ES2339329T3 - Procedimiento para producir pigmentos carotenoides. - Google Patents
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Abstract
Procedimiento para producir compuestos carotenoides mediante el cultivo de un microorganismo que produce una pluralidad de compuestos carotenoides, en el que el microorganismo es una bacteria en la que la secuencia nucleótida de un ADN que corresponde a su ARN ribosómico 16S muestra una homología del 98% o superior con respecto a la secuencia nucleótida tal como se muestra en la SEC. ID nº:1, en el que la tasa de producción de la astaxantina es aumentada mediante el control de la concentración del oxígeno disuelto en el cultivo durante el proceso de cultivo, en un intervalo comprendido entre el 20 y el 30% de la concentración saturada de oxígeno.
Description
Procedimiento para producir pigmentos
carotenoides.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de producción microbiológica de compuestos
carotenoides. Más en particular, la presente invención describe un
procedimiento para producir compuestos carotenoides tales como
astaxantina, adonixantina, \beta-caroteno,
equinenona, cantaxantina, zeaxantina,
\beta-criptoxantina,
3-hidroxiequinenona, asteroidenona y
adonirubina.
Los compuestos carotenoides son pigmentos
naturales útiles como aditivos tipo pienso, aditivos alimentarios,
productos farmacéuticos y similares. En particular, la astaxantina
posee un alto valor industrial como aditivo de piensos para
potenciar el color de los peces criados, por ejemplo, salmón, trucha
o besugo, y como aditivos alimentarios naturales seguros. Por
tanto, la adonixantina, si se establece su procedimiento de
producción industrial, es prometedora como aditivo alimentario,
aditivo de piensos, de productos farmacéuticos, etc. Además, el
\beta-caroteno se ha utilizado como aditivo de
piensos, aditivo alimentario, de productos farmacéuticos, etc.; la
cantaxantina se ha utilizado como aditivo alimentario, aditivo de
pienso, cosméticos, etc.; y la zeaxantina se ha utilizado como
aditivo alimentario, aditivo para piensos, etc. Además, otros
compuestos carotenoides tales como la equinenona,
\beta-criptoxantina,
3-hidroxiequinenona, asteroidenona y adonirubina,
constituyen asimismo prometedores como aditivos para piensos,
aditivos alimentarios, etc. Como procedimientos para producir estos
compuestos carotenoides, se conocen procedimientos tales como la
síntesis química, la producción mediante microorganismos, y
extracción a partir de productos naturales. Para la astaxantina,
cantaxantina y \beta-caroteno, ya se han
comercializado productos sintetizados químicamente.
La astaxantina está contenida en pescados tales
como el besugo, salmón y trucha y en crustáceos tales como las
gambas, cangrejos y camarones, y puede obtenerse mediante su
extracción de ellos. Ejemplos de microorganismos que produzcan la
astaxantina incluyen la levadura roja Phaffia rhodozyma, una
bacteria que pertenece al género Brevibacterium (Journal of
General and Applied Microbiology, 15, 127, 1969,), la cepa
bacteriana E-396 (FERM BP-4283) que
pertenece a un nuevo género (publicación de patentes japonesas no
examinadas nº 7-79796 y nº 8-9964;
patentes US nº 5.607.839 y nº 5.858.761): bacteria Agrobacterium
aurantiacum (publicación de patente japonesa no examinada nº
7-184688), y el alga verde Haematococcus
pluviales (Phytochemistry, 20, 2561, 1981). Como procedimientos
de síntesis química se conocen la conversión del
\beta-caroteno (Pure Appl. Chem. 57, 741, 1985) y
la síntesis a partir de las sales de C_{15} fosfonio (Helv. Chim.
Acta, 64, 2436, 1981).
Es conocido que la Cantaxantina está contenida
en ciertas especies de champiñones (Botanical Gazette, 112,
228-232, 1950), así como en pescados y crustáceos
(Carotenoids of Marine Organisms, Journal of the Japanese Society
of Fisheries Science, 1978). Ejemplos de microorganismos que
producen cantaxantina incluyen un microorganismo que pertenece al
género Brevibacterium (Applied and Environmental
Microbiology, 55 (10), 2505, 1989); un microorganismo que pertenece
al género Rhodococcus (publicación de patente japonesa no
examinada nº 2-138996); la cepa bacteriana
E-396 (FERM BP-4283) que pertenece a
un nuevo género (publicación de patentes japonesas no examinadas nº
7-79796 y nº 8-9964; patentes US nº
5.607.839 y nº 5.858.761); y bacteria Agrobacterium
aurantiacum (Biosci. Biotechnol. Biochem. 58, 1842, 1994). Como
procedimientos de síntesis química se conocen la conversión del
\beta-caroteno (J. Amer. Chem. Soc., 78, 1427,
1956) y la síntesis a partir de una nueva sal de
3-oxo-C_{15} fosfonio (Pure Appl.
Chem., 51, 875, 1979).
Es conocido que la adonixantina está contenida
en pescados tales como peces de colores y carpas. Sin embargo, se
cree que la síntesis química es difícil, y no se conoce un
procedimiento industrial para la producción de la adonixantina.
Ejemplos de microorganismos que producen adonoxantina incluyen
microorganismos que pertenecen a los géneros Flavobacterium,
Alcaligenes, Pseudomonas, Alteromonas, Hyphomonas y
Caryophanon, respectivamente (publicación de patente
japonesa no examinada nº 6-165684); cepa bacteriana
E-396 (FERM BP-4283) que pertenece
a un nuevo género (publicaciones de patentes japonesas no examinadas
nº 7-79796 y nº 8-9964; patentes US
nº 5.607.839 y nº 5.858.761); y la bacteria Agrobacterium
aurantiacum (Biosci. Biotechnol. Biochem, 58, 1842,
1994).
1994).
Como procedimientos para producir
\beta-caroteno, se conocen la síntesis a partir de
la \beta-ionona (Pure Appl. Chem. 63 (1), 45,
1979) y la extracción a partir de vegetales amarillos o verdes tales
como la zanahoria, el boniato o la calabaza (Natural Coloring Agent
Handbook, Kohrin (1979), editado por el Editorial Committee of
Natural Coloring Agent Handbook. Ejemplos de microorganismos
productores de \beta-caroteno incluyen algas que
pertenecen al género Dunaliella, hongos que pertenecen al
género Blakeslea, (J. Appl. Bacteriol., 70, 181, 1991), que se
describe asimismo en J. Microbiol. Biotechnol (1999), 9(5),
548-553; la cepa bacteriana E-396
(FERM BP-4283) que pertenece a un género nuevo
(publicaciones de patentes japonesas no examinadas nº
7-79796 y nº 8-9964; patentes US nº
5.607.839 y nº 5.858.761); y la bacteria Agrobacterium
aurantiacum (FEMS Microbiology Letters 128, 139, 1995).
La equinenona se extrae a partir de productos
naturales, por ejemplo, estrellas de mar tales como la corona de
espinas, órganos internos de pescados tales como besugos, erizos de
mar, órganos internos de crustáceos tales como gambas, etc.
Ejemplos de microorganismos que producen equinenona incluyen la cepa
bacteriana E-396 (FERM BP-4283) que
pertenece a un género nuevo (publicaciones japonesas no examinadas
nº 7-79796 y nº 8-9964; patentes US
nº 5.607.839 y nº 5.858.761) y la bacteria Agrobacterium
aurantiacum (FEMS Microbiology Letters 128, 139, 1995).
Como procedimientos para producir zeaxantina, se
conocen la síntesis química que se inicia a partir de una
hidroxicetona ópticamente activa obtenida mediante reducción
asimétrica del oxoisoforón (Pure Appl. Chem, 63 (1), 45, 1991) y la
extracción a partir de semillas de maíz (Biopigments, 1974, Asakura
Shoten). Ejemplos de microorganismos que producen zeaxantina
incluyen una bacteria que pertenece al género Flavobacterium
(Carotenoids, en Microbial Technology, 2ª edición, Vol 1,
529-544, Academic Press, New York); la cepa
bacteriana E-396 (FERM BP-4283) que
pertenece a un género nuevo (publicación de las patentes japonesas
no examinadas nº 7-79796 y nº
8-9964; patentes US nº 5.607.839 y nº 5.858.761) y
la bacteria Agrobacterium aurantiacum (FEMS Microbiology
Letters 128, 139, 1995).
La producción de carotenoides se describe
también en Chemical Abstracts 81 (1974), 534606, Israel Journal of
Botany, Vol 31 (1982), páginas 221-227, Journal of
General Microbiology (1988), 134, 2449-1455, y
JP-A-5068585.
Sin embargo, los procedimientos de producción
anteriormente mencionados adolecen de varios inconvenientes. Por
ejemplo, la seguridad no está garantizada para los productos
sintetizados; la producción mediante los microorganismos muestra
una baja productividad; y la extracción a partir de los productos
naturales es muy costosa. En la producción de astaxantina, por
ejemplo, la extracción a partir de los productos naturales tales
como el camarón o cangrejo es muy costosa, ya que el contenido en
astaxantina es muy pequeño y entonces, la extracción es difícil. La
levadura roja Phaffia rhodozyma muestra una escasa velocidad
de crecimiento, produce sólo cantidades pequeñas de astaxantina y
posee una dura pared celular que hace que su extracción sea
difícil. Procedimientos que utilicen Phaffia rhodozyma se
describen, por ejemplo, en WO88/08025. De este modo, la
industrialización de la producción de astaxantina utilizando esta
levadura, es problemática. El alga verde Haematococcus
pluvialis presenta también muchos problemas. Su velocidad de
crecimiento es extremadamente baja; este microorganismo se
contamina fácilmente; y la extracción de la astaxantina a partir
suyo es difícil. Así, la industrialización utilizando este
microorganismo, es problemática.
Las cepas bacterianas E-396
(FERM-BP-4283) y
A-581-1
(FERM-BP-4671) que pertenecen a un
nuevo género (publicación de patente japonesa no examinada nº
7-79796 y nº 8-9964; patente US nº
5.607.839 y nº 5.858.761 y la solicitud de patente europea EP
0635576) poseen diversas ventajas, por ejemplo, alta productividad,
alta velocidad de crecimiento, y facilidad de extracción. Sin
embargo, ya que estos microorganismos producen simultáneamente
diversos compuestos carotenoides tales como astaxantina,
adonixantina, \beta-caroteno, equinenona,
cantaxantina, zeaxantina, \beta-criptoxantina,
3-hidroxiequinenona, asteroidenona y adonirubina,
las tasas de producción de estos compuestos varían de cultivo a
cultivo, habiendo sido difícil producir pigmentos con proporciones
estables. Cuando la mezcla de pigmentos resultante se utiliza en
piensos animales, etc., como potenciadora del color, el efecto de
esta potenciación del color varía de forma bastante amplia. Esto ha
constituido un obstáculo para la producción comercial de pigmentos
utilizando estos microorganismos.
De este modo, se ha deseado un procedimiento
para producir establemente compuestos carotenoides en proporciones
constantes.
La presente invención se ha llevado a cabo
teniendo en cuenta dichas circunstancias. Un objetivo de la presente
invención es controlar las proporciones de producción de compuestos
carotenoides y proporcionar un procedimiento para producir
establemente compuestos carotenoides en tales proporciones
específicas controladas.
Como resultado de investigaciones intensas y
extensas con respecto a la solución de los problemas anteriormente
descritos, estos inventores han descubierto que es posible controlar
las tasas de producción de diversos compuestos carotenoides y
producir los compuestos carotenoides en dichas proporciones
específicas controladas, controlando apropiadamente la
concentración de oxígeno disuelto en un cultivo durante el cultivo
de un microorganismo que produzca los compuestos carotenoides. De
esta forma, se ha obtenido la presente invención.
A continuación, la presente invención se
describirá con mayor detalle.
En el procedimiento de la invención, se utilizan
las bacterias que producen los compuestos carotenoides en las que
la secuencia nucleótida de un ADN que corresponde a su ARN
ribosómico 16S, posee una homología del 98% o más respecto a la
secuencia nucleótida tal como se muestra en SEC ID nº: 1. En
particular, las cepas bacterianas E-396 (FERM
BP-4283) y A-581-1
(FERM BP-4671); varias cepas mutantes que pueden
obtenerse potenciando la mutación en estas cepas; y especies
relacionadas de estas cepas que pueden enumerarse. La secuencia
nucleótida tal como se muestra en SEC ID nº: 1 (ADN) corresponde al
ARN ribosómico 16S de la cepa E-396, y la secuencia
nucleótida tal como se muestra en SEC ID nº: 2 (ADN) corresponde al
ARN ribosómico 16S de la cepa
A-581-1.
Recientemente, la clasificación de
microorganismos que se basa en la homología de las secuencias
nucleótidas de los ARN ribosómicos 16S se ha vuelto predominante
como medio para clasificar microorganismos, porque la clasificación
convencional que se basa en la motilidad, auxotrofía, asimilación de
sacáridos, etc., tiene un problema: que los microorganismos pueden
identificarse erróneamente cuando los caracteres han cambiado
mediante una mutación natural, o similar. La fiabilidad de la
clasificación mejora de forma notable cuando se basa en la
homología de las secuencias nucleótidas de los ARN ribosómicos 16S,
ya que estas secuencias nucleótidas son hereditariamente muy
estables. La homología entre las secuencias nucleótidas de los ARN
ribosómicos 16S de la cepa E-396 y de la cepa
A-581-1 es del 99,4%. Esto muestra
que estas cepas son cepas que están estrechamente relacionadas. De
este modo, estas cepas forman un grupo de bacterias que producen
carotenoides. La cepa E-396 y la cepa
A-581-1, así como aquellas cepas que
producen efecto bajo las condiciones de cultivo de la presente
invención, se definen como microorganismos que muestran una
homología del 98% o más para con la secuencia nucleótida del ARN
ribosómico 16S de la cepa E-396, como una especie
mutante relacionada de la cepa E-396 o de la cepa
A-581-1.
Ahora, la cepa E-396 que
constituye un ejemplo específico del microorganismo que se utiliza
en la presente invención, se describirá a continuación. Esta cepa
se aisló nuevamente por estos inventores y se depositó en el
International Patent Organism Depository, National Institute of
Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6,
1-1, Higashi 1-chome,
Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón) el 27 de abril de 1993
como FERM BP-4283. Otro ejemplo específico de
microorganismo es la cepa A-581-1
(FERM BP-4671). Esta cepa se aisló nuevamente por
estos inventores y se depositó en el International Patent Organism
Depository, National Institute of Advanced Industrial Science and
Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi
1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki,
Japón) el 20 de mayo de 1994 como FERM BP-4671.
El procedimiento de fermentación según la
invención es tal como se describe en la reivindicación 1.
Brevemente, un microorganismo que produce carotenos se cultiva en
un medio que contiene componentes que se requieren para el
crecimiento del microorganismo y que generan pigmentos
carotenoides.
El procedimiento de fermentación puede ser un
cultivo aeróbico convencional, tal como un cultivo de agitación
aireación, un cultivo de burbujeo en columna, o un cultivo en lecho
fluidificado. Preferentemente, se utiliza el cultivo de agitación
aireación. Por ejemplo, la cepa E-396 (FERM
BP-4283) produce simultáneamente compuestos
carotenoides de \beta-caroteno, equinenona,
\beta-criptoxantina,
3-hidroxiequinenona, asteroidenona, cantaxantina,
zeaxantina, adonirubina, adonixantina y astaxantina.
La biosíntesis de la astaxantina se considera de
la siguiente forma. Los anillos de seis elementos que se localizan
superiormente en ambos extremos del
\beta-caroteno, son modificados mediante la
quetolasa y la hidroxilasa, respectivamente, para producir
finalmente la astaxantina. Sin embargo, se ha observado un fenómeno,
que no todos los compuestos carotenoides se convierten en
astaxantina, incluso si se ha prolongado el período de
fermentación, y que parte de estos compuestos permanecen sin
convertirse hasta el final de la fermentación. Además, las tasas de
producción de estos compuestos varían según el cultivo. Por ejemplo,
en un cultivo, las tasas de \beta-caroteno,
equinenona, 3-hidroxiequinenona, cantaxantina,
adonirubina, que se considera están localizadas por encima en la
vía biosintética, son altas; en otro cultivo, la tasa de producción
de la astaxantina es alta, y en otro cultivo, la tasa de producción
de la adonixantina es alta.
Por las razones anteriormente descritas, el
efecto de la mejoría del color varía bastante ampliamente cuando la
mezcla de pigmentos resultante se utiliza en piensos animales, etc.,
como un potenciador del color. Así, dicha mezcla de pigmentos no
puede venderse como una mercancía. Esto ha constituido un obstáculo
para la producción comercial de dichos pigmentos. Como resultado de
varias investigaciones con respecto a la solución de este problema,
estos inventores han encontrado que un factor que influencia las
tasas de producción de pigmentos es el oxígeno disuelto en el
cultivo. Se descubrió que, en un cultivo de agitación con una
velocidad específica de agitación-rotación, la
concentración del oxígeno disuelto en el cultivo está influenciada
por sutiles diferencias en la tasa de consumo del oxígeno del
microorganismo, y de esta forma, las tasas de producción de
pigmentos varían por lote de cultivo. Controlando la concentración
del oxígeno disuelto en el cultivo durante la realización de éste,
es posible controlar las tasas de producción de los compuestos
carotenoides, es decir, de \beta-caroteno,
equinenona, \beta-criptoxantina,
3-hidroxiequinenona, asteroidenona, cantaxantina,
zeaxantina, adonirubina, adonixantina y astaxantina.
Controlando la baja concentración del oxígeno
disuelto en el cultivo, es posible aumentar las tasas de producción
de los compuestos carotenoides, es decir, de
\beta-caroteno, equinenona,
3-hidroxiequinenona, cantaxantina y adonirubina,
que se cree están localizados por encima en la vía biosintética.
Controlando la concentración del oxígeno disuelto en el cultivo a
un nivel moderado, es posible aumentar la tasa de producción de la
astaxantina. Controlando la alta concentración del oxígeno disuelto
en el cultivo, es posible aumentar la tasa de producción de la
adonixantina.
Por ejemplo, para aumentar la tasa de producción
de la astaxantina, la concentración del oxígeno disuelto en el
cultivo se controla en un intervalo del 20-30%, de
la concentración saturada de oxígeno. La tasa de producción de la
astaxantina puede aumentarse hasta el 40% o más, con la condición de
que la concentración del oxígeno disuelto sea el
20-30% de la concentración saturada de oxígeno.
Cuando la concentración del oxígeno disuelto es
del orden del 0-15%, preferentemente del
0-10%, de la concentración saturada de oxígeno, el
\beta-caroteno, la equinenona, la
3-hidroxiequinenona, la cantaxantina y la
adonirubina, se acumulan abundantemente, mientras que la producción
de astaxantina se inhibe. Bajo dichas condiciones, el total de
\beta-caroteno, equinenona,
3-hidroxiequinenona, cantaxantina y adonirubina
producidos constituye el 60% o más del rendimiento total de todos
los compuestos. De este modo, la tasa de producción de la
astaxantina puede reducirse al 40% o menos.
Para aumentar la tasa de producción de la
adonixantina, la concentración del oxígeno disuelto en el cultivo
se controla entre el 35 y el 100%, preferentemente entre el 40 y el
100%, de la concentración saturada de oxígeno. La tasa de
producción de la adonixantina puede aumentarse hasta el 35% o más
bajo dichas condiciones.
Con respecto a la etapa de cultivo, la
concentración del oxígeno disuelto es importante en la etapa de
crecimiento logarítmico. Por ejemplo, cuando la concentración del
oxígeno disuelto se eleva durante esta etapa, la tasa de producción
de la adonixantina aumenta, incluso si la concentración disminuye
posteriormente.
El control de la concentración del oxígeno
disuelto puede llevarse a cabo mediante procedimientos
convencionales que se utilizan en el cultivo de los
microorganismos. Por ejemplo, el control puede realizarse ajustando
automáticamente la velocidad del flujo del aire o del oxígeno
suministrado al fermentador según la concentración del oxígeno
disuelto en el cultivo, que se mide con un electrodo disuelto de
oxígeno. Alternativamente, el control puede llevarse a cabo
ajustando automáticamente la velocidad de rotación de un propulsor
según la concentración del oxígeno disuelto en el cultivo, que se
mide con un electrodo disuelto de oxígeno.
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A continuación, la presente invención será
descrita más específicamente con respecto a los Ejemplos siguientes.
Sin embargo, la presente invención no está limitada a dichos
Ejemplos.
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Un medio (100 ml) con la composición que se
muestra en la Tabla 1 que sigue, se dispuso en un matraz Erlenmeyer
de 500 ml y se esterilizó al vapor a 121ºC durante 15 minutos. Se
inoculó en él la cepa E-396 (FERM
BP-4283) y se cultivó bajo agitación rotatoria a
150 rpm y a 28ºC durante un día. A continuación, 600 ml de este
cultivo se inocularon en 20 l de un medio que presentaba la
composición que se muestra en la siguiente Tabla 2 contenida en un
fermentador de agitación-aireación de 30 l, medio
que se cultivó bajo condiciones aeróbicas con una tasa de aireación
de 1,0 vvm y a 28ºC durante 90 horas. Durante el cultivo, se
controló continuamente el pH a 7,2 con NaOH al 20%. Dado que la
sacarosa se consume a medida que el microorganismo crece, en los
días 1 y 2 del cultivo se añadieron 300 g de sacarosa. El oxígeno
disuelto en el cultivo se controló automáticamente engranando el
electrodo de oxígeno disuelto con el motor de un impulsor, y
cambiando la velocidad de rotación del impulsor, según el valor que
se había medido del oxígeno disuelto. La velocidad mínima de
rotación se fijó en 80 rpm.
La concentración del oxígeno disuelto constituye
una proporción de la concentración saturada de oxígeno en el medio
que se utilice. En este experimento, las concentraciones del oxígeno
disuelto se fijaron en el 5%, 15%, 20%, 25%, 30% y 35% de la
concentración saturada de oxígeno.
Las concentraciones y proporciones de los
compuestos carotenoides producidos bajo condiciones individuales,
fueron tal como se muestran en las siguientes Tablas 4 y 5 (las
letras que representan estos compuestos se muestran en la Tabla
3).
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Un medio (100 ml) con la composición que se
muestra en la Tabla 1 que sigue, se dispuso en un matraz Erlenmeyer
de 500 ml y se esterilizó al vapor a 121ºC durante 15 minutos. Se
inoculó en él la cepa E-396 (FERM
BP-4283) y se cultivó bajo agitación rotatoria a
150 rpm y a 28ºC durante un día. A continuación, 100 ml de este
cultivo se inocularon en 2 l de un medio que presentaba la
composición que se muestra en la siguiente Tabla 2 contenida en un
fermentador de agitación-aireación de 5 l, medio que
se cultivó bajo condiciones aeróbicas con una tasa de aireación de
1,0 vvm y a 28ºC durante 90 horas. Durante el cultivo, se controló
continuamente el pH a 7,2 con NaOH al 20%. Ya que la sacarosa se
consume a medida que el microorganismo crece, en los días 1 y 2 del
cultivo se añadieron 30 g de sacarosa. El oxígeno disuelto en el
cultivo se controló automáticamente engranando un electrodo de
oxígeno disuelto con el motor de un impulsor, y cambiando la
velocidad de rotación del impulsor, según el valor que se había
medido del oxígeno disuelto. La velocidad mínima de rotación se fijó
en 100 rpm. La concentración del oxígeno disuelto constituye una
proporción de la concentración saturada de oxígeno en el medio que
se utilice. En este experimento, la concentración del oxígeno
disuelto se fijó en el 25% de la concentración saturada de
oxígeno.
A título comparativo, la misma cepa se cultivó
bajo condiciones que no controlaban el oxígeno disuelto (es decir,
la agitación se llevó a cabo a una velocidad de rotación constante
de 450 rpm).
Las concentraciones de los compuestos
carotenoides producidos bajo condiciones individuales se muestran en
la Tabla 6.
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La cepa E-396 (FERM
BP-4283) se sometió a mutación con NTG
(N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina)
y se seleccionaron colonias con un profundo color rojo. Se
analizaron los compuestos carotenoides en el cultivo de estos
clones, seguido por la selección de un clon mutante
Y-1071 que presentaba un aumento en la productividad
de astaxantina. Un medio (100 ml) con la composición que se muestra
en la Tabla 1 anterior, se dispuso en un matraz Erlenmeyer de 500
ml y se esterilizó al vapor a 121ºC durante 15 minutos. Se inoculó
en el mismo el clon Y-1071 y se cultivó bajo
agitación rotatoria a 150 rpm y a 28ºC durante un día.
A continuación, 100 ml de este cultivo se
inocularon en 2 l de un medio que presentaba la composición que se
muestra en la Tabla 2 anterior contenida en un fermentador de
agitación-aireación de 5 l, que se cultivó bajo
condiciones aeróbicas con una tasa de aireación de 1,0 vvm y a 28ºC
durante 90 horas. Durante el cultivo, se controló continuamente el
pH a 7,2 con NaOH al 20%. Dado que la sacarosa se consume a medida
que el microorganismo crece, en los días 1 y 2 del cultivo se
añadieron 30 g de sacarosa. El oxígeno disuelto en el cultivo se
controló automáticamente engranando un electrodo de oxígeno
disuelto con el motor de un impulsor, y cambiando la velocidad de
rotación del impulsor, según el valor que se había medido del
oxígeno disuelto. La velocidad mínima de rotación se fijó en 100
rpm.
La concentración del oxígeno disuelto constituye
una proporción de la concentración saturada de oxígeno en el medio
que se utilice. En este experimento, las concentraciones del oxígeno
disuelto se fijaron en el 5%, 15%, 20%, 25%, 30% y 35% de la
concentración saturada de oxígeno.
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Las concentraciones y proporciones de los
compuestos carotenoides producidos bajo condiciones individuales se
muestran en las Tablas 7 y 8 a continuación.
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Un medio (100 ml) con la composición que se
muestra en la Tabla 1 anterior, se dispuso en un matraz Erlenmeyer
de 500 ml y se esterilizó al vapor a 121ºC durante 15 minutos. Se
inoculó una cepa A-581-1
(FERM-BP-4671) y se cultivó bajo
agitación rotatoria a 150 rpm y a 28ºC durante un día. A
continuación, 100 ml de este cultivo se inocularon en 2 l de un
medio que presentaba la composición que se muestra en la Tabla 2
anterior contenida en un fermentador de
agitación-aireación de 5 l, que se cultivó bajo
condiciones aeróbicas con una tasa de aireación de 1,0 vvm y a 28ºC
durante 90 horas. Durante el cultivo, se controló continuamente el
pH a 7,2 con NaOH al 20%. Dado que la sacarosa se consume a medida
que el microorganismo crece, en los días 1 y 2 del cultivo se
añadieron 30 g de sacarosa. El oxígeno disuelto en el cultivo se
controló automáticamente engranando un electrodo de oxígeno
disuelto con el motor de un impulsor, y cambiando la velocidad de
rotación del impulsor, según el valor que se había medido del
oxígeno disuelto. La velocidad mínima de rotación se fijó en 100
rpm. La concentración del oxígeno disuelto constituye una
proporción de la concentración saturada de oxígeno en el medio que
se utilice. En este experimento, las concentraciones del oxígeno
disuelto se fijaron en el 5%, 15%, 20%, 25%, 30% y 35% de la
concentración saturada de oxígeno.
Las concentraciones y proporciones de los
compuestos carotenoides producidos bajo condiciones individuales se
muestran en las Tablas 9 y 10 a continuación.
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El control de la concentración del oxígeno
disuelto en un cultivo durante el desarrollo de éste, si es posible
cambiar las tasas de producción de los compuestos carotenoides
resultantes en un procedimiento de producción microbiológica de
diversos compuestos carotenoides.
<110> Nippon Mitsubishi Oil
Corporation
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<120> Procedimiento para producir
pigmentos carotenoides
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<130>
PH-1223-PCT
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<140>
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<141>
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<150> JP 2000-175124
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<151>
2000-06-12
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<160> 2
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\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn Ver. 2.0
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<210> 1
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<211> 1452
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<212> ADN
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Desconocido
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Descripción del organismo
desconocido: E-396
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 1426
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<212> ADN
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<213> Desconocido
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<220>
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<223> Descripción del organismo
desconocido: A-581-1
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<400> 2
Claims (2)
1. Procedimiento para producir compuestos
carotenoides mediante el cultivo de un microorganismo que produce
una pluralidad de compuestos carotenoides, en el que el
microorganismo es una bacteria en la que la secuencia nucleótida de
un ADN que corresponde a su ARN ribosómico 16S muestra una homología
del 98% o superior con respecto a la secuencia nucleótida tal como
se muestra en la SEC. ID nº:1, en el que la tasa de producción de
la astaxantina es aumentada mediante el control de la concentración
del oxígeno disuelto en el cultivo durante el proceso de cultivo,
en un intervalo comprendido entre el 20 y el 30% de la concentración
saturada de oxígeno.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, en
el que el microorganismo se selecciona de entre el grupo constituido
por la cepa E-396 (FERM BP-4283) y
sus mutantes, y la cepa A-581-1
(FERM BP-4671) y sus mutantes.
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