DE2420102B2

DE2420102B2 - Immobilisierter, glucoseisomerase bildender mikroorganismus und verwendung desselben

Info

Publication number: DE2420102B2
Application number: DE19742420102
Authority: DE
Inventors: Ichiro Suita Osaka; Tosa Tetsuya Kyoto; Sato Tadashi Takatsuki Osaka; Chibata (Japan)
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-25
Publication date: 1976-11-11
Also published as: CH608520A5; US4081327A; JPS49132290A; FR2227324B1; JPS5247036B2; DE2420102A1; GB1443269A; FR2227324A1

Description

Die Erfindung betrifft einen Glui oseisomerase bildenden Mikroorganismus und die Verwendung desselben zur üblichen enzymatischen Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose.

D-Fructose ist bekanntlich als Süßstoff geeignet und kann durch enzymatische Umwandlung von D-G!ucose mit Hilfe von Glucoseisomerase nach den verschiedensten Verfahren erzeugt werden. So können z.B. zur Herstellung von D-Glucose Glucoseisomerase-biidende Mikroorganismen in einem D-Glucose enthaltenden Nährmedium gezüchtet werden, oder Glucoseisomerase kann aus einem Mikroorganismus extrahiert und das erhaltene Enzym kann mit D-Glucose umgeset2t werden. Diese Verfahren sind jedoch zur kommerziellen Herstellung von D-Fructose wenig geeignet, da die dabei gebildete D-Fructose mit dem Enzym, mit Mikrobenzellen und Nährstoffquellen des Mediums· und/oder mit Protein verunreinigt ist. Zur Gewinnung von D-Fructose hohen Reinheitsgrads sind daher zusätzliche Verfahrensschritte zur Entfernung des Enzyms oder anderer Verunreinigungen aus dem Produkt erforderlich. Weiterhin wird nach Beendigung der enzymatischen Reaktion die Reaktionslösung zum Sieden gebracht und/oder angesäuert, um das Enzym oder die Mikroorganismen zu denaturieren, worauf das ausgefällte Enzym oder der ausgefällte Mikroorganismus abfiltriert werden, was zur Folge hat, daß die Glucoseisomerase oder der Glucoseisomerase-bildende Mikroorganismus nur einmal verwendbar sind und anschließend verworfen werden müssen.

Aus »Applied Microbiology«, 1971, Seiten 588-593, ist es auch bereits bekannt, Glucoseisomerase in der Matrix eines Polymerisats, z.B. dem Polymerisat von Acrylamid und Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylumid, einzn- <>o schließen und zu immobilisieren, und in der US-PS 38 17832 wird die Verwendung von zellgcbundencr Glucoseisomerase zur enzymalischen Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose beschrieben. Hs zeigte sich jedoch, daß die Aktivität dieser bekannten im- <>s mobilisierten Enzyme vergleichsweise gering ist und mit einer Halbwertszeit von nur wenigen Tagen ziemlich rasch verloren geht, so daß derartige Enzymprodukte für eine kontinuierliche Verfahrensdurchführung in industriellem Maßstab praktisch nicht in Frage kommen.

In »Biochim. Biophys. Acta«, Bd. 252, (1971), Seiten 246 bis 254 wird ferner die Immobilisierung der Mikroorganismen Streptococcus faecalis ATCC 8043 beschrieben, die jedoch ausschließlich zur Durchführung des Argininstoffwechsels befähigt sind, so daß daraus keine Schlüsse auf das Verhalten von Glucoseisomerase produzierende Mikroorganismen gezogen werden konnten.

Aufgabe der Erfindung ist es, einen immobilisierten Mikroorganismus bereitzustellen, der während einer langen Zeit eine hohe Glucoseisomerase-Aktivität ergibt und nicht verworfen zu werden braucht, sondern in einer Reihe weiterer Verfahrensschritte wiederverwendet werden kann, so daß mit seiner Hilfe ein verbessertes industriell verwendbares Verfahren zur Herstellung von D-Fructose aus D-GJucose durchführbar ist.

Gegenstand der Erfindung ist daher ein immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus, der gekennzeichnet ist durch einen fest in das Gitter eines semipermeablen Acrylpolymerisats eingeschlossenen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus, wobei das Acrylpolymerisat ein Homopolymerisat von Ν,Ν'-NiedrigaIkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl)-äther oder Ν,Ν'-Diacryläthylenharnstoff, ein Mischpolymerisat von Acrylamid und N,N'-Niedrij>alkylen-bis-acrylamid, ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Bis(acryiamidomethyl)äther und/oder ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Ν,Ν'-Diacryläthylenharnstoff ist und pro g des Acrylpolymerisats 0,25 bis 2,5g des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus eingeschlossen enthalten sind.

Typische, für die Erfindung in besonders günstiger Weise verwendbare Glucoseisomerase bildende Mikroorganismen sind z.B. Streptomyces griseus IFO (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3430, Streptomyces griseus IFO3356, Streptomyces aureus IFO3175. Streptomyces olivaceus IFO 3409 und Bacillus coagulans IFO 12714, die bei der genannten Hinterlegungsstelle Tür die Öffentlichkeit zugänglich sind. Neben diesen besonders guten Mikroorganismen sind jedoch auch alle anderen bekannten Glucoseisomerase-bildenden Mikroorganismen verwendbar. Erfindungsgemäß wird der Glucoseisomerase-bildende Mikroorganismus in Mengen von 0,25 bi: 2,5 g, am besten von 0,5 bis 2.0g pro g der verwendeten Acrylmonomcren eingesetzt.

Zur Herstellung der erfindungsgemäßen immobilisierten Mikroorganismen wird mindestens ein Acrylmonomeres in einer einen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus enthaltenden wäßrigen Suspension polymerisiert. Die Polymerisationsreaktion dient dazu, die Mikroorganismen in das Polymerisationsgitter einzuschließen, wodurch sich eine lang anhaltende hohe enzymatische Aktivität erzielen läßt. Die Polymerisationsreaktion kann in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt werden. Als Polymerisationsinitiator ist Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B, und Methylenblau verwendbar und als Polymcrisationsbeschleuniger kann /(-(Dimethylamino)-propionitril und Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramthvläthylcndiamin verwendet werden. Am günstigsten wird der Polymerisationsinitiator in der wäßrigen Suspension des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in

Mengen von 1 bis 100mg, insbesondere 5 bis 50 mg pro g des oder der Acrylmonomeren verwendet. Den Polymerisationsbeschleuniger verwendet man am besten in Mengen von 1 bis 100mg, insbesondere 10 bis 50 mg pro g des oder der Acrylmonomeren. Die Reaktion wird gut bei einer Temperatur von 0 bis 50°C, besser von 20 bis 40°C, durchgerührt. Die Reaktion kann im Verlauf von 10 bis 60Minuten beendigt werden. Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyUäther oder N,N'-Diacryläthylenharnstoff verwendet man bei der Mischpolymerisation mit Acrylamid gut in Mengen von 5 bis 160 mg, besser von 25 bis 80mg pro g Acrylamid. Nach Beendigung der Polymerisationsreaktion wird der sich ergebende, immobilisierte, Glucoseisomerase bildende Mikroorganismus granuliert, indem man ihn durch ein Sieb führt und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 1 bis 10mm, am besten von 3 bis 4 mm zerkleinert.

D-Fructose kann man dann durch enzymatische Reaktion des immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus mit D-Glucose herstellen. Die enzymatische Reaktion wird bei einer Temperatur von 20 bis 80⁰C, am besten von 40 bis 70⁰C durchgeführt. Man führt die Reaktion bei einem pH-Wert von 6 bis 9, insbesondere bei einem pH-Wert von 7 bis 8,5 durch. Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion kann man die enzymatische Aktivität in wirksamer Weise dadurch stabilisieren, daß man Magnesium- und Kobalt(Il)-ionen in die Reaktionslösung einbringt. Die Magnesiumionen setzt man in Mengen von 1 bis 20Millimol, am besten von 3 bis lOMillimol pro Liter der Reaktionslösung /u der Reaktionslösung zu. Die Kobalt(H)-ionen verwendet man in der Reaktionslösung in Mengen von 0,1 bis lOMillimol, am besten von 0,5 bis 5Millimol pro Liter der Reaktionslösung. Die Konzentration des verwendeten Substrats ist nicht kritisch. Zum Beispiel löst man D-Glucose in irgendeiner Konzentration in Wasser. Der genannte immobilisierte Mikroorganismus wird in der D-GIucose-Lösung suspendiert, worauf man die Suspension rührt. Nach Beendigung der Reaktion filtriert oder zentrifugiert man die Mischung, um den immobilisierten Mikroorganismus für die spätere Weiterverwendung abzutrennen. Als Filtrat oder als überstehende Lösung erhält man eine wäßrige, D-Fructose enthaltende Lösung. D-Fructose wird dann nach an sich bekannten Verfahrensweisen isoliert, z. B. durch Zusatz von Borsäure oder eines Borats (z.B. Natriumtetraborat) zu dem Filtrat oder der übersiehenden Lösung und Behandeln der Mischung mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz. Die optimalen Reaktionsbedingungen zur Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose können leicht durch Steuern der Reaktionszeit erreicht werden.

Alternativ kann die enzymatisch« Reaktion nach der Säulenmethode durchgeführt weiden. Die Säulenmethode ermöglicht es, die Reaktion stufenweise durchzuführen. Zum Beispiel füllt man eine Säule mit dem immobilisierten Mikroorganismus und führt eine wäßrige Lösung von D-Glucose mit geeigneter Durchflußgeschwindigkeit durch die Säule. Als Abstrom erhält man eine wäßrige D-Fructose enthaltende Lösung. Die D-Fructose wird nach der gleichen Methode aus dem Abstrom gewonnen, wie sie oben für das genannte Filtrat oder die überstehende Losung beschrieben wurde. Bei der Durchführung dir enzymatischen Reaktion hängt die LImwandlungsrate der D-Glucose in die D-Fructose überwiegend von der enzymatischen Aktivität des immobilisierten Mikroorganismus, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab. Im Fall der Säulenmethode kann man die optimalen Reakuonsbedingungen Tür die Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose in einfacher Weise durch Steuern der Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung erreichen.

In jedem Fall behält der erfindungsgemäß eingesetzte immobilisierte Mikroorganismus während der

ίο Reaktion ein hohes Maß an enzymatischer Aktivität bei, besonders in Gegenwart von Magnesium- und Kobalt(II)-ionen. Weiterhin kann der erfindungsgemäß eingesetzte immobilisierte Mikroorganismus aufgrund der in ausreichender Weise anhaltenden enzymati-

,₅ sehen Aktivität wiederholt bei der enzymatischen Reaktion verwendet werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern.
Der hierin verwendete Ausdruck »Niedrigalkylen« steht für Alkylen-Uruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

In den folgenden Beispielen wird die Aktivität eines Mikroorganismus oder eines immobilisierten Mikroorganismus, der bei der Reaktion mit D-Glucose bei

ir einem pH-Wert von 8,0 und bei 60⁰C im Verlaufe von einer Stunde lmg D-Fructose liefen, als eine Einheit definiert. Die Identifizierung von D-Fructose in der Lösuna erfolgt papierchromatographisch, wobei man eine Mischung aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser

,o (4:1:1) als Entwicklungslösungsmittel verwendet. Die D-Fructose-Menge in der Lösung wird nach dem Verfahren von M. C. Cad mus et al. (Analytical Biochemistry, Volume 26, Seiten 484 bis 487 [1968]) bestimmt. Hierzu setzt man 0,4ml einer D-Fructose-

-,5 Lösung zu einer Mischung aus 0,1ml einer 20%igen Lösung von L-Cysteinhydrochloridhydrat und 5 ml 75%iger (Volumen/Volumen) Schwefelsäure zu. Man rührt die Mischung und läßt sie dann während einer Stunde stehen, wonach man die D-Fructose-Menge in der Mischung kolorimetrisch bestimmt.

Beispiel 1

(1) Man stellt ein wäßriges Nährmedium (pH 7,0) her, das die folgenden Bestandteile enthält:

Pepton	1 (Gewicht/Volumen-%)
Hefeextrakt	0,25
Fleischextrakt	0,5
D-Glucose	0,3
D-Xylose	0,7
Magnesiumsulfat-
heptahydrat	0,05
Kobalt'dD-chlorid-
hexahydrat	0,024
Natriumchlorid	0,5

do Man inokuliert 200ml d:s Mediums mit Streptomyces griseus IFO 3430. Dann bebrütet man das Medium unter Schütteln während 72Stunden bei 30⁰C und zentrifugiert es anschließend. Die in dieser Weise gesammelten Mikrohenzellen zeigen eine Glucoseiso-

<,s meiase-Aklivität von 30Einheiten pro Gramm. Man suspendiert 17 g der Mikrobenzellen in 68 ml physiologischer Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 12,75 g Acrylamid, 680mg N.N'-Methylen-bis-acryl-

amid, 7,5 ml einer 5%igen j8-<Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 7,5 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30Minuten bei 37°C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man cas in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurchführt und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Anschließend wäscht man die Körnchen mit 1700ml einer physiologischen Salzlösung. Man erhält 170ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO3430. Giucoseisomerase-Aktivität: 25 Einheiten/ml.

(2) Man beschickt eine Säule (4cm X 13,5 cm) mit 170 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO3430. Dann führt man mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h 200 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5Millimoi Magnesiumionen und 1 Millimol Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält bei 60⁰C durch die Säcle. Zu 200 ml des Abstroms gibt man 200ml einer wäßrigen 0,04-m Natriumtetraboratlösurig. Anschließend führt man die Mischung durch eine mit einem entsprechenden lonenaustauscherharz (H⁺-Typ) gefüllte Säule, die man zuvor mit einer wäßrigen 0,02-m Natriumtetraborat-Lösung gewaschen hat. Der Abstrom wird dann durch eine weitere, mit einem entsprechenden lonenaustauscherharz (H⁺-Typ) gefüllte Säule geführt. Dann engt man den Abstrom ein, wobei man 13,9g eines D-Fructose-Sirups erhält. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 2

(1) Man inokuliert 200 ml eines wäßrigen Nährmediums (pH = 7,0), das die gleiche Zusammensetzung wie das von Beispiel 1 aufweist, mit Streptomyces aureus IFO3175. Man bebrütet das Medium unter Schütteln während 72Stunden bei 30°C. Anschließend zentrifugiert man das Medium, wobei man Mikrobenzellen mit einer Glucoseisomerase-Aktivität von 15Einheiten/g erhält. Dann suspendiert man 12g der Mikrobenzellen in 48 ml einer physiologischen Salzlösung. Zu der Suspension gibt man 9g Acrylamid, 480 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 6 ml einer 5%igen jS-(Dimethylamino)-propionitiil-Lösung und 6ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37°C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet, wobei man Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm erhält. Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces aureus IFO3175. Glucoseisomerase-Aktivität: lOEinheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces aureus IFO 3175 in 400 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(N)-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während einer gewissen Zeitdauer bei 6O⁰C. Der D-Fructose-Gehalt der Suspension wird dann bestimmt, worauf man die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt.

Tabelle 1

Reaktionszeit	Umwandlungsrate
	in D-Fructose
(Stunden)	(%)
3	H
7	20
16	41
20	•17
48	46

Nach 48stündigem Rühren filtriert man die Suspension, um das immobilisierte Präparat abzutrennen. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 30,1g eines D-Fructose-Sirups. Der Sirup weist einen D-Fructose-Gehal: von 87% auf.

Beispiel 3

(1) Man inoculiert 100 ml eines wäßrigen Niihrmediums (pH = 7,0), das die gleiche Zusammensetzung aufweist wie das von Beispiel 1, mit Streptomyces olibaceus IFO3409. Man bebrütet das Medium während 72Stunden bei 30°C. Dann zentrifugiert man das Medium, wobei man Mikrobenzellen erhält, die eine Glucoseisomerase-Aktivität von 9 Einheiten/g aufweisen. Man suspendiert 5 g der Mikrobenzellen in 20 mi einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man /u der Suspension 3,75g Acrylamid, 200mg Bis(acrylamidomethyl)äther, 2,5 ml einer 5%igen j8-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 2,5ml einer l%igen Ammoniumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30Minuten bei 37⁰C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb führt, wobei man Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm erhält. Die Körnchen werden dann mit 500 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 50ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces olibaceus IFO3409. Glucoseisomerase-Aktivität: 6 Einheiten/ml.

(2) Man beschickt eine Säule (2cmX16cm) mit 50ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces olibaceus IFO3409. Dann führt man mit der in der folgenden Tabelle II angegebenen Durchflußgeschwindigkeit eine wäßrige, 40%ige D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5mM Magnesiumionen und ImM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält, durch die Säule. Dann wird der D-Fructose-Gehalt in dem Abstrom ermittelt und die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose daraus berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabellen zusammengestellt.

Tabellen

Umwandlung (%) in D-Fructose

Behandlungszeit	DurchfluBgeschwindigkeit	6,5ml/Std.
(Stunden)	I2,5ml/Std.	40,2
5	28,2	39,4
24	25,2	40,0
48	26,2	40,3
72	26,3	39,9
96	25,8	40.0
112	26.2

Beispiel 4

(1) Man stellt ein wäßriges Nährmedium (pH = 7,0) her, das die folgenden Bestandteile enthält:

Hefeextrakt	0,3 (Gewicht/Volumcn-%)
D-Glucose	2
Ammoniumchlorid	0,3
Dikaliumphosphat	0,1
Magnesiumsulfat-
heptahydrat	0,05
Mangan-II-suIfat-
tetrahydrat	0,005
Calciumcarbonat	0,2

Man inokuliert 11 des Mediums mit Bacillus coagulans IFO12714. Man bebrütet das Medium während 24 Stunden bei 37° C. Dann gibt man zu dem Medium 11 einer wäßrigen Lösung, die 3 % (Gewicht/Volumen) Pepton und 2% (Gewicht/Volumen) D-Xylose enthält. Man läßt das Medium während 6 Stunden bei 37° C stehen und zentrifugiert es dann. Die in dieser Weise erhaltenen Mikrobenzellen besitzen eine Glucoseisomerase-Aktivität von 7 Einheiten/g. Man suspendiert dann 12g der Mikrobenzellen in 68ml einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 9g Acrylamid, 480mg N,N'-M»thylen-bis-acrylamid, 6ml einer 5%igen j8-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 6 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung, wonach man die Suspension während 30 Minuten bei 37°C stehen läßt. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120ml eines immobilisierten Präparats von Bacillus coagulans IFO12714. Glucoseisomerase-Aktivität: 5 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120ml des immobilisierten Präparats von Bacillus coagulans IFO12714 in 400ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(H)-ionen pro Liter enthält. Die Suspension wird während 96 Stunden bei 45° C gerührt und dann zur Abtrennung des immobilisierten Präparats filtriert. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 22,6 g eines D-Fructose-Sirups. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 81%.

Beispiel 5

(1) Man suspendiert 12 g Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 in 48 ml einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 9 g Acrylamid, 480 mg NUN'-Di-acryläthylenharnstoff, 6,5 ml einer 5%igen jff-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 6 ml einer 2,5%igen Ammoniumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30Minuten bei 37°C stehen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm verarbeitet Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 15 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400 nil einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH =8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während 48 Stunden bei 60⁰C und filtriert sie cknn zur Abtrennung des immobilisierten Präparats. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 27,8 g eines D-Fructose-Sirups. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 6

is (1) Man suspendiert 24g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 in 240 ml einer physiologischen Salzlösung. Zu der Lösung gibt man dann 600mg Bis(acrylamidomethyl)äther, 18ml einer 0,112%igen N,N.N',N'-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und ? ml einer 2,5%igen Ammoniumpersulfat-Lösung, worach man die Suspension während 60Minuten bei 37°C stehenläßt. Das erhaltene steife Gel wird durch Hindurcharbeiten durch ein Sieb zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 420ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 4Einheiten/ml. (2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8.0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(ll)-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während 72 Stunden bei 60° C und filtriert sie dann zur Abtrennung des immobilisierten Präparats. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt. Man erhält 27,8g eines D-Fructose-Sirups. Der D-Fructose-Gehait des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 7

(1) Man suspendiert 24g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 in 240 ml einer physiologischen Salzlösung und gibt dann 600mg N,N'-Diacryläthylen-harnstoff, 18 ml einer 0,112%igen N.N,N'-N'-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 2 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung zu der Suspension. Dann läßt man die Suspension während 30Minu ten bei 30⁰C stehen. Man granuliert das erhaltene steife Gel, indem nan es durch ein Sieb hindurch arbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser vor 3 mm zerkleinert Die Körnchen werden mit 4200 m einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man er hält 420ml des immobilisierten Präparats von Strepto myces griseus IFO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität 3 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Prä parats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400 m einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0] die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(ID-ionei pro Liter enthält Dann rührt man die Suspension wäti rend 72 Stunden bei 6O⁰C und filtriert sie dann zur Al trennung des immobilisierten Präparats. Man behar delt das Filtrat in gleicher Weise wie in Beispiel 1 be schrieben, wobei man 27,8 g D-Fructose-Sirup erhäl Der Frjctose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 8

(1) Man suspendiert 24g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO3430 in 240ml einer physiologischen Salzlösung, worauf man die Suspension mit s 600 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 18 ml einer 0,112%igen Ν,Ν,Ν',Ν'-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 2 ml einer 2,5%igen Kaliumpersulfat-Lösung versetzt. Anschließend läßt man die Suspension während 60Minuten bei 37°C stehen, wonach m man das erhaltene steife Gel dadurch granuliert, daß man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen, wobei sich 420ml i_s des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO3430 ergeben. Glucoseisomerase-Aktivität:

5 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(Il)-ionen pro Liter enthält. Die Suspension wird während 72 Stunden bei 60° C gerührt und dann zur Entfernung des immobilisierten Präparats abfiltriert. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, behandelt, wobei man 27,8 g eines D-Fructose-Sirups erhält. Der D-Fructcse-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 9

Man suspendiert 60 ml des in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO3430 in 200ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt(II)-ionen pro Liter enthält bzw. in 200 ml einer wäßrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0). Man rührt die Suspensionen dann während einer gewissen Zeit bei 6O⁰C, wonach man den D-Fructose-Gehalt in der Suspension bestimmt und daraus die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle 111

Reaktionszeit Umwandlungsrate in D-Fructose (%)

Zugabe von Keine Zugabe

(Stunden) Metallionen von Metallionen

3	22	4
5	31	6
16	46	14
24	45	22
48	47	31
72	46	39

Claims

Patentansprüche:

1. Immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus, gekennzeichnet durch > einen fest in das Gitter eines semipermeablen Acrylpolymerisats eingeschlossenen, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus, wobei das Acrylpolymerisat ein Homopolymerisat von N,N'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyi)äther oder Ν,Ν'-Diacryläthylenharnstoff, ein Mischpolymerisat von Acrylamid und Ν,Ν'-Niedrigalkylenbis-acrylamid, ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Bis(acrylamidomethyl)äther und/oder ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und Ν,Ν'-Diacryl- ι s äthylenharnstoff ist und pro g des Acrylpolymerisats 0,25 bis 2,5g des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus eingeschlossen enthalten sind.

2. Verwendung des immobili.i.'rten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorgan smus nach Anspruch 1 zur üblichen enzymatischen Umwandlung von d-Glucose in d-Fruktose.