DE2420102C3

DE2420102C3 - Immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus und Verwendung desselben

Info

Publication number: DE2420102C3
Application number: DE19742420102
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka Tosa Tetsuya Kyoto Sato Tadashi Takatsuki Osaka Chibata, (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co, Ltd, Osaka (Japan)
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-25
Publication date: 1977-07-14

Description

Die Erfindung betrifft einen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus und die Verwendung desselben zur üblichen enzymatischen Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose.

D-Fructose ist bekanntlich als Süßstoff geeignet und kann durch enzymatische Umwandlung von D-Glucose mit Hilfe von Glucoseisomerase nach den verschiedensten Verfahren erzeugt werden. So können z.B. zur Herstellung von D-Glucose Glucoseisomerase-bildende Mikroorganismen in einem D-Glucose enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden, oder Glucoseisomerase kann aus einem Mikroorganismus extrahiert und das erhaltene Enzym kann mit D-Glucose umgesetzt werden. Diese Verfahren sind jedoch zur kommerziellen Herstellung von D-Fructose wenig geeignet, da die dabei gebildete D-Fructose mit dem Enzym, mit Mikrobenzellen und Nährstoffquellen des Mediums und/oder mit Protein verunreinigt ist. Zur Gewinnung von D-Fructose hohen Reinheitsgrads sind daher zusätzliche Verfahrensschritte zur Entfernung des Enzyms oder anderer Verunreinigungen aus dem Produkt erforderlich. Weiterhin wird nach Beendigung der enzymatischen Reaktion die Reaktionslösung zum Sieden gebracht und/oder angesäuert, um das Enzym so oder die Mikroorganismen zu denaturieren, worauf das ausgefällte Enzym oder der ausgefällte Mikroorganismus abfiltriert werden, was zur Folge hat, daß die Glucoseisomerase oder der Glucoseisomerase-bildende Mikroorganismus nur einmal verwendbar sind und anschließend verworfen werden müssen.

Aus »Applied Microbiology«, 1971, Seiten 588-593, ist es auch bereits bekannt, Glucoseisomerase in der Matrix eines Polymerisats, z.B. dem Polymerisat von Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, einzuschließen und zu immobilisieren, und in der US-PS 3817832 wird die Verwendung von zellgebundener Glucoseisomerase zur enzymatischen Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose beschrieben. Es zeigte! sich jedoch, daß die Aktivität dieser bekannten im- 6s mobilisierten Enzyme vergleichsweise gering ist unil mit einer Halbwertszeit von nur wenigen Tagen ziemlich rasch verloren geht, so daß derartige Enzym produkte für eine kontinuierliche Verfahrensdurchführung in industriellem Maßstab praktisch nicht in Frage korn-

^miJ'»Biochim. Biophys. Acto«, Bd1.252. (1971), Seiten •Mfi his 254 wird ferner die Immobilisierung der Mikroorsanisrnen Streptococcus faecalis ATCC 8043 beschrieben die jedoch ausschließlich zur Durchführung des Argininstoffwechsels befähigt sind, so daß daraus keine Schlüsse auf das Verhaiten von Glucoseisomerase produzierende Mikroorganismen gezogen werden konnten. . . .

Aufgabe der Erfindung ist es, einen immobilisierten Mikroorganismus bereitzustellen, der während einer langen Zeit eine hohe Glucoseisomerase-Aktivität ergibt und nicht verworfen zu werden braucht, sondern in einer Reihe weiterer Verfahrensschritte wiederverwendet werden kann, so daß mit seiner Hilfe ein verbessertes industrieU verwendbares Verfahren zur Herstellung von D-Fructose aus D-Glucose durchführbar ist. , .

Gegenstand der Erfindung ist daher ein immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus, der gekennzeichnet ist durch einen fest in das Gitter eines semipermeablen Acrylpolymerisats eingeschlossenen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus, wobei das Acrylpolymerhsat ein Homopolymerisat von N N'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl)-äther oder Ν,Ν'-Diacryläthylenharnstoff, ein Mischpolymerisat von Acrylamid und N,N'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Bis(acrylamidomethyl)äther und/oder ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Ν,Ν'-Diacryläthylenharnstoff ist und pro g des Acrylpolymerisats 0,25 bis 2,5g des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus eingeschlossen enthalten sind.

Typische, für die Erfindung in besonders günstiger Weise verwendbare Glucoseisomerase bildende Mikroorganismen sind z. B. Streptomyces griseus IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3430, Streptomyces griseus IFO 3356, Streptomyces aureus IFO 3175, Streptomyces olivaceus IFO 3409 und Bacillus coagulans IFO12714, die bei der genannten Hinterlegungsstelle für die Öffentlichkeit zugänglich sind. Neben diesen besonders guten Mikroorganismen sind jedoch auch alle anderen bekannten Glucoseisomerase-bildenden Mikroorganismen verwendbar. Erfindungsgemäß wird der Glucoseisomerase-bildende Mikroorganismus in Mengen von 0,25 bis 2,5 g, am besten von 0,5 bis 2,0g pro g der verwendeten Acrylmonomeren eingesetzt

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen immobilisierten Mikroorganismen wird mindestens ein Acrylmonomeres in einer einen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus enthaltenden wäßrigen Suspension polymerisiert. EMe Polymerisationsreaktion dient dazu, die Mikroorganismen in das Polymerisationsgitter einzuschließen, wodurch sich eine lang anhaltende hohe enzymatische Aktivität erzielen läßt Die Polynierisationsreaktion kann in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt werden. Als Polymerisationsinitiator ist Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B₂ und Methylenblau verwendbar und als Polymerisationsbeschleuniger kann XDimethylamino)-propionitril und Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramthyläthylendiamin verwendet werden. Am günstigsten wird der Polymerisationsinitiator in der wäßrigen Suspension des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in

Mengen von 1 bis 100 mg, insbesondere 5 bis 50 mg pro g des oder der Acrylrnonomeren verwendet. Den Polymensationsbeschleuniger verwendet man am besten in Mengen von 1 bis 100 mg, insbesondere 10 bis 50 mg pro g des oder der Acrylmonomeren. Die $ Reaktion wird gut bei einer Temperatur von 0 bis 5O⁰C, besser von 20 bis 4O⁰C, durchgeführt. Die Reaktion kann im Verlauf von 10 bis 60Minuten beendigt werden. Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylarnid, Bis(acrylamidomethyOäther oder Ν,Ν'-Diacryläthylenhamstoff verwendet man bei der Mischpolymerisation mit Acrylamid gut in Mengen von 5 bis 160 mg, besser von 25 bis 80 mg pro g Acrylamid. Nach Beendigung der Polymerisationsreaktion wird der sich ergebende, immobilisierte, Glucoseisomerase bildende Mikroorganismus granuliert, indem man ihn durch ein Sieb führt und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 1 bis 10 mm, am besten von 3 bis 4 mm zerkleinert.

D-Fructose kann man dann durch enzymatische Reaktion des immobilisierten, Glucoseisomerase biJ-denden Mikroorganismus mit D-Glucose herstellen. Die enzymatische Reaktion wird bei einer Temperatur von 20 bis 8O⁰C, am besten von 40 bis 70⁰C durchgerührt. Man führt die Reaktion bei einem pH-Wert von 6 bis 9, insbesondere bei einem pH-Wert von 7 bis 8,5 durch. Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion kann man die enzymatische Aktivität in wirksamer Weise dadurch stabilisieren, daß man Magnesium- und KobaIt(IIHonen in die Reaktionslösung einbringt. Die Magnesiumionen setzt man in Mengen von 1 bis 20Millimol, am besten von 3 bis lOMillimol pro Liter der Reaktionslösung zu der Reaktionslösung zu. Die Kobalt(II)-ionen verwendet man in der Reaktionslösung in Mengen von 0,1 bis lOMillimol, am besten von 0,5 bis 5Millimol pro Liter der Reaktionslösung. Die Konzentration des verwendeten Substrats ist nicht kritisch. Zum Beispiel löst man D-Glucose in irgendeiner Konzentration in Wasser. Der genannte immobilisierte Mikroorganismus wird in der D-GIucose-Lösung suspendiert, worauf man die Suspension rührt. Nach Beendigung der Reaktion filtriert oder zentrifugiert man die Mischung, um den immobilisierten Mikroorganismus für die spätere Weiterverwendung abzutrennen. Als Filtrat oder als überstehende Lösung erhält man eine wäßrige, D-Fructose enthaltende Lösung. D-Fructose wird dann nach an sich bekannten Verfahrensweisen isoliert, z. B. durch Zusatz von Borsäure oder eines Borats (z.B. Natriumtetraborat) zu dem Filtrat oder der überstehenden Lösung und Behandeln der Mischung mit einem stark basisehen Anionenaustauscherharz. Die optimalen Reaktionsbedingungen zur Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose können leicht durch Steuern der Reaktionszeit erreicht werden.

Alternativ kann die enzymatische Reaktion nach der Säulenmethode durchgeführt werden. Die Säulenmethode ermöglicht es, die Reaktion stufenweise durchzuführen. Zum Beispiel füllt man eine Säule mit dem immobilisierten Mikroorganismus und führt eine wäßrige Lösung von D-Glucose mit geeigneter Durchflußgeschwindigkeit durch die Säule. Als Abstrom erhält man eine wäßrige D-Fructose enthaltende Lösung. Die D-Fructose wird nach der gleichen Methode aus dem Abstrom gewonnen, wie sie oben für das genannte Filtrat oder die überstehende Lösung beschrieben wuirde. Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion hängt die Umwandlungsrate der D-Glucose in die D-Fructose überwiegend von der enzymatischen Aktivität des immobilisierten Mikroorganismus, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab. Im Fall der Säulenmethode kann man die optimalen Reaktionsbedingungen für die Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose in einfacher Weise durch Steuern der Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung erreichen.

In jedem Fall behält der erfindungsgemäß eingesetzte immobilisierte Mikroorganismus während der Reaktion ein hohes Maß an enzymatischer Aktivität bei, besonders in Gegenwart von Magnesium- und Kobalt(II)-ionen. Weiterhin kann der erfindungsgemäß eingesetzte immobilisierte Mikroorganismus aufgrund der in ausreichender Weise anhaltenden enzymatischen Aktivität wiederholt bei der enzymatischen Reaktion verwendet werden.

Die folgenden Baispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.

Der hierin verwendete Ausdruck »Niedrigalkylen« steht fiir AJkylen-Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

In den folgenden Beispielen wird die Aktivität eines Mikroorganismus oder eines immobilisierten Mikroorganismus, der bei der Reaktion mit D-Glucose bei einem pH-Wert von 8,0 und bei 6O⁰C im Verlaufe von einer Stunde 1 mg D-Fructose liefert, als eine Einheit definiert. Die Identifizierung von D-Fructose in der Lösung erfolgt papierchromatographisch, wobei man eine Mischung aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) als Entwicklungslösungsmittel verwendet. Die D-Fructose-Menge in der Lösung wird nach dem Verfahren von M. C. Cadmus et al. (Analytical Biochemistry, Volume 26, Seiten 484 bis 487 [1968]) bestimmt. Hierzu setzt man 0,4 ml einer D-Fructose-Lösung zu einer Mischung aus 0,1ml einer 20%igen Lösung von L-Cysteinhydrochloridhydrat und 5 ml 75%iger (Volumen/Volumen) Schwefelsäure zu. Man rührt die Mischung und läßt sie dann während einer Stunde stehen, wonach man die D-Fructose-Menge in der Mischung kolorimetrisch bestimmt.

Beispiel 1

(1) Man stellt ein wäßriges Nährmedium (pH 7,0) her, das die folgenden Bestandteile enthält:

Pepton	1 (Gewicht/Volumen-%)
Hefeextrakt	0,25
Fleischextrakt	0,5
D-Glucose	0,3
D-Xylose	0,7
Magnesiumsulfat-
heptahydrat	0,05
KobaltdD-chlorid-
hexahydrat	0,024
Natriumchlorid	0,5

Man inokuliert 200 ml des Mediums mit Streptomyces griseus IFO 3430. Dann bebrütet man das Medium unter Schütteln während 72 Stunden bei 30⁰C und zentrifugiert es anschließend. Die in dieser Weise gesammelten Mikrobenzellen zeigen eine Glucoseisomerase-Aktivität von 30Einheiten pro Gramm. Man suspendiert 17g der Mikrobenzellen in 68 ml physiologischer Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 12,75 g Acrylamid, 680 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acryl-

amid, 7,5 ml einer 5%igen XDimethylamino)-propionitril-Lösung und 7,5 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30Minuten bei 37⁰C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurchführt und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Anschließend wäscht man die Körnchen mit 1700 ml einer physiologischen Salzlösung. Man erhält 170 ml eines immobilisierten Prä- ι ο parats von Streptomyces griseus IFO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 25 Einheiten/ml.

(2) Man beschickt eine Säule (4 cm X 13,5 cm) mit 170 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430. Dann führt man mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h 200 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 Millimol Magnesiumionen und 1 Millimol Kobalt(H)-ionen pro Liter enthält bei 60⁰C durch die Säule. Zu 200 ml des Absiroms gibt man 200ml einer wäßrigen 0,04-m Natriumtetraboratlösung. Anschließend führt man die Mischung durch eine mit einem entsprechenden Ionenaustauscherharz (H⁺-Typ) gefüllte Säule, die man zuvor mit einer wäßrigen 0,02-m Natriumtetraborat-Lösung gewaschen hat. Der Abstrom wird dann durch eine weitere, mit einem entsprechenden lonenaustauscherharz (H⁺-Typ) gefüllte Säule geführt. Dann engt man den Abstrom ein, wobei man 13,9 g eines D-Fructose-Sirups erhält. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Tabelle 1

Reaktionszeit
(Stunden)

Umwandlungsrate
in D-Fructose

3	11
7	20
16	41
20	47
48	46

Beispiel 2

(1) Man inokuliert 200 ml eines wäßrigen Nährmediums (pH = 7,0), das die gleiche Zusammensetzung wie das von Beispiel 1 aufweist, mit Streptomyces aureus IFO 3175. Man bebrütet das Medium unter Schütteln während 72Stunden bei 3O⁰C. Anschließend zentrifugiert man das Medium, wobei man Mikrobenzellen mit einer Glucoseisomerase-Aktivität von 15 Einheiten/g erhält. Dann suspendiert man 12 g der Mikrobenzellen in 48 ml einer physiologischen Salzlösung. Zu der Suspension gibt man 9 g Acrylamid, 480 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 6 ml einer 5%igen j3-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 6 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37°C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet, wobei man Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm erhält. Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces aureus IFO 3175. Glucoseisomerase-Aktivität: 10 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces aureus IFO 3175 in 400 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während einer gewissen Zeitdauer bei 6O⁰C. Der D-Fructose-Gehalt der Suspension wird dann bestimmt, worauf man die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

Nach 48stündigem Rühren filtriert man die Suspension, um das immobilisierte Präparat abzutrennen. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 30,1 g eines D-Fructose-Sirups. Der Sirup weist einen D-Fructose-Gehalt von 87% auf.

Beispiel 3

(1) Man inoculiert 100 ml eines wäßrigen Nährmediums (pH = 7,0), das die gleiche Zusammensetzung aufweist wie das von Beispiel 1, mit Streptomyces olibaceus IFO 3409. Man bebrütet das; Medium während 72Stunden bei 30⁰C. Dann zentrifugiert man das Medium, wobei man Mikrobenzellen erhält, die eine Glucoseisomerase-Aktivität von 9 Einheiten/g aufweisen. Man suspendiert 5 g der Mikrobenzellen in 20 ml einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 3,75 g Acrylamid, 200mg Bis(acrylamidomethyl)äther, 2,5 ml einer 5%igen j8-(Dimethylamino)-propionil:ril-Lösung und 2,5 ml einer l%igen Ammoniumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37° C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb führt, wobei man Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm erhält. Die Körnchen werden dann mit 500 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 50ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces olibaceus IFO 3409. Glucoseisomerase-Aktivität: 6 Einheiten/ml.

(2) Man beschickt eine Säule (2 cm X16 cm) mit 50 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces olibaceus IFO 3409. Dann führt man mit der in der folgenden Tabelle II angegebenen Durchflußgeschwindigkeit eine wäßrige, 40%ige D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält, durch die Säule. Dann wird der D-Fructose-Gehalt in dem Abstrom ermittelt und die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose daraus berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt.

Tabellen

Umwandlung (%) in D-Fructose

Behandlungszeit	Durchflußgeschwindigkeit	6,5ml/Std.
(Stunden)	12,5ml/Std.	40,2
5	28,2	39,4
24	25,2	40,0
48	26,2	40,3
72	26,3	39,9
96	25,8	40,0
112	26,2

7 8

Beispiel 4 @) ^Man suspendiert 120ml des immobilisierten Prä

parats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400ml

(1) Man stellt ein wäßriges Nährmedium (pH = 7,0) einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), her, das die folgenden Bestandteile enthält: die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen

5 pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während

Hefeextrakt 0,3(Gewicht/Volumen-%) 48Stunden bei 60°C und nitriert sie dann zur Abtren-

D-Glucose 2 nung des immobilisierten Präparats. Das Filtrat wird

Ammoniumchlorid 0,3 in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behan-

Dikaliumphosphat 0,1 delt. Man erhält 27,8g eines D-Fructose-Sirups. Der

Magnesiumsulfat- io D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.
heptahydrat 0,05
Mangan-II-sulfat-

tetrahydrat 0,005 Beispiel 6
Calciumcarbonat 0,2

15 (1) Man suspendiert 24g der Mikrobenzellen von

Man inokuliert 11 des Mediums mit Bacillus coagu- Streptomyces griseus IFO 3430 in 240ml einer physiolans IFO12714. Man bebrütet das Medium während logischen Salzlösung. Zu der Lösung gibt man dann 24Stunden bei 37⁰C. Dann gibt man zu dem Medium 600mg Bis(acrylamidomethyl)äther, 18ml einer 11 einer wäßrigen Lösung, die 3 % (Gewicht/Volumen) 0,112%igen Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin-Lö-Pepton und 2% (Gewicht/Volumen) D-Xylose enthält. 20 sung und 2 ml einer 2,5%igen Ammoniumpersulfat-Lö-Man läßt das Medium während 6Stunden bei 37⁰C sung, wonach man die Suspension während 60Minuten stehen und zentrifugiert es dann. Die in dieser Weise bei 37⁰C stehenläßt. Das erhaltene steife Gel wird durch erhaltenen Mikrobenzellen besitzen eine Glucoseiso- Hindurcharbeiten durch ein Sieb zu Körnchen mit merase-Aktivität von 7 Einheiten/g. Man suspendiert einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körndann 12 g der Mikrobenzellen in 68 ml einer physiolo- 25 chen werden dann mit 4200ml einer physiologischen gischen Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension Salzlösung gewaschen. Man erhält 420 ml des im-9g Acrylamid, 480mg Ν,Ν'-MethyIen-bis-acrylamid, mobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 6ml einer 5%igen XDimethylaminoi-propionitril- 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 4Einheiten/ml.
Lösung und 6 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung, (2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präwonach man die Suspension während 30Minuten bei ₃₀ parats von Streptomyces griseus IFO3430 η 400ml 37⁰C stehen läßt. Nach Beendigung der Reaktion gra- einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), nuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(H)-ionen indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerklei- 72Stunden bei 6O⁰C und filtriert sie dann zur Abtrennert. Die Körnchen werden dann mit 1200ml einer 35 nung des immobilisierten Präparats. Das Filtrat wird in physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, behan-120 ml eines immobilisierten Präparats von Bacillus delt. Man erhält 27,8g eines D-Fructose-Sirups. Der coagulans IFO12714. Glucoseisomerase-Aktivität: D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.
5 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120 ml des immobilisierten Prä- ₄₀

parats von Bacillus coagulans IFO12714 in 400ml Beispiel 7
einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0),
die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen

pro Liter enthält. Die Suspension wird während 96 Stun- (D Man suspendiert 24g der Mikrobenzcllen von

den bei 45⁰C gerührt und dann zur Abtrennung des ₄₅ Streptomyces griseus IFO 3430 in 240 ml einer physio-

immobilisierten Präparats filtriert. Das Filtrat wird in logischen Salzlösung und gibt dann 600 mg N,N'-Di-

gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behan- acryläthylen-harnstoff, 18 ml einer 0,112%igcn

delt. Man erhält 22,6g eines D-Fructose-Sirups. Der Ν,Ν,Ν'-N'-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 2ml

D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 81 %. einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung zu der Suspen-

jo sion. Dann läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 3O⁰C stehen. Man granuliert das erhaltene

Beispiel 5 steife Gel, indem nan es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von

(1) Man suspendiert 12g Mikrobenzellen von Strepto- 3mm zerkleinert. Die Körnchen werden mit 4200ml tnyces griseus IFO 3430 in 48 ml einer physiologischen ₅₅ einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erSalzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 9 g ' hSlt 420 ml des immobilisierten Präparats von Strepto-Acrylamid, 480 mg Ν,Ν'-Di-acryläthylenharnstoff, rnycos griseus IFO3430. Qlucoseisomerase-Aktivität: 6,5 ml einer 5%igen j5-(Dimethy!amino)-proplonitril- 3 Einheiten/ml.

Lösung und 6 ml einer 2,5%lgen Ammoniumpersulfat· (2) Man suspendiert 420 ml des Immobilisierten PräLösung. Anschließend läßt man die Suspension wäh- _6o parats von Streptomyces griseus IPO3430 in 400 ml rend 30 Minuten bei 37° C stehen. Das erhaltene steife einer wäßrigen 40%igen D-Qlucose-Lösung (pH - 8,0), OeI wird granuliert, indem man es durch ein Sieb die SmM Magnesiumionen und 1 mM KobaIt(II)-lonen hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durch- pro Liter enthalt Dann rührt man die Suspension wähmesser von 3mm verarbeitet Die Körnchen werden rend 72Stunden bei 6O⁰C und flltriert sie dann zur Abdann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung _6j trennung des immobilisierten Präparats. Man behangewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten delt das Filtrat in gleicher Weise wie in Beispiel 1 bePräparats von Streptomyces griseus IPO 3430. Glucose- schrieben, wobei man 27,8 g D-Fructose-Slrup erhält, isomerase-Aktivität: IS Einheiten/ml. Der Fructoso-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

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Beispiel 8

(1) Man suspendiert 24g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 in 240 ml einer physiologischen Salzlösung, worauf man die Suspension mit .s 600 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 18 ml einer 0,112%igen Ν,Ν,Ν',Ν'-Tctrarnethyläthylendiamin-Lösung und 2 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung versetzt. Anschließend läßt man die Suspension während 60Minuten bei 37°C stehen, wonach man das erhaltene steife Gel dadurch granuliert, daß man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen, wobei sich 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO3430 ergeben. Glucoseisomerase-Aktivität:

5 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält. Die Suspension wird während 72 Stunden bei 6O⁰C gerührt und dann zur Entfernung des immobilisierten Präparats abfiltriert. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei man 27,8g eines D-Fructose-Sirups erhält. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 9

Man suspendiert 60 ml des in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 200 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält bzw. in 200 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0). Man rührt die Suspensionen dann während einer gewissen Zeit bei 6O⁰C, wonach man den D-Fructose-Gehalt in der Suspension bestimmt und daraus die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt. ■

Tabelle III

Reaktionszeit Umwandlungsrate in D-Fructose (%)

Zugabe von Keine Zugabe

(Stunden) Metallionen von Metallionen

3	22	4
5	31	6
16	46	14
24	45	22
48	47	31
72	46	39

Claims

Patentansprüche:

1. Immobilisierter, Gluoseisomerase bildender Mikroorganismus, gekennzeichnet durch S einen fest in das Gitter eines semipermeablen Acrylpolymerisats eingeschlossenen, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus, wobei das Acrylpolymerisat ein Homopolymerisat von N,N'-Niedrigalkylen-bis-aciylamid, Bis(acrylamidoniethyl)äther oder N.N'-Diacryläthylenharnstoff, ein Mischpolymerisat von Acrylamid und N,N'-Niedrigalkylenbis-acrylamid, ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Bis(acrylamidomethyl)äther und/oder ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Ν,Ν'-Diacrylethylenharnstoff ist und pro g des Acrylpolymerisats 0,25 bis 2,5 g des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus eingeschlossen enthalten sind.

2. Verwendung des immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus nach Anspruch 1 zur üblichen enzymatischen Umwandlung von d-Glucose in d-Fruktose.