WO2001096591A1 - Procede pour produire des pigments carotenoides - Google Patents

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Akira Tsubokura
Haruyoshi Mizuta
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Nippon Mitsubishi Oil Corporation
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P23/00—Preparation of compounds containing a cyclohexene ring having an unsaturated side chain containing at least ten carbon atoms bound by conjugated double bonds, e.g. carotenes

Definitions

  • the present invention relates to a microbiological method for producing carotenoid compounds.
  • carotenoid compounds such as astaxanthin, adonixanthin, 3-ryokuten, echinenone, canthaxanthin, zeaxanthin, / 3-cryptoxanthin, 3-hydroxyechinenone, asteroidenone, adironrubin, etc. It relates to a manufacturing method. Background art
  • Carotenoid compounds are useful as feed additives, food additives and pharmaceuticals as natural pigments.
  • Astaxanthin has high industrial value as a feed additive, such as body color improvers for cultured fish such as salmon, trout, and red sea bream, and as a safe natural food additive.
  • Adonixanthin is expected to be used as a feed additive, food additive, pharmaceutical product, etc. in the same manner as astaxanthin by establishing an industrial production method.
  • 3-Carotene is used as a feed additive, food additive, pharmaceutical, etc.
  • Canthaxanthin is used as a food additive, feed additive, cosmetics, etc.
  • zeaxanthin is a food additive, feed additive, etc.
  • Has been used as Echinenone, 3-cryptoxanthin, 3-hydroxyxeninenone, asteroidenone, adironrubin, etc. are also expected to be used as feed additives and food additives.
  • Known methods for producing these carotenoid compounds include chemical synthesis, microbial production, and extraction from natural products. Astaxanthin, canthaxanthin, and) 3-carotene have already been obtained by chemical synthesis. These are commercially available.
  • Astaxanthin is found in fish such as red sea bream, salmon, and trout and in crustaceans such as shrimp, ryuji, crayfish, and krill, and can be extracted therefrom.
  • microorganisms that produce astaxanthin include the red yeast Phaffia rhodozyma and the genus B r_e v J_ bacterium belonging to the genus B. an d Applied Microbiology, 15, 127, 1969), a new genus of bacteria E-396 strain (FERM BP-4283) (JP-A-7-79796, JP-A-8-9964, U.S.A.) Patent No. 5,607,839, U.S. Patent No.
  • Canthaxanthin is known to be present in certain mushrooms (Botanical Gazette, 112, 228-232, 1950), fish and crustaceans (carotenoids of marine animals). , Journal of the Fisheries Society of Japan, 1978).
  • Examples of microorganisms that produce canthaxanthin include microorganisms belonging to the genus Brevipacterium.
  • donixanthin is present in fish such as goldfish and carp, its production by chemical synthesis is considered to be difficult, and no industrial production method is known.
  • microorganisms that produce adonixanthin include Flavavacterium (Fl av obacte ri um), genus Alaligenes, seu dmonas, seroteromoas (.Alter omon as), Hyphomo nas and Carry ophan on , A new genus of bacteria E-396 strain (FE RM BP-4283) (JP-A 7-79796, JP-A 8-9964, U.S. Pat. 607, 839, U.S. Pat. No.
  • Bacterial bacteria Agrobacterium 'Aurantiacum (Ag robacteri um aur anti ac um) (Biosci. Biotec hnol) Biooch em. 5 _8, 1842, 1 994) is known.
  • 0-carotene The production method of 0-carotene is as follows: synthesis from / 3-nonone (Pure Ap p. 1. Chem., 6_ (1), 45, 1979), extraction from carrots, satsumaimo, kabochia and other green and yellow vegetables (natural Coloring Handbook, Korin (1979), Natural Coloring Handbook Editing Committee) is known. 3—Examples of microorganisms that produce rikiguchiten include fungi belonging to the genus Dunaliella (Duna 1 ie 1 1a) and the genus Brakesula (B 1 akes 1 ea) (J. Ap p 1. B acteriol., 70).
  • Echinenone is extracted from natural products, such as starfishes such as sea starfish, fish offal such as red sea bream, and crustacean offal such as sea urchin and lobster.
  • natural products such as starfishes such as sea starfish, fish offal such as red sea bream, and crustacean offal such as sea urchin and lobster.
  • microorganisms that produce echinenone include a new genus of bacteria, strain E-396 (FERM BP-4283) (JP-A-7-79796, JP-A-8-9964, U.S. Pat. No. 5,607). No. 5,858,761), Aggropacterium 'Alantiakum (Agr ob acteri um au ⁇ _ ⁇ ti acum) (FEM S Mi crobiolo gy Le tters) 1, 28, 139, 1995).
  • Zeaxanthin can be produced by a chemical synthesis method using an optically active hydroxyketone obtained by asymmetric reduction of oxoisophorone as a raw material (Pure Appl. Chem., 6_3_ (1), 45, 1991), or from corn seeds.
  • An extraction method biological pigment, 1974, Asakura Shoten
  • microorganisms that produce zeaxanthin include a method using a bacterium belonging to the genus Flavopacterium (Car 0 ten 0 ids, in Micro tech cial cn ology, 2 ndedn, Vol.
  • the above-mentioned chemical synthesis method has problems such as the safety has not been confirmed, the productivity is low when produced by microorganisms, and the cost is too high when extracted from natural products.
  • the productivity is low when produced by microorganisms
  • the cost is too high when extracted from natural products.
  • Astaxanthin production by extraction from natural products such as krill and crayfish has a very low content and is difficult to extract, so the cost is high.
  • Red yeast Phaffia rho do zyma has problems such as low growth rate, low production, and difficulty in extracting astaxanthin due to its strong cell wall.
  • the green algae Hamatoma tococcus pluvialis also has: t There are many problems in industrializing this method due to its disadvantages such as extremely slow breeding speed, easy contamination, and difficulty in extraction. .
  • 5,858,761 have advantages such as high productivity, high growth rate, and easy extraction, but they are composed of multiple carotenoid compounds, namely, Staxanthin, Adonixanthin, ⁇ -Carotene, Echinenone, Canthaxanthin, Zeaxanthin, / 3-Cryptoxan Since tin, 3-hydroxyecinenone, asteroidenone and addirubin are simultaneously produced, their production ratio fluctuates from one culture to another, making it difficult to produce a pigment at a stable ratio. For this reason, when the produced pigment mixture is used as a color tone improving agent in animal feeds and the like, the color tone effect varies, which has been an obstacle to commercial production. Therefore, there has been a demand for a production method for stably producing a certain ratio of carotenoid compounds.
  • the present invention has been made in view of such circumstances, and an object of the present invention is to provide a production method for controlling the production ratio of a carotenoid compound and stably producing the carotenoid compound at a specific ratio. is there. Disclosure of the invention
  • the present inventors have conducted various studies to solve the above-mentioned problems, and found that by controlling the dissolved oxygen in the culture solution during cultivation to an appropriate concentration in culturing a carotenoid-producing microorganism, a plurality of carotenoids were obtained.
  • the present inventors have found that it is possible to control the production ratio of the compound and to stably produce the carotenoid compound at the specific ratio, and have reached the present invention.
  • a microorganism that produces a carotenoid compound is used.
  • Such microorganisms include, for example, carotenoid-producing bacteria, yeasts, molds, and the like.
  • the bacterium include a bacterium in which the nucleotide sequence of DNA corresponding to 16S ribosomal RNA has 98% or more homology with the nucleotide sequence described in SEQ ID NO: 1. Specifically, E-396 strains (FERMBP-4283) and A-581-1 strains (FRRM
  • BP-4671 various mutants obtained by mutating the E-396 strain or the A-581-l strain, and closely related species of these two strains.
  • Array The nucleotide sequence of the DNA of No. 1 corresponds to the 16S ribosome RNA of E-396 strain, and the nucleotide sequence of the DNA of SEQ ID No. 2 is 16 S of the A-581-1 strain. Ribosome Corresponds to RNA.
  • Microbial classification based on 16 S ribosomal RNA base sequence homology has recently become mainstream as a means of microbial classification, but it is based on conventional motility, auxotrophy, and sugar utilization. This is because the classification based on such factors has the problem that incorrect identification may be made due to changes in traits due to spontaneous mutation.
  • Classification based on the homology of the base sequence of 16 S ribosomal RNA greatly improves the reliability because it is based on the base sequence of 16 S ribosomal RNA which is extremely genetically stable.
  • the nucleotide sequence homology of the E-396 strain and the A-581-1 strain of 16S liposomal RNA was 99.4%, indicating that the strains were extremely closely related.
  • the E-396 strain and the A-581-1 strain and the strains which exhibit an effect under the culture conditions of the present invention include the E-396 strain or the mutant strain of the A-581-1 strain and the closely related E-396 strain.
  • the E-396 strain which is a specific microorganism used in the present invention, will be described.
  • This strain which was newly isolated by the present inventors, was registered at the Patent Organism Depositary Center, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (1-1, Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan). Deposited as FERM BP-4283 on March 27. More specific other microorganisms include A-581-1 strain (FERM BP-4671). This strain was newly isolated by the inventors, and is incorporated by National Institute of Advanced Industrial Science and Technology.
  • a strong tenoid compound namely ⁇ -carotene, echinenone, / 3-cryptoxanthin, 3-hydroxyechinenone, asteroy. It can control the production ratio of denone, canthaxanthin, zeaxanthin, adodonilbin, adonixanthin, and astaxanthin.
  • Controlling the dissolved oxygen concentration in the culture medium to a medium level can increase the production ratio of astaxanthin, and increasing the dissolved oxygen concentration in the culture solution can increase the production ratio of riadonixanthin. Can be.
  • the concentration of dissolved oxygen in the culture solution is controlled to 15 to 40%, preferably 20 to 30% of the saturated oxygen concentration.
  • Dissolved acid Under the condition that the elemental concentration is 20 to 30% of the saturated oxygen concentration, the production ratio of astaxanthin can be increased to 40% or more.
  • the dissolved oxygen concentration is in the range of 0 to 15%, preferably 0 to 10% of the saturated oxygen concentration, ⁇ -lactate, echinenone, canthaxanthin, 3-hydroxyechinenone and adorubin are accumulated in large amounts. Production of astaxanthin is suppressed. Under these conditions, the total amount of ⁇ -dextrin, echinenone, canthaxanthin, 3-hydroxyechinenone, and adilrubin is 60% or more, and the production ratio of astaxanthin is 40% or less.
  • the dissolved oxygen concentration in the culture solution is controlled to 35 to 100%, preferably 40 to 100% of the saturated oxygen concentration. Under these conditions, the production ratio of adonixanthin can be increased to 35% or more.
  • the dissolved oxygen concentration is important during the logarithmic growth phase. For example, if the dissolved oxygen concentration is increased at this time, the rate of production of adonixanthin will increase even if the conditions are subsequently changed to lower.
  • the dissolved oxygen concentration is controlled by the method usually used in culture, for example, the flow rate of air or oxygen supplied to the culture tank is automatically adjusted according to the dissolved oxygen concentration in the culture solution measured by the dissolved oxygen electrode. Any method can be used, such as a method or a method of automatically adjusting the rotation speed of the stirring blade according to the dissolved oxygen concentration value in the culture solution measured by the dissolved oxygen electrode.
  • a medium having the composition shown in Table 1 was placed in a 50-Om1 Erlenmeyer flask and sterilized with steam at 121 ° C for 15 minutes.
  • the E-396 strain (FERMBP-4283) was inoculated into this, and the cells were cultured at 28 ° C for 1 day at 150 rpm with rotary shaking.
  • 600 mL of this culture solution was added to a 30 L aeration stirred culture tank containing 20 L of a medium having the composition shown in Table 2. Aerobically cultured at 28 ° C. and 1.0 vvm for 90 hours.
  • the pH was continuously controlled at 7.2 with 20% NaOH. Since sucrose is consumed with growth, 300 g was added on each of the first and second days of culture.
  • the dissolved oxygen in the culture solution was automatically controlled by changing the rotation speed according to the dissolved oxygen value by linking the dissolved oxygen electrode and the motor of the stirring blade.
  • the minimum rotation speed was set at 80 rpm.
  • the dissolved oxygen concentration was set at 5, 15, 20, 25, 30, and 35% by the ratio of the saturated concentration of oxygen in the medium.
  • Table 4 and Table 5 show the concentrations and ratios of carotenoids produced under each condition (the symbols for each compound are shown in Table 3).
  • sucrose Since sucrose is consumed with growth, 30 g of each was added on the first and second days of the culture.
  • the dissolved oxygen in the culture solution was automatically controlled by changing the rotation speed according to the value of dissolved oxygen by linking the dissolved oxygen electrode and the motor of the stirring blade.
  • the minimum rotation speed was set at 100 rpm.
  • the dissolved oxygen concentration was set to 25% as the ratio of the saturated concentration of oxygen in the medium. For comparison, cultivation was also performed under conditions in which dissolved oxygen was not controlled, that is, at a constant stirring rotation speed of 45 Orpm.
  • Table 6 shows the concentration of carotenide formed under each condition.
  • the E-396 strain (FERM BP-4283) was mutated with NTG (N-methyl-N, -ni-t-ro-N-nitrosoguanidine), and colonies with a deep red color were selected.
  • the carotenoid compounds in the cultures of these strains were analyzed, and a mutant strain Y-1071 having improved astaxanthin productivity was selected.
  • 100 ml of a medium having the composition shown in Table 1 was placed in a 500 ml Erlenmeyer flask, and steam sterilized at 121 ° C for 15 minutes.
  • Y-1071 strain was inoculated into the culture, and cultured at 28 ° C for 1 day with rotation and shaking at 150 rpm.
  • Table 7 and Table 8 show the concentration and ratio of carotenoids produced under each condition.
  • sucrose was consumed with growth, 30 g of sucrose was added on each of the first and second days of culture.
  • Dissolved oxygen in the culture solution is rotated according to the value of dissolved oxygen by linking the dissolved oxygen electrode with the motor of the stirring blade. It was controlled automatically by changing the speed.
  • the minimum rotation speed was set to 100 rpm.
  • the dissolved oxygen concentration was set at 5, 15, 20, 25, 30, and 35% by the ratio of the saturated concentration of oxygen in the medium.
  • the rate of carotenoid compound production can be changed by controlling the concentration of dissolved oxygen in the culture solution during the culture.

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Description

¾糸田 カロテノィド色素の製法
技術分野
本発明はカロテノイド化合物の微生物学的製造法に関する。 詳細には、 ァスタキサ ンチン、 アドニキサンチン、 3—力口テン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 ゼアキ サンチン、 /3—クリプトキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノン、 ァステロイデノン、 アド二ルビンなどのカロテノィド化合物を製造する方法に関するものである。 背景技術
カロテノイド化合物は天然色素として飼料添加物、 食品添加物、 医薬品等として有 用である。 ァスタキサンチンは養殖魚であるサケ、 マス、 マダイ等の体色改善剤のご とき飼料添加物として、 また安全な天然食品添加物として産業上の価値が高い。 また ァドニキサンチンは工業的製造法が確立されることによりァスタキサンチンと同様に 飼料添加物、 食品添加物、 医薬品等としての用途が期待される。 さらに /3—カロテン は飼料添加物、 食品添加物、 医薬品等として使用され、 カンタキサンチンは、 食品添 加物、 飼料添加物、 化粧品等として使用され、 ゼアキサンチンは食品添加物、 飼料添 加物等として使用されている。 さらにェキネノン、 3—クリプトキサンチン、 3—ヒ ドロキシェキネノン、 ァステロイデノン、 アド二ルビン等も飼料添加物、 食品添加物 等としての使用が期待される。 これらカロテノイド化合物の製造方法としては、 化学 合成法、 微生物による産生方法、 天然物からの抽出法などが知られており、 すでにァ スタキサンチン、 カンタキサンチン、 ）3—カロテンについては化学合成法により得ら れたものが市販されている。
ァスタキサンチンはマダイ、 サケ、 マス等の魚類およびェビ、 力二、 ザリガニ、 ォ キアミ等の甲殻類等に存在しており、 これらより抽出することが可能である。 また、 ァスタキサンチンを生産する微生物の例としては、 赤色酵母ファフィァ ·ロドチ一マ (Ph a f f i a rh o d o zyma 、 ブレビノヽクテリウム ( B r_e v J_ b a c t e r i u m) 属に属する '田菌 (J ou r n a l o f Ge n a r a l an d Ap p l i e d Mi c r o b i o l o gy, 1 5， 1 27, 1 969) 、 新属の細 菌 E— 396株 （FERM BP— 4283) (特開平 7— 79796号公報、 特開 平 8— 9964号公報、 米国特許第 5， 607, 839号明細書、 米国特許第 5， 8 58， 76 1号明細書） 、 細菌ァグロバクテリウム ·ォウランティアクム (Ag r 0 b a c t e r i um au r an t i a c urn) (特開平 7— 1 84688号公報） 、 ,禄藻類のへマトコッカス .プルビアリス (H a e m a t o c o c c u s 1 u v i a 1 i s) (Phy t o c h em i s t ry, 20 , 256 1 , 1 98 1 ) 、 が知ら れている。 また化学合成法では^—カロテンの変換による方法 （Pu r e Ap p 1. Ch em. , 57， 741 , 1 985 ) および C 1 5ホスホニゥム塩から合成する方 法 （He l v. Ch i m. Ac t a, 64， 2436, 1 981) が知られている。 カンタキサンチンは、 ある種のきのこ （B o t an i c a l Ga z e t t e, 1 1 2, 228- 232, 1 950).、 魚類および甲殻類などに存在していることが 知られている （水産動物のカロテノイド， 日本水産学会誌， 1 978) 。 また、 カン タキサンチンを生産する微生物の例としては、 ブレビパクテリゥム属に属する微生物
(Ap p l i e d an d Env i r o nme n t a l Mi c r o b i o l o g y, _55. (10) , 2505, 1 989) 、 ロドコッカス属に属する微生物 （特開平 2- 1 38996号公報） 、 新属の細菌 E— 396株 （FERM BP— 4283)
(特開平 7— 79796号公報、 特開平 8— 9964号公報、 米国特許第 5， 607,
839号明細書、 米国特許第 5， 858, 76 1号明細書） 、 細菌ァグロバクテリウ ム -才ウランティアクム (Ag r ob a c t e r i u m a u r a n t i a c u m)
(B i o s c i . B i o t e c hn o l . B i o c h e m. 58, 1 842, 1
994) が知られている。 また、 化学合成法では )9一力口テンの変換による方法 （J. Ame r. C h e m. S o c. ， 78, 1427， 1 956) および新規な 3—ォキ ソ— C 1 5ホスホニゥム塩から合成する方法 （Pu r e Ap 1. Ch em. , 5_ 丄， 875， 1 979) が知られている。
了ドニキサンチンは金魚ゃコィ等の魚類に存在していることが知られているが、 化 学合成法による製造は困難と思われ、 工業的製造法は知られていない。 アドニキサン チンを生産する微生物の例としては、 フラボパクテリゥム属 (F l av o b a c t e r i um) 、 アルカリゲネス属 (A l e a l i g e n e s) 、 シユードモナス属 （ s eu d omon a s) 、 ァソレテロモアス属 (.Al t e r omon a s) , ヒポモナ ス属 (Hyphomo n a s) およびカリオファノン属 (C a ry op h an o n) に属する微生物 （特開平 6— 165684号公報） 、 新属の細菌 E— 396株 （FE RM BP— 4283) (特開平 7— 79796号公報、 特開平 8— 9964号公報、 米国特許第 5， 607， 839号明細書、 米国特許第 5， 858, 761号明細書） 、 細菌ァグロパクテリゥム 'ォウランティアクム (Ag r o b a c t e r i um a u r an t i ac um) (B i o s c i . B i o t e c hn o l. B i o c h em. 5 _8, 1842， 1 994) が知られている。
0—カロテンの製造法としては /3—ョノンからの合成 （Pu r e Ap p 1. Ch em. ， 6_ ( 1 ) ， 45， 1979) 、 ニンジン、 サツマィモ、 カボチヤ等緑 黄色野菜からの抽出 （天然着色料ハンドブック、 光琳 （1979) 、 天然着色料ハン ドブック編集委員会編） が知られている。 3—力口テンを生産する微生物の例として は、 ドナリエラ (Du n a 1 i e 1 1 a) 属藻類、 ブラケスラ (B 1 a k e s 1 e a ) 属のカビ （J. Ap p 1. B a c t e r i o l . ， 70， 181 , 1991 ) 、 新 属の細菌 E— 396株 （FERM BP— 4283) (特開平 7— 79796号公報、 特開平 8— 9964号公報、 米国特許第 5， 607, 839号明細書、 米国特許第 5 , 858， 761号明細書） 、 細菌ァグロパクテリゥム ·ォウランティアクム (Ag r ob a c t e r i um au r an t i a c um) ， EMS Mi c r o i o l o gy L e t t e r s 128, 139, 1995 ) が知られている。
ェキネノンは、 ォニヒトデなどのヒトデ類、 マダイ等の魚類の内臓、 ゥニ類、 イセ ェビ等の甲殻類の内臓等、 天然物から抽出されている。 また、 ェキネノンを生産する 微生物の例としては、 新属の細菌 E— 396株 （FERM BP— 4283) (特開 平 7— 79796号公報、 特開平 8— 9964号公報、 米国特許第 5， 607， 83 9号明細書、 米国特許第 5， 858, 761号明細書） 、 ァグロパクテリゥム 'ォゥ ランティァクム (Ag r ob a c t e r i um a u Τ_Ά η t i acum) (F EM S Mi c r o b i o l o gy Le t t e r s 1 28, 139， 1995) が知 られている。 ゼァキサンチンの製造法としてはォキソイソホロンの不斉還元により得た光学活性 なヒドロキシケトンを原料として用いる化学合成法 （Pu r e App l . Ch em. ， 6_3_ (1) ， 45， 1991) 、 トウモロコシの種子から抽出する方法 （生体色 素， 1 974， 朝倉書店） が知られている。 ゼアキサンチンを生産する微生物の例 としては、 フラボパクテリゥム属細菌を用いる方法 （C a r 0 t e n 0 i d s, i n M i c r ob i a l Te c hn o l o gy, 2 n d e d n , Vo l . 1，
529-544, New Yo r k： Ac a d emi c Pr e s s) 、 新属の細 菌 E—396株 （FERM BP— 4283) (特開平 7— 79796号公報、 特開 平 8— 9964号公報、 米国特許第 5， 607, 839号明細書、 米国特許第 5， 8 58, 76 1号明細書） 、 細菌ァグロパクテリゥム 'ォウランティアクム (Ag r o b a c t e r i um au r an t i a c um) (FEMS Mi c r o b i o l o g y Le t t e r s 128, 139， 1 995 ) が知られている。
しかしながら、 前述の化学合成法は、 安全性が確証されてない、 微生物による産生 では生産性が低い、 天然物からの抽出ではコストがかかりすぎる等の問題点があった。 例えば、 ァスタキサンチンの製造においては、 天然物のォキアミやザリガニからの抽 出による製造では、 含有量が極めて少なく、 しかも抽出が困難なことからコストが高 い。 赤色酵母ファフィァ .ロドチ一マ (P h a f f i a rho d o zyma) は増 殖速度が小さい、 生産量が少ない、 強固な細胞壁を持っためにァスタキサンチンの抽 出が困難であるなどの問題があるので、 工業化には問題点が多い。 緑藻類へマトコッ カス ·プソレビアリス (Ha_ema t o c o c c u s p l uv i a l i s) も: t曽殖速 度が極めて遅い、 雑菌汚染を起こしやすい、 抽出が困難などの欠点を有するので、 こ の方法の工業化には問題点が多い。
新属の細菌 E— 396株 （FERM BP— 4283) および A - 581— 1株 （ FERM BP— 4671) (特開平 7— 79796公報、 特開平 8— 9964公報、 米国特許第 5， 607, 839号明細書、 米国特許第 5， 858， 761号明細書） は、 生産性が高く、 増殖速度が速い、 抽出が容易であるなどの利点を有するが、 それ らは複数のカロテノイド化合物、 すなわちァスタキサンチン、 アドニキサンチン、 β —カロテン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 ゼアキサンチン、 /3—クリプトキサン チン、 3—ヒドロキシェキネノン、 ァステロイデノンおよびアド二ルビンを同時に生 成するので、 それらの生成割合が培養毎に変動し、 安定した比率で色素を生成させる ことが困難であった。 このため、 生成した色素混合物を動物飼料等に色調改善剤とし て使用する際の色調効果にばらつきを生じ、 商業的生産に対する障害となっていた。 従って一定の比率のカロテノィド化合物を安定して生産する製造方法が求められて いた。
本発明は、 このような実状に鑑みなされたものであり、 その目的は、 カロテノイド 化合物の生成割合を制御すると共に、 その特定の比率のカロテノイド化合物を安定し て生産する製造方法を提供することにある。 発明の開示
本発明者らは、 上記の課題を解決すべく種々検討した結果、 カロテノイドを産生す る微生物の培養において培養中の培養液の溶存酸素を適当な濃度に制御することによ リ、 複数のカロテノイド化合物の生成比率を制御すると共に、 その特定の比率のカロ テノィド化合物を安定に生産することが可能であることを見いだし、 本発明に到達し た。
本明細書は、 本願の優先権の基礎である日本国特許出願、 特願 2000- 175124号の明細 書およびノまた図面に記載される内容を包含する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明をさらに詳細に説明する。
本発明の方法においては、 カロテノイド化合物を産生する微生物が用いられる。 こ のような微生物としては、 たとえばカロテノイドを産生する細菌、 酵母、 かびなどが 挙げられる。 細菌としては 1 6 Sリボソーム RNAに対応する D NAの塩基配列が配 列番号 1記載の塩基配列と 9 8 %以上の相同性を有する細菌が挙げられる。 具体的に は、 E— 3 9 6株 （F E RM B P— 4 2 8 3 ) および A— 5 8 1— 1株 （F R RM
B P— 4 6 7 1 ) 、 ならびに E— 3 9 6株あるいは A— 5 8 1— 1株を変異改良す ることで得られる各種変異株およびこれら 2株の近縁種を挙げることができる。 配列 番号 1の DN Aの塩基配列は、 E— 396株の 16 Sリボソーム RN Aに対応するも のであリ、 また配列番号 2の DN Aの塩基配列は、 A— 581— 1株の 1 6 Sリボソ —ム R N Aに対応するものである。
16 S リボソーム RNAの塩基配列の相同性に基づいた微生物の分類は近年、 微 生物の分類の手段として主流になりつつあるが、 これは、 従来の運動性、 栄養要求性、 糖の資化性などに基づく分類では、 自然突然変異による形質の変化等によリ誤った同 定をされる場合もあるという問題点があつたためである。 16 S リボソーム RNA の塩基配列の相同性に基づいた分類では、 極めて遺伝的に安定な 16 S リボソーム RNAの塩基配列に基づくため、 信頼度が格段に向上する。 E— 396株と A— 58 1— 1株の 16 S リポソ一ム RN Aの塩基配列の相同性は 99. 4 %であリ、 極め て近縁な株であることが判明した。 よって、 これらの菌株はカロテノイドを生産する 細菌として一つのグループを形成している。 E— 396株および A— 581— 1株な らびに本発明の培養条件によって効果を発揮する菌株は、 E- 396株あるいは A— 581 - 1株の変異株および近縁種として E— 396株の 16 S リボソーム RNA の塩基配列と 98 %以上の相同性を有する微生物として定義される。
本発明に使用する具体的な微生物として挙げられる E— 396株について説明する。 この株は、 本発明者らが新しく単離したものであり、 独立行政法人産業技術総合研究 所特許生物寄託センター （日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番地 1中央第 6) に平成 5年 4月 27日に FERM B P— 4283として寄託された。 さらに具体的な他の 微生物としては A— 581— 1株 （FERM BP— 4671) を挙げることができ る。 この株は、 発明者らが新しく単離したものであり、 独立行政法人産業技術総合研
—クリブトキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノン、 ァステロイデノン、 カンタキサ ンチン、 ゼアキサンチン、 アド二ルビン、 アドニキサンチン、 ァスタキサンチンを同 時に生成する。
生合成は^一力口テンを上流とし、 ケト化酵素および水酸化酵素によりそれぞれ両 端の 6員環が修飾され最終的にはァスタキサンチンが生成すると推定されている。 し かしながら培養時間を長くしても、 全てがァスタキサンチンに変換されることはなく、 それらの化合物が培養終了まで存在する現象が認められていた。 またその生成割合は 培養毎に一定ではなく、 例えば、 生合成で上流と思われる^—カロテン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 アド二ルビン、 3—ヒドロキシェキネノンの生成割合が多い場合、 ァスタキサンチンの生成割合が多い場合、 ァドニキサンチンの生成割合が多い場合な ど様々であった。
このため、 生成した色素混合物を動物飼料等に色調改善剤として使用する際の色調 効果にばらつきを生じ、 商品として販売できないことから商業生産のための障害とな つていた。 そこで種々検討を重ねた結果、 生成色素の生成割合に影響を与える因子は、 培養液中の溶存酸素であることを見いだした。 撹拌回転速度を一定にした培養では、 培養液中の溶存酸素濃度は微生物の微妙な酸素消費速度の差に左右され、 その結果そ れぞれの色素の生成割合が培養ロット毎にばらついていたことが判明した。 この問題 を解決するために培養中の培養液中の溶存酸素を制御することにより、 生成する力口 テノイド化合物すなわち^—カロテン、 ェキネノン、 /3—クリプトキサンチン、 3— ヒドロキシェキネノン、 ァステロイデノン、 カンタキサンチン、 ゼアキサンチン、 ァ ドニルビン、 アドニキサンチン、 ァスタキサンチンの生成比率を制御できる。
培養液中の溶存酸素濃度を低く制御すると、 生合成で上流と思われる /3—力口テン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノンおよびアド二ルビンの生 成割合を高めることができ、 培養液中の溶存酸素濃度を中程度に制御すると、 ァスタ キサンチンの生成割合を高めることができ、 また培養液中の溶存酸素濃度を高く制御 することによリアドニキサンチンの生成割合を高めることができる。
例えば、 ァスタキサンチンの生成比率を高めるためには培養液中の溶存酸素濃度を 飽和酸素濃度の 1 5〜4 0 %、 好ましくは 2 0〜 3 0 %にコントロールする。 溶存酸 素濃度が飽和酸素濃度の 2 0〜 3 0 %の条件下、 ァスタキサンチンの生成割合を 4 0 %以上に高めることができる。
溶存酸素濃度が飽和酸素濃度の 0〜 1 5 %、 好ましくは 0〜 1 0 %の範囲では、 β 一力口テン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノンおよびアド 二ルビンが多く蓄積しァスタキサンチンの生成が抑制される。 この条件下、 β—力口 テン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノンおよびアド二ルビ ンの生成量の合計は 6 0 %以上であり、 ァスタキサンチンの生成割合を 4 0 %以下に することができる。
また、 ァドニキサンチンの生成比率を高めるためには培養液中の溶存酸素濃度を飽 和酸素濃度の 3 5〜 1 0 0 %、 好ましくは 4 0 ~ 1 0 0 %にコントロールする。 この 条件によりアドニキサンチンの生成割合を 3 5 %以上にすることができる。
また培養フェーズにおいては、 対数増殖期において溶存酸素濃度は重要であり、 例 えばこの時期に溶存酸素濃度を高くすると、 その後に低い条件に変えてもアドニキサ ンチンの生成割合は高くなる。
溶存酸素濃度の制御は通常培養で用いられる方法、 例えば溶存酸素電極によリ測定 した培養液中の溶存酸素濃度値に応じて培養槽内に供給する空気あるいは酸素の流量 を自動的に調節する方法あるいは溶存酸素電極によリ測定した培養液中の溶存酸素濃 度値に応じて撹拌羽根の回転速度を自動的に調節する方法等いずれの方法も用いるこ とができる。 実施例
以下、 実施例にょリ本発明をさらに詳しく説明するが、 本発明はこれらの実施例の みに限定されるものではな 、。
〔実施例 1〕
表 1の組成からなる培地 1 0 O m 1を 5 0 O m 1容量の三角フラスコに入れ 1 2 1 °C、 1 5分間蒸気殺菌した。 これに E— 3 9 6株 （F E RM B P— 4 2 8 3 ) を植 菌し 2 8 °Cで 1日間、 1 5 0 r p mの回転振とう培養を行った。 次ぎに、 この培養液 6 0 0 m l分を表 2の組成からなる培地が 2 0 L入った 3 0 L容量の通気撹拌培養槽 に植菌し 2 8 °C、 1 . 0 vvmの好気培養を 9 0時間行った。 培養途中の p Hは 7 . 2に 2 0 %N a O Hで連続的に制御した。 シユークロースは生育とともに消費されるので 培養開始 1日目および 2日目にそれぞれ 3 0 0 gずつ添加した。 培養液中の溶存酸素 は、 溶存酸素電極と撹拌羽根のモータ一とを連動させ、 溶存酸素の値に応じて回転速 度を変化させる方法にょリ自動制御した。 また最低回転速度は 8 0 r p mに設定した。 溶存酸素濃度は、 その培地における酸素の飽和濃度の比率で、 それぞれ 5、 1 5、 2 0、 2 5、 3 0、 3 5 %に設定した。
各条件における生成したカロテノイド （各化合物の記号を表 3に示す） の生成濃度 と比率は、 表 4および表 5に示すとおりであつた。
表 1 組成 添加:
コーンスチープリカー 30g/L
シユークロース 30g/L
KH2P04 0.54g/L
K2HP04 2.78g/L
MgS04- 7H20 12.0g/L
CaCI2- 2H20 0.1 g/し
FeS04-フ H20 0.3g/L
PH7.2
表 2 組成 添加】
コーンスチープリカ一 30g/L
シユークロース 30g/し
KH2P04 1.5g/L
Na2HP04- 12H20 3.8g/L
gS04-7H20 3.0g/L
CaCI2.2H20 0.2g/L
FeS04-7H20 1.0g/L
pH7.2 表 3
Figure imgf000011_0001
表 4
Figure imgf000011_0002
表 5
Figure imgf000011_0003
前駆体： A+B+G+D+E+F
〔実施例 2〕
上記表 1の組成からなる培地 100mlを 500m l容量の三角フラスコに入れ 1 21で、 15分間蒸気殺菌した。 これに E— 396株 （FERM BP— 4283) を植菌し 28°Cで 1日間、 1 50 r pmの回転振とう培養を行った。 次ぎにこの培養 液 100 m 1分を上記表 2の組成からなる培地が 2 L入った 5 L容量の通気撹拌培養 槽に植菌し 28 °C、 1. 0 vvmの好気培養を 90時間行つた。 培養途中の p Hは 7. 2 に 20°/oNaOHで連続的に制御した。 シュ一クロースは生育とともに消費されるの で培養開始 1日目および 2日目にそれぞれ 30 gずつ添加した。 培養液中の溶存酸素' は、 溶存酸素電極と撹拌羽根のモータ一とを連動させ、 溶存酸素の値に応じて回転速 度を変化させる方法により自動制御した。 また最低回転速度は 100 rpmに設定し た。 溶存酸素濃度はその培地における酸素の飽和濃度の比率で、 25%に設定した。 比較のため溶存酸素を制御しない条件、 すなわち撹拌回転速度を 45 Orpm—定での 条件での培養も行った。
各条件における生成したカロテノィドの生成濃度は、 表 6に示すとおりであった。 表 6
Figure imgf000012_0001
〔実施例 3〕
E— 396株 （FERM BP— 4283) を NTG (N— me t hy l— N， ― n i t o r o-N-n i t r o s o gu an i d i n e) で変異処理し、 赤色の色調 が濃いコロニーを選択した。 これらの株の培養液中のカロテノイド化合物を分析し、 ァスタキサンチンの生産性が向上した変異株 Y— 107 1株を選択した。 表 1の組成 からなる培地 100mlを 500m l容量の三角フラスコに入れ 121°C、 15分間 蒸気殺菌した。 これに Y— 107 1株を植菌し 28°Cで 1日間、 1 50 rpmの回転 振とう培養を行った。
次ぎにこの培養液 100 m 1分を上記表 2の組成からなる培地が 2L入った 5 L容 量の通気撹拌培養槽に植菌し 28°C、 1. 0 vvmの好気培養を 90時間行った。 培養途 中の pHは 7. 2に 20%N a OHで連続的に制御した。 シュ一クロースは生育とと もに消費されるので培養開始 1日目および 2日目にそれぞれ 30 gずつ添加した。 培 養液中の溶存酸素は、 溶存酸素電極と撹拌羽根のモーターとを連動させ、 溶存酸素の 値に応じて回転速度を変化させる方法により自動制御した。 また最低回転速度は 10 O rpmに設定した。 溶存酸素濃度はその培地における酸素の飽和濃度の比率で、 そ れぞれ 5、 1 5、 20、 25、 30、 35%に設定した。
各条件における生成したカロテノイドの生成濃度と比率は、 表 7および表 8に示す とおりであった。
表 7 .
Figure imgf000013_0001
表 8
Figure imgf000013_0002
〔実施例 4〕
上記表 1の組成からなる培地 10 Om 1を 500m 1容量の三角フラスコに入れ 1 21°C、 15分間蒸気殺菌した。 これに A— 581— 1株 （FERM BP— 467 1) を植菌し 28°Cで 1日間、 1 50 r pmの回転振とう培養を行った。 次ぎにこの 培養液 100 m 1分を上記表 2の組成からなる培地が 2 L入った 5 L容量の通気撹拌 培養槽に植菌し 28°C、 1. Ovvmの好気培養を 90時間行った。 培養途中の p Hは 7 2に 20%Na〇Hで連続的に制御した。 シユークロースは生育とともに消費される ので培養開始 1日目および 2日目にそれぞれ 30 gずつ添カ卩した。 培養液中の溶存酸 素は、 溶存酸素電極と撹拌羽根のモータ一とを連動させ、 溶存酸素の値に応じて回転 速度を変化させる方法により自動制御した。 また最低回転速度は 1 0 0 r p mに設定 した。 溶存酸素濃度はその培地における酸素の飽和濃度の比率で、 それぞれ 5、 1 5、 2 0、 2 5、 3 0、 3 5 %に設定した。
各条件における生成したカロテノイドの生成濃度と比率は、 表 9および表 1 0に示 すとおりであった。
表 9
Figure imgf000014_0001
表 1 0
Figure imgf000014_0002
本明細書で引用した全ての刊行物、 特許および特許出願をそのまま参考として本明 細書にとり入れるものとする。 産業上の利用可能性
複数種のカロテノィド化合物の微生物学的製造法において、 培養中の培養液の溶存 酸素濃度を制御することにより、 産生するカロテノィド化合物の生成割合を変化させ ることができる。

Claims

言青求の章包囲
1. カロテノィド化合物を複数種類産生する微生物を培養してカロテノィド化合物を 製造する方法において、 培養中の培養液の溶存酸素濃度を制御することにより、 産生 するカロテノィド化合物の生成割合を一定にすることを特徴とする方法。
2. 微生物が 16 Sリボソーム RNAに対応する DNAの塩基配列が配列番号 1記載 の塩基配列と 98 %以上の相同性を有する細菌である請求項 1に記載の方法。
3. 微生物が E— 396株 （FERM BP-4283) およびその変異株ならびに A— 58 1— 1株 （FERM BP— 467 1) およびその変異株から選ばれる請求 項 1に記載の方法。
4. カロテノイド化合物がァスタキサンチン、 アドニキサンチン、 β—力 Ό亍ン、 ェ キネノン、 カンタキサンチン、 ゼアキサンチン、 ^一クリプトキサンチン、 3—ヒド 口キシェキネノン、 ァステロイデノンおよびアド二ルビンより選ばれる 1種以上であ る請求項 1に記載の方法。
5. カロテノィド化合物を複数種類産生する微生物を培養してカロテノィド化合物を 製造する方法において、 培養中の培養液の溶存酸素濃度を制御することにより、 産生 するカロテノィド化合物の生成割合を変えることを特徴とする方法。
6. 微生物が 16 Sリボソーム RNAに対応する DNAの塩基配列が配列番号 1記載 の塩基配列と 98 %以上の相同性を有する細菌であることを特徴とする請求項 5に記 載の方法。
7. 微生物が Ε— 396株 （FERM BP-4283) およびその変異株ならびに A— 581— 1株 （FERM BP-4671 ) およびその変異株から選ばれる請求 項 5に記載の方法。
8. カロテノイド化合物がァスタキサンチン、 アドニキサンチン、 /3—力口テン、 ェ キネノン、 カンタキサンチン、 ゼアキサンチン、 iS—クリプトキサンチン、 3—ヒド 口キシェキネノン、 ァステロイデノンおよびァドニルビンよリ選ばれる 1種以上であ る請求頊 5に記載の方法。
9. 培養中の培養液中の溶存酸素濃度を飽和濃度の 40〜100%に制御することに よリアドニキサンチンの生成比率を高める請求項 5に記載の方法。
1 0 . 培養中の培養液中の溶存酸素濃度を飽和濃度の 2 0〜 3 0 %に制御することに よリアスタキサンチンの生成比率を高める請求項 5に記載の方法。
1 1 . 培養中の培養液中の溶存酸素濃度を飽和濃度の 0〜 1 0 %に制御することによ リ i3—カロテン、 ェキネノン、 カンタキサンチン、 3—ヒドロキシェキネノンおよび ァドニルビンの生成比率を高める請求項 5に記載の方法。
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