DE2629447C2

DE2629447C2 -

Info

Publication number: DE2629447C2
Application number: DE2629447A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka Jp Chibata; Tetsuya Kyoto Jp Tosa; Tadashi Sato; Kozo Takatsuki Osaka Jp Yamamoto
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1975-07-11
Filing date: 1976-06-30
Publication date: 1987-12-10
Also published as: US4486532A; DE2629447A1; JPS5231952B2; FR2317270A1; CH605552A5; GB1506112A; JPS5210488A; FR2317270B1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Apfelsäure aus Fumarsäure oder einem ihrer Salze unter Verwendung immobilisierter, Fumarase bildender Mikroorganismen, die hergestellt worden sind durch Polymerisation mindestens eines Acryl- oder Allylmonomeren in einer Fumarase bildenden, Mikroorganismen enthalenden wäßrigen Suspension.

Zur Herstellung von L-Apfelsäure sind bereits verschiedene Verfahren bekannt. L-Apfelsäure kann beispiels weise hergestellt werden durch Züchten eines Fumarase bildenden Mikroorganismus in einem Nährmedium, das Fumarsäure oder eines ihrer Salze enthält, und durch Gewinnung der L-Apfelsäure aus der dabei entstehenden Fermentationsbrühe. Sie kann auch durch Behandlung von Zellen eines Fumarase bildenden Mikroorganismus mit Fumarsäure oder einem Salz der Säure hergestellt werden. Diese Verfahren sind jedoch für die großtechni sche Herstellung von L-Apfelsäure ungeeignet, da die dabei erhaltene L-Apfelsäure durch Mikroorganismenzel len, Quellen für Nährstoffe und/oder Proteine verunreinigt ist. Es sind daher zusätzliche Stufen für die Entfer nung der Mikroorganismenzellen und der übrigen Verunreinigungen aus dem Produkt erforderlich, um hochrei ne L-Apfelsäure zu gewinnen. Da die Reaktionslösung nach Beendigung der enzymatischen Reaktion zur Zerstörung der Fumarase bildenden Mikroorganismen erhitzt und/oder angesäuert wird und der Niederschlag an Mikroorganismen abfiltriert wird, können die Fumarase bildenden Mikroorganismen somit nur einmal verwendet werden und müssen anschließend verworfen werden.

Aus der JP-OS 69 289/1975 ist ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Apfelsäure aus Fumarsäu re oder einem ihrer Salze bekannt, bei dem immobilisierte, Fumarase bildende Mikroorganismen verwendet werden, die durch Polymerisation mindestens eines Acryl- oder Allylmonomeren in einer Fumarase bildenden, Mikroorganismen enthaltenden wäßrigen Suspension hergestellt worden sind. Dieses Verfahren hat den Nach teil, daß die gebildete L-Apfelsäure durch unerwünschte Nebenprodukte, wie Bernsteinsäure, verunreinigt ist. Außerdem ist es sehr schwierig, aus der mit Bernsteinsäure verunreinigten L-Apfelsäure die Bernsteinsäure nach üblichen Reinigungsverfahren zu entfernen.

Aufgabe der Erfindung war es daher, ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Apfelsäure aus Fumarsäure oder Salzen derselben zu finden, das ohne die unerwünschte Bildung von Nebenprodukten, wie Bernsteinsäure, abläuft, und mit dessen Hilfe es möglich ist, L-Apfelsäure in großtechnischem Maßstab herzu stellen.

Es wurde nun überraschend gefunden, daß diese Aufgabe dadurch gelöst werden kann, daß die Aktivität von immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen dadurch wesentlich verbessert werden kann, daß man die immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen zur Durchführung der enzymatischen Reaktion mit Gallensäuren oder ihren Salzen behandelt.

Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Apfelsäure aus Fumarsäu re oder einem ihrer Salze unter Verwendung immobilisierter, Fumarase bildenden Mikroorganismen, die herge stellt worden sind durch Polymerisation mindestens eines Acryl- oder Allylmonomeren in einer Fumarase bildenden, Mikroorganismen enthaltenden wäßrigen Suspension, das dadurch gekennzeichnet ist, daß die einge setzten immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen vor Durchführung der enzymatischen Reaktion mit mindestens einer Gallensäure oder einem Salz davon behandelt werden.

Die nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene L-Apfelsäure ist frei von unerwünschten Bernstein säure-Nebenprodukten, deren Abtrennung von dem gewünschten Endprodukt außerordentlich kompliziert, technisch aufwendig und kostspielig ist. Das erfindungsgemäße Verfahren bietet den Vorteil, daß die eingesetz ten, Fumarase bildenden Mikroorganismen nach Durchführung der enzymatischen Reaktion wiederverwendet werden können und ihre hohe Fumarase-Aktivität über lange Zeiträume hinweg beibehalten. Auf diese Weise läßt sich L-Apfelsäure in großtechnischem Maßstab in reiner Form herstellen.

Als Gallensäuren werden erfindungsgemäß vorzugsweise Monohydroxycholansäure, Dihydroxycholansäure, Trihydrocholansäure, Taurocholsäure, Glycocholsäure, Taurodesoxycholsäure, Glycodesoxycholsäure, 3-Hy droxy-6-ketocholansäure, 3-Hydroxy-6-ketoallocholansäure und/oder Salze dieser Gallensäure, insbesondere ihre Natrium-, Kalium- und Magnesiumsalze, verwendet.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen mit einem Gemisch aus den Natriumsalzen der Taurocholsäure und Glycocholsäu re behandelt. Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Erfindung werden die immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen mit Desoxycholsäure behandelt.

Die Behandlung erfolgt vorzugsweise bei einer Temperatur von 0° bis 50°C und bei einem pH-Wert von 5 bis 10.

Unter dem hier verwendeten Ausdruck "immobilisiert" ist zu verstehen, daß der eingesetzte Mikroorganismus in seiner Bewegungsfreiheit in der Reaktionslösung eingeschränkt ist durch die Umhüllung mit dem Polymeren. Durch diese Umhüllung wird der Mikroorganismus gleichzeitig geschützt, ohne daß dadurch seine katalytische Aktivität herabgesetzt wird.

Zur Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens können alle bekannten Fumarase bildenden Mikroor ganismen eingesetzt werden, wie sie beispielsweise im Bergey′s Manual of Determinative Bacteriology, 7. Auflage (1958), beschrieben sind. Die Fumarase bildenden Mikroorganismen werden in einer Menge im Bereich von 0,1 bis 5 g, vorzugsweise von 1 bis 3 g, pro Gramm verwendetem Acryl- oder Allylmonomeren eingesetzt. Bei der Polymerisation werden die Mikroorganismen in dem Gitter des Polymeren fest eingeschlossen.

Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann die Polymerisation in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt werden. Als Polymerisationsin itiatoren sind Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B₂ und Methylenblau geeignet. Bevorzugte Poly merisationsbeschleuniger sind β-(Dimethylamino)-propionitril und N,N,N′,N′-Tetramethyl-äthylendiamin. Der Polymerisationsinitiator wird zu der wäßrigen Suspension der Fumarase bildenden Mikroorganismen in einer Menge im Bereich von 1 bis 100 mg/g Acryl- oder Allylmonomer zugegeben. Der Polymerisationsbeschleuniger wird in Mengen im Bereich von 10 bis 200 mg/g Acryl- oder Allylmonomer zugegeben.

Vorzugsweise wird die Umsetzung bei einer Temperatur von 0° bis 50°C, besonders bevorzugt von 10° bis 30°C, durchgeführt.

Die Umsetzung ist innerhalb von 5 bis 60 Min. beendet.

Bei der vorliegenden Erfindung können als Acryl- oder Allylmonomere beispielsweise Acrylsäure, Methacryl säure, Acrylamid, Hydroxy-niedrig-alkylmethacrylat, N,N′-niedrig-Alkylen-bis-(acrylamid), Bis-(acrylamidome thyl)-äther, N,N′-Diacryl-äthylenharnstoff, niedrig-Alkylenglykol-dimethacrylat, N,N′,N′′-Triacryl-hexahydro triazin, Diallylmaleat, N,N′-Diallyl-weinsäurediamid und Triallylcyanurat verwendet werden. Als Hydroxy-nied rig-alkylmethacrylate werden bevorzugt 2-Hydroxyäthylmethacrylat und 3-Hydroxypropylmethacrylat verwen det; N,N′-Methylen-bis-(acrylamid) und N,N′-Propylen-bis-(acrylamid) sind geeignete N,N′-niedrig-Alkylen-bis (acrylamide). Bevorzugte Beispiele von niedrig-Alkylenglykol-dimethacrylat sind Athylenglykol-dimethacrylat und 1,3-Butylenglykol-dimethacrylat. Bei der vorliegenden Erfindung ist es bevorzugt, die Fumarase bildenden Mikroorganismen in ein Polymer einzuschließen, das aus einem oder zwei der oben erwähnten Monomeren erhalten wird, insbesondere in ein Homopolymer aus N,N′-niedrig-Alkylen-bis-(acrylamid), Bis-(acrylamidme thyl)-äther, N,N′-Diacryl-äthylenharnstoff, niedrig-Alkylenglykol-dimethacrylat, N,N′,N′′-Triacryl-hexahydro triazin, N,N′-Diallyl-weinsäurediamid oder Triallylcyanurat; oder in ein Copolymer aus Acrylamid oder Hy droxy-niedrig-alkylmethacrylat und einem Monomer aus der Gruppe N,N′-niedrig-Alkylen-bis-(acrylamid), Bis (acrylamidomethyl)-äther, N,N′-Diacryl-äthylenharnstoff, niedrig-Alkylenglykol-dimethacrylat, N,N′,N′′-Tri acryl-hexahydrotriazin, Diallylmaleat, N,N′-Diallyl-weinsäureamid und Triallylcyanurat. Die geeigneten Men gen an N,N′-niedrig-Alkylen-bis-(acrylamid), Bis-(acrylamidomethyl)-äther, N,N′- Diacryl-äthylenharnstoff, nied rig-Alkylenglykol-dimethacrylat, N,N′,N′′-Triacryl-hexahydrotriazin, Diallylmaleat, N,N′-Diallyl-weinsäuredia mid oder Triallylcyanurat, die zur Copolymerisations mit Acrylamid oder Hydroxy-niedrig-alkylmethacrylat verwendet werden, betragen 10 bis 200 mg, bevorzugt 50 bis 100 mg/g Acrylamid oder Hydroxy-niedrig-alkyl methacrylat. Nachdem die Polymerisationsreaktion, wie oben beschrieben, beendigt ist, wird das entstehende Gel unter Bildung von Körnchen mit einem Durchmesser von 0,5 bis 30 mm, bevorzugt 1 bis 5 mm, granuliert, indem man es durch ein Sieb durchsiebt.

Die so erhaltenen, immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen werden dann mit mindestens einer der Gallensäuren oder ihrer Salze behandelt. Diese Behandlung kann leicht erfolgen, indem man die immobili sierten Präparation bzw. Zubereitung in eine wäßrige Lösung der Gallensäuren oder ihrer Salze eintaucht oder darin einweicht. Die Gallensäuren oder ihre Salze liegen in der wäßrgien Lösung bevorzugt in einer Konzentra tion von etwa 0,1 bis 5 Gew./Vol.-% besonders bevorzugt von 0,2 bis 2 Gew./Vol.-% vor. Es ist bevorzugt, diese Behandlung bei einer Temperatur von 0° bis 50°C, insbesondere bei 20° bis 40°C, und bei einem pH-Wert von 5 bis 10, insbesondere bei pH von 6 bis 8, durchzuführen. Es ist weiterhin bevorzugt, die Behandlung während einer Zeit von etwa 2 bis 24 Stunden durchzuführen. Bei der Durchführung der oben beschriebenen Behandlung kann Fumarsäure oder eines ihrer Salze zu der Lösung als Stabilisator zugegeben werden. Bei der vorliegenden Erfindung können verschiedene Gallensäuren, sowohl natürliche als auch synthetische, verwendet werden. Beispiele für solche Säuren sind Monohydroxycholansäuren (z. B. Lithocholsäure, 6-Hydroxycholansäure, 7-Hy droxycholansäure, 1 1-Hydroxycholansäure, 12-Hydroxycholansäure), Dihydroxycholansäuren (z. B. Hyodesox ycholsäure, Desoxycholsäure, Isodesoxycholsäure, Chenodesoxycholsäure, Ursodesoxycholsäure, Lagodesox ycholsäure, 3,11 -Dihydroxycholansäure, 11,12-Dihydroxycholansäure), Trihydroxycholansäure (z. B. Cholsäure, 3,11,12-Trihydroxycholansäure), Taurocholsäure, Glycocholsäure, Taurodesoxycholsäure, Glycodesoxycholsäu re, 3-Hydroxy-6-ketocholansäure, 3-Hydroxy-6-ketoallocholansäure und Gemische dieser Säuren. Diese Gallen säuren können entweder in Form der freien Basen oder ihrer Salze, wie der Alkalimetall- oder Erdalkalimetall (z. B. Natrium-, Kalium-, Magnesium-)Salze verwendet werden. Bei der vorliegenden Erfindung ist es ferner nicht immer notwendig, reine Kristalle der Gallensäuren und ihrer Salze zu verwenden. Beispielsweise kann im Handel erhältlicher Ochsengallenextrakt ohne Reinigung verwendet werden. Ochsengallenextrakt besteht hauptsächlich aus den Natriumsalzen von Taurocholsäure und Glycocholsäure. Wie zuvor erwähnt, wird die Fumaraseaktivität der immobilisierten Präparation bzw. Zubereitung wesentlich erhöht, wenn man sie mit diesen Gallensäuren behandelt. Beispielsweise zeigen immobilisierte, Fumarase bildenden Mikroorganismen, die mit mindestens einer der Gallensäuren oder ihren Salzen behandelt wurden, eine enzymatische Aktivität, die etwa um das 15fache oder mehr höher ist als die von nichtbehandelten Mikroorganismen. Die, wie oben beschrieben, behandelten, immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen bilden bei der Behandlung mit Fumarsäure oder einem ihrer Salze praktisch keine Bernsteinsäure.

Nach der oben beschriebenen Behandlung werden die immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganis- men mit Fumarsäure oder einem ihrer Salze behandelt. Geeignete Beispiele für Fumarsäuresalze, die bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, sind die Alkalimetall- (z. B. Natrium-, Kalium-)Salze, Erdal kalimetall- (z. B. Calcium-, Barium-)Salze. Die enzymatische Reaktion kann bei einer Temperatur von 5° bis 60°C, bevorzugt 10° bis 50°C, durchgeführt werden. Bevorzugt wird die Umsetzung bei einem pH-Wert von 5 bis 10, besonders bevorzugt von 6 bis 8, durchgeführt. Die Konzentration des Substrats (d. h. der Fumarsäure oder eines ihrer Salze) ist bei der vorliegenden Erfindung nicht kritisch. Beispielsweise kann die Fumausäure oder eines ihrer Salze in Wasser in irgendeiner Konzentration gelöst oder suspendiert werden. Die immobilisier ten, Fumarase bildenden Mikroorganismen werden zu der wäßrigen Fumaratlösung oder -suspension gegeben und das Gemisch wird gerührt. Im dem Reaktionsgemisch wird L-Apfelsäure gebildet. Die optimalen Bedingun gen für die Umwandlung der Fumarsäure oder eines ihrer Salze zu L-Apfelsäure können leicht durch Einstellung der Reaktionszeit erhalten werden.

Alternativ kann die erfindungsgemäße enzymatische Reaktion nach dem Säulenverfahren durchgeführt wer den. Bei dem Säulenverfahren kann die Umsetzung kontinuierlich durchgeführt werden. Beispielsweise kann man die immobilisierten Mikroorganismen in eine Säule geben und eine wäßrige Lösung, die ein Alkalimetallsalz der Fumarsäure oder Ammoniumfumarat enthält, wird durch die Säule geleitet. Eine wäßrige Lösung, die das entsprechende L-Malat enthält, wird als Abstrom erhalten. Wird ein Gemisch aus Natriumfumarat und Calcium fumarat als Substrat verwendet, so wird die wäßrige Suspension des Substrats filtriert und das Filtrat wird durch die Säule geleitet, die mit den immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen gefüllt ist. Der so erhalte ne Abstrom wird mit der wäßrigen Suspension des Substrats vermischt. Das Gemisch wird erneut filtriert und das Filtrat wird durch die Säule geleitet. Werden diese Verfahrensstufen kontinuierlich wiederholt, so kann das Calciumfumarat fast vollständig in Calcium-L-malat überführt werden.

Die Gewinnung der L-Apfelsäure aus dem Reaktionsgemisch oder dem Abstrom kann in an sich bekannter Weise erfolgen. Wird ein Alkalimetallsalz der Fumarsäure als Substrat verwendet, so kann die L-Apfelsäure beispielsweise durch Ansäuern des Reaktionsgemisches oder des Abstroms mit Chlorwasserstoffsäure, Abfiltra tion des Niederschlags aus Fumarsäure, Zugabe von Calciumcarbonat oder Calciumhydroxid zu dem Filtrat und Ausfällung des Calcium-L-malats und Neutralisation des Calcium-L-malats mit Schwefelsäure erhalten werden.

Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion hängt die Umwandlungsrate (%) der Fumarsäure oder ihrem Salz zu L-Apfelsäure hauptsächlich von der enzymatischen Aktivität der immobilisierten Mikroorganis men, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab. Bei dem Säulenverfahren können die optimalen Reaktionsbe dingungen für die Umwandlung von Fumarsäure oder ihrem Salz zu L-Apfelsäure leicht erhalten werden, indem man die Strömungsgeschwindigkeit der Substratlösung einstellt.

Die immobilisierten, mit Gallensäuren oder ihren Salzen behandelten Mikroorganismen behalten den hohen Grad an enzymatischer Aktivität während der Umsetzung bei. Die erfindungsgemäß immobilisierten Mikroor ganismen können, da ihre enzymatische Aktivität lange erhalten bleibt, wiederholt für die enzymatische Reak tion verwendet werden.

In der vorliegenden Anmeldung bedeutet der Ausdruck′′niedrig-Alkyl′′ Alkylgruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoff atomen. Der Ausdruck "niedrig-Alkylen" bedeutet Alkylengruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den folgenden Beispielen wird die Menge an gebildeter L-Apfelsäure entsprechend dem Verfahren bestimmt, wie es in "Analytical Chemistry", 29, 283 (1957), beschrie ben wird. Die Menge an Bernsteinsäure wird papierchromatographisch unter Verwendung eines Gemisches aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4 : 1 : 1) als Lösungsmittel und 0,1% Bromphenolblau als Anfärbungsreagens bestimmt.

Beispiel 1

(1) Ein wäßriges Nährmedium (pH 7,0), das die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt.

100 ml des Mediums werden mit jedem der in Tabelle 1 aufgeführten, Fumarase bildenden Mikroorganismen inokuliert. Das Medium wird 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Die Mikrobenzellen werden dann durch Zentrifugieren gesammelt. 1 g der Mikrobenzellen wird in 4 ml physiologischer Kochsalzlösung suspen diert. 750 mg Acrylamid, 40 mg N,N-Methylen-bis-(acrylamid), 0,5 ml einer wäßrigen 5%igen (Vol./Vol.) β-(Di methylamino)-propionitril-Lösung und 0,5 ml einer wäßrigen 1%igen (Gew./Vol.) Kaliumpersulfat-Lösung wer den zu der Suspension gegeben. Das Gemisch wird 10 Minuten bei 25°C stehengelassen. Das so erhaltene Gel wird unter Bildung von Körnchen mit einem Durchmesser von 2 mm granuliert, indem man es durch ein Sieb gibt. Die Körnchen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Man erhält 7,5 g immobilisierte Präpara tion aus Fumarase bildenden Mikroorganismen.

(2) 7,5 g der immobilisierten Präparation, hergestellt gemäß (1), werden in 30 ml einer wäßrigen 1 M-Natrium fumaratlösung (pH 7,5) , enthaltend 3 mg/ml Ochsengallenextrakt oder 2 mg/ml Desoxycholsäure, suspendiert. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen. Die immobilisierte Präparation wird dann abfiltriert und mit physiologischer Salzlösung gewaschen.

(3) 7,5 g der gemäß (1) oder (2) erhaltenen, immobilisierten Präparation werden zu 30 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) gegeben. Das Gemisch wird 1 Stunde bei 37°C gerührt. Die Mengen an gebildeter L-Apfelsäure in den Reaktionsgemischen sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle I

(4) 7,5 g der gemäß (1) oder (2) hergestellten, immobilisierten Präparation werden zu 30 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) gegeben. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 37°C gerührt. Aus den Mengen an L-Apfelsäure und Bernsteinsäure in den Reaktionsgemischen werden die quantitativen Verhältnisse von Bernsteinsäure zu L-Apfelsäure daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle 11 aufgeführt.

Tabelle II

Beispiel 2

30 g einer immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, die auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, erhalten wurde, werden in 100 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5), die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält, suspendiert. Die Suspension wird 20 Stunden bie 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlö sung gewaschen und in eine Säule eingefüllt (2,2 cm×19,5 cm). 1 l einer 1 M wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5) wird durch die Säule bei 37°C in einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h geleitet. Das abströmen de Material wird mit 200 ml konzentrierter Chlorwasserstoffsäure angesäuert und dann zur Entfernung des Niederschlags an Fumarsäure filtriert. Mit etwa 70 g Calciumhydroxid wird der pH-Wert des Filtrats auf 6,0 eingestellt. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und dann getrocknet. Man erhält dabei 150 g Calcium-L-malat-dihydrat, (Ausbeute: 72%, bezogen auf eingesetzte Fumarsäure). 350 ml 2 n Schwe felsäure werden zu dem Calcium-L-malat-dihydrat zugegeben. Das Gemisch wird zur Entfernung des Nieder schlags filtriert. Das Filtrat wird durch eine Säule gegeben, die mit etwa 150 ml Amberlite IR-120 (H⁺-Typ) gefüllt ist. Dann wird es durch eine Säule geleitet, die mit etwa 150 ml Amberlite IR-45(OH⁻-Typ) gefüllt ist. Der Abstrom wird bei 60°C und vermindertem Druck konzentriert. Der kristalline Niederschlag wird abfiltriert, mit einer geringen Acetonmenge gewaschen und getrocknet. Man erhält 50 g L-Apfelsäure. Die Mutterlauge wird konzentriert und die konzentrierte Lösung wird auf gleiche Weise, wie oben beschrieben, behandelt. Man erhält 22 g L-Apfelsäure. Gesamtmenge: 77 g; (Ausbeute; 57,5%, bezogen auf eingesetzte Fumarsäure) Fp. 100°C;

Beispiel 3

20 g einer immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, hergestellt auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, werden in 90 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert, die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann in eine Säule (1,6 cm×15 cm) eingefüllt. Eine wäßrige 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) wird durch die Säule in einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/h oder 25 ml/h geleitet. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Abstrom wird bestimmt und der Prozentgehalt Umwandlung von Fumarsäure zu L-Apfelsäure wird daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle III aufgeführt.

Tabelle III

Beispiel 4

30 g einer immobilisierten Präparation von Microbacterium flavum IAM 1642, hergestellt auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, werden in 100 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspen diert, die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird in 500 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlö sung (pH 7,5) suspendiert. Die Suspension wird bei 37°C eine gewisse Zeit lang gerührt. Der Gehalt an L-Apfelsäure in dem Reaktionsgemisch wird bestimmt und der Prozentgehalt Umwandlung der Fumarsäure zu L-Apfelsäure wird daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle IV aufgeführt.

Tabelle IV

Beispiel 5

30 g einer immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, hergestellt auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, wcrden in 120 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert, die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann in eine Säule (1,72 cm×28 cm) eingefüllt. Eine Substratsuspension wird hergestellt, indem man 500 ml Einer wäßrigen 1 M Calciumfumaratsuspension (pH 7,5) zu 150 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) zugibt. Diese Substratsuspension wird unter Rühren filtriert. Das Filtrat wird bei 37°C durch eine Säule mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 200 ml/h geleitet. Der Abstrom wird mit einer Substratsuspension vermischt. Das Gemisch wird erneut unter Rühren filtriert, und das Filtrat wird durch die Säule geleitet. Diese Stufen werden 40 Stunden lang kontinuierlich wiederholt. Der Niederschlag wird abfiltriert; man erhält 92 g Calcium-L-malat-dihydrat (Ausbeute: 68%, bezogen auf eingesetzte Fumarsäure).

Beispiel 6

(1) 50 ml eines wäßrigen Mediums (pH 7,0), das die gleichen Bestandteile wie in Beispiel 1-(1) enthält, werden mit Corynebacterium equi IAM 1038 inokuliert. Das Medium wird 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Die Mikrobenzellen werden von der Brühe abzentrifugiert und dann in 4 ml physiologischer Salzlö sung suspendiert. 750 mg Acrylamid, 40 mg Diallylmaleat, 0,5 ml einer wäßrigen 5%igen (Vol./Vol.) β-(Dimethy- lamino)-propionitril-Lösung und 0,5 ml einer wäßrigen 1%igen (Gew./Vol.) Kaliumpersulfat-Lösung werden zu der Suspension zugegeben. Dann wird das Gemisch 10 Minuten bei 25°C stehengelassen. Das so erhaltene Gel wird unter Bildung von Körnchen mit einem Durchmesser von 2 mm granuliert, indem man es durch ein Sieb durchgibt. Die Körnchen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. 8 g einer immobilisierten Präpara tion aus Corynebacterium equi IAM 1038 werden erhalten.

(2) 8 g der gemäß (1) erhaltenen, immobilisierten Präparation werden in 30 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfu marat-Lösung (pH 7,5) suspendiert. die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann in 50 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumarat-Lösung (pH 7,5) suspendiert. Das Gemisch wird eine gewisse Zeit lang bei 37°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung der immobilisierten Präparation filtriert. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Filtrat wird bestimmt und der Prozentgehalt Umwandlung von Fumarsäure zu 1-Apfelsäure wird daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle V aufgeführt.

Tabelle V

Beispiel 7

30 g der immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, hergestellt auf gleiche Weise wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, werden in 100 ml einer 0,1 M Natriumphosphat-Pufferlösung (pH 7,5) suspendiert, die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und dann in 500 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert. Die Suspension wird eine gewisse Zeit lang bei 37°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung der immobilisierten Präparation abfiltriert. Der Gehalt an L-Apfelsäure in dem Filtrat wird bestimmt und der Prozentgehalt Umwandlung von Fumarsäure zu L-Apfelsäure wird daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VI aufgeführt.

Tabelle VI

Beispiel 8

(1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 werden in 16 ml physiologischer Salzlö sung suspendiert. Zu der Suspension gibt man 40 mg Bis-(acrylamidomethyl)-äther, 1,2 ml einer wäßrigen 0,1 12%igen (Gew./Vol.) N,N,N′,N′-Tetramethyl-äthylendiamin-Lösung und 0,12 ml einer wäßrigen 2,5%igen (Gew./Vol.) Ammoniumpersulfat-Lösung. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 37°C stehengelassen. Das so erhaltene Gel wird unter Bildung von Körnchen mit einem Durchmesser von 2 mm granuliert, indem man es durch ein Sieb gibt. Die Körnchen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Man erhält 25 g immobili sierte Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645.

(2) 25 g der gemäß (1) erhaltenen, immobilisierten Präparation werden in 120 ml einer wäßrigen 1 M Natrium fumaratlösung (pH 7,5) suspendiert, die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 500 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) gewaschen. Die Suspension wird 24 Stunden bei 37°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung der immobilisierten Präparation filtriert. Die L-Apfelsäure in dem Filtrat wird als Calciumsalz auf die gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, gewonnen. Man erhält 70 g Calcium-L-malat-dihydrat (Ausbeute: 67%, bezogen auf eingesetzte Fumarsäure).

Beispiel 9

(1) 4 g Mikrobenzellen von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645 werden in 16 ml physiologischer Salzlö sung suspendiert. Zu der Suspension gibt man 40 mg N,N′-Diacryl-äthylen-harnstoff, 1,2 ml einer wäßrigen 0,1 12%igen (Gew./Vol.) N,N,N′,N′-Tetramethyl-äthylendiamin-Lösung und 0,12 ml einer wäßrigen 2,5%igen (Gew./Vol.) Ammoniumpersulfat-Lösung. Das Gemisch wird 60 Minuten bei 37°C stehengelassen. Das so erhaltene Gel wird unter Bildung von Körnchen mit einem Durchmesser von 2 mm granuliert, indem man es durch ein Sieb gibt. Die Körnchen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Man erhält 25 g immobili sierte Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645.

(2) 25 g gemäß (1) erhaltenen, immobilisierten Präparation werden in 120 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfu marat-Lösung (pH 7,5) suspendiert, die 3 mg/ml Ochsengallenextrakt enthält. Die Suspension wird. 20 Stunden bei 37°C stehengelassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in 500 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) suspendiert. Die Suspension wird 24 Stunden bei 37°C gerührt. Das Reaktionsgemisch wird zur Entfernung der immobilisierten Präparation filtriert. Die L-Apfelsäure in dem Filtrat wird als Calciumsalz auf gleiche Weise, wie in Beispiel 2 beschrieben, gewonnen. Man erhält 70 g Calcium-L-malat-dihydrat (Ausbeute: 67%, bezogen auf eingesetzte Fumarsaure).

Beispiel 10

Dieses Beispiel erläutert die Verwendung von Desoxycholsäure als Gallensäure.

30 g einer immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, die auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, erhalten wurde, werden in 100 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5), enthaltend 2 mg/ml Desoxycholsäure, suspendiert. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehenge lassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in eine Säule (3,2 cm×19,5 cm) eingefüllt. Ein Liter einer 1 M wäßrigen Natriumfumaratlösung (pH 7,5) wird durch die Säule bei 37°C mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 20 ml/h geleitet. Die Konzentra tion an L-Apfelsäure im Ablauf beträgt 110 mg/ml (Ausbeute: 82%, bezogen auf eingesetzte Fumarsäure). Der Ablauf wird in gleicher Weise wie in Beispiel 2 beschrieben, behandelt, wobei 150 g Calcium-L-malat-dihydrat (Ausbeute: 88%, aus dem Ablauf) erhalten werden.

Beispiel 11

Dieses Beispiel ist ein Vergleich zwischen dem erfindungsgemäßen Verfahren und einem Verfahren gemäß Stand der Technik (ohne Behandlung mit Gallensäure).

22,5 g der immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, in gleicher Weise hergestellt, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, werden einerseits direkt verwendet, andererseits nach Behandlung mit Ochsengallenextrakt, wie in Beispiel 2 beschrieben, verwendet. Die immobilisierte Präparation wird in eine Säule (1,6 cm×16 cm) eingefüllt und eine wäßrige 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) durch die Säule bei 37°C und einer Strömungsgeschwindigkeit von 6 ml/h geleitet. Der Gehalt an L-Apfelsäure und Bernsteinsäure im Ablauf wird bestimmt und die Ausbeute an L-Apfelsäure aus Fumarsäure hieraus berechnet. Die Ergebnisse sind in Tabelle VII gezeigt.

Tabelle VII

Beispiel 12

Dieses Beispiel erläutert die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens bei verschiedenen Temperatu ren und verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten.

22,5 g einer immobilisierten Präparation von Brevibacterium ammoniagenes IAM 1645, in gleicher Weise hergestellt, wie in Beispiel 1-(1) beschrieben, werden in 100 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5), enthaltend 3 mg/ml Ochsengallenextrakt, suspendiert. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehenge- lassen und dann filtriert. Die so erhaltene, immobilisierte Präparation wird mit physiologischer Salzlösung gewaschen und in eine Säule (1,6 cm×16 cm) eingefüllt. Eine wäßrige 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) wird durch die Säule bei verschiedenen Temperaturen und verschiedenen Strömungsgeschwindigkeiten geleitet. Der Gehalt an L-Apfelsäure im Ablauf wird bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII gezeigt.

Tabelle VIII

Beispiel 13

Dieses Beispiel erläutert die Überlegenheit des erfindungsgemäßen Verfahrens gegenüber dem Stand der Technik bei Verwendung von sechs verschiedenen Mikroorganismen.

100 ml des Medium werden mit jedem der in Tabelle IX aufgeführten, Fumarase bildenden Mikroorganismen inokuliert. Das Medium wird 20 Stunden bei 30°C unter Schütteln kultiviert. Die Mikrobenzellen werden dann durch Zentrifugieren gesammelt. 1 g der Mikrobenzellen wird in 4 ml physiologischer Kochsalzlösung suspen diert. 750 mg Acrylamid, 40 mg N,N-Methylen-bis-(acrylamid), 0,5 ml einer wäßrigen 5%igen (Vol./Vol.) β-(Di methylamino)-propionitril-Lösung und 0,5 ml einer wäßrigen 1%igen (Gew./Vol.) Kaliumpersulfat-Lösung wer den zu einer Suspension gegeben. Das Gemisch wird 10 Stunden bei 25°C stehengelassen. Das so erhaltene Gel wird unter Bildung von Körnchen mit einem Durchmesser von 2 mm granuliert, indem man es durch ein Sieb gibt. Die Körnchen werden mit physiologischer Salzlösung gewaschen. Man erhält 7,5 g einer immobilisierten Präparation aus Fumarase bildenden Mikroorganismen.

(2) 7,5 g der immobilisierten Präparation, hergestellt gemäß (1), werden in 30 ml einer wäßrigen 1 M Natrium fumaratlösung (pH 7,5), enthaltend 3 mg/ml Ochsengallenextrakt, suspendiert. Die Suspension wird 20 Stunden bei 37°C stehengelassen. Die immobilisierte Präparation wird dann abfiltriert und mit physiologischer Salzlö sung gewaschen.

(3) 7,5 g der gemäß (1) oder (2) erhaltenen, immobilisierten Präparation werden zu 30 ml einer wäßrigen 1 M Natriumfumaratlösung (pH 7,5) gegeben. Das Gemisch wird 24 Stunden bei 37°C gerührt. Die Menge an gebildeter L-Apfelsäure und Bernsteinsäure in den Reaktionsgemischen werden bestimmt und die Ausbeute an L-Apfelsäure aus Fumarsäure daraus berechnet. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IX gezeigt.

Tabelle IX

Claims

Verfahren zur enzymatischen Herstellung von L-Apfelsäure aus Fumarsäure oder einem ihrer Salze unter Verwendung immobilisierter, Fumarase bildender Mikroorganismen, die hergestellt worden sind durch Polymerisation mindestens eines Acryl- oder Allylmonomeren in einer Fumarase bildenden, Mikroorganis men enthaltenden wäßrigen Suspension, dadurch gekennzeichnet, daß die eingesetzten immobilisierten, Fumarase bildenden Mikroorganismen vor Durchführung der enzymatischen Reaktion mit mindestens einer Gallensäure oder einem Salz davon behandelt werden.