DE2344586B2

DE2344586B2 - Verfahren zur Herstellung von Pullulan

Info

Publication number: DE2344586B2
Application number: DE2344586A
Authority: DE
Inventors: Koso Kato; Makoto Shiosaka
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1972-09-04
Filing date: 1973-09-04
Publication date: 1979-07-12
Also published as: ES418475A1; CH579629A5; AU5993173A; JPS5142199B2; NO140828C; DE2344586A1; NO140828B; BE804441A; FR2199553B1; FI50139B; FI50139C; ZA736011B; IT995276B; DE2344586C3; SE412601B; AR196451A1; US3912591A; NL7312184A; GB1450130A; PH10289A

Description

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Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Pullulan durch Züchtung eines Pullulan erzeugenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Phosphat und für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält.

Pullulan ist ein Polysaccharid, das aus λ-1,4-verknüpften Maltotriose-Einheiten besteht, die über oc-l,6-Verknüpfungen der endständigen Glucosidreste des Trisaccharids polymerisiert sind.

Wie aus den Artikeln von H. Bender, Biochem. Biophys. Acta, 36,309 (1959), Seinosuke U e d a, Journal of the Chemical Society of Japan, Industrial Chemistry Section, 67, 575-760 (1964) und von Eiji N i η ο m i y a, Journal of Agricultural Chemical Society of Japan, 43, 115-118 (1969) hervorgeht, wird Pullulan extracellular von einem Stamm von Pullularia pullulans erzeugt, wenn dieser Stamm in einem Saccharose und/oder Glucose als Kohlenstoffquellen enthaltendem Medium aerob kultiviert wird. Es wird berichtet, daß der eo Polymerisationsgrad (nachstehend als PG abgekürzt) des auf diese Weise erhaltenen Pullulans in den Bereich von wenigen 100 bis mehreren 1000 fällt. Es liegen aber noch keine Anhaltspunkte über die Beziehungen zwischen den Kultivierungsbedingungen und dem Polymerisationsgrad des Pullulans vor.

In dem Artikel von B. J. Cat ley in »Appl. Microbiology«, 22, Nr. 4, Okt. 1971, Seite 650-654, werden Untersuchungen über das Wachstum von Pullularia pullulans Quartermaster-strain Nr. 3092 beschrieben, bei dem dieser Pullulan erzeugende Stamm in einem Medium gezüchtet wird, welches neben üblichen Kohlenstoff- und Stickstoffquellen 0,5% K2HPO4 enthält Die Züchtung dieses Mikroorganismus erfolgte bei verschiedenen pH-Werten und führte zu dem Ergebnis, daß das Zellwachstum und die Pullulanbildung nicht gleichsinnig erfolgen.

Aussagen über einen eventuellen Zusammenhang zwischen Phosphatgehalt und pH-Wert des Mediums und einen Einfluß dieser Parameter auf die Art des gebildeten Pullulans (Molekulargewicht) sind diesem Artikel nicht zu entnehmen.

Der Erfindung liegt dagegen die Aufgabe zugrunde, das durchschnittliche Molekulargewicht des in dem Kulturmedium gebildeten Pullulans zu regeln, indem man den Anfangs-pH-Wert und/oder den Anfangsgehalt des Mediums an Phosphat einstellt. Es wurde gefunden, daß bei niedrigen pH-Werten die Tendenz zu einer Bildung von hochmolekularem Pullulan und bei hohen Phosphationenkonzentrationen die Tendenz zur Bildung von niedermolekularem Pullulan besteht, jedoch stets unter der Voraussetzung, daß der Anfangs-pH-Wert des Kulturmediums zwischen 5 und 7,5 und die Phosphatkonzentration zwischen 0,1 und 0,5% liegt. Ferner wurde gefunden, daß die Erhöhung des Anfangs-pH-Werts zu einer Verkürzung der Züchtungsdauer und zu einer Erhöhung der Pullulanausbeute führt.

Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von Pullulan durch Züchtung eines Pullulan erzeugenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Phosphat und für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man zur Bildung von Pullulan mit einem Molekulargewicht von 4 500 000 bis 50 000 den Anfangs-pH-Wert des Mediums auf 5 bis 7,5 und/oder die Phosphatkonzentration auf 0,1 bis 0,5% (Gewicht/Vol.) einstellt, wobei jedoch das Arbeiten mit 0,5% (Gewicht/Vol.) K₂HPO₄ mit dem Stamm Quartermaster-strain Nr. 3092 von Pullularia pullulans ausgenommen ist.

Erfindungsgemäß wird ermöglicht, den Polymerisationsgrad, die Ausbeute und die Kultivierungszeit des Pullulans bei der technischen Herstellung frei einzustellen. Weiterhin wird hierdurch die technische Herstellung von Pullulan mit dem gewünschten Polymerisationsgrad ermöglicht. Die Erfindung stellt somit ein Verfahren zur Herstellung von Pullulan zur Verfügung, das für die technische Herstellung von Pullulan geeignet ist.

Bei dem Verfahren kann auch die Kultivierungszeit verkürzt werden und die Ausbeute des Pullulans verbessert werden, indem die Kultivierung in einem Kulturmedium mit einem höheren pH-Wert und einer höheren Phosphatkonzentration erfolgt. Dieses Verfahren ist geeignet, um Pullulan mit niedrigem Molekulargewicht herzustellen, das zur Herstellung von Produkten mit niedriger Viskosität oder zur Herteilung von Maltotriose aus diesem Pullulan herangezogen werden kann. Ferner besitzt das auf diese Weise erhaltene Pullulan mit niedrigem Molekulargewicht eine niedrige Viskosität, die die Reinigung erleichtert, so daß das erfindungsgemäße Verfahren zur technischen Herstellung von Pullulan mit niedrigem Moiekulargcwiciu äußerst gut geeignet ist. Andererseits kann gewünsch-

tenfalls bei der Herstellung von Formkörpern wie Filmen, Folien und Fasern, wobei die Verwendung eines Pullulans mit höherem Molekulargewicht gewünscht wird, eine Erniedrigung des Anfangs-pH-Wertes und des Phosphatgehaltes des Kulturmediums zu der Bildung eines Pullulans mit einem Molekulargewicht von mehr als 2 000 000 führen. Das auf diese Weise erhaltene Pullulan mit hohem Molekulargewicht kann wirksam dazu verwendet werden, um transparente zähe Filme bzw. Folien, Fasern und andere Formkörper herzustellen.

Durch die Erfindung kann auch ein Pullulan mit einem Polymerisationsgrad hergestellt werden, der auch zur Anwendung als Verdickungsmittel (Mittel zur Erhöhung der Viskosität) und Dispergierungsmittel bei der Herstellung von Nahrungsmittel geeignet ist

Als Pullulan-erzeugende Mikroorganismen können bei dem Verfahren der Erfindung alle beliebigen Stämme verwendet werden, welche dazu imstande sind, in einem Kulturmedium Pullulan zu erzeugen, sowie alle Mutanten davon, die die gleiche Aktivität besitzen. Beispiele für geeignete Stämme sind: Aureobasidium pullulans IFO 6401, Aureobasidium pullulans IFO 6402, Aureobasidium pullulans IFO 6353 oder Aureobasidium pullulans IFO 4464.

Das Kulturmedium, wie es in den oben genannten Literaturstellen beschrieben wird, enthält als Kohlenstoffquelle Saccharose, Invertzucker, isomerisierten Zucker, Fructose und/oder Glucose, wobei auch die Verwendung einer teilweise hydrolysierten Stärke in dem Medium sehr zufriedenstellende Ergebnisse ergibt.

Im allgemeinen können Ammoniumsalze und Nitrate als anorganische Stickstoffquellen und Peptone als organische Stickstoffquellen verwendet werden. Darüberhinaus können geeignete Mengen von Phosphat- und Metallionen, z. B. Magnesiumionen oder Eisen(ll)-ionen zu den Kulturmedien zugesetzt werden. Nach der Wärmesterilisierung des auf diese Weise erhaltenen Kulturmediums nach der Einstellung des pH-Wertes werden Stämme des Ausgangsmediums auf das Medium inokuliert. Die Mikroorganismen werden in dem Medium nach der üblichen Methode kultiviert, z. B. unter Belüftung oder Durchbewegung, bei 25 bis 30° C, vorzugsweise bei 27° C und über Zeitspannen von etwa 7 Tagen. Etwa 3 Tage nach Beginn der Fermentation wird die Bildung einer erheblichen Menge von Pullulan beobachtet und die Viskosität des Kulturgemisches steigt an.

Der Restzucker in dem Medium wird in bestimmten Intervallen bestimmt und die Kultivierung wird an dem Punkt abgebrochen, wo die Menge des Restzuckers ihren niedrigsten Wert erreicht hat. Die Mikrobenzellen werden aus dem Flüssigkeitsmedium durch Zentrifugieren auf die übliche Weise entfernt und das zellfreie flüssige Medium wird gewünschtenfalls mit Aktivkohle entfernt.

Vorzugsweise wird die resümierende Flüssigkeit mit einem hydrophilen organischen Lösungsmittel, z. B. Methylalkohol, Äthylalkohol etc. versetzt, um das erzeugte Pullulan zur Ausfällung zu bringen, das sodann durch Zentrifugieren abgetrennt wird. Weiterhin kann das gewonnene Pullulan gewünschtenfalls in warmem Wasser aufgelöst werden und die Reinigung durch Ausfällung durch Zugabe eines Lösungsmittels kann wiederholt werden. Die Pullulanausbeute wird nach dem Trocknen des Produkts errechnet. Das auf diese Weise erhaltene Pullulan ist ein weißliches Pulver, das sich ir. Wasser sehr rasch unter Bildung einer viskosen Lösung auflöst. Das Molekulargewicht des nach dem obigen Vorgehen erhaltenen Pullulans variiert in einem weiten Bereich, je nach den angewendeten Kultivierungsbedingungen, d h. im Bereich von 50 000 bis 4 500 000. Auch die Ausbeute des Pullulans, bezogen auf den eingesetzten Zucker variiert je nach den angewendeten Kultivierungsbedingungen von 20 bis 75%.

Oben wurde ein typischer Prozeß zur Erzeugung von Pullulan beschrieben. Die vorliegende Erfindung soll

ίο nachstehend hinsichtlich der Wirkungen des pH-Wertes und der Konzentration der Phosphationen im Kulturmedium auf das Molekulargewicht und die Ausbeute des Pullulans, sowie den Kultivierungszeitraum weiter erläutert werden. Wie in den Beispielen im einzelnen beschrieben wird, wurden Kulturtests mit mehreren Stämmen auf Kulturmedien durchgeführt, die 10 Gew.-% teilweise hydrolysierte Stärke als Kohlenstoffquelle, Peptone als Stickstoffquelle und geringe Mengen von Phosphat, Natriumchlorid, Ammonium-Eisen(II)-sulfat und Ammoniumsulfat enthielten. Die AnfangspH-Werte der Medien wurden im Bereich von 5,0 bis 7,5 variiert Dabei wurden folgende Ergebnisse erhalten:

Die Anwendung eines pH-Wertes von 6,5 oder niedriger erhöht offensichtlich die Viskosität der Kulturbrühe auf oberhalb 300 centipoise. Ein pH-Wert von 7,0 oder höher vermindert die Viskosität auf weniger als 240 centipoise. Bei einem pH-Wert von 5 bis 6 hatte das erhaltene Pullulan ein Molekulargewicht im Bereich von 1 500 000 bis 4 000 000 und die Kulturbrühe war hochviskos, so daß die Brühe ihre Fließfähigkeit verlor. Wenn andererseits die Inkubierung bei einem pH-Wert von 6,5 oder höher durchgeführt wurde, dann lagen die Pullulan-Ausbeuten im Bereich von 50 bis 75 Gew.-%. Das durch Gel-Filtrationsanalyse gemessene Molekulargewicht war niedrig und lag bei etwa 50 000 bis 100 000.

Das Verfahren der Erfindung ergibt im Verhältnis zu den bekannten Verfahren, bei denen die Ausbeuten etwa 20 bis etwa 50 Gew.-% betrugen, höhere Ausbeuten. Die Beobachtung des Wachstums von Stämmen auf Kulturmedien von verschiedenen pH-Werten nach 4,6 und 7 Tagen zeigten, daß bei einem niedrigen pH-Wert, z. B. 5,5, die Viskosität der Brühe über 1000 centipoise betrug, während bei einem pH-Wert von 7,8 bis 8,0 die Viskosität lediglich 24 bis 31 centipoise betrug. Der Vergleich der Ausbeuten zeigte jedoch, daß ein hoher pH-Bereich, d. h. von 7,8 bis 8,0, eine hohe Ausbeute, d. h. von über 50 Gew.-% ergibt. Anders ausgedrückt bedeutet das, daß die Pullulan-Ausbeute, bezogen auf den eingesetzten Zucker, bei einem pH-Wert von 5,5 30% betrug, daß sie jedoch bei Anwendung eines pH-Bereiches von 6,6 bis 7,0 auf über 50 Gew.-% anstieg.

Das durchschnittliche Molekulargewicht des Pullulans betrug bei einem pH-Wert von 6 etwa 3 000 000, während es bei einem pH-Wert von 7,0 etwa 80 000 betrug. Somit wurde gemäß der Erfindung festgestellt, daß es möglich ist, sowohl die Ausbeute als auch das durchschnittliche Molekulargewicht des Pullulans in einem großen Ausmaß zu variieren.

Weiterhin wurden die Menge des Restzuckers in der Brühe und die Pullulan-Ausbeute nach einer 4tägigen, 6tägigen und 8lägigen Kultivierung bestimmt. Dabei wurde festgestellt, daß die Menge des Restzuckers allmählich bis zur Endstufe der Kultivierung abnimmt und daß umgekehrt die Pullulan-Ausbeute ansteigt. Der Restziicker beträgt nach 8 Tagen etwa !0 bis 20 Gew.-%. Bei einem pH-Bereich von 7,0 bis 8,0 betrug

jedoch der Restzucker innerhalb 4 bis 6 Tagen 1 bis 10 Gew.-%. Umgekehrt erreichte die Pullulan-Ausbeute in dem gleichen Zeitraum, d. h. von 4 bis 6 Tagen nahezu ihren höchsten Wert. Die obigen Tatsachen zeigen, daß je höher der pH-Wert ist, desto rascher der Zuckerverbrauch und die Bildung des Puilulans erfolgt, und daß dementsprechend die Pullulan-Ausbeute erhöht wird.

Die oben beschriebene Verbesserung der Ausbeute und die Verkürzung der Kultivierungsperiode durch Kontrolle des pH-Wertes des Kulturmediums zeigt sich am signifikantesten, wenn als Kohlenstoffquelle eine Dattelextrakt-Lösung verwendet wird.

Datteln haben einen Zuckergehalt von etwa 50 Gew.-%. Die Feststoffe der wäßrigen Extraktlösung umfassen fast annähernd gleichwertige Mengen von Glucose und Fructose, wobei der Rest aus anorganischen Salzen besteht Der Gesamt-Anionengehalt beträgt 2500 bis 3500 mg/1 bei einer Zuckerkonzentration von 18% (GeWTVoI.) als CaCO₃. Die Verwendung eines Dattelextrakts, ob dieser nun als Kohlenstoffquelle nach der Entfärbung mit Aktivkohle oder per se verwendet wird, verkürzt die Kulturperiode und verbessert die Pullulan-Ausbeute, ähnlich wie in dem oben beschriebenen Fall eines hohen pH-Wertes. Darüber hinaus bringt eine Verwendung einer Dattelextrakt-Lösung, die mit Ionenaustauschern gereinigt worden ist, im Vergleich zu der Verwendung eines teilweisen Stärkehydrolysate oder von Saccharose als Kohlenstoffquelle keinen wesentlichen Unterschied mit sich. Dies ist wahrscheinlich auf eine Pufferwirkung der Ionen, die in großen Mengen in dem Medium vorhanden sind und nicht auf die Abnahme des pH-Wertes in der Kultur zurückzuführen. Die Verwendung einer Dattelextrakt-Lösung als Kohlenstoffquelle ist für die technische Herstellung von Pullulan von Vorteil.

Es wurde weiterhin gefunden, daß die Konzentration der Phosphationen in dem Medium den Kultivierungszeitraum und die Ausbeute an Pullulan beeinflußt. So ergibt, wie oben beschrieben, die Verwendung von 0,1 bis 0,5% (Gew7Vol.) von Phosphat bei einem pH-Wert von 5,5 die Bildung von Pullulan mit einem hohen Molekulargewicht, das sich von 1 500 000 bis 3 000 000 erstreckt. Das Molekulargewicht des Puilulans vermindert sich entsprechend der Zunahme der Phosphatkonzentration. 0,1 bis 0,3% Phosphat führen zu einem Pullulan mit einem Molekulargewicht vor 2 000 000 bis 3 000 000. In ähnlicher Weise ergeben bei einem pH-Wert von 6,0 0,5% (Gew./Vol.) Phosphat ein Molekulargewicht von etwa 70 000, während 0,1 bis 0,2% (Gew7Vol.) ein Molekulargewicht von etwa 200 000 ergeben. Wie oben beschrieben wurde, ergibt ein niedriger Anfangs-pH-Wert im allgemeinen ein

Tabelle I

Stamm: Aureobasidium puilulans IFO 4464

hohes Molekulargewicht des Puilulans, das jedoch stark entsprechend der Phosphatkonzentration variiert. Somit kann das Molekulargewicht des Puilulans, das in dem Kulturmedium erzeugt wird, kontrolliert werden, indem man den Anfangs-pH-Wert und/oder die Phosphat-Ionen-Konzentration in dem Medium variiert oder modifiziert. Für die Fermentation kann ein Phosphat verwendet werden, wie es herkömmlicherweise eingesetzt wird, z. B. K2HPO4-

Die Erfindung wird in den Beispielen erläutert. Als Phosphat wurde K2HPQ4 verwendet

Beispiel 1

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkung der Änderung des pH-Wertes auf das Molekulargewicht des erhaltenen Puilulans.

Bei dieser Versuchsreihe wurde als Mikroorganismus Aureobasidium puilulans IFO 4464 verwendet. Das Kulturmedium enthielt 10% (GewJVol.) Stärkesirup mit einem Dextrose-Äquivalentwert (nachstehend als DÄ-Wert abgekürzt) von 43, 0,2% Phosphat. 0,2% Natriumchlorid, 0,2% Pepton, 0,04% Magnesiumsulfat und 0,001% Ammonium-Eisen(II)-sulfat. Diese Angaben beziehen sich auf das Verhältnis von Gewicht zu Volumen. Die Ausgangskultur oder Impfkultur wurde durch Kultivierung des Mikroorganismus auf einem Medium mit der obigen Zusammensetzung bei 27⁰C während eines Zeitraums von 2 Tagen erhalten. Die Ausgangskultur wurde auf das Hauptkultivierungsmedi-

jn um in einer Menge von 2 bis 3% (VolVVol.), bezogen auf das Medium, inokuliert.

Die Hauptkultivierung erfolgte in der Weise, daß 100 ml des obigen, in einem 500 ml Erlenmeyer-Kolben gegebenen Mediums sterilisiert wurden, der pH-Wert des Mediums auf 5,5 bis 8,0 eingestellt wurde, 2% (VolVVol.) einer Ausgangskultur zugegeben wurde und daß sodann das Gemisch 7 Tage auf einem Drehmischer bei 27⁰C inkubiert wurde. Nach Vervollständigung der Kultivierung wurden die Zellen abzentrifugiert. Das überstehende Produkt wurde entfärbt und durch Zugabe von Aktivkohle gereinigt. Es wurde mit Methylalkohol versetzt, das eine Lösung mit einer Konzentration von 50% (VoL/Vol.) des Alkohols erhalten wurde, um Pullulan auszufällen. Der von der Lösung durch Zentrifugieren gewonnene Niederschlag wurde in einer geringen Menge Wasser wieder aufgelöst, worauf die Zugabe von Methylalkohol und die Zentrifugierung wiederholt wurde. Das auf diese Weise erhaltene gereinigte Pullulan-Produkt wurde mit Methanol gewaschen und im Vakuum getrocknet. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengestellt.

Anfangs- End-pH-Wert
pH-Wert

Trübung (XlO)

Restzucker
% Gew./Gew.

Pullulan-Ausbeute
% Gew./Gew.

Mittleres
Molekulargewicht

Kultivierungszeitraum, Tage
4 6 7 4

5,5	3,30	3,30	3,30	0,9	1,4	1,8	50,5	24,4	16,5	18,6	21,8	31,2	200X10⁴
	3,30	3,38	3,32	0,9	1,3	1,6	51,9	23,9	17.3	11,9	22,6	25,7	180 X10"
6,0	3,5	3,5	3,5	0,9	1,4	1,9	38.	25.	20.	26	30	36	180X 10⁴
	3.4	3.5	3.4	1.0	1,5	1,8	41.	28.	22.	24	31	35	IVOX IU⁴

Fortsetzung

Anfangs- End-pH-Wert pH-Wert

Trübung (X 10) Restzucker
% Gew./Gew.

Pullulan-Ausbeute
% Gew./Gew.

Kultivierungszeitraum, Tage

4 6 7 4 6

Mittleres
Molekulargewicht

6,5	3,7	3,6	3,6	U	1,5	1,7	28.	17.	17.	35	40	40	200X10"
	3,7	3,6	3,7	1,0	1,7	1.7	29.	19.	18.	36	40	41	200X10"
7.0	3,9	3,9	3,8	U	1,8	2,0	19.	15.	10.	48	61	60	25X10"
	3.9	3,9	3,8	1,1	1,7	1.9	20.	13.	12.	45	62	63	26X10"
7.5	4,2	4,2	4,2	1,1	1,9	2	18.	10.	5.	47	68	69	20X10"
	4,2	4,2	4,3	1.2	1,8	2	19.	11.	10.	49	69	69	21X10"
8.0	4,7	4,5	4,6	1,2	1,8	2	15.	1.	0,8	48	70	71	18X10"
	4,7	4,5	4,7	1,1	1,7	2	16.	0.3	0.5	55	71	71	15X10"

Fußnote: Die Trübung (X 10) ist als Absorption einer lOfach verdünnten Lösung bei 660 m;;. dargestellt, wozu ein Spektrophotometer Modell 101 von Hitachi mit einer Zelle von 10 mm verwendet wurde. Der Restzucker und die Pullulan-Ausbeule sind als Gew.-%, bezogen auf den eingesetzten Zucker angegeben.

Die vorstehenden Ergebnisse verdeutlichen die Tendenz, daß pH-Werte von 7,0 oder mehr zu einem äußerst niedrigen Molekulargewicht führen, während pH-Werte von 6,0 oder darunter eine starke Erhöhung kommt noch, daß hinsichtlich der Pullulan-Ausbeute und des Kultivierungszeitraumes die Anwendung eines pH-Wertes von 6,5 oder mehr den Kultivierungszeitraum vermindert und die Ausbeute an Pullulan verbessert.

Beispiel Ib

Es wurde entsprechend Beispiel 1 verfahren, mit der Ausnahme, daß Aureobasidium puliulans Stamm IFO und als Kohlenstoffquelle Glucose verwendet

Tabelle Il

wurde. Die erhaltenen Ergebnisse sind in Tabelle Il zusammengestellt.

Phosphat. % Anfangs-pH-Wert Ausbeute gegenüber dem eingesetzten Mittleres

Zucker, % Molekulargewicht

Kultivierungszeitraum. Tage

7

0.1 0,2 0,3 0,4 0,5

0,1 0,2 0,3 0,4 0,5

0,1 0,2 0,3 0,4 0.5

5,5

6,0

6,5

18	25	270 x10"
21	32	270X10"
31	38	280X10"
34	40	200 x10"
35	40	110X10"
20	28	180X10"
38	49	200 x 10"
41	57	200 x 10"
43	63	50 x 10"
45	65	20 X 10"
25	28	25X10"
34	37	15X10"
61	68	8X10"
65	68	5X10"
67	70	5X10"

Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß im Falle eines Glucose-enthaltenden Mediums die Phosphatkonzentration und der Anfangs-pH-Wert die

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Ausbeute und das Molekulargewicht des Pullulans in ähnlicher Weise beeinflussen wie in den vorstehenden Beispielen.

Beispiel

Dieses Beispiel beschreibt die Wirkungen der Variation des pH-Wertes und der Phosphatkonzentration auf das Molekulargewicht des erzeugten Pullulans. Es wurde mit dem Stamm und unter den Bedingungen iu des Beispiels 1 gearbeitet. Die Änderungen des

Tabelle III

Stamm: Aureobasidium pullulans IFO 4464 mittleren Molekulargewichtes, die durch Variation des pH-Wertes im Bereich von 5,5 bis 6,5 und des Phosphatgehaltes von 0,1 bis 0,5% (Gew./Vol.) erhalten wurden, sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt. Der Kultivierungszeitraum betrug 7 Tage.

Phosphat, %	Anfangs-pH-Wert	Ausbeute, bezogen auf den eingesetzten Zucker, %	Mittleres Molekulargewicht
0,1		40	200 X 10⁴
0,2		60	200 X 10"
0,3	6,5	70	290 X10"
0,4		70	350 XlO⁴
0,5		71	62 X 10⁴

Aus den obigen Ergebnissen wird ersichtlich, daß es vorzuziehen ist, zur Erzielung eines Pullulans mit einem höheren Molekulargewicht 0,2 bis 0,4% Phosphat zu verwenden.

Beispiel

In diesem Beispiel wurde bei den Bedingungen des Beispiels 1 gearbeitet, mit der Ausnahme, daß als Kohlenstoffquelle ein Dattelextrakt verwendet wurde. Der Dattelextrakt wurde hergestellt, indem Datteln in das 4fache Volumen warmes Wasser unter gelegentlichem Rühren 3 Stunden lang eingetaucht wurden und sodann die überstehende Flüssigkeit gewonnen wurde, die hierauf mit Aktivkohlen entfärbt und konzentriert wurde. Der Feststoffgehalt der resultierenden Lösung betrug 18% (Gew7Vol.). Davon betrug der Anteil der Glucose 50 Gew.-%. Der Rest bestand hauptsächlich aus Fructose und einer geringen Menge von Pentose. Der Extrakt war dunkel gefärbt und sein Gesamtanionengehalt als CaCO₃ betrug 2500 bis 3500 mg/1. Der Aschegehalt der Extraktlösung, bezogen auf den Zucker, betrug etwa 2 Gew.-%. Eine Extraktlösung und eine durch Ionenaustauscher gereinigte Lösung wurde bei dieser Versuchsreihe getrennt als Kohlenstoffquelle verwendet.
Ein Kulturmedium, das 10% (Gew./Vol.) Dattelextraktlösung, 0,3% (GewVVol.) Phosphat, 0,2% (Gew./ Vol.) Pepton, 0,2% (Gew./Vol.) Natriumchlorid, 0,04% (Gew./Vol.) Magnesiumsulfat und 0,001% (GewVVol.) Ammonium-Eisen(lI)-sulfat enthielt, wurde sterilisiert und auf einen pH-Wert von 6,5 eingestellt. Sodann wurden zu diesem Hauptkultivierungsmedium 2% (VoL/Vol.) einer Ausgangskultur gegeben, welche nach einer 41 stündigen Kultivierung erhalten worden war. Das Gemisch wurde 144 Stunden unter Rührbedingungen kultiviert. Sodann wurde das erzeugte Pullulan abgetrennt, gereinigt und nach der Arbeitsweise des Beispiels 1 auf das Molekulargewicht untersucht. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV zusammengestellt.

Tabelle IV	End-pH-Wert Trübung (x 10) Kultivierungszeitraum, h 48 96 120 144 48 96 120	4,6 5,0 18	5,1 5,6 38	39	0,95 0,96 07	1,25 1,23 0,9	1,22 1,25 1,0	144	Restzucker %, Gew./Gew. 48 96 120	4 2 2,4	5 3 1,0	144	Ausbeute bezogen auf den eingesetzten Zucker, Gew.-% 48 96 120 144	67 76 51 58
	4,6 4,7 3,8	3,7	3,7	3,7	0,6	0,8	0,9	1,0	4,7 4,3 5,5	3,1	2,1	2	22,9 68 30,6 73 19 45	59 60
Entfärbt Durch Ionenaustauscher	3,8		1,0	6,2		1,1	23 46
gereinigt

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß bei Verwendung einer Dattelextrakt-Lösung zufriedenstellende Ergebnisse erhalten werden können. Die Verwendung einer durch Ionenaustauscher gereinigten Extraktlösung und einer Extraktlösung, die nicht durch Ionenaustauscher gereinigt worden war, ergab sehr ausgeprägte Unterschiede hinsichtlich des Fortschritts der Kultivierung und auch hinsichtlich der Art und Weise der Pullulanbildung. Die Extraktlösung, die nämlich nicht durch Ionenaustauscher gereinigt worden war, ergab nämlich eine verminderte Kultivierungszeit und eine verbesserte Ausbeute.

Claims

Patentansprüche:

1. Verfahren zur Herstellung von Pullulan durch Züchtung eines Pullulan erzeugenden Mikroorganismus in einem Kulturmedium, das assimilierbare Kohlenstoff- und Stickstoffquellen, Phosphat und für das Wachstum des Mikroorganismus erforderliche Nährstoffe enthält, dadurch gekennzeichnet, daß man zur Bildung von Pullulan mit einem to Molekulargewicht von 4 500 000 bis 50 000 den Anfangs-pH-Wert des Mediums auf 5 bis 7,5 und/oder die Phosphatkonzentration auf 0,1 bis 0,5% (Gewicht/Vol.) einstellt, wobei jedoch das Arbeiten mit 0,5% (Gewicht/Vol.) K₂HPO₄ mit dem Stamm Quartermaster-strain Nr. 3092 von Pullularia pullulans ausgenommen ist

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung durchführt, bis Pullulan in einer Ausbeute von 20 bis 75 Gew.-% gebildet ist

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Züchtung während einer Dauer von 3 bis 8 Tagen durchführt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Aureobasidium pullulans IFO 6401, Aureobasidium pullulans IFO 6402, Aureobasidium pullulans IFO 6353 oder Aureobasidium pullulans IFO 4464 verwendet. jo

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß man als assimilierbare Kohlenstoffquelle im wesentlichen einen Dattelextrakt verwendet.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man den Anfangs-pH-Wert auf zwischen 6 und 7 einstellt.