DE2420102A1

DE2420102A1 - Verfahren zur herstellung von dfructose

Info

Publication number: DE2420102A1
Application number: DE2420102A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; Tadashi Sato; Tetsuya Tosa
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1973-04-25
Filing date: 1974-04-25
Publication date: 1974-11-14
Also published as: CH608520A5; US4081327A; JPS49132290A; FR2227324B1; JPS5247036B2; GB1443269A; FR2227324A1; DE2420102B2

Description

Verfahren zur Herstellung von D-Pructose

.Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von D-Pructose. Sie betrifft insbesondere ein Verfahren zur Herstellung von D-Pructose durch enzymatische Reaktion eines immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus mit D-Glucose.

D-Pructose ist als Süßstoff geeignet. Es ist bekannt, daß Glucoseisomerase D-Glucose in D-Pructose umzuwandeln in der Lage ist. Es sind verschiedene Verfahren zur Herstellung von D-Pructose aus D-Glucose durch enzymatische Reaktion mit Glucoseisomerase bekannt. Zum Beispiel kann man D-Pructose dadurch herstellen, daß man Glucoseisomerase bildende Mikroorganismen in einem D-Glucose enthaltenden Nährmedium züchtet. Alternativ kann man sie dadurch herstellen, daß man Glucoseisomerase aus einem Mikroorganismus extrahiert und das Enzym mit D-Glucose umsetzt. Diese Verfahren sind jedoch zur kommerziellen Herstellung von D-Fructose von Nachteil. Die nach diesen Verfahren gebildete D-Pructose ist mit dem Enzym, Mikrobenzellen und Nährstoffquellen des Mediums und/oder Protein verunreinigt. Demzufolge sind zur Gewinnung von D-Pructose mit hoher Reinheit zusätzliche Verfahrensschritte zur Entfernung des Enzyms oder anderer Verunreinigungen aus .dem Produkt erforderlich. Weiterhin wird, wenn die enzymatische Reaktion beendigt ist, die Reaktionslösung zum Sieden gebracht und/oder angesäuert, um das Enzym oder die Mikroorganismen zu denaturieren, worauf das ausgefällte Enzym oder der ausgefällte Mikroorganismus abfiltiert werden. Somit können die Glucoseisomerase oder der Glucoseisomerase bildende Mikroorganismus nur einmal verwendet werden und müssen anschließend verworfen werden.

Es ist daher ein Ziel der Erfindung, einen neuen immobilisierten Mikroorganismus bereitzustellen, der während langer Zeit eine hohe Glucoseisomerase-Aktivität ergibt. Ein weiteres Ziel der Erfindung besteht darin, einen immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus bereitzustellen, mit dem das Verwerfen des Mikroorganismus vermieden werden kann, und der in einer Reihe weiterer Verfahrensschritte wieder verwendet werden kann. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist die Schaffung eines verbesserten Verfahrens zur Herstellung von D-Pructose aus D-Glucose durch die Verwendung eines Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus.

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Die Erfindung betrifft daher ein Verfahren zur Herstellung von D-Fructose, das dadurch gekennzeichnet ist', daß man mindestens ein Acrylmonomeres in einer einen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus enthaltenden wässrigen Suspension unter Bildung eines immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus polymerisiert und den immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose unterwirft.

Bevorzugte Beispiele für erfindungsgemäß verwendete Glucoseisomerase bildende Mikroorganismen schließen ein: Streptomyces griseus IPO (Institute for Fermentation, Osaka,.Japan) 3430, Streptomyces griseus IFO 3356, Streptomyces aureus IFO 3175, Streptomyces olivaceus IFO 3409 und Bacillus coagulans IFO 12714. All diese Mikroorganismen sind bei der genannten Hinterlegungsstelle für die Öffentlichkeit zugänglich. In diesem Zusammenhang, ist jedoch festzuhalten, daß die Erfindung nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Mikroorganismen eingeschränkt ist, sondern die Anwendung sämtlicher Glucoseisomerase bildender Mikroorganismen einschließt. Erfindungsgemäß verwendet man den Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in Mengen von 0,25 bis 2,5 g, bevorzugter 0,5 bis 2,0 g pro g der verwendeten Acrylmonomeren. Die erfindungsgemäße Polymerisationsreaktion dient dazu, die Mikroorganismen in das Pplymerisationsgitter einzuschließen, wodurch sich eine lang anhaltende hohe enzymatische Aktivität erzielen läßt.

Die erfindungsgemäße Polymerisationsreaktion kann in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt werden. Als Polymerisationsinitiator kann man Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B₂ und Methylenblau einsetzen. Andererseits kann man als Polymerisationsbeschleuniger β -(Dimethylamine)-propionitril und Ν,Ν,Ν¹,N'-Tetramethyläthylendiamin verwenden. Vorzugsweise verwendet man den Polymerisationsinitiator in der wässrigen Suspension des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in Mengen von 1 bis 100 mg, insbesondere 5 bis 50 mg pro g des oder der Acrylmonomeren. Den

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Polymerisationsbeschleuniger verwendet man vorzugsweise .in Mengen von 1 bis 100 mg, insbesondere 10 bis 50 mg pro g des oder der Acrylmonomeren. Vorzugsweise bewerkstelligt man die Reaktion bei einer Temperatur von 0 bis 50⁰C, bevorzugter von 20. bis ¹IO⁰C. Die Reaktion kann im Verlauf von 10 bis 60 Minuten beendigt werden. Erfindungsgemäß geeignete Acrylmonomeren sind Acrylamid, Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethy1)äther und N,N'-Di-acryläthylenharnstoff (= N,N'-Di-acrylimidazolidin-2-on). Erfindungsgemäß ist es von Vorteil, den Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in ein Polymerisat einzubauen, das man aus einem oder zwei der oben erwähnten Monomeren gebildet hat, insbesondere in ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und einem Acrylmonomeren wie zum Beispiel Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethy 1) äther und/oder N,N'-Di-acryläthylenharnstoff, oder in ein Homopolymerisat aus N,N'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethy1)äther oder'N,N¹-Di-acryläthylenharnstoff. Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid und NjN'-Propylen-bis-acrylamid sind die bevorzugten N,N¹-Niedrigalkylen-bis-acrylamide. Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethy1)äther oder N,N¹-Diacry läthy lenharnstoff verwendet man bei der Mischpolymerisation mit Acrylamid vorzugsweise in Mengen von .5 bis 160 mg, bevorzugter 25 bis 80 mg pro g Acrylamid. Nach Beendigung der Polymerisationsreaktion wird der sich ergebende, immobilisierte, Glucoseisomerase bildende Mikroorganismus granuliert, indem man ihn durch ein Sieb führt und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 1 bis 10 mm, bevorzugter 3 bis 4 mm zerkleinert.

D-Pructose kann man dann durch enzymatische Reaktion des immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus mit D-Glucose herstellen. Die enzymatische Reaktion wird bei einer Temperatur von 20 bis 80°C, bevorzugter 40 bis 70°C durchgeführt.. Vorteilhafterweise führt man die Reaktion bei einem pH-Wert von 6 bis 9, insbesondere bei einem pH-Wert von 7 bis 8,5 durch. Bei der Durchführung der erfindungsgemäßen enzymatischen Reaktion kann man die enzymatische Aktivität in wirksamer Weise dadurch stabilisieren, daß man Magnesium- und Kobalt-II-ionen in die Reaktionslösung einbringt. Die Magnesiumionen setzt man in Mengen von

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1 bis 20 Millimol, bevorzugter 3 bis 10 Millimol pro Liter der Reaktionslösung zu der Reaktionslösung zu. Die Kobalt-II-ionen verwendet man in der Reaktionslösung in Mengen von 0,1 bis 10 Millimol, bevorzugter 0,5 bis 5 Millimol pro Liter der Reaktionslösung. Die Konzentration des verwendeten Substrats ist erfindungsgemäß nicht kritisch. Zum Beispiel löst man D-Glucose in irgendeiner Konzentration in Wasser. Der genannte immobilisierte Mikroorganismus wird in der D-Glucose-Lösung suspendiert, worauf man die Suspension rührt. Nach Beendigung der Reaktion filtriert oder zentrifugiert man die Mischung,um den immobilisierten Mikroorganismus für die spätere Weiterverwendung abzutrennen. Als Piltrat oder als überstehende Lösung erhält man eine wässrige, D-Pructose enthaltende Lösung. D-Pructose wird dann _snach an sich bekannten Verfahrensweisen isoliert, zum Beispiel durch Zusatz von Borsäure oder eines Borats (zum Beispiel Natriumtetraborat) zu dem Piltrat oder der überstehenden Lösung und Behandeln der Mischung mit einem stark basischen Anionenaustauscherharz. Die optimalen Reaktionsbedxngungen zur Umwandlung von D-Glucose in D-Pructose können leicht durch Steuern der Reaktionszeit erreicht werden.

Alternativ kann die erfindungsgemäße enzymatische Reaktion nach der Säulenmethode durchgeführt werden. Die Säulenmethode ermöglicht es, die Reaktion stufenweise durchzuführen. Zum Beispiel füllt man eine Säule mit dem immobilisierten Mikroorganismus und führt eine wässrige Lösung von D-Gluoose mit geeigneter Durchflußgeschwindigkeit durch die Säule. Als Abstrom erhält man eine wässrige D-Pructose enthaltende Lösung. Die D-Pructose wird nach der gleichen Methode aus dem Abstrom gewonnen, wie sie oben für das genannte Piltrat oder die überstehende Lösung beschrieben wurde. Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion hängt die Umwandlungsrate der D-Glucose in die D-Pructose überwiegend von der enzymatischen Aktivität des immobilisierten Mikroorganismus, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab. Im Fall der Säulenmethode kann man die optimalen Reaktionsbedingungen für die Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose in einfacher Weise durch Steuern der Durchflußgeschwindigkeit der Substratlösung erreichen.

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In jedem Pall behält der erfindungsgemäß eingesetzte immobilisierte Mikroorganismus während der Reaktion ein hohes Maß an enzymatischer Aktivität bei, insbesondere in Gegenwart von Magnesium- und Kobalt-II-ionen. Weiterhin kann der erfindungsgemäß eingesetzte immobilisierte Mikroorganismus aufgrund der in ausreichender Weise anhaltenden enzymatischen Aktivität wiederholt bei der enzymatischen Reaktion verwendet werden.

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch zu beschränken.

Der hierin verwendete Ausdruck "Niedrigalkylen" steht für Alkylen-Gruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen.

In den folgenden Beispielen wird die Aktivität (oder Potenz) eines Mikroorganismus oder eines immobilisierten Mikroorganismus, der bei der Reaktion mit D-Glucose bei einem pH-Wert von 8,0 und bei 60 C im Verlaufe von einer Stunde 1 mg D-Pructose liefert, als eine Einheit definiert. Die Identifizierung von D-Pructose in der Lösung erfolgt papierchromatographisch, wobei man eine Mischung aus n-Butanol, Essigsäure und Wasser (4:1:1) als Entwicklungslösungsmittel verwendet. Die D-Pructose-Menge in der Lösung wird nach dem Verfahren von M.C.Cadmus et al. (Analytical Biochemistry, Volume 26, Seiten 484 bis 487 (1968)) bestimmt. Hierzu setzt man 0,4 ml einer D-Pructose-Lösung zu einer Mischung aus 0,1 ml einer 20#igen Lösung von L-Cysteinhydrochlridhydrat und 5 ml 75$iger (Volumen/Volumen) Schwefelsäure zu. Man rührt die Mischung und läßt sie dann während einer Stunde stehen, wonach man die D-Pructose-Menge in der Mischung kolorimetrisch bestimmt.

Beispiel 1

(1) Man stellt ein wässriges Nährmedium (pH 7,0) her, das die folgenden Bestandteile enthält:

Pepton 1 (Gewicht/Volumen-%)

Hefeextrakt 0,25

Fleischextrakt 0,5

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D-Glucose O₈3

D-Xylose 0,7

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0_s 05

Kobalt-II-chlorid-hexahydrat 0,024

Natriumchlorid 0,5

Man inokuliert 200 ml des Mediums mit Streptomyoes griseus IPO 3430. Dann züchtet man das Medium unter Schütteln während 72 Stunden bei 30⁰C und zentrifugiert es anschließend. Die in dieser Weise gesammelten Mikrobenzellen zeigen eine Glucoseisomerase-Aktivität von 30 Einheiten pro Gramm. Man suspendiert 17 g der Mikrobenzellen in 68 ml physiologischer Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 12,75 g Acrylamid, 680 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 7,5 ml einer 5$igen yS-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 7,5 ml einer 2_s5$igen Kaliumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37°C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurchführt und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Anschließend wäscht man die Körnchen mit 1700 ml einer physiologischen Salzlösung. Man erhält I70 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IPO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 25 Einheiten/ml.

(2) Man beschickt eine Säule (4 cm χ 13,5 cm) mit I70 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IPO 3430. Dann führt man mit einer Strömungsgeschwindigkeit von 60 ml/h 200 ml einer wässrigen 40#igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 Millimol Magnesiumionen und 1 Millimol Kobalt-II-ionen pro Liter enthält bei 6O⁰C durch die Säule. Zu 200 ml des Abstroms gibt man 200 ml einer wässrigen 0,04 m Natriumtetraboratlösung. Anschliessend führt man die Mischung durch eine mit einem Ionenaustauscherharz (Dowex 1 χ 2 (H -Typ) der Dow Chemical Company) gefüllte Säule, die man zuvor mit einer wässrigen 0,02 m Natriumtetraborat-Lösung gewaschen hat. Der Abstrom wird dann durch eine weitere, mit einem Ionenaustauscherharz (Dowex 50 χ 8 (H -Typ) der Dow Chemical Company) gefüllte Säule geführt. Dann engt man den

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Abstrom ein, wobei man 13,9 g eines D-Fructose-Sirups erhält. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90$.

Beispiel 2

(1) Man inokuliert 200 ml eines wässrigen Nährmediums (pH= 7>0)s das die gleiche Zusammensetzung wie das von Beispiel 1 aufweist, mit Streptomyces aureus IPO 3175· Man züchtet das Medium unter Schütteln während 72 Stunden bei 3O⁰C. Anschließend zentrifugiert man das Medium, wobei man Mikrobenzellen mit einer Glucoseisomerase-Aktivität von 15 Einheiten/g erhält. Dann suspendiert man 12 g der Mikrobenzellen in 48 ml einer physiologischen Salzlösung. Zu der Suspension gibt man 9 g Acrylamid, 480 mg Ν,Ν'-Methylen-bis-acrylamid, 6 ml einer 5%igen /&-(Dimethylamine)-propionitril-Lösung und 6 ml einer 2,5$igen Kaliumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37⁰C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet, wobei man Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm erhält. Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces aureus IPO 3175· Glucoseisomerase-Aktivität: 10 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces aureus IPO 3175 in 400 ml einer wässrigen 40#igen D-Glucose-Lösung (pH=8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während einer gewissen Zeitdauer bei 60°C. Der D-Fructose-Gehalt der Suspension wird dann bestimmt, worauf man die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Pructose berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle I zusammengefaßt .

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Tabelle I

Reaktionszeit (Stunden) Umwandlungsrate in D-Fructose {%)

3 11

7 20

16 41

20 47

48 46

Nach 48stündigem Rühren filtriert man die Suspension, um das immobilisierte Präparat abzutrennen. Das Piltrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 30,1 g eines D-Pructose-Sirups. Der Sirup weist einen D-Fructose-Gehalt von 875? auf.

Beispiel 3

(1) Man inoGuliert 100 ml eines wässrigen Nährmediums (pH = 7₅0), das die gleiche Zusammensetzung aufweist wie das von Beispiel 1, mit Streptomyces olibaceus IPO 3409. Man züchtet das Medium während 72 Stunden bei 30⁰C. Dann zentrifugiert man das Medium, wobei man Mikrobenzellen erhält, die eine Glucoseisomerase-Aktivität von 9 Einheiten/g aufweisen. Man suspendiert 5 g der Mikrobenzellen in 20 ml einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 3,75 g Acrylamid, 200 mg Bis(acrylamidomethyl)äther₃ 2,5 ml einer 5#igen ft>-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 2,5 ml einer en Ammoniumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37°C stehen. Nach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb führt, wobei man Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm erhält. Die Körnchen xierden dann mit 500 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 50 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces olibaceus IPO 3409. Glucoseisomerase-Aktivität: 6 Einheiten/ml.

(2) Man beschickt eine Säule (2 cm χ 16 cm) mit 50 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces olibaeeus IPO 3409. Dann führt man

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mit der in der folgenden Tabelle II angegebenen Durchflußgeschwindigkeit eine wässrige^ 4O$ige D-Giucose-Lösung (pH = 8₃O), die 5 mM Magnesiumionen und 1 m'Ä Kobalt-II-ionen pro Liter enthält ₃ durch die Säule. Dann wird der D-Fructose-Gehalt in dem Abstrom ermittelt und die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose daraus berechnet» Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II zusammengestellt„

Tabelle II

Umwandlung {%) in D-Pruotose

Behandlungszeit Durchflußgeschwindigkeit

(Stunden) 12,5 ml/Std. 6,5 ml/Std,

5 28,2 40,2

24 25,2 39,4

48 26,2 40,0

72 26,3 40,3

96 25,8 39,9

112 26,2 40,0

Beispiel 4

(1) Man stellt ein wässriges Nährmedium (pH = 7,0) her, das die folgenden Bestandteile enthält:

Hefeextrakt 0,3 (Gewicht/

Volumen %)

D-Glucose 2

Ammoniumchlorid 0,3

Dikaliumphosphat 0,1

Magnesiumsulfat-heptahydrat 0,05

Mangan-II-sulfat-tetrahydrat 0,005

Calciumcarboaat 0,2

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Man inokuliert i 1 des Mediunis nit Sacillus eoagulans IFO 12714. Man züchtet das Medium während 24 Stunden bei 37°C» Dann gibt man zu dem Medium 1 1 einer wässrigen Lösung,, die 3/« (Gewicht/Volumen) Pepton und 2% (Gewicht/Volumen) D-Xylose enthält» Man läßt das Medium während β Stunden bei 37^C stehen und zentrifugiert es dann« Die in dieser Weise erhaltenen Mikrobenseilen besitzen eine Glucoseisomerase-Aktivität von 7 Sinheiten/g. Man suspendiert dann 12 g der Mikrobenzellen in 68 ml einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man su der Suspension 9 g Acrylamid,, 480 mg HaN'-Methylen-bis-acrylamidji 6 ml einer 5/aigen A -(Dimethylamine)-propionitril-Lösung und 6 ml einer 2,5$igen Kaliumpersulfat-Lösung, wonach man die Suspension während 30 Minuten bei 37⁰C stehen läßt ο Mach Beendigung der Reaktion granuliert man das in dieser Weise erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und su Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparats von Bacillus eoagulans IFO 12714. Glucoseisomerase-Aktivität: 5 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120 ml des immobilisierten Präparats von Bacillus eoagulans IFO 12714 in 400 ml einer wässrigen 40$igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter enthält. Die Suspension wird während 96 Stunden bei 45°C gerührt und dann zur Abtrennung des immobilisierten Präparats filtriert. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 22,6 g eines D-Fructose-Sirups. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 81$.

Beispiel 5

(1) Man suspendiert 12 g Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 in 48 ml einer physiologischen Salzlösung. Dann gibt man zu der Suspension 9 g Acrylamid, 480 mg N,N¹-Di-acryläthylenharnstoff, 6,5 ml einer 5$igen /S-(Dimethylamino)-propionitril-Lösung und 6 ml einer 2,5$igen Ammoniumpersulfat-Lösung. Anschließend läßt man die Suspension während 30 Minuten bei 37 C stehen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert-^ indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durch-

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messer von 3 mm verarbeitet. Die Körnchen werden dann mit 1200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 15 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 120 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IPO 3430 in 400 ml einer wässrigen 40%igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während 48 Stunden bei 60°C und filtriert sie dann zur Abtrennung des immobilisierten Präparats. Das Piltrat wird in gleicher VJeise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 27,8 g eines D-Pructose-Sirups. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt

Beispiel 6

(1) Man suspendiert 24 g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IFO 3430 in 240 ml einer physiologischen Salzlösung. Zu der Lösung gibt man dann 600 mg Bis(acrylamidomethyl)äther, 18 ml einer 0,112#igen N,N,N¹,N'-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 2 ml einer 2,5%igen Ammoniumpersulfat-Lösung, wonach man die Suspension während 60 Minuten bei 37⁰C stehen läßt. Das erhaltene steife Gel wird durch Hindurcharbeiten durch ein Sieb zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3^30. Glucoseisomerase-Aktivität: 4 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400 ml einer wässrigen 40#igen D-Glucose-LÖsung (pH = 8.,O), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter enthält. Man rührt die Suspension während 72 Stunden bei 6O⁰C und filtriert sie dann zur Abtrennung des immobilisierten Präparats. Das Filtrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt. Man erhält 27_}8 g eines D-Fructose-Sirups. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90$.

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Beispiel 7

(1) Man suspendiert 24 g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IPO 3430 in 240 ml einer physiologischen Salzlösung und gibt dann 600 mg N,N¹-Di-acryläthylen-harnstoff, 18 ml einer 0,112%igen Ν,Ν,Ν'-N'-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 2 ml einer 2,5$igen Kaliumpersulfat-Lösung zu der Suspension. Dann läßt man die Suspension während 3° Minuten bei 3O⁰C stehen. Man granuliert das erhaltene steife Gel, indem man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen. Man erhält 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IPO 3430. Glucoseisomerase-Aktivität: 3 Einheiten/ml.

(2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IPO 3430 in 400 ml einer wässrigen 40$igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter ^enthält. Dann rührt man die Suspension während 72 Stunden bei 6O⁰C und filtriert sie dann zur Abtrennung des immobilisierten Präparats. Man behandelt das Piltrat in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei man ²7»8 g D-Pructose-Sirup erhält. Der D-Pructose-Gehalt des Sirups beträgt 90%.

Beispiel 8

(1) Man suspendiert 24 g der Mikrobenzellen von Streptomyces griseus IPO 343O in 240 ml einer physiologischen Salzlösung, worauf man die Suspension mit 600 mg NjN'-Methylen-bis-acrylamid, 18 ml einer 0,112#igen N,N,N¹,N¹-Tetramethyläthylendiamin-Lösung und 2 ml einer 2,5&igen Kaliumpersulfat-Lösung versetzt. Anschließend läßt man die Suspension während 60 Minuten bei 37°C stehen, wonach man das erhaltene steife Gel dadurch granuliert, daß man es durch ein Sieb hindurcharbeitet und zu Körnchen mit einem Durchmesser von 3 mm zerkleinert. Die Körnchen werden dann mit 4200 ml einer physiologischen Salzlösung gewaschen, wobei sich 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 ergeben. Glucoseisomerase-Aktivität: 5 Einheiten/ml.

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(2) Man suspendiert 420 ml des immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 400 ml einer wässrigen 40#igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter enthält. Die Suspension wird während 72 Stunden bei 60°C gerührt und dann zur Entfernung des immobilisierten Präparats abfiltriert. Dars Piltrat wird in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben behandelt, wobei man 27,8 g eines D-Fructose-Sirups erhält. Der D-Fructose-Gehalt des Sirups beträgt 90$.

Beispiel 9

Man suspendiert 60 ml des in gleicher Weise wie in Beispiel 1 beschrieben hergestellten immobilisierten Präparats von Streptomyces griseus IFO 3430 in 200 ml einer wässrigen 40#igen D-Glucose· Lösung (pH = 8,0), die 5 mM Magnesiumionen und 1 mM Kobalt-II-ionen pro Liter enthält bzw. in 200 ml einer wässrigen 40#igen D-Glucose-Lösung (pH = 8,0). Man rührt die Suspensionen dann während einer gewissen Zeit bei 60°C, wonach man den D-Fructose-Gehalt in der Suspension bestimmt und daraus die prozentuale Umwandlung von D-Glucose in D-Fructose berechnet. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III zusammengestellt.

Tabelle III

Reaktionszeit (Stunden) Umwandlungsrate in D-Fructose (%)

Zugabe von Metall- Keine Zugabe ionen von Metallionen

3 22 4

5 · 31 6

16 46 . 14

24 45 22

48 47 31

72 46 39

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von D-Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß man mindestens ein Acrylmonomeres in einer wässrigen Suspension eines Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers unter Bildung eines immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus polymerisiert und den immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose unterwirft.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acrylmonomeres Acrylamid, N,N^f-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl)äther und/oder N,N^f-Di-acryläthylenharnstoff einsetzt.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Reaktion in Gegenwart von Magnesium- und Kobalt-II-ionen durchgeführt wird.

4. Verfahren zur Herstellung von D-Fructose, dadurch g e kennzeichnet, daß man Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl)äther oder Ν,Ν'-Di-acryläthylenharnstoff oder Acrylamid mit Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl)äther oder Ν,Ν'-Di-acryläthylenharnstoff ineiner wässrigen Suspension eines Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers unter Bildung eines immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus polymerisiert bzw. mischpolymerisiert und den immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus in Gegenwart von Magnesium- und Kobalt-II-ionen einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose unterzieht.

5. Verfahren gemäß Anspruch 4,dadurch gekenn-

z e i c h ne t, daß die Polymerisation bei einer Temperatur von

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O bis 5O⁰C und die enzymatische Reaktion bei einem pH-Wert von 6 bis 9 bei einer Temperatur von 20 bis 8O⁰C durchgeführt werden.

6. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerisation bei einer Temperatur von 20 bis 40⁰C und die enzymatische Reaktion bei einer Temperatur von 50 bis 7O⁰C bewirkt werden.

7. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B„ und/oder Methylenblau und als Polymerisationsbeschleuniger yS-(Dimethylamino)-propionitril und/oder N,N,N'-N'-Tetramethyläthylendiamin verwendet.

8. Verfahren gemäß Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus Streptomyces griseus IPO 3430, Streptomyces griseus IPO 3356, Streptomyces aureus TPO 3175 _s Streptomyces olivaceus IPO 3409 und/oder Bacillus coagulans IPO 12714 einsetzt.

£k Verfahren zur Herstellung von D-Pructose, dadurch gekennzeichnet, daß man Ν,Ν'-Niedrigalkylen-bisacrylamid, Bis(acrylamidomethyl)äther oder N,N'-Di-acryläthylenharnstoff in einer wässrigen Suspension, die pro g des Acrylmonomeren 0,25 bis 2,5 g eines Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus enthält, in Gegenwart von 1 bis 100 mg eines Polymerisationsinitiators pro g des Acrylmonomeren und 1 bis 100 mg eines Polymerisationsbeschleunigers pro g des Acrylmonomeren bei 0 bis 50⁰C polymerisiert, den erhaltenen, immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus zur Bildung von Körnchen durch ein Sieb hindurcharbeitet und die Körnchen des immobilisierten Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose bei 20 bis 80⁰C und einem pH-Wert von 6 bis 9 in Gegenwart von 1 bis 20 mM Magnesiumionen und 0,1 bis 10 mM Kobalt-II-ionen pro Liter der Reaktionslösung einer enzymatischen Reaktion unterwirft.

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10. Verfahren gemäß Anspruch 9,dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin Bp und/oder Methylenblau und als Polymerisationsbeschleuniger β -(Dimethylamine)-propionitril und/oder Ν,Ν,Ν',N'-Tetramethyläthylendiamin einsetzt.

11. Verfahren zur Herstellung von D-Fructose, dadurch gekennzeichnet, daß man Acrylamid mit 5 bis 160 mg N,N'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl)äther oder Ν,Ν'-Di-acryläthylenharnstoff pro g Acrylamid in einer wässrigen Suspension, die pro g der Acrylmonomeren 0,25 bis 2,5 eines Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus enthält, in , Gegenwart von 1 bis 100 mg eines Polymerisationsinitiators pro g der Acrylmonomeren und 1 bis 100 mg eines Polymerisätionsbeschleunigers pro g der Acrylmonomeren bei 0 bis 50°C polymerisiert, den erhaltenen, immobilisierten, Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus zur Bildung von Körnchen durch ein Sieb hindurcharbeitet und die Körnchen des immobilisierten Mikroorganismus bei einer Temperatur von 20 bis 80°C und einem pH-Wert von 6 bis 9 in Gegenwart von 1 bis 20 mM Magnesiumionen und 0,1 bis 10 mM Kobalt-II-ionen pro Liter der Reaktionslösung einer enzymatischen Reaktion mit D-Glucose unterzieht.

12. Verfahren gemäß Anspruch ll_s dadurch gekennzeichnet, daß man als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B„ und/oder Methylenblau

uund als Polymerisationsbeschleuniger β -(Dimethylamine)-propionitril und/oder Ν,Ν,Ν'jN'-Tetramethyläthylendiamin einsetzt.

13· Immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus, enthaltend einen fest in das Gitter eines semipermeablen Acrylpolymerisats eingeschlossenen Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus, wobei das Acry!polymerisat ein Homopolymerisat von N,N¹-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethyl) äther oder Ν,Ν'-Di-acryläthylenharastoff₉ ein Mischpolymerisat von Acrylamid und NjN'-Niedr-igalkylen-bis-acrylamidj ©in Mischpolymerisat aus Acrylamid und Bis(aerylasaifiomethyl)äther

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und/oder ein Mischpolymerisat aus Acrylamid und N,N^f-Diacryläthylenharnstoff ist.

14. Immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus gemäß Anspruch 13»dadurch gekennzeichnet, daß pro g des Acrylpolymerisats 0,25 bis 2,5 g des Glucoseisomerase bildenden Mikroorganismus eingeschlossen enthalten sind.

15. Immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus gemäß Anspruch 13»dadurch gekennzeichnet, daß das semipermeable Acry!polymerisat in Form von Körnchen mit einem Durchmesser von 1 bis 10 mm vorliegt.

16. Immobilisierter, Glucoseisomerase bildender Mikroorganismus gemäß Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß der Glucoseisomerase bildende Mikroorganismus in einer Menge von 0,25 bis 2,5 g pro Gramm des Acrylpolymerisats in einem Mischpolymerisat aus Acrylamid und 5 bis 160 mg N,N'-Niedrigalkylen-bis-acrylamid, Bis(acrylamidomethy1)äther oder N,N^f-Di-acryläthylenharnstoff pro g Acrylamid eingeschlossen ist.

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