DE2414128A1

DE2414128A1 - Verfahren zur herstellung von 6-aminopenicillansaeure

Info

Publication number: DE2414128A1
Application number: DE2414128A
Authority: DE
Inventors: Ichiro Chibata; Tadashi Sato; Tetsuya Tosa
Original assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Current assignee: Tanabe Seiyaku Co Ltd
Priority date: 1973-03-24
Filing date: 1974-03-23
Publication date: 1974-10-03
Also published as: NL163263C; NL7403834A; SE431768B; DK143165B; DE2414128B2; CH593980A5; FR2222436B1; JPS5247038B2; JPS49118892A; FR2222436A1; NL163263B; US3953291A; GB1442282A; DK143165C

Description

DR. MÜLLER-BORE UIPL.-IN3. GROENING DIPL.-CHEM. DR. DEUFEL DIPL.-CHEM. DR. SCHÖN DIPL.-PHYS. H ERTEL

PATENTANWÄLTE £ 4 1 4 Ί Z O

D/Sh - T 1283

Tanabe Seiyaku Co., Ltd. Osaka / Japan

Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure

Priorität: Japan vom 24„März 1973 Nr. 33769/73

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 6-Aminopenicillansäure, insbesondere die Herstellung von 6-Aminopenicillansäure (im folgenden einfach 6-APA genannt) durch enzymatisch^ Umsetzung eines immobilisierten Penicillinamidase produzierenden Mikroorganismus mit Penicillin.

Es ist bekannt, daß 6-APA durch enzymatisch^ Deacylierung von Penicillin hergestellt werden kann, beispielsweise durch

Dr. Müller-Bora 409840/0979 _eufe, . _{Dr Schön} . _DIp| ._{phys Herte}, Braunschweig, Am Bürgerpark 8 ö Munäien 22, Robert-Koch-StraBe 1 Telefon (0531) 7 38 87 Telefon (089) 29 36 45, Telex 5-22 050 mbpat, Kabel: Muebopat München Bank: Zentralkasse Bayer. Volksbanken MQnchen, Kto.-Nr. 9822 - Postscheck: München 954 95 - 802

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die Umsetzung von Penicillin mit Penicillinamidase oder einem Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus. Diese Methode hat jedoch Nachteile für die großtechnische Produktion. Die nach dieser Methode hergestellte 6-APA ist mit Enzym, Mikroorganismen eJLen, Nährstoffen und/oder Proteinen verunreinigt. Demgemäß müssen zusätzliche Stufen angewandt werden, um das Enzym, die Mikroorganismenzellen und/oder andere Verunreinigungen zu entfernen und 6-APA in hoher Reinheit zu gewinnen. Überdies wird nach Beendigung der enzymatischen Reaktion die Reaktionslösung zum Sieden gebracht und/oder angesäuert, um das Enzym und den Mikroorganismus zu zerstören,iand Niederschläge des Enzyms oder Mikroorganismus werden abfiltriert. So können Penicillinamidase oder Penicillinamidase erzeugende Mikroorganismen nur einmal verwendet werden und müssen nachher verworfen werden. Es ist auch bekannt, 6-APA durch chemische Deacylierung von Penicillin herzustellen. So wird beispielsweise Penicillin mit Tripiienylmethylchlorid umgesetzt, um den Triphenylmethylester von Penicillin zu erhalten. Dieser Ester wird mit Phosphortrichlorid behandelt, und der so erhaltene Triphenylmethylester von N-Iminochlorpenicillin wird mit Methanol umgesetzt, um den entsprechenden N-Iminomethoxypenicillinester zu erhalten. 6-APA wird durch Hydrolyse dieses N-Iminomethoxypenicillinesters mit wäßrigem Ammoniak erhalten. Bei der technischen Erzeugung von 6-APA hat gedoch auch diese chemische Methode Nachteile wegen der langwierigen Arbeitsweise, die es umfaßt sowie wegen der geringen erhaltenen Ausbeuten an 6-APA.

Ziel der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines neuen immobilisierten Mikroorganismus, der eine hohe Aktivität an Penicillinamidase für lange Zeiträume liefert. Weiterhin ist es Ziel der Erfindung einen immobilisierten Penicillin-

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amidase erzeugenden Mikroorganismus zu liefern, der die Notwendigkeit vermeidet, den Mikroorganismus zu verwerfen, sondern die Wiederverwendung bei einer Anzahl von aufeinanderfolgenden Arbeitsg&qgen gestattet. Weiteres Ziel der Erfindung ist ein verbessertes Verfahren zur Herstellung von 6-APA aus Penicillin -durch Verwendung eines Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus sowie ein Verfahren, dass das Erfordernis zusätzlicher Stufen zur Abtrennung des gewünschten Produktes, nämlich von 6-APA, von den im Reaktionsgemisch vorliegenden Substanzen vermeidet. Weitere Möglichkeiten und Vorteile der Erfindung sind aus der folgenden Beschreibung ersichtlich.

Erfindungsgemäß kann 6-APA hergestellt, indem man wenigstens ein acrylisches Monomeres in einer wäßrigen Suspension eines Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus polymerisiert und den erhaltenen immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus der enzymatischen Reaktion mit Penicillin unterzieht.

Bevorzugte Beispiele von Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden, umfassen Escherichia coli ATOO 9637, Escherichia coli ATCC 11105, Streptomyces griseus O¹O (Institute for Fermentation, Osaka, Japan) 3355, Nocardia gardneri ATCC 9604, Micrococcus roseus IPO 3764, Pseudomonas aeruginosa OUT (Faculty of Technology, Osaka University, Japan) 8352 und Alkaligenes faecalis OXIT 8025.

Alle diese Mikroorganismen sind von den oben erwähnten Hinterlegungsstätten erhältlich. Es sei jedoch darauf hingewiesen, daß die vorliegende Erfindung nicht auf die Verwendung dieser spezifischen Mikroorganismen beschränkt ist, sondern für alle Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismen verwendet werden können, wie diejenigen, die zur Gattung

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Escherichia, Streptomyces, Nocardia, Alkaligenes, Micrococcus und Pseudomonas gehören. Geeignete Mengen des Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus, wie sie in der Erfindung angewandt werden, "betragen 0,32 bis 3,2 g, insbesondere 0,95 bis 1,9 g» pro g acryliscb.es Monomeres oder acrylische Monomere. Die Polymerisationsreaktion der vorliegenden Erfindung dient dazu, jeden der Mikroorganismen eng in das Netzwerk des Polymeren einnubauen und dadurch eine hohe enzymatische Aktivität für eine lange Zeitspanne zu liefern.

Die Polymerisationsreaktion kann erfindungsgemäß in Gegen wart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers durchgeführt werden. Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin B2 und Methyl en-Bl au eignen sich als Polymerisationsinitiatoren. Andererseits werden B-(Dimethylamino)-propionitril und Ν,Ν,Ν¹ ,N'-Tetramethyläthylendiamin als Polymerisationsbeschleuniger verwendet. Geeignete Mengen des zur wäßrigen Suspension des Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus zugesetztem Polymerisationsinitiators sind 5 bis 50 mg pro g Acryloylmonomeres oder Monomere. Geeignete Mengen an Polymerisationsbeschleuniger sind 1,5 bis 15 mg pro g des Acryloylmonomeren oder der Monoaeren. Vorzugsweise wird die Reaktion bei 0 bis 50 ⁰C, insbesondere 20 bis 40 ⁰C durchgeführt. Die Reaktion kann innerhalb 10 bis 60 Minuten beendet sein. Zu den Acryloylmonomeren, die sich für die Verwendung in der Erfindung eignen, gehören Acryloylamid, NjN'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, bis(Acryloylamidomethyl)äther und Η,ΪΓ-Di-acryloyläthylenharnstoff (»N,N'-Di-acryloylimidazolidin-2-on). Für die Erfindung ist es geeignet, den Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus in ein Polymeres einzubauen, das aus einem oder zwei der oben erwähnten Monomeren erhalten ist, insbesondere in ein Oopolymeres von Acryloylamid und einem Acryloyl-

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monomeren der Gruppe NjN'-liiedrigalkylen-bis-acryloylamid, lDis(Acryloylamidomethyl)äther und ITjlJ'-Di-acryloyläthylenharastoff. N,N'-Methylen**bis-acrylaylamid und Ν,Ν'-Propylenbis-acryloylamid werden vorzugsweise als N,N'-Niedrigalkylen-"bis-acryloylamid verwendet. Geeignete Mengen des Ν,Ν¹-Niedrigalkylen-bis-acryloylemid, bisCAcryloylamidomethyl)-äthers oder NjIT-Di-acryloyläthylenharnstoffes, die zur Copolymerisation mit Acryloylamid verwendet werden, betragen 5 bis 160 mg, insbesondere 15 bis 130 mg und ganz besonders 25 bis 80 mg, pro g Acryloylamid. Nach beendeter Polymerisat ionsreaktion wird der erhaltene immobilisierte Penicillinamidase erzeugende Mikroorganismus granuliert, indem er durch ein Sieb gedruckt wird, um Teilchen von 2,5 bis 5,5 πιπί) insbesondere 3 bis 4· mm Durchmesser zu erzeugen.

6-APA kann durch enzymatisch^ Umsetzung des immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus mit Penicillin erhalten werden. Die enzymatische Reaktion wird bei 25 bis 50 ⁰C, insbesondere 30 bis 45 °0, durchgeführt. Vorzugsweise wird sie bei einem pH von 7 bis 9,5» insbesondere bei pH 8 bis 9 durchgeführt. Jedes bekannte Penicillin kann als Substrat gemäß der Erfindung verwendet werden. Typische Beispiele solcher Penicillinarten sind durch die folgende Formel wiedergegeben;

B-COM-CH

Il i

CH H" CH-COOH

worin R einen AiÜkyl-, Alkenyl- oder Arylalkylrest oder eine

1 1
Gruppe der Formel R -X-C^-, R einen Alkyl-, Alkenyl- oder Arylrest und Z Sauerstoff oder Schwefel bedeuten. Insbesondere gehören zu den bekannten Penicillinen, die erfindungsgemäß eingesetzt werden können, Penicillin G (=» Benzylpenicillin),

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Penicillin K (= n-Heptylpenicillin), Penicillin Σ (» p-Hydroxybenzylpenieillin), Penicillin P (2-Pentenylpenicillin), Dihydropenieillin,F (* n-Amylpenicillin), Penicillin AT (a Allylmereaptomethylpenicillin), Penicillin BT (* Butylthiomethylpenicillin), Penicillin S (=» γ -Chlorcrotylmercaptomethylpenicillin) und Penicillin V (» Phenoxymethylpenicillin).

Die Menge des Substrats, die in einer wäßrigen Suspension eines Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus gelöst wird, ist nicht kritisch. Zum Beispiel wird Penicillin in Wasser "bei beliebiger Konzentration gelöst. Der oben erwähnte immobilisierte Mikroorganismus wird in der wäßrigen Penicillinlösung suspendiert, und die Suspension wird gerührt. Nach beendeter Umsetzung wird das Gemisch filtriert oder zentrifugiert, um den immobilisierten Mikroorganismus für die spätere Wiederverwendung zurückzugewinnen. 6-APA wird aus dem Piltrat oder der überstehenden Lösung gewonnen. Die optimalen Bedingungen für die vollständige Umwandlung von Penicillin in 6-APA können leicht durch Einstellung der Reaktionszeit erhalten werden. Alternativ kann die enzymatisch^ Reaktion gemäß der Erfindung auch durch eine Säulenmethode durchgeführt werden. Die Säulenmethode ermöglicht die Durchführung der Reaktion in kontinuierlicher Weise. Beispielsweise wird der immobilisierte Mikroorganismus in eine Säule gepackt und eine wäßrige Penicillinlösung durch die Säule mit geeigneter Durchflußgeschwindigkeit feeschickt. Als Abfluß wird eine wäßrige Lösung erhalten, die 6-APA enthält. 6-APA wird durch an sich bekannte Verfahren gewonnen, wie beispielsweise Einstellung des Abflusses auf einen pH-Wert von 4- bis 5· Bei der Durchführung der enzymatischen Reaktion hängt die Umwandlungsgeschwindigkeit von Penicillin in 6-APA vor allem von der enzymatisehen Stärke

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des■ "immobilisierten Mikroorganismus, der Temperatur oder der Reaktionszeit ab. Im lalle einer Säulenmethode jedoch können die optimalen Reaktionsbedingungen für die vollständige Umwandlung von Penicillin in 6-APA leicht durch Einstellung der Strömungsgeschwindigkeit der Substratlösung erhalten werden.

In jedem Fall behält der immobilisierte Mikroorganismus gemäß der Erfindung einen hohen Grad an enzymatischer Aktivität während der Reaktion bei. Überdies kann wegen der ausreichenden Dauerhaftigkeit seiner enzymatisehen Aktivität der immobilisierte Mikroorganismus gemäß der Erfindung wiederholt für die enzymatische Reaktion verwendet werden.

Praktische und derzeit bevorzugte Ausführungsformen der Erfindung sind in den folgenden Beispielen gezeigt. Der Ausdruck "niederes Alkylen" bedeutet hier Alkylengruppen mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen. In den folgenden Beispielen ist die Penicillinamidaaktivität eines Mikroorganismus oder eines immobilisierten Mikroorganismus ausgedrückt in "Einheiten", wobei eine Einheit als die Aktivität des Mikroorganismus oder immobilisierten Mikroorganismus definiert ist, welche die Hydrolysierung von 1 mg Penicillin G durch Umsetzung einer wäßrigen Suspension des Mikroorganismus mit dem Penicillin bei pH 9»0 bei 40 ⁰C für eine Stunde ermöglicht. Überdies wird die Menge an 6-APA in der Lösung gemäß der Methode bestimmt, die im "Industrial and Engineering Chemistry", 18, 619 (1946) und "Analytical Chemistry", J5£, 648 (1961) beschrieben ist. D. ü., daß eine 6-APA-Lösung mit 2 η-Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und mit Methylisobutylketon gewaschen wird, um Penicillin und andere Verunreinigungen zu entfernen. Die Menge an 6-APA in der so erhaltenen wäßrigen Schäi&fit wird zuerst colorimetrisch gemäß

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der Jodabsorptionsmethode bestimmt. Dann wird die wäßrige Schicht weiter mit Hienylacetylchlorid behandelt, im 6-APA in Penicillin G zu überführen. Die Menge an 6-APA in der' wäßrigen Lösung wird wieder auf der Basis der aatimikrobiellen Aktivität derselben berechnet, die gemäß der Papierscheibenmethode bestimmt wird.

Beispiel 1

(1) Ein wäßriges Nährmedium (pH 7*0), das die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt:

Pepton	2 % Gew./Vol.
Monokal iumpho sphat	0,3 % Gew./VoI
Dikaliumpho sphat	0,7
Hefeextrakt	0,5
Magnesiumsulfat · 7 HoO	0,02 "
Eisen(III)Chlorid ·
6 H₂O	0,02 "
Natrium-L-glutamat	0,5
Phenoxyessigsäure	0,2

1 Liter des Mediums wird mit Escherichia coli ATCC 9637 beimpft. Das Medium wird bei 30 ⁰C 24 Stunden unter Schütteln kultiviert und dann zentrifugiert. Die so gesammelten Zellen des Mikroorganismus zeigen eine Penicillinamidaseaktivität von 6,5 Einheiten/g. 12 g der Mikroorganismenzellen werden in 48 ml einer physiologischen Salzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 9 S Acryloylamid, 480 mg N,N¹-Methylen-bis-acryloylamid, 6 ml 5 %iges ß-(Dimethylamino)-propionitril und 6 ml 2,5 %iges KaliumpersulÄ zugefügt. Dann wird die Emulsion 30 Minuten bei 37 ⁰C stehen gelassen. Nach beendeter Umsetzung wird die Suspension filtriert. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, in-

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dem es durch ein Sieh getriehen wird, um Teilchen von 3 mm Durchmesser zu hilden. Es werden 120 ml eines immobilisierten Präparats von Escherichia coli ATCC 9637 erhalten. Die Peniclllinamidaseaktivität beträgt 4,7 Einheiten/ml.

(2) 120 ml des immobilisierten Präparatesvon Escherichia coli ATCC 9637 werden in eine Säule von 2,1 cm χ 34,8 cm gepackt. 500 ml einer wäßrigen 1 %igen Kalium-Penicillin-G-Lösung (pH 9iO) werden durch die Säule bei 40 ⁰C mit einer Fließgeschwindigkeit von 16 ml/Stunde durchgeleitet. Der so erhaltene Abfluß wird mit 2 η Salzsäure auf pH 2,0 eingestellt und zweimal mit 10 ml Methylisobutylketon gewaschen, um Vinylessigsäure zu entfernen. Die wäßrige Schicht wird wieder mit 2 η Natriumhydroxid auf pH 7>0 eingestellt. Dann wird die wäßrige Schicht bei 50 ⁰C unter vermindertem Druck eingeengt, um ihr Gesamtvolumen auf 5 ml zu bringen. Nach Einstellen auf pH 4,3 mit 2 η Salzsäure wird die konzentrierte Lösung bei 27 ⁰C über Nacht stehen gelassen. Der kristalline Niederschlag wird durch Filtrieren gesammelt und bei 50 ⁰C unter vermindertem Druck getrocknet. Man erhält 2,23 g 6-APA. Ausbeute = 85 %, F = 204 - 207 °C (Zers.)

Beispiel 2

Ein immobilisiertes Präparat von Escherichia coli ATCC 9637 wird in der gleichen weise wie im Beispiel 1 No. (1) beschrieben hergestellt. 120 ml des immobilisierten Präparates werden in eine Säule von 2,1 cm χ 34,8 cm gepackt. Eine wäßrige 1 %ige Lösung von Kalium-Penicillin-G (pH 9,0) wird durch die Säule bei 40 ⁰C mit der in Tabelle 1 gezeigten Fließgeschwindigkeit durchgeleitet. Der prozentuale Umsatz von Penicillin G in 6-APA im Abfluß ist in tabelle I gezeigt:

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- 10 Tabelle I

Fließgeschwindigkeit	Umwandlung (%) in 6-APA
(ml/Stunde)
10	90,6
15	90,2
30	74,2
60	56,1
72	42,2
110	34,4
Beispiel 3

(1) 1 Liter eines wäßrigen Mhrmediums (pH 7*0), das die gleichen Bestandteile wie in Beispiel 1 Nr. (1) beschrieben enthält, wird mit Escherichia coli ATCC 11105 beimpft. Das Medium wird 24 Stunden unter Schütteln bei 30 ⁰C kultiviert. Dann wird es zentrifugiert und die so erhaltenen Mikroorganismenzellen zeigen eine Penicillinamidaseaktivitat von 6,9 Einheiten/g. 12 g der Mikroorganismenzellen werden in 48 ml einer physiologischen Salzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 9 g Acryloylamid, 480 ml Njlf'-Methylen-bis-acryloylamid, 6 ml 5 %iges B-(Dimethylamino)propionitril und 6 ml 2,5 %iges Kaliumpersulfat zugefügt. Dann wird die Suspension 30 Minuten bei 37 ⁰C stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem es durch ein Sieb gedrückt wird, um Teilchen von Durchmesser zu bilden. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105. Penicillinamidaseaktivitat beträgt 5 Einheiten/ml.

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(2) 10 g Penicillin V werden in 450 ml Wasser suspendiert, und die Suspension wird mit 2 η Natriumhydroxid auf pH 9_T0 eingestellt, um Penicillin Y zu lösen. Zu der erhaltenen wäßrigen Penicillin-V-Lösung wird Wasser zugefügt, um das Gesamtvolumen auf 500 ml zu bringen. Dann werden 120 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli AICC 11105 in der wäßrigen Lösung von Pencillin V suspendiert. Die so erhaltene Suspension wird eine bestimmte Zeitspanne bei 40 ⁰C gerührt. Der prozentuale Umsatz von Penicillin V zu 6-APA in der Suspension ist in Tabelle II gezeigt.

Tabelle II

Reaktionszeit Umwandlung (%) zu 6-APA

(Stunden)

2 12

4 26

6 42

10 89

24 92

30 ■ 91

Nachdem die Penicillin-V-Suspension 30 Stunden wie oben beschrieben gerührt wurde, wird sie abfiltriert, um unlösliches Material zu entfernen. Das so erhaltene 3?iltrat wird in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 Nr. (2) beschrieben behandelt. Man erhält 5,27 g 6-APA vom F =» 204 - 207 ⁰C (Zers.)

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Beispiel 4

(1) 1 Liter eines wäßrigen Nährmediums (pH 7>0), das die gleichen Bestandteile wie in Beigiel 1 Mr. (1) beschrieben enthält, wird mit Escherichia coli ATCC 11105 beimpft. Das Medium wird 24 Stunden unter Schütteln bei 30 ⁰C gezüchtet und dann zentrifugiert. Die so gesammelten Mikroorganismenzellen zeigen eine Penicillinamidaseaktivität von 6,9 Einheiten/g. 12 g der Mikroorganismenzellen werden in 48 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Zu der Suspension werden 9 g Acryloylamid, 480 ml bis(Acryloylamidomethyl)äther, 6 ml 5 %iges ß-(Dimethylamino)-propionitril und 6 ml 2,5 %iges Ammoniumpersulfat zugefügt. Dann wird die Suspension 1 Stunde bei 37 ⁰C stehen gelassen. Das erhaltene Steife Gel wird granuliert, indem es durch ein Sieb gedrückt wird, um Teilchen von 3 mm Durchmesser zu bilden. Man erhält 120 ml eines immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105. Die Penicillinamidaseaktivität beträgt 5 Einheiten/ml.

(2) 120 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 werden in eine Säule von 2,1 χ 34,8 cm gefüllt. Eine wäßrige 2 %ige Lösung von Penicillin G (pH 9»0) wird kontinuierlich bei 40 ⁰C mit der in der Tabelle III gezeigten Fließgeschwindigkeit durchgeleitet. Die prozentuale Umwandung von Penicillin G zu 6-APA im Abfluß wird in 24-stündigen Intervallen untersucht. Der Ergebnisse sind in Tabelle III wiedergegeben.

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	Tabelle III	15 ml/Stunde
		92
Betriebszeit	Umsatz (%)	92
(Stunden)	FIießge schwindigkeit	90
24	30 ml/Stunde	92
48	52	91
72	51	89
96	52	90
120	49
144	50
168	53
51

Beispiel 5

(1) Ein wäßriges Nährmedium (pH 7,0), das die folgenden Bestandteile enthält, wird hergestellt:

Glucose	3	% Grew./Vol.
Mai s quellwas s er	2,5
Hefeextrakt	0,5	tt
Natriumchlorid	0,5	It
Kaiziumcarbonat	0,2	It
Phenoxyessigsäure	0,2	Il

1 Liter dieses Mediums wird mit Streptomyces griseus Ii¹O 3355 beimpft. Das Medium wird 48 Stunden lang bei 30 ⁰G gezüchtet und dann zentrifugiert. Die so gesammelten Mikroorganismenzellen zeigen eine Penicillinamidaseaktivität von 3,6 Einheiten/g. 24 g der Mikroorganismenzellen werden in 96 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert.

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Zu der Suspension werden 18 g Acryloylamid, 960 mg N,N'-Methylen-bis-aeryloylamid, 12 ml 5 %iges ß-(Dimethylamino)-propionitril und 12 ml 2,5 %iges Kaliumpersulfat zugesetzt. Dann wird die Suspension 30 Minuten lang bei 37 °0 stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem es durch ein Sieb gedrückt wird, um Teilchen von 3 mm Durchmesser zu bilden. Man erhält 240 ml eines immobilisierten Präparates von Streptomyces griseus IJB¹O 3355. Die Penicillinamidaseaktivitat beträgt 0,5 Einheiten/ml.

(2) 240 ml des immobilisierten Präparates von Streptomyces griseus IFO 3355 werden zu 500 ml einer wäßrigen 2 %igen Penicillin-V-Iiösung (pH 9,0) zugegeben. Das Gemisch wird 30 Stunden bei 40 ⁰C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert und das so erhaltene Filtrat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 Nr. (2) beschrieben behandelt. Man erhält 5,11 g 6-APA vom I » 204 - 207°C (Zers.)

Beispiel 6

(1) 1 Liter eines wäßrigen Nährmediums (pH 7*0), das die gleichen Bestandteile wie im Beispiel 5> Nr. (1) beschrieben enthält, wird mit Nocardia gardneri ATCC 9604 beimpft. Das Medium wird 72 Stunden unter Schütteln bei 30 ⁰C gezüchtet und dann zentrifugiert. Die so gesammelten Mikroorganismenzellen zeigen eine Penicillinamidaseaktivitat von 3»6 Einheiten/g. 24 g der Mikroorganismenzellen werden in der gleichen Weise wie im Beispiel 5 Nr. (1) beschrieben behandelt. Man erhält 240 ml eines immobilisierten Präparates von Nocardia gardneri ATCC 9604 mit einer Penicillinamidaseaktivitat von 0,5 Einheiten/ml.

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(2) 240 ml des immobilisierten Präparates von Nocardia gardneri IiDCC 9604 werden zu 500 ml einer wäßrigen 2 %igen Lösung von Penicillin G (pH 9,0) gefügt. Das Gemischt wird bei 40 ⁰C 30 Stunden gerührt und dann abfiltriert und das so erhaltene IPiltrat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 Ur. (2) beschrieben behandelt. Man erhält 5»26 g 6-ΔΡΑ vom 1 = 204 - 207 ⁰C (Zers.)

Beispiel 7

(1) 24 g der Mikroorganismenzellen von Escherichia coli ATCC 11105 werden in 96 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Zur Suspension werden 18 g Acryloylamid, 960ng N,N'-Di-acryloyläthylenharnstoff, 12 ml 5 %iges ß-(Dimethylamine)-propionitril und 12 ml 2,5 %iges Ammoniumpersulfat zugesetzt. Dann wird die Suspension 30 Minuten bei 37 ⁰C stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem es durch ein Sieb gedrückt wird, um Teilchen • von 3mm Durchmesser zu bilden. Man erhält 240 ml eines immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCG 11105 mit einer Penicillinamidaseaktivität von 0,5 Einheiten/ml.

(2) 240 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 werden zu 500 ml einer wäßrigen 2 %igen Lösung von Penicillin V (pH 9,0) zugefügt. Das Gemisch wird 30 Stunden bei 40 ⁰C gerührt. Dann wird das Reaktionsgemisch filtriert und das Ifiltrat in der gleichen Weise wie im Beispiel 1 Nr. (2) beschrieben behandelt. Man Erhält 5,11 S 6-APA von F « 204 - 207 ⁰C (Zers.).

Beispiel 8

(1) 24 g der Mikroorganismenzellen von Escbei?ichia coli ATCC 11105 werden in 24Ό ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Zur Suspension werden 600 mg bis(Acryl-

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amidomethyl)äther, 18 ml 0,112 %iges Ή,Ή,Ή' ,Η'-Tetramethyl endiamin und 2 ml 2,5 %iges Ammoniumpersulfat zugesetzt. Dann wird die Suspension 60·Minuten bei 37 ⁰C stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem es durch' ein Sieb gedrückt wird, um Teilchen von 3 nun Durchmesser zu bilden. Es werden 420 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 erhalten. Die Penicillinamidaseaktivität beträgt 0,3 Einheiten/ml.

(2) 420 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 werden zu 500 ml einer wäßrigen 2 %igen Lösung von Penicillin G (pH 9*0) gefügt. Das Gemisch wird 30 Stunden bei 40 ⁰C gerührt und dann filtriert und das Piltrat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 ITr. (2) beschrieben behandelt. Man erhält 5,26 g 6-APA vom i¹ » 204 bis 207 ⁰C (Zers.).

Beispiel 9

(1) 24 g der Mikroorganismenzellen von Escherichia coli ATCC 11105 werden in 240 ml einer physiologischen Kofthsalzlösung suspendiert. Zur Suspension werden 600 mg IT,M"'-Methylenbis(acrylamid), 18 mg 0,112 %iges Ν,Ν,ΪΓ·¹ ,N'-Tetramethylendiamin und 2 ml 2,5 #iges Ammoniumpersulfat zugefügt. Dann wird die Suspension 60 Minuten bei 30 ⁰C stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem es durch ein Sieb gedrückt wird, um Teilchen von 3 mm Durchmesser zu bilden. Es werden 420 ml eines immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 mit einer Penicillinamidaseaktivitat von 0,3 Einheiten/ml erhalten.

(2) 420 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 werden zu 500 ml einer wäßrigen 2 #igen LS-

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sung von Penicillin G (pH 9,0) gefügt. Das Gemisch wird 30 Stunden bei 40 ⁰C gerührt und dann abfiltriert und das Filtrat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 Nr. (2) beschrieben behandelt. Man erhält 5»26 g 6-APA vom F = 204 - 207 ⁰C (zers.).

Beispiel 10

(1) 24 g der Mikroorganismenzellen von Escherichia coli ATCC 11105 werden in 240 ml einer physiologischen Kochsalzlösung suspendiert. Zur Suspension werden 500 mg ΪΓ,ΙΓ-ΰί-acryloyläthylenharnstoff, 18 ml 0,112 %iges NjlsrjN'H'-iDetramethylendiamin und 2 ml 2,5 %iges Kaliumpersulfat gefügt. Dann wird die Suspension 30 Minuten bei 37 ⁰C stehen gelassen. Das erhaltene steife Gel wird granuliert, indem es durch ein Sieb gedruckt wird, um Teilchen von 3 mm Durchmesser zu bilden. Es werden 420 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 erhalten. Die Penicillinamidaseaktivität beträgt 0,2 Einheiten/ml.

(2) 420 ml des immobilisierten Präparates von Escherichia coli ATCC 11105 werden zu 500 ml einer wäßrigen 2 %igen Lösung von Penicillin Y (pH 9,0) gefügt. Das Gemisch wird 48 Stunden bei 40 ⁰C gerührt und dann filtriert und das FiI-trat in der gleichen Weise wie in Beispiel 1 Nr. (2) beschrieben behandelt. Man erhält 5,11 g 6-APA vom F = 204 - 207 ⁰C (Zers.).

Pat ent an Sprüche:

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Claims

Patentansprüche

1. Verfahren zur Herstellung von 6-AminopenicillÄnsäure, dadurch gekennzeichnet , daß man wenigstens ein Acryloylmonomeres in einer wäßrigen Suspension eines Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers unter Bildung eines immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus polymerisiert und den erhaltenen immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus der enzymatischen Umsetzung mit Penicillin unterwirft.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Acryloylmonomeres Acryloylamid, H",M"'-Medrigalkylen-bis-acryloylamid, bisCAcryloylamidomethyl) äther oder Ν,ΪΓ¹-Diacryloyläthylenharnstoff verwendet.

3· Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, gekennzeichnet durch die Polymerisation von M^N'-Niedrigalkylenbis-acryloylamid, bisCAcrylolyamidomethyl)äther oder NjlT-Diacryloyläthylenharnstoff oder die Copolymerisation von Acryloylamid mit U^lT-Iiiedrigalkylen-bis-acryloylainid, bisCAcryloylamidomethyl)äther oder H^N'-Diacrylätyläthylenharastoff in wäßriger Suspension eines Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers zur Erzeugung eines immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus und Umsetzung des immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus mit Penicillin in einer enzymatischen Reaktion.

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4. Verfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet , daß die Polymerisation bei 0 bis 50 ⁰C und die enzymatisch^ Reaktion bei 25 - 50 ⁰C bei einem pH von 7 bis 9,5 durchgeführt wird.

5· Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Polymerisation bei 20 bis 40 ⁰C und die enzymatische Reaktion bei 30 bis 4-5 °0 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin Bo oder Methylenblau und als Polymerisationsbeschleuniger ß-(Dimethylamino)propionitril oder N,M^-,N¹ ,IT'-Tetramethyläthylendiamin verwendet wird.

7. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß als Penicillinamidase erzeugender Mikroorganis-

. mus Eßcherichia coli ATCC 9637, Escherichia coli ATCC 11105, Streptomyces griseus IFO 3355, Nocardia gardneri ATCC 9604, Micrococcus roseus HO 3764·, Pseudomonas aeruginosa OtJT 8252 oder Alkaligenes faecalis OUT 8025 verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man UjN'-Niedrigalkylenbis-acryloylamid, bis(Acryloylamidomethyl)äther oder IT₅IT¹-Diacryloyläthylenharnstoff in einer wäßrigen Suspension, die 0,32 bis 3,2 g pro g Acryloylmonomeres eines Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus enthält, in Gegenwart eines Polymerisationsinitiätors und eines Polymerisationsbeschleunigers bei 0 bis 50 ⁰C polymerisiert, de^- erhaltenen immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus unter Bildung von Granulat von 2,5 "bis 5,5 mm Durchmesser des immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus granuliert und das erhaltene Granulat des immobilisierten

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Mikroorganismus einer enzymatisehen Reaktion mit Penicillin bei 25 Ms 50 ⁰C und pH 7 bis 9,5 unterwirft.

9. Verfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeich-. net, daß als Polymerisationsinitiator Kaliump er sulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin Bg oder Methylenblau und als Polymerisationsbeschleuniger ß-(JDimethylaminο)propionitril ο der N, N, N', ϊϊ' -T etramethyläthyl endi amin ν erwendet wi rd.

10. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet , daß man Acryloylamid mit 5 bis 160 mg pro g Acryloylamid an Ν,ϊΓ-Bxedrialkylen-bisacryloylamid, bis(Acryloylamidomethyl)äther oder ϊϊ,ΙΓ-Μ-acryloyläthylenharnstoff in einer wäßrigen Suspension, die 0,32 bis 3,2 g pro g der Acryloylmonomeren" an einem Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus enthält, in Gegenwart eines Polymerisationsinitiators und eines Polymerisationsbeschleunigers bei 0 bis 50 ⁰C copolymer!siert, den erhaltenen immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus unter Bildung eines Granulats des immobilisierten Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus von vorzugsweise 2,5 bis 5»5 mm Durchmesser durch vorzugsweise ein Sieb granuliert und dann das Granulat des immobilisierten Mikroorganismus einer enzymatischen Reaktion mit Penicillin bei 25 bis 50 ⁰O und einem pH von 7 bis 9,5 unterwirft.

11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß als Polymerisationsinitiator Kaliumpersulfat, Ammoniumpersulfat, Vitamin Bg oder Methylenblau und als Polymerisationsbeschleuniger ß-(Dimethylamino)propionitril oder Ν,Η,Ν¹ ,H'-Tetramethyläthylendiamin verwendet wird.

12. Immobilisierter Penicillinamidase erzeugender Mikroorganismus, gekennzeichnet durch einen Penicillinamidase erzeugenden Mikroorganismus, der fest in ein Netzwerk

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eines semipermeablen Acryloylpolymeren der Gruppe Homopolymere von ^,N'-Niedrigalkylen-bis-acryloylamid, bis(Acryloylamidomethyl)äther oder N^'-Diäcryloyläthylenharnstoff oder Copolymere von Acryloylamid und !!,H'-lTiedrigalkylen-bisacryloylamid, Copolymere von Acryloylamid und bis(Acryloylamidomet]iyl)äther und Copolymere von Acryloylamid und ΪΤ,Ν¹-Di-aeryloyläthylenham stoff eingebaut ist.

13. Immobilisierter Mikroorganismus anach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet , daß . 0,32 bis 3*2 g pro g des Acryloylpolymeren an Penicillinämidase erzeugendem Mikroorganismus eingebaut sind.

14·. Immobilisierter Mikroorganismus nach Anspruch 12,.dadurch gekennzeichnet , daß das semipermeable Acryloylpolymere in Form eines Granulates von 2,5 bis 5»5 nun Durch-

messer vorliegt.

15· Immobilisierter Mikroorganismus nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet ,· daß 0,32 bis 3»2 g pro g des Acryloylpolymeren an Penicillinämidase erzeugendem Mikroorganismus in einem Copolymeren von Acryloylamid und 5 Ms 160 mg, pro g Acryloylamid, an N,N'-Niedrigalkylen-bisacryloylamid, bisCAcryloylamidomethy^äther oder N,N¹-Diacrylolyäthylenharnstoff eingeschlossen sind.

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