균주는 E-396주 또는 A-581-1주의 변이주 및 근접종으로서의 E-396주의 16S 리보좀 RNA염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 미생물로 정의된다.
본 발명에 사용하는 구체적인 미생물로 예를 들 수 있는 E-396주에 대하여설명한다. 이 주는 본 발명의 발명자들이 새롭게 분리한 것으로, 독립행정법인 노교기쥬츠소고겐큐쇼 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 다이 6)에 평성 5년 4월 27일에 FERM BP-4238로 기탁되었다. 보다 구체적인 다른 미생물로는 A-581-1주(FERM BP-4671)를 예로 들 수 있다. 이 주는 본 발명의 발명자들이 새롭게 분리한 것으로 독립행정법인 노교기쥬츠소고겐큐쇼 특허생물기탁센터(일본국 이바라키켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반치 1츄오 다이 6)에 평성 6년 5월 20일에 FERM BP-4671로 기탁되었다.
본 발명의 배양방법은 예를 들면 다음과 같다. 즉, 생산균의 생육에 필요하고 카로티노이드 색소를 생성하는 성분을 포함하는 배지에서 배양한다.
배양방법은 통상의 호기배양 예를 들면, 통기교반배양, 기포탑 배양, 유동층배양 등의 어느 방법이라도 무방하나, 통기교반배양이 바람직하다. 예를 들면, E-396주(FERM BP-4283)는 카로티노이드 화합물로 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴, 아스타크산틴을 동시에 생성한다.
생합성은 β-카로틴을 상류로 하여 케토화 효소 및 수산화 효소에 의해 각각 양 말단의 6원환이 수식되어 최종적으로는 아스타크산틴이 생성된다고 추정되고 있다. 그러나, 배양시간을 길게 하여도 모두가 아스타크산틴으로 변환하는 것은 아니고, 이들의 화합물이 배양종료까지 존재하는 현상이 확인되어져 있다. 또한 이 생성비율은 배양마다 일정하지 않고, 생합성에서 상류로 생각되는 β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 아도니루빈, 3-히드록시에키네논의 생성비율이 높은 경우, 아스타크산틴의 생성비율이 높은 경우, 아도니크산틴의 생성비율이 높은 경우 등 여러가지이다.
이 때문에, 생성된 색소혼합물을 동물 사료 등에서 색조개선제로 사용하는 경우, 색조효과의 불균일이 생기고 상품으로 판매될 수 없기 때문에 상업적 생산에 장해가 되고 있다. 여기에서 많은 검토를 거듭한 결과, 생성색소의 생성비율에 영향을 받는 인자는 배양액 중의 용존산소인 것을 알아내었다. 교반회전 속도를 일정하게 한 배양에서는 배양액 중의 용존산소 농도가 미생물의 미묘한 산소소비속도의 차에 좌우되고 그 결과, 각각의 색소의 생성비율이 배양로트(culture lot)마다 불균일이 생기는 것으로 판명되었다. 이 문제를 해결하기 위하여 배양시의 배양액 중의 용존산소를 억제하는 것으로 생성되는 카로티노이드 화합물 즉 β-카로틴, 에키네논, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논, 칸타크산틴, 제아크산틴, 아도니루빈, 아도니크산틴, 아스타크산틴의 생성비율을 억제할 수 있다.
배양액 중의 용존산소 농도를 낮게 억제하면, 생합성에서 상류로 생각되는 β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논 및 아도니루빈의 생성비율을 높일 수 있고, 배양액 중의 용존산소 농도를 중간 정도로 억제하면, 아스타크산틴의 생성비율을 높일 수 있고, 또한, 배양액 중의 용존산소 농도를 높게 억제하여 아도니크산틴의 생성비율을 높일 수 있다.
예를 들면, 아스타크산틴의 생성비율을 높이기 위하여는 배양액 중의 용존산소 농도를 포화산소 농도의 15 내지 40%, 바람직하게는 20 내지 30%로 조절한다. 용존산소 농도가 포화산소 농도의 20 내지 30%의 조건하에서는 아스타크산틴 생성비율을 40% 이상 높일 수 있다. 용존산소 농도가 포화산소 농도의 0 내지 15%, 바람직하게는 0 내지 10%의 범위에서는 β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논 및 아도니루빈이 많이 축적되며, 아스타크산틴의 생성이 억제된다. 이 조건하에서는 β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논 및 아도니루빈의 생성량의 합계는 60% 이상으로, 아스타크산틴의 생성비율을 40% 이하로 할 수 있다.
또한, 아도니크산틴의 생성비율을 높이기 위해서는 배양액 중의 용존산소 농도를 포화산소 농도의 35 내지 100%, 바람직하게는 40 내지 100%로 조절한다. 이 조건으로 아도니크산틴의 생성비율을 35% 이상으로 할 수 있다.
또한, 배양 단계에 있어서는 대수증식기의 용존산소 농도가 중요하고, 예를 들면 이 시기에 용존산소 농도를 높이면, 그 후에 낮은 조건으로 바뀌어도 아도니크산틴의 생성비율은 높아진다.
용존산소 농도의 억제는 통상배양에서 이용될 수 있는 방법, 예를 들면, 용존산소전극으로 측정한 배양액 중의 용존산소 농도치에 따라 배양조 내에 공급하는 공기 또는 산소의 유량을 자동적으로 조절하는 방법 또는 용존산소 전극으로 측정한 배양액 중의 용존산소 농도치에 따라 교반 회전체의 회전속도를 자동적으로 조절하는 방법 등의 어느 방법이라도 이용할 수 있다.
이하에서는 실시예에 의해 본 발명을 보다 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
표 1의 조성의 배지 100ml을 500ml용량의 삼각플라스크에 넣고 121℃, 15분간 증기살균한다. 여기에 E-396주(FERM BP-4283)를 접종하고 28℃ 1일간, 150rpm으로 회전진탕배양하였다. 이어서, 이 배양액 600ml을 표 2의 조성의 배지가 20L 든 30L용량의 통기교반배양조에 접종하고, 28℃, 1.0vvm의 호기배양을 90시간 행하였다. 배양도중의 pH는 7.2로 20% NaOH로 연속적으로 억제하였다. 슈크로스는 생육과 동시에 소비되는 것으로 배양개시 1일째 및 2일째에 각각 300g씩 첨가하였다. 배양액 중의 용존산소는 용존산소 전극과 교반 회전체의 모터를 연동시켜, 용존산소의 값에 따라 회전속도를 변화시키는 방법으로 자동억제하였다. 또한, 최저회전속도는 80rpm으로 설정하였다.
용존산소 농도는 배양시의 산소의 포화농도의 비율로 각각 5, 15, 20, 25, 30, 35%로 설정하였다.
각 조건에서 생성된 카로티노이드(각 화합물의 기호를 표 3에 나타냄)의 생성농도와 비율은 표 4 및 표 5에 나타내었다.
표 1
조성 첨가량
콘스팁리커 30g/L
슈크로스 30g/L
KH2PO4 0.54g/L.
K2HPO4 2.78g/L.
MgSO4·7H2O 12.0g/L.
CaCl2·2H2O 0.1g/L.
FeSO4·7H2O 0.3g/L.
pH 7.2
표 2
조성 첨가량
콘스팁리커 30g/L
슈크로스 30g/L
KH2PO4 1.5g/L
Na2HPO4·12H2O 3.8g/L
MgSO4·7H2O 3.0g/L
CaCl2·2H2O 0.2g/L
FeSO4·7H2O 1.0g/L
pH 7.2
표 3
기호 화합물
ABCDEFGHIJ β-카로틴에키네논3-히드록시에키네논칸타크산틴아도니루빈β-크립토크산틴아스타크산틴아스테로이데논아도니크산틴제아크산틴
표 4
용존산소 농도% 색소생성농도(mg/L)
A B C D E F G H I J 합계
51520253035 5.02.93.53.82.61.6 1.62.12.21.40.90.4 0.50.30.20.20.10.1 3.33.72.01.70.80.7 4.07.53.84.31.71.6 0.00.00.00.00.00.0 2.88.611.614.69.88.5 0.10.20.20.30.20.2 0.41.83.55.75.17.9 0.10.10.10.10.10.1 17.827.227.232.121.321.1
표 5
용존산소 농도 % 전구체 G I
mg/L % mg/L % mg/L %
51520253035 14.616.812.111.86.44.7 826244373022 2.88.611.614.69.88.5 163243464640 0.41.83.55.75.17.9 2713182437
전구체: A+B+C+E+D+F
실시예 2
상기 표 1의 조성의 배지 100ml을 500ml용량의 삼각플라스크에 넣고 121℃, 15분간 증기살균하였다. 여기에 E-396주(FERM BP-4283)를 접종하고, 28℃ 1일간, 150rpm으로 회전진탕배양하였다. 이어서, 이 배양액 100ml을 상기 표 2의 조성의 배지가 2L든 5L용량의 통기교반배양조에 접종하고, 28℃, 1vvm의 호기배양을 90분간 행하였다. 배양도중의 pH는 20% NaOH를 이용하여 7.2로 연속적으로 억제하였다. 슈크로스는 생육과 동시에 소비되기 때문에 배양개시 1일째 및 2일째에 각각 30g씩 첨가하였다. 배양액 중의 용존산소는 용존산소 전극과 교반 회전체의 모터를 연동시키고, 용존산소값에 따라 회전속도를 변화시키는 방법으로 자동억제하였다. 또한, 최저 회전 속도는 100rpm으로 설정하였다. 용존산소 농도는 배양에 있어서 산소의 포화농도의 비율, 25%로 설정하였다.
비교를 위한 용존산소를 억제하지 않는 조건, 즉, 교반회전체 속도를 450rpm일정하게 한 조건에서의 배양도 행하였다.
각 조건에서 생성된 카로티노이드의 생성농도는 표 6에 나타내었다.
표 6
운전번호 용존산소억제 전구체 아스타크산틴 아도니크산틴 총색소
mg/L % mg/L % mg/L % mg/L %
12345 없음(450rpm)없음(450rpm)없음(450rpm)없음(450rpm)없음(450rpm) 16.513.86.510.612.5 6282294539 8.62.58.97.114.9 3215393047 1.80.55.26.14.6 73232614 26.816.822.623.832.0 100100100100100
678910 있음(25%)있음(25%)있음(25%)있음(25%)있음(25%) 11.512.810.913.29.9 2841404436 15.313.511.812.513.2 4943434247 4.44.84.54.34.7 1415171417 31.231.127.230.027.8 100100100100100
실시예 3
E-396주(FERM BP-4283)을 NTG(N-methyl-N'-nitro-N-nitrosoguanidine)으로 변이처리하고, 적색의 색조가 진한 콜로니를 선택하였다. 이들 주의 배양액 중의카로티노이드 화합물을 분석하고, 아스타크산틴의 생산성이 향상된 변이주 Y-1071주를 선택하였다. 표 1의 조성의 배지 100ml을 500ml용량의 삼각플라스크에 넣고 121℃, 15분간 증기살균하였다. 이에 Y-1071주를 접종하고, 1일간, 150rpm으로 회전진탕배양을 행하였다.
이어서, 이 배양액 100ml을 상기 표 2의 조성의 배지가 2L든 5L용량의 통기교반배양조에 접종하고, 28℃, 1.0vvm의 호기배양을 90시간 행하였다. 배양도중의 20% NaOH를 이용하여 pH는 7.2로 연속적으로 억제하였다. 슈크로스는 생육과 동시에 소비되기 때문에 배양개시 1일째 및 2일째에 각각 30g씩 추가하였다. 배양액 중의 용존효소는 용존효소 전극과 교반 회전체모터를 연동시키고, 용존효소값에 따라 회전속도를 변화시키는 방법으로 자동억제하였다. 또한, 최저 회전속도는 100rpm으로 설정하였다. 용존산소 농도는 배양시의 효소의 포화농도의 비율로 각각 5, 15, 20, 25, 30, 35%로 설정하였다.
각 조건에서 생성된 카로티노이드의 생성농도와 비율은 표 7 및 표 8에 나타내었다.
표 7
용존산소 농도% 색소생성농도 mg/L
A B C D E F G H I J 합계
51520253035 79.131.136.936.925.115.3 17.818.916.915.69.95.2 3.34.31.82.01.00.9 29.838.517.217.89.38.4 46.368.839.439.514.815.9 0.10.10.10.10.10.1 35.394.8122.8128.8102.690.9 0.71.92.52.62.11.8 5.26.832.635.551.380.4 0.80.51.81.31.10.9 218.4265.7272.0280.1217.3219.8
표 8
용존산소 농도% 전구체 G I
mg/L % mg/L % mg/L %
51520253035 177.9164.1116.6115.863.448.5 816243412922 35.394.8122.8128.8102.690.9 163645464741 5.26.832.635.551.380.4 2312132437
실시예 4
상기 표 1의 조성의 배지 100ml을 500ml용량의 삼각플라스크에 넣고 121℃, 15분간 증기살균하였다. 여기에 A-581-1주(FERM BP-4671)을 접종하고, 28℃, 1시간, 150rpm으로 회전진탕배양을 행하였다. 이어서 이 배양액 100ml을 상기 표 2의 조성의 배지가 2L든 5L용량의 통기교반배양조에 접종하고, 28℃, 1.0vvm의 호기배양을 90시간 행하였다. 배양도중의 20% NaOH를 이용하여 pH는 7.2로 연속적으로 억제하였다. 슈크로스는 생육과 동시에 소비되기 때문에 배양개시 1일째 및 2일째에 각각 30g씩 첨가하였다. 배양액 중의 용존산소는 용존산소전극과 교반 회전체의 모터를 연동시켜 용존산소치에 따라 회전속도를 변화시켜 자동억제하였다. 또한, 최저회전속도는 100rpm으로 설정하였다. 용존산소 농도는 배양시의 효소의 포화농도의 비율로 각각 5, 15, 20, 25, 30, 35%로 설정하였다.
각 조건에서 생성된 카로티노이드 생성농도와 비율은 표 9 및 10에 나타내었다.
표 9
용존산소 농도% 색소생성농도 mg/L
A B C D E F G H I J 합계
51520253035 0.800.550.680.750.450.28 0.200.480.420.290.290.06 0.120.040.030.030.020.02 0.550.820.360.350.150.12 0.891.330.720.820.330.30 0.000.000.000.000.000.00 0.331.562.222.931.651.32 0.000.000.000.000.000.00 0.230.560.851.431.621.96 0.010.020.020.020.020.02 3.135.365.306.624.534.08
표 10
용존산소 농도% 전구체 G I
mg/L % mg/L % mg/L %
51520253035 2.63.22.22.31.30.8 826042342820 0.331.562.222.931.651.32 112942443632 0.20.60.91.41.62.0 71016223648
본 명세서에서 인용한 모든 간행물, 특허 및 특허출원을 그대로 참고로 하여 본 명세서에서 사용하였다.
여러 종류의 카로티노이드 화합물의 미생물학적 제조방법에 있어서, 배양시의 배양액의 용존산소 농도를 억제하여, 생산하는 카로티노이드 화합물의 생성비율을 변화시킬 수 있다.

Claims (11)

  1. 카로티노이드 화합물을 여러 종류 생산하는 미생물을 배양하여 카로티노이드 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 배양시의 배양액의 용존산소 농도를 억제하여, 생산되는 카로티노이드 화합물의 생성비율을 일정하게 하는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    미생물은 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 세균인
    방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    미생물은 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는
    방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    카로티노이드 화합물은 아스타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네논, 아스테로이데논 및 아도니루빈으로부터 선택되는 1종 이상인
    방법.
  5. 카로티노이드 화합물을 여러 종류 생산하는 미생물을 배양하여 카로티노이드 화합물을 제조하는 방법에 있어서, 배양시의 배양액의 용존산소 농도를 억제하여 생산되는 카로티노이드 화합물의 생성비율을 변환시키는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    미생물은 16S 리보좀 RNA에 대응하는 DNA의 염기서열이 서열번호 1에 기재된 염기서열과 98% 이상의 상동성을 가지는 세균인 것을 특징으로 하는
    방법.
  7. 제 5항에 있어서,
    미생물은 E-396주(FERM BP-4283)와 그의 변이주 및 A-581-1주(FERM BP-4671)와 그의 변이주로부터 선택되는
    방법.
  8. 제 5항에 있어서,
    카로티노이드 화합물은 아스타크산틴, 아도니크산틴, β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 제아크산틴, β-크립토크산틴, 3-히드록시에키네 논, 아스테로이데논 및 아도니루빈으로부터 선택되는 1종이상인
    방법.
  9. 제 5항에 있어서,
    배양시의 배양액 중의 용존산소 농도를 포화 농도의 40 내지 100%로 억제하여 아도니크산틴의 생성비율을 높이는
    방법.
  10. 제 5항에 있어서,
    배양시의 배양액 중의 용존산소 농도를 포화농도의 20 내지 30%로 억제하여 아스타크산틴의 생성비율을 높이는
    방법.
  11. 제 5항에 있어서,
    배양시의 배양액 중의 용존산소 농도를 포화농도 0 내지 10%로 억제하여 β-카로틴, 에키네논, 칸타크산틴, 3-히드록시에키네논 및 아도니루빈의 생성비율을 높이는
    방법.
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