DE2344586A1

DE2344586A1 - Verfahren zur herstellung von pullulan

Info

Publication number: DE2344586A1
Application number: DE19732344586
Authority: DE
Inventors: Koso Kato; Makoto Shiosaka
Original assignee: Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1972-09-04
Filing date: 1973-09-04
Publication date: 1974-03-14
Also published as: FR2199553B1; FI50139C; DE2344586B2; JPS5142199B2; JPS4942894A; NL7312184A; GB1450130A; CH579629A5; AR196451A1; IT995276B; CA1003352A; ZA736011B; NO140828B; US3912591A; DE2344586C3; FR2199553A1; ES418475A1; BE804441A; AU5993173A; NO140828C

Description

Priorität: 4. September 1972, Japan, Nr. 87 938/1972

Verfahren zur Herstellung von Pullulan

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pullulan durch Kultivierung von geeigneten Mikroorganismen in einem Kulturmedium, das als Haupt-Kohlenstoffquelle ein Saccharid enthält.

Pullulan ist ein Polymeres von Glucose, genauer ein PoIysaccharid, das aus ^-1,4-verknüpften Maltotriose-Einheiten besteht, die wiederholt durch oH,6-Verknüpfungen auf den endständigen Glucosidresten des Trisaccharids polymerisiert sind. Dies kann durch folgende Struktur veranschaulicht werden:

0-0-

0-0-0

.-1, ^-Verknüpfung 0-0 /-1,6-Verknüpfung Q

Wie aus den Artikeln von H. Bender, Biochem. Biophys. Acta, J>6, 3o9 (1959), Seinosuke Ueda, Journal of the Chemical Society of Japan, Industrial Chemistry Section, 67, 575-?6o (196²O und von Eiji Ninomiya, Journal of Agricultural Chemical Society of Japan, 115-118 (1969) hervorgeht, wird Pullulan extracellular von

4 09811/ÖÖÖ0

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einem Stamm von PulIuIarla pullulans erzeugt, wenn dieser Stamm in einem Saccharose und/oder Glucose als Kohlenstoffquellen enthaltendem Medium aerobisch kultiviert wird. Es wird berichtet, daß der Polymerisationsgrad (nachstehend als PG abgekürzt) des auf diese Weise erhaltenen Pullulans in den Bereich von wenigen loo bis mehreren looo fällt. Es liegen aber noch keine Anhaltspunkte über die Beziehungen zwischen den Kultivierungsbedingungen und .dem Polymerisationsgrad des Pullulans vor.

Es wurden nun in ausgedehntem Maße die Kultivierungsbedingungen untersucht, die den Polymerisationsgrad des gebildeten Pullulans bestimmen, um Bedingungen ausfindig zu machen, welche zu der Erzeugung eines Pullulans mit dem gewünschten Polymerisationsgrad für die jeweiligen Anwendungszxvecke führen. Diese Untersuchungen haben zu der Erkenntnis geführt, daß eine Erniedrigung der Anfangs-pH-Werte des Kulturmediums und/oder eine verminderte Konzentration von Phosphationen im Medium den Polymerisationsgrad des Pullulans stark erhöhen. Es ist weiterhin festgestellt worden, daß die Erhöhung des Anfangs-pH-Wertes gleichzeitig zu einer Verkürzung der Kultivierungsperiode und zu einer Erhöhung der Ausbeute an Pullulan, d.h. zu einer Erhöhung des Verhältnisses von Pullulan zu eingesetztem Zucker führt. Hierdurch wird es ermöglicht, den Polymerisationsgrad, die Ausbeute und die Kultivierungszeit des Pullulans bei der technischen Herstellung frei einzustellen. 'Weiterhin wird hierdurch die technische Herstellung von Pullulan mit dem gewünschten Polymerisationsgrad ermöglicht. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung von'Pullulan zur Verfügung, das für die technische Herstellung von Pullulan geeignet ist.

Durch die Erfindung kann auch die Kultivierungszeit verkürzt werden und die Ausbeute des Pullulans verbessert werden, indem die Kultivierung in einem Kulturmedium mit einem höheren pH-V7ert und einer höheren Phosphatkonzentration erfolgt. Dieses Verfahren ist geeignet, um Pullulan mit niedrigem Molekulargewicht herzustellen, das zur Herstellung von Produkten mit niedriger Viskosität

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-3- 23U586

oder zur Herstellung von Maltotriose aus diesem Pullulan herangezogen werden kann. Ferner besitzt das auf diese Weise erhaltene Pullulan mitiniedrigem Molekulargewicht eine niedrige Viskosität, die die Reinigung erleichtert, so daß das erfindungsgemäße Verfahren zur technischen Herstellung von Pullulan mit niedrigem Molekulargewicht äußerst gut geeignet ist. Andererseits kann gewtinschtenfalls bei der Herstellung von Formkörpern wie Filmen, Folien und Fasern, wobei die Verwendung eines Pullulans mit höherem Molekulargewicht gewünscht wird, eine Erniedrigung des Anfangs-pH-Wertes und des Phosphatgehaltes des Kulturmediums zu der Bildung eines Pullulans mit einem Molekulargewicht von mehr als 2.000.000 führen. Das auf diese Weise erhaltene Pullulan mit hohem Molekulargewicht kann wirksam dazu verwendet werden, um transparente zähe Filme bzw. Folien, Fasern und andere Formkörper herzustellen.

Durch die Erfindung kann auch ein Pullulan mit einem Polymerisationsgrad hergestellt werden, der auch zur Anwendung als Verdickungsmittel (Mittel zur Erhöhung der Viskosität) und Dispergierungsmittel bei der Herstellung von Nahrungsmittel geeignet ist.

Als Pullulan-erzeugende Mikroorganismen können bei dem Verfahren der Erfindung alle beliebigen Stämme verwendet werden, welche dazu imstande sind, in einem Kulturmedium Pullulan zu erzeugen, sowie alle Mutanten davon, die die gleiche Aktivität besitzen. Beispiele-für geeignete Stämme sind: Pullularia fermentans var fermentans IFO 64ol, Pullularia fermentans var fusca IFO 64o2, Pullularia pullulans AHU 9553, Pullularia pullulans IFO 6353 und Dematium pullulans IFO 4464.

Das Kulturmedium, wie es in den oben genannten Literaturstellen beschrieben wird, enthält als Kohlenstoffquelle Saccharose, Invertzucker, Isomerisierten Zucker, Fructose und/oder Glucose, wobei auch die Verwendung einer teilweise hydrolysierten Stärke in dem Medium sehr zufriedenstellende Ergebnisse ergibt.

'i 09811/0980 -4-

* ' 23U586

Im allgemeinen können Ammoniumsalze und Nitrate als anorganische Stickstoffquellen und Peptone als organische Stickstoffquellen verwendet werden. Darüberhinaus können geeignete Mengen von Phosphat- und'Metallionen, z.B. Magnesiumionen oder Eisen(II)-ionen zu den Kulturmedien zugesetzt werden. Nach der Wärmesterilisierung des auf diese Weise erhaltenen Kulturmediums nach der Einstellung des pH-Wertes werden Stämme des Ausgangsmediums auf das Medium Inokuliert. Die Mikroorganismen werden in dem Medium nach der üblichen Methode kultiviert, z.B. unter Belüftung oder Durchbewegung, bei 25 bis j5o°C, vorzugsweise bei 27°C und über Zeitspannen von etwa 7 Tagen. Etwa j5 Tage nach Beginn der Fermentation wird die Bildung einer erheblichen Menge von Pullulan beobachtet und die Viskosität des Kulturgemisches steigt an.

Der Restzucker in dem Medium wird in bestimmten Intervallen bestimmt und die Kultivierung wird an dem Punkt abgebrochen, wo die Menge des Restzuckers ihren niedrigsten Wert erreicht hat. Die Mikrobenzellen werden aus dem Flüssigkeitsmedium durch Zentrifugieren auf die übliche Weise entfernt und das zellfreie flüssige Medium wird gewünsehtenfalls mit Aktivkohle entfernt.

Vorzugsweise wird die resultierende Flüssigkeit mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, z.B. Methylalkohol, Äthylalkohol etc. versetzt, um das erzeugte Pullulan zur Ausfällung zu bringen, das sodann durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Weiterhin kann das gewonnene Pullulan gewünsehtenfalls in warmem Wasser aufgelöst werden und die Reinigung durch Ausfällung·'durch Zugabe eines Lösungsmittels kann wiederholt werden. Die Pullulanausbeute wird nach dem Trocknen des Produkts errechnet. Das auf diese Weise erhaltene Pullulan ist ein weißliches Pulver, das sich in Wasser sehr rasch unter Bildung einer viskosen Lösung auflöst. Das Molekulargewicht des nach dem obigen Vorgehen erhaltenen Pullulans variiert in einem weiten Bereich, je nach den angewendeten Kultivierungsbedingungen, d.h. im Bereich von 50.000 bis 4.500.000. Auch die Ausbeute des Pullulans, bezogen auf den eingesetzten Zucker variiert je nach den angewendeten Kultivierungsbedingungen von 2o bis 75$.

40981 1 /0980 " ⁵ ~

Oben wurde ein typischerProzess zur Erzeugung von Pullulan beschrieben. Die vorliegende Erfindung soll nachstehend hinsichtlich der Wirkungen des pH-Wertes und der Konzentration der Phosphationen 'im Kulturmedium auf das Molekulargewicht und die Ausbeute des Pullulans, sowie den KultivierungsZeitraum weiter erläutert werden. Wie in den Beispielen im einzelnen beschrieben wird, wurden Kulturtests mit mehreren Stämmen auf Kulturmedien durchgeführt, die Io Gew.-^ teilweise hydrolyslerte Stärke als Kohlenstoffquelle, Peptone als Stickstoffquelle und geringe Mengen von Phosphat, Natriumchlorid, Ammonium-Eisen(II)-sulfat und Ammoniumsulfat enthielten. Die Anfangs-pH-Werte der Medien wurden im Bereich von 5,0 bis 7,5 variiert. Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Die Anwendung eines pH-Wertes von 6,5 oder niedriger erhöht offensichtlich die Viskosität der Kulturbrühe auf oberhalb 300 centipoise. Ein_;pH-Wert von 7,ο oder höher vermindert die Viskosität auf weniger als 24o centipoise. Bei einem pH-Wert von 5 bis

6 hatte das erhaltene Pullulan ein Molekulargewicht im Bereich von I.500.000 bis 4.000.000 und die KuItürbrühe war hochviskos, so daß die Brühe ihre Fließfähigkeit verlor. Wenn andererseits die Inkubierung bei einem pH-Wert von 6,5 oder höher durchgeführt wurde, dann lagen die Pullulan-Ausbeuten im Bereich von 50 bis 75 Gew.-^. Das durch Gel-Filtrationsanalyse gemessene Molekulargewicht war niedrig und lag bei etwa 5°·000 bis loo.ooo.

Das Verfahren der Erfindung ergibt im Verhältnis zu den bekannten Verfahren, bei denen die Ausbeuten etwa 2o bis etwa 5o Gew.-% betrugen, höhere Ausbeuten. Die Beobachtung des Wachstums von Stämmen auf Kulturmedien von verschiedenen pH-Werten nach 4, 6 und

7 Tagen zeigten, daß bei einem niedrigen pH-Wert, z.B. 5*5* die Viskosität der Brühe über l.ooo centipoise betrug, während bei einem pH-Wert von 7,8 bis 8,0 die Viskosität lediglich 24 bis centipoise betrug. Der Vergleich der Ausbeuten zeigte jedoch, daß ein hoher pH-Bereich, d.h. von 7,8 bis 8,0 eine hohe Ausbeute, d.h. von über 50 Gew.-% ergibt. Anders ausgedrückt bedeutet das, daß die Pullulan-Ausbeute, bezogen auf den eingesetzten Zucker,

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bei einem pH-Wert von 5,5 3o# betrug, daß sie jedoch bei Anwendung eines pH-Bereiches von 6,6 bis J_to auf über 5o Gew.-% anstieg.

4 *

Das durchschnittliche Molekulargewicht des Pullulans betrug bei einem pH-Wert von 6 etwa J5.ooo.ooo, während es bei einem pH-Wert von 7,o etwa 80.000 betrug. Somit wurde gemäß der Erfindung festgestellt, daß es möglich ist, sowohl die Ausbeute als auch das durchschnittliche Molekulargewicht des Pullulans in einem großen Ausmaß zu variieren.

Weiterhin wurden die Menge des Restzuckers in der Brühe und die Pullulan-Ausbeute nach einer 4-tägigen, 6-tägigen und 8-tägigen Kultivierung bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß die Menge des Restzuckers allmählich bis zur Endstufe der Kultivierung abnimmt und daß umgekehrt die Pullulan-Ausbeute ansteigt. Der Restzucker beträgt nach 8 Tagen etwa lo.bis 2o Gew.-^. Bei einem pH-Bereich von 7»ο bis 8,0 betrug jedoch der Restzucker innerhalb 4 bis 6 Tagen 1 bis Io Gew.-^. Umgekehrt erreichte die Pullulan-Ausbeute in dem gleichen Zeitraum, d.h. von 4 bis 6 Tagen nahezu ihren höchsten Wert. Die obigen Tatsachen zeigen, daß je höher der pH-Wert ist, desto rascher der Zuckerverbrauch und die Bildung des Pullulans erfolgt, und daß dementsprechend die Pullulan-Ausbeute erhöht wird.

Die oben beschriebene Verbesserung der Ausbeute und die Verkürzung der Kultivierungsperiode durch Kontrolle des pH_rWertes des Kulturmediums zeigt sich am signifikantesten, wenn als Kohlenstoffquelle eine Dattelextrakt-Lösung verwendet wird.

Datteln haben einen Zuckergehalt von etwa 50 Gew.-^. Die Feststoffe der wässrigen Extraktlösung umfassen fast annähernd gleichwertige Mengen von Glucose und Fructose, wobei der Rest aus anorganischen Salzen besteht. Der Gesamt-Anionengehalt beträgt 2.5oo bis 3·5οο mg/1 bei einer Zuckerkonzentration von l8# (Gew./Vol.) als CaC(X. Die Verwendung eines Dattelextrakts, ob dieser nun als Kohlenstoffquelle nach der Entfärbung mit Aktivkohle oder per se verwendet

409811/09S0 "⁷~

wird, verkürzt die Kulturperiqde und verbessert die Pullulan-Ausbeute, ähnlich wie in dem oben beschriebenen Fall eines hohen pH-Wertes. Darüberhinaus bringt eine Verwendung einer Dattelextrakt-Lösung, die mit Ionenaustauschern gereinigt worden ist, im Vergleich zu der Verwendung eines teilweisen Stärkehydrolysate oder von Saccharose als Kohlenstoffquelle keinen wesentlichen Unterschied mit sieh. Dies ist wahrscheinlich auf eine Pufferwirkung der Ionen, die in großen Mengen in dem Medium vorhanden sind und nicht auf die Abnahme des pH-Wertes in der Kultur zurückzuführen. Die Verwendung einer Dattelextrakt-Lösung als Kohlenstoffquelle ist für die technische Herstellung von Pullulan von Vorteil.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die Konzentration der Phosphationen in dem. Medium den KultivierungsZeitraum und die Ausbeute an Pullulan beeinflußt. So ergibt, wie oben beschrieben, die Verwendung von o,l bis o,5$ (Gew./Vol.) von Phosphat bei einem pH-Wert von 5,5 die Bildung von Pullulan mit einem hohen Molekulargewicht, das sich von 1.500.000 bis 3·°ο°·οοο erstreckt. Das Molekulargewicht des Pullulans vermindert sich entsprechend der Zunahme der Phosphatkonzentration. o,l bis o,3# Phosphat führen zu einem Pullulan mit einem Molekulargewicht von 2.000.000 bis J>,000.000. In ähnlicher Weise ergeben bei einem pH-Wert von 6,0 o,5# (Gew./Vol.) Phosphat ein Molekulargewicht von etwa 7o.ooo, während o,l bis o,2$ (Gew./Vol.) ein Molekulargewicht von etwa 2oo.ooo ergeben. Wie oben beschrieben wurde, ergibt ein niedriger Anfangs-pH-Wert im allgemeinen ein hohes Molekulargewicht des Pullulans, das jedoch stark entsprechend der Phosphatkonzentration variiert. Somit kann das Molekulargewicht des Pullulans, das in dem Kulturmedium erzeugt wird, kontrolliert werden, indem man den Anfangs-pH-Wert und/oder die Phosphat-Ionen-Konzentration in dem Medium variiert oder modifiziert. Für die Fermentation kann ein Phosphat verwendet werden, wie es herkömmlicherweise eingesetzt wird, z.B. KpHPO₂,. .

de K₂HPO₁^ verwendet.

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Als Phosphat wur-

- 8 409811/0980

Beispiel 1;

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung der Variierung des pH-Wertes auf das Molekulargewicht des erhaltenen Pullulans.

Beispiel la:

Bei dieser Versuchsreihe wurden als Stämme Dematium pullulans IPO 4464- und Pullularia Pullulans-2 (nachstehend als Kp-13 bezeichnet) verwendet. Das Kulturmedium enthielt lofo (Gew./Vol.) Stärkesirup mit einem Dextrose-Äquivalentwert (nachstehend als DK-Wert abgekürzt) von 4^, o,2$ Phosphat, o,2# Natriumchlorid, o,2.% Pepton, o,o4$ Magnesiumsulfat und ο,οοΐ^ Ammonium-Eisen(II)-sulfat. Diese Angaben beziehen sich auf das Verhältnis von Gewicht zu Volumen. Die Ausgangskultur oder Impfkultur wurde durch Kultivierung der einzelnen Stämme auf einem Medium mit der obigen Zusammensetzung bei 27⁰C über einen Zeitraum von 2 Tagen erhalten. Die Ausgangskultur wurde auf das Hauptkultivierungsmedium in einer Menge von 2 bis ~5$> (Vol./Vol), bezogen auf das Medium, inokuliert.

Die Hauptkultivierung erfolgte in der Weise, daß loo ml des obigen, in einem 5oo ml Erlenmeyer-Kolben gegebenen Mediums sterilisiert wurden, der pH-Wert des Mediums auf 5*5 bis 8,ο eingestellt wurde, 2% (Vol./Vol.) einer Ausgangskultur von einem der Stämme zugegeben wurde und daß sodann das Gemisch 7 Tage auf einem Drehmischer bei 27°C inkubiert wurde. Nach Vervollständigung der Kultivierung wurden die Zellen abzentrifugiert* Das überstehende Produkt wurde entfärbt und durch Zugabe von Aktivkohle gereinigt. Es wurde mit Methylakohol versetzt, das eine Lösung mit einer Konzentration von 5o# (Vol./Vol.) des Alkohols erhalten wurde, um Pullulan auszufällen. Der von der Lösung durch Zentrifugieren gewonnene Niederschlag wurde in einer geringen Menge Wasser wieder aufgelöst, worauf die Zugabe von Methylakohol und die Zentrifugierung wiederholt wurde. Das auf diese Weise erhaltene gereinigte Pullulan-Produkt wurde mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in den Tabellen Ia und Ib zusammengestellt.

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Tabelle la

Stamm: Dematium pullulans IFO 4464

End-pH-Wert

Trübung (x lo)

Restzucker
% Gew./Gew.

Pullulan-Ausbeufee
% Gew./Gew.

mittleres Molekulargewicht

Kultivierungs- 4
Zeitraum, Tage

Anfangs-pH- wert	5,5	VjJ VjJ VjJ VjJ O O	3,3o	3,3o ?, 32	o,9 o,9	1,4	1,8 1,6	5o,5 51,9	24,4 23,9	16,5 .17,3	18,6 11,9	21,8 22,6	r	31,2 25,7	2oo χ I8o	ti
	6,o	3,5 3,4	3,5 3,5	3,5 3,4	o,9	1,4 1,5	1,9 1,8	38. 41.	in co OJ Ol	O Ol OI CVI	26 24	3o 31	36 35	l8o 19o	tt tt
	6,5	3,7 3,7	3,6 3,6	3,6 3,7	1,1	1,7	1,7 1,7	co Ch CM Ol	17. 19.	17. 18.	35 36	4o 4o	4o 41	2oo 2oo	tt tt
(O CO	7,o	3,9 3,9	3,9 3,9	3,8 3,8	1,1. 1,1	1,8 1,7	2,ο 1,9	Ch O rH CM	15. 13.	• ft. O CM tH tH	48 45	61 62	O\ Ch VjJ O	ro ro Ch Ul	tt tt *
1 /0	7,5	4,2 4,2	4,2 4,2	4,2 4,3	1,1 1,2	1,9 1,8	OJ OJ	18. 19.	lo. 11.	5. lo.	'47 49	Ch Ch VO OO	Ch Ch VO VO	O tH CM Ol	tt tt
O	8,o	4,7 4,7	4,5 4,5	4,6 4,7	1,2 1,1	1,8 1,7	OJ CM	Ch ui	1. o.3	O O Ul OO	48 55	7o 71	71 71	18 15	tt tt

Fußnote: Die Trübung (xlo) ist als Absorption einer lo-fach verdünnten Lösung bei 66o m λχ dargestellt, wozu ein Spektrophotometer Modell lol von Hitachi mit einer Zelle von Io mm verwendet wurde

Der Restzucker und die Pullulan-Ausbeute sind als Gew.-%, bezogen auf den eingesetzten Zucker angegeben. Dieselben Angaben gelten auch für Tabelle Ib.

. - Io -

Tabelle Ib

Stamm Kp-13

End-pH-Wert

Trübung

Restzucker % Gew./Gew.

Pullulan-Ausbeute
% Gew./Gew.

mittleres Molekulargewicht

Kultivierungszeitraum, Tage

Anfangs-pH-Wert

5,5 6,o 6,5 7,o

3,3 3,4 3,6 4,o

3,3 3,4 3,6 3,9

3,2 3,3

3,5 3,9

o,9 1,1 1,2

1,3

1,3 1,5 2 2

5o.
28.
16.
15.

18.

17. lo.

5.

12. lo. 1. 0.5

27 4o 68 69

38 55 7o 75

246xlo

292 "

2o "

8 "

KJ

OO

cn

2344 58 β - li -

Obgleich die mit dem Stamm Kp-13 erhaltenen Ergebnisse nicht immer in jeder Hinsicht mit den Werten übereinstimmen, die unter Verwendung' von Dematium Pullulans IFO 4464 erhalten wurden, zeigen doch beide Stämme ähnliche Tendenzen, da hinsichtlich des pH-Wertes ein Wert von 7,o oder mehr zu einem äußerst niedrigen Molekulargewicht führt, während ein pH-Wert von 6,ο oder darunter eine starke Erhöhung des Molekulargewichtes des Pullulans bewirkt. Der absolute Wert des Molekulargewichts des Pullulans zeigt je nach dem verwendeten Stamm einen geringfügigen Unterschied. Dazu kommt noch, daß hinsichtlich der Pullulan-Ausbeute und des Kultivierungszeitraumes die Anwendung eines pH-Wertes von 6,5 oder mehr den Kultivierungszeitraum vermindert und die Ausbeute an Pullulan verbessert.

Beispiel Ib;

Es wurde wie im Beispiel la verfahren, wobei der Stamm Kp-IJ und Saccharose als Kohlenstoffquelle verwendet wurden. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle II zusammengestellt.

40981 1/0980 -12-

Tabelle II

Phosphat, ^c/	ί> Anfangs-pH- Wert	..	6,5	Ausbeute gegenüber dem eingesetzten Zucker, %	27	mittleres Mole kulargewicht
				KultivierungsZeitraum, Tage 4 7	4o
o,l				21	42	250x1o⁴
• o,2		35	43	250 "
o,3	5,5	35	46	280 "
o,4		36	25	260 " "
o,5		37	5o	150 "
o.l		2o	55	2ooxlo
o,2		37	61	300 "
o,3	6,0	37	67	2oo "
o,4		4o	26	80 "
o,5	41	39	3o "
o,l	2o	65	2oxlo⁴
o,2	31	7o	15 "
o,3	57	72	8 "
o,4	68	7 "
o,5	7o	7 "

Beispiel Ic;

Es wurde entsprechend Beispiel 1 verfahren, mit der Ausnahme, daß ein Stamm Pullularia pullulans IFO 6353 und als Kohlenstoffquelle Glucose verwendet wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle III zusammengestellt.

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Tabelle III

Phosphat,	% Anfangs-pH- Ausbeute gegenüber Wert dem eingesetzten Zucker, %	25	mittleres Mole kulargewicht
	Kultivierungszeltraum Tage 4 7	32
ο,Ι	18	38	27oxlo⁴
o,2	21	4o	270 "
o,3	5,5 31	4o	280 "
o,4	34	28	2oo "
o,5	35	49	Ho "
ο,Ι	2o	57	I80XI0⁴
o,2	38	63	2oo "
o,3	6,0 41	65	2oo "
o,4	43	28	• 5o "
o,5	' 45	37	2o "
ο,Ι	25	68	25x1o⁴
o,2	34	68	15 "
o,3	6,5 61	7o	8 "
o,4 -	65	5 "
o,5	67	5 "

Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß im Falle eines Glucose-enthaltenden Mediums die Phosphatkonzentration und der Anfangs-pH-Wert die Ausbeute und das Molekulargewicht des Pullulans in ähnlicher Weise beeinflussen wie in den vorstehenden Beispielen.

Beispiel 2;

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkungen der "Variierung des pH-Wertes und der Phosphatkonzentration auf das Molekulargewicht des erzeugten Pullulans. Es wurde mit den Stämmen und bei den Bedingungen des Beispiels la gearbeitet. Die Variierungen des mittleren Molekulargewichtes, die durch Variierung des pH-Wertes im Bereich von 5,5 bis 6,5 und des Phosphatgehaltes von ο,ί bis o,5# (Gew./Vol.)

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erhalten wurden, sind In der folgenden Tabelle zusammengestellt.

Der Kultivierungszeitraum betrug 7 Tage.

	Tabelle IY	■	6,o	Stamm: Kp-13	mittleres Molekularge- wicht	mittleres Mo lekulargewicht
Phosphat, %	Anfangs-pH- Wert			Ausbeute gegenüber dem eingesetzten Zucker, %	2ooxlo	2ooxlo
' o,l			25	25o "	2oo ⁿ
o,2			38	300 ^w	290 "
o,3	5,5		38	260 ⁿ	350 "
o,4		6,5	4o	150 ⁿ	62 "
. o,5			47	2ooxlo
o,l		23	3oo ^w
o,2	Tabelle V	55	I50 ⁿ
o,3	Anfangs-pH- Wert	59	7o ^M
o,4		65	2o "
o,5		7o	2oxlo⁴
o,l	6,5	25	2o "
o,2		4o	6,5 "
o,3		7o	7,o »
o,4	72	7,o "
o,5	73	Stamm: Dematium pullulans IPO 4464
		Ausbeute gegenüber dem eingesetzten Zucker, <ä
Phosphat, %	4o
o,l	6o
o,2	7o
o,3	7o
o,4	71
o,5

- 15 -

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Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß es vorzuziehen ist, zur Erzielung eines Pullulans mit einem höheren Molekulargewicht o,2 bis o,4# Phosphat zu verwenden.

Beispiel 3?

In diesem Beispiel wurde bei den Bedingungen des Beispiels 1 gearbeitet, mit der Ausnahme, daß als Kohlenstoffquelle ein Dattelextrakt verwendet wurde. Der Dattelextrakt wurde hergestellt, indem Datteln in das 4-fache Volumen warmes Wasser unter gelegentlichem Rühren 3 Stunden lang eingetaucht wurden und sodann die überstehende Flüssigkeit gewonnen wurde, die hierauf mit Aktivkohlen entfärbt und konzentriert wurde. Der Feststoffgehalt der resultierenden Lösung betrug 18^ (Gew./yol.). Davon betrug der Anteil der Glucose 5o Gew.-%. Der Rest bestand hauptsächlich aus Fructose und einer geringen Menge von Pentose. Der Extrakt war dunkel gefärbt und sein Gesamtanionengehalt als CaCO, betrug 2.500 bis J5.5oo mg/1. Der Aschegehält der Extraktlösung, bezogen auf den Zucker, betrug etwa 2 Gew.-#. Eine Extraktlösung und eine durch Ionenaustauscher gereinigte Lösung wurde bei dieser Versuchsreihe getrennt als Kohlenstoffquelle verwendet.

Ein Kulturmedium, das \o% (Gew./Vol.) Dattelextraktlösung, 0,3% (Gew./Vol.) Phosphat, o,2# (Gew.,/Vol.) Pepton, o,2$ (Gew./Vol.) Natriumchlorid, o,o4# (Gew./Vol.) Magnesiumsulfat und o,ool$ (Gew./Vol.) Ammonium-Eisen(II)-sulfat enthielt, wurde sterilisiert und auf einen pH-Wert 'von 6,5 eingestellt. Sodann wurden zu diesem Hauptkultivierungsmedium 2% (Vol.,/Vol.) einer Ausgangskultur gegeben, v/eiche nach einer 4l-stündigen Kultivierung erhalten worden war. Das Gemisch wurde Ikk Stunden unter Rührbedingungen kultiviert, Sodann wurde das erzeugte Pullulan abgetrennt, gereinigt und nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 auf das Molekulargewicht untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle VI zusammengestellt.

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	Kultivierungs zeitraum, h	48	6	End-pH- Wert	12o	3 3	144	48	Tabelle	12p	VI	48	Restzucker %, Gew./Gew.	12o	144	48'-	Ausbeute bezogen auf den eingesetz ten Zucker, Gew.-^	12o 144
	Entfärbt	4,	7	96 ·	5,1			o,95	Trübung (xlo)	1,22		4,	96	5		22,9	96	67
		4,	8 8	4,6	5,6			o,96	96	1,25	144	4,	7 4	3		3o,6	68	76
	durch Ionen austauscher greinigt	3, 3,		5,o	3,8 3,7		,9 ,7	o,7 o,6	1,25	l,o o,9		5, 6,	3 2	l,o 2,1	2 1,1	19 23	73	51 58 .59 So
				3,8 3,7				1,23				5 2,4 2 3,1				45 46	I I
O CD							o,9 o,8	l,o l,o
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Die obigen Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung einer Dattelextrakt-Lösung zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden können. Die Verwendung einer durch Ionenaustauscher gereinigten Extraktlösung und einer Exträktlösung, die nicht durch Ionenaustauscher gereinigt worden war, ergab sehr ausgeprägte Unterschiede hinsichtlich des Portschritts der Kultivierung und auch hinsichtlich der Art und Weise der Pullulanbildung, Die Extraktlösung, die nämlich nicht durch Ionenaustauscher gereinigt worden war, ergab nämlich eine verminderte Kultivierungszeit und eine verbesserte Ausbeute.

- Patentansprüche -

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von Pullulan, dadurch gekennzeichnet , daß man einen Pullulan-erzeugenden Mikroorganismus auf einem Kultivierungsmedium züchtet, welches assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und geringere für das Wachstum der Mikroorganismen erforderliche Nährstoffmengen enthält, bis Pullulan mit einem Molekulargewicht von 4.500.000 bis 50.000 mit der gewünschten Ausbeute in dem Medium in dem erforderlichen Kultivierungszeitraum gebildet wird, indem man den pH-Wert auf 5 bis 7,5 und/odei- die Konzentration des Phosphats auf o,l bis 0,5$ (Gew../Vol.) in dem Kultivierungsmedium einstellt und daß man das gebildete Pullulan aus dem Medium gewinnt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Ausbeute an Pullulan von 2o bis 75 Gew.-^ erhält.

3. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 2, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Kultivierungszeitraum von 3 bis 8 Tagen anwendet.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet , daß man als Mikroorganismus Pullularia fermentans var fermentans IFO 64ol, Pullularia fermentans var fusca IPO 64o2, Pullularia pullulans AHU 9553, Pullularia pullulans IPO 6353, Dematium pullulans IPO 4464 und/oder Pullularia pullulans-2 (Kp-I3) verwendet.

5· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch

gekennzeichnet , daß man als assimilierbare Kohlenstoff quelle im wesentlichen einen Dattelextrakt verwendet.

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6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5* dadurch gekennzeichnet, daß man den pH-Wert auf zwischen 6 und 7 einstellt.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet , daß man eine Konzentration von Phosphat zwischen o,2 und o,4$ (Gew./Vol.) anwendet.

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