KR20150062130A - 유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 ij-1의 생장 및 생물계면활성제 생산효율을 증가시키기 위한 배양방법 - Google Patents

유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 ij-1의 생장 및 생물계면활성제 생산효율을 증가시키기 위한 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 유류 분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 IJ-1에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유류 분해능을 갖고 생물계면활성제를 생산하는 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주는 원유, 휘발유, 등유 및 경유 등 유류분해능이 뛰어나고 더 나아가 생물계면활성제를 생산하는 능력을 가지고 있으므로, B. pumilus IJ-1 균주의 생장 및 생물계면활성제를 생산할 수 있는 최적의 배양조건을 규명한 본 발명은 해양 유류 사고 시 또는 토양의 유류 오염 시 유류 오염의 확산 방지 및 유류의 효율적인 분해에 사용할 수 있으므로 환경 산업적으로 매우 유용하다.

Description

유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생장 및 생물계면활성제 생산효율을 증가시키기 위한 배양방법{Culture method for increasing the biosurfactant production and growth of oil-degradable strain Bacillus pumilus IJ-1}
본 발명은 유류 분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 IJ-1에 관한 것으로, 보다 상세하게는 유류분해능을 갖는 신균주 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생장 및 생물계면활성제 생산효율을 증가시키기 위한 배양방법에 관한 것이다.
전 세계적으로 유류수송은 대부분 해양수송에 의존하고 있으며, 유조선의 사고 등에 의한 유류 유출 및 각종 폐유 방출 등으로 해양오염이 늘어나면서 해양 생태계에 커다란 피해를 유발시키고 있다. 최근, 유류수송 선박이 대형화, 자동화 및 고속화됨에 따라 해양사고 시 수만 톤에서 수십만 톤에 이르는 초대형 오염사고도 발생하고 있는데, 1989년 Exxon Valdez호 오염사고, 1991년 걸프전쟁 당시의 고의유출사고, 1993년 영국 Braer호 유출사고 등 전 세계적으로 원유가 해양으로 유출되는 양은 엄청나다. 우리나라에서도 해양 유류 오염 사고가 수시로 발생하여 해양오염에 의한 자연생태계의 파괴와 연안 해역에서의 양식업에도 중대한 피해를 입히고 있다. 이러한 해양 유류 오염의 발생증가와 아울러 유류 오염 문제를 해결하려는 노력들이 많은 연구자들에 의해 활발하게 진행되어 왔다.
특히 해양 유류 오염물질인 n-, iso-, cyclo-alkane 계열의 탄화수소원과 원유(crude oil) 및 경유, 등유 등의 석유 제품에 대한 다양한 탄화수소원 기질을 분해 및 제거시키기 위한 기술이 개발되어 사용되고 있다. 일반적으로 유류 오염물질을 제거하기 위해서는 오일펜스를 설치하거나 유겔화제(oil solidifying agent)를 사용하거나, 제한된 범위에 한해서는 붐형 유흡착제(boom type absorbent)를 연결하여 사용하기도 한다. 유출된 유류는 유회수기(oil skimmer, trawl skimmer)를 이용하여 기계적으로 회수하거나 유흡착제를 사용하여 유출유를 직접 흡유하여 회수한다. 그 후에 남은 얇은 유막은 유처리제를 살포하여 해상의 유출유를 미립자화하여 분산시켜 자연계에 존재하는 유류분해 미생물이 유적(oil droplet)을 효과적으로 이용할 수 있게끔 접촉면적을 넓혀 제거한다.
그러나 종래 이러한 방법들은 유처리제 사용지침에 의거하여 사용해야 하며, 유류를 회수하지 않고 현장을 소각하는 방법은 대기오염이나 소각 잔재물의 영향 등으로 좋은 방법이라고 할 수 없다.
따라서 해양 유류 사고 시 유류 오염의 조기포착, 오염의 확산 방지 및 효율적인 방제를 위한 새로운 기술이 개발될 필요가 있으며, 특히 이러한 방법으로 생물학적 처리 방법에 대한 관심이 증가하고 있다.
이는 종래 물리화학적인 방법보다는 생물학적 처리 방법, 예컨대 자연에 존재하는 유용 미생물을 사용할 경우 친환경적인 장점이 있기 때문에 자연에 존재하는 유류 분해능이 우수한 유용 미생물의 발굴이 시급한 실정이다.
유류분해 능력을 지니면서 생물계면활성제(biosurfactant)를 생산하는 미생물로는 Pseudomonas, Achromobacter, Flavobacterium, Nocardia, Aeromonas, Arthrobacter, Vibrio, Bacillus, Micrococcus, Corollospora, Dendryphiella, Mycobacterium, Torulopsis, Acinetobacter 속(genus)들이 보고되고 있다.
한편, lipopeptide 계열의 생물계면활성제로는 Arthrobacter sp.가 생산하는 arthrofactin, B. licheniformis가 생산하는 peptide-lipid, Serratia marcescens가 생산하는 serrawettin, Pseudomonas fluorescens가 생산하는 viscosin이 있다.
그리고 바실러스에서 생산되는 생물계면활성제로는 단순 peptide 형태인 gramicidin S와 tyrocidine, 7개의 amino acid cyclic peptide에 β-hydroxy fatty acid가 에스테르 결합을 하고 있는 계면활성제, 7개의 α-amino acid와 한 개의 β-amino acid 잔기를 갖는 iturin이 있다.
이와 같은 생물계면활성제는 종래의 화학합성계면활성제와는 달리 생물체에서 생산되는 물질이므로 생분해도가 우수하고 독성도 적을 뿐 아니라 다양한 화학 구조와 각 구조마다 특이성이 있어 세제, 환경, 식품 및 음료, 석유관련 제품, 의약품, 화장품 공업, 페인트 공업 등에서 광범위한 용도로 이용될 수 있다.
생물계면활성제 중에서도 미생물에 의한 생물계면활성제에 대한 관심이 점차 고조되고 있는 이유는 미생물은 다른 동식물 세포에 비해 다루기 쉽고, 미생물 종(species)에 따라 다양한 종류의 생물계면활성물질을 얻을 수 있으며, 생장속도도 다른 생물체에 비해 훨씬 빨라 단시일 내에 비교적 간단한 장치를 이용하여 다량의 생물계면활성제를 생산해 낼 수 있기 때문이다. 또한 배양과정이 비교적 간단하고, 포도당, 탄화수소, 식품성 유류 등 단순 원료를 이용하여 쉽게 생산이 가능하며, 유전공학이나 생화학적 기법을 응용하여 유용한 변이주를 만들 수도 있다는 장점이 있다.
이처럼 생물계면활성제에 대한 관심은 기본적으로 환경에 대한 우려에 기인하여 기존의 화학합성계면활성제를 대체하고자 하는 것이지만, 화학합성계면활성제에 비해 상대적으로 비싼 단가와 생물을 다루어야하는 어려움으로 인해 아직까지 산업적으로 많이 생산되지는 못하고 있는 실정이다. 따라서 이의 해결을 위해서는 생산성이 높은 균주를 확보하고, 효과적인 생산방법과 분리방법을 개발할 필요가 있으며, 생물로부터 유래한 물질의 장점을 살려 고부가가치 상품에 도움이 될 고기능 생물계면활성제의 개발이 요구되는 실정이다.
한국등록특허 제10-0641834호 한국등록특허 제10-52063호
Hur SH, Yang JS, and Hong JH (2002) Production of biosurfactant using Bacillus spp..JKorean Soc Food Sci Nutr 31, 389-93
본 발명은 상기한 종래의 문제점을 해결하기 위한 것으로서, 본 발명의 목적은 해양 원유 오염을 제거할 수 있는 생물계면활성제 생산수율을 향상시키기 위해 B. pumilus IJ-1 균주을 배양하는 배양방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여 본 발명은, (A) B. pumilus IJ-1 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 종 배양(seed culture)하는 단계; 및 (B) 상기 종 배양된 B. pumilus IJ-1 균주를 A-배지에 0.1 ~ 5.0%(v/v) 되게 접종하여 추가 배양하는 단계를 포함하는 바실러스 퓨밀러스(B. pumilus ) IJ-1 균주로부터 생물계면활성제 생산을 위한 IJ-1 균주 배양방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (A) 단계는 pH 6.5~7.5의 액체 배지를 사용하여 33~37℃에서 150~250 rpm으로 14~18시간 동안 배양하고, 상기 (B) 단계는 33~37℃에서 150~250 rpm으로 72~120시간 동안 배양할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 탄소원으로 카르복시메틸 셀루로오스(carboxymethyl cellulose, CMC), 덱스트로오즈(dextrose), 프룩토오즈(fructose), 갈락토오즈(galactose), 글루코오즈(glucose), 글리세롤(glycerol), 락토오즈(lactose), 말토오즈(maltose), 만니톨(mannitol), 만노오즈(mannose), 라피노오즈(raffinose), 수크로오즈(sucrose), 트레할로오즈(trehalose), 자일로오즈(xylose), 노난(nonane), 데칸(decane), 테트라데칸(tetradecane), 헥사데칸(hexadecane), 원유(crude oil), 벤젠(benzene), 톨루엔(toluene) 및 파라핀(paraffin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 탄소원으로 글리세롤(glycerol)이 더 포함되고, 상기 글리세롤은 총 배지 조성물의 0.1~1.5%(v/v)로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 유기 질소원을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기 질소원은 고기 추출물(beef extract), 카제인(casein), 맥아 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 스킴 밀크(skim milk), 소이톤(soytone), 트립톤(tryptone) 및 효모 추출물(yeast extract)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 무기 질소원으로 KNO3를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 유기 질소원은 트립톤(tryptone)이고, 상기 트립톤은 총 배지 조성물의 0.3~1.5%(w/v)로 포함될 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서는 A-배지에 NaCl을 0~2%(w/v) 농도로 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서 A-배지의 pH는 5~10일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 (B) 단계에서 배양 온도는 15~40℃일 수 있다.
본 발명의 미생물 B. pumilus IJ-1 균주는 원유, 휘발유, 등유 및 경유 등 유류분해능이 뛰어나고 더 나아가 생물계면활성제를 생산하는 능력을 가지고 있으므로, B. pumilus IJ-1 균주의 생장 및 생물계면활성제를 생산할 수 있는 최적의 배양조건을 규명한 본 발명은 해양 유류 사고 시 또는 토양의 유류 오염 시 유류 오염의 확산 방지 및 유류의 효율적인 분해에 사용할 수 있으므로 환경 산업적으로 매우 유용하다.
도 1은 0.5%(w/v) 트립톤(tryptone)을 함유하는 A-배지에서 B. pumilus IJ-1 의 성장에 미치는 NaCl 농도의 영향을 확인한 그래프이다.
도 2는 0.5%(w/v) 트립톤(tryptone)을 함유하는 A-배지에서 B. pumilus IJ-1 에 의해 생산된 생물계면활성제의 표면장력에 미치는 NaCl 농도의 영향을 확인한 그래프이다.
도 3은 0.5%(w/v) 트립톤(tryptone)을 함유하는 A-배지에서 B. pumilus IJ-1 의 성장에 미치는 초기 pH의 영향을 확인한 그래프이다.
도 4는 0.5%(w/v) 트립톤(tryptone)을 함유하는 A-배지에서 B. pumilus IJ-1 에 의해 생산된 생물계면활성제의 표면장력에 미치는 초기 pH의 영향을 확인한 그래프이다.
도 5는 0.5%(w/v) 트립톤(tryptone)을 함유하는 A-배지에서 B. pumilus IJ-1 의 성장에 미치는 배양 온도의 영향을 확인한 그래프이다.
도 6은 0.5%(w/v) 트립톤(tryptone)을 함유하는 A-배지에서 B. pumilus IJ-1 에 의해 생산된 생물계면활성제의 표면장력에 미치는 배양 온도의 영향을 확인한 그래프이다.
도 7은 실험 plot 대 예측된 plot의 표면장력 감소율을 비교한 결과이다.
도 8은 본 발명에 따른 독립변수에 대한 반응변수의 반응표면상태를 3차원 그래프와 등고선 분석으로 나타낸 결과이다.
본 발명은 유류 분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생물계면활성제 생산 효율을 증가시킬 수 있는 배양방법을 제공함에 그 특징이 있다.
석유 탄화수소 화합물이 포함된 유류의 유출은 자연환경 오염을 야기하고 인간의 건강을 해치는 원인이 되고 있으며, 특히 유류의 해양과 토양으로의 유출은 생태계의 오염과 함께 오염된 해양과 토양 복원을 위해 많은 시간과 비용이 소비되는 문제가 있다.
따라서 유류오염 제거를 위한 많은 기술들이 종래 연구된 바 있지만 대부분이 화학물질을 사용하는 방법으로써 이러한 방법은 다른 자연환경 오염의 원인이 될 수 있다는 문제점이 있다.
본 발명자들은 기 출원된 출원번호 제10-2013-0087007호를 통해 유류오염 제거를 위한 방법으로 미생물을 사용할 수 있는 방법을 개발하기 위해 유류 분해능이 우수한 자연계에 존재하는 미생물을 분리 및 동정하고 이를 "바실러스 퓨밀러스(Bacillus pumilus) IJ-1 균주"로 명명하고, 동정한 균주를 2012년 11월 02일자로 한국미생물 보존센타(KCCM)에 기탁하여 기탁번호 KCCM11319P를 부여받았다.
본 발명은 상기 균주의 생장, 유류 분해능 및 생물계면활성제 생산능을 극대화시키기 위한 배양방법에 관한 것으로, 본 발명을 좀 더 명확히 이해하기 위하여 상기 출원번호 제10-2013-0087007호를 참고할 수 있을 것이다.
본 발명은 (A) 바실러스 퓨밀러스(B. pumilus ) IJ-1 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 종 배양(seed culture)하는 단계; 및 (B) 상기 종 배양된 바실러스 퓨밀러스(B. pumilus) IJ-1 균주를 A-배지에 0.1 ~ 5.0%(v/v) 되게 접종하여 추가 배양하는 단계를 포함하는 생물계면활성제 생산을 위한 배양방법을 제공한다.
이 경우, 상기 (A) 단계는 pH 6.5~7.5의 액체 배지를 사용하고 33~37℃에서 150~250 rpm으로 14~18시간 동안 배양하고, 상기 (B) 단계는 33~37℃에서 150~250 rpm으로 72~120시간 동안 배양하는 것이 바람직하다.
이 경우, 상기 (A) 단계는 pH 7의 액체 배지를 사용하고 35℃에서 200 rpm으로 16시간 동안 배양하고, 상기 (B) 단계는 35℃에서 200 rpm으로 96시간 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하다.
한편, 상기 A-배지는 탄소원으로 카르복시메틸 셀루로오스( c arboxymethyl cellulose, CMC), 덱스트로오즈(dextrose), 프룩토오즈(fructose), 갈락토오즈(galactose), 글루코오즈(glucose), 글리세롤(glycerol), 락토오즈(lactose), 말토오즈(maltose), 만니톨(mannitol), 만노오즈(mannose), 라피노오즈(raffinose), 수크로오즈(sucrose), 트레할로오즈(trehalose), 자일로오즈(xylose), 노난(nonane), 데칸(decane), 테트라데칸(tetradecane), 헥사데칸(hexadecane), 원유(crude oil), 벤젠(benzene), 톨루엔(toluene) 및 파라핀(paraffin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하면 표면장력이 대조군에 비해 감소하는 것으로 확인된 바, 상기 탄소원을 첨가한 배지는 바실러스 퓨밀러스(B. pumilus ) IJ-1 균주의 생물계면활성제 생산 효율을 증가시키는 효과가 있다(표 1 참조).
이 경우 상기 탄소원으로 글리세롤(glycerol)이 첨가되는 것이 바람직하고, 상기 글리세롤은 총 배지 조성물의 0.1~1.5%(v/v)로 첨가하는 것이 바람직한데, 최고의 균주 생장을 위해서는 상기 글리세롤의 농도가 1.0%(v/v)이 되도록 첨가하고, 최고의 생물계면활성제 생산 효율을 위해서는 상기 글리세롤의 농도가 0.5%(v/v)가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다(표 2 참조).
또한, 상기 A-배지는 유기 질소원 또는 무기 질소원을 더 첨가하는 것이 바람직한데, 상기 유기 질소원으로는 고기 추출물(beef extract), 카제인(casein), 맥아 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 스킴 밀크(skim milk), 소이톤(soytone), 트립톤(tryptone) 및 효모 추출물(yeast extract)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 첨가하는 것이 바람직하고, 상기 (B) 단계의 A-배지는 무기 질소원으로 KNO3를 더 첨가하는 것이 바람직하다(표 3 참조).
이 경우, 상기 유기 질소원으로 트립톤(tryptone)을 첨가하는 것이 더욱 바람직한데, 최고의 균주 생장을 위해서는 상기 트립톤의 농도가 1.5%(w/v)가 되도록 첨가하고, 최고의 생물계면활성제 생산 효율을 위해서는 상기 글리세롤의 농도가 0.5%(w/v)가 되도록 첨가하는 것이 바람직하다(표 4 참조).
한편, 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주의 생장 및 생물계면활성제 생산 효율을 높이기 위해서, 상기 균주를 배양하는 (B) 단계에서 NaCl을 0~2%(w/v) 농도로 추가로 포함하는 것이 바람직하하고, NaCl을 1%(w/v) 농도로 추가로 포함하는 것이 더욱 바람직하다(도 1 및 도 2 참조).
또한, 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주의 생장 및 생물계면활성제 생산 효율을 높이기 위해서, 상기 균주를 배양하는 (B) 단계의 배양 시 A-배지는 pH가 5~10인 것이 바람직하고, pH가 9인 것이 더욱 바람직하다(도 3 및 도 4 참조).
또한, 본 발명의 바실러스 퓨밀러스 IJ-1 균주의 생장 및 생물계면활성제 생산 효율을 높이기 위해서, 상기 (B) 단계의 배양 온도는 15~40℃인 것이 바람직하고, 최고의 생장 효율을 위하여 상기 배양온도는 35℃인 것이 더욱 바람직하고, 최고의 생물계면활성제 생산 효율을 위하여 상기 배양온도는 20℃인 것이 더욱 바람직하다(도 5 및 도 6 참조).
나아가 본 발명자들은 유류분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생물계면활성제 생산을 위한 배양 조건의 최적조건을 보다 확실하고 정확하게 찾기 위하여 반응표면분석법을 이용하여 확인한 결과, 생물계면활성제 생산을 위한 최적 배양 조건에서 NaCl 농도는 0.745% (w/v), 배양 온도는 19.29℃, 트립톤의 농도는 0.787% (w/v)로 예측되어 확인을 위한 실험치 간에 다소의 차이가 있었으나 90% 이상의 정확도는 확보할 수 있어 생물계면활성제 생산의 예측에 유용하게 쓰일 수 있을 것으로 예상된다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하고자 한다.
본 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1>
유류분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스 IJ -1의 생물계면활성제 생산을 위한 배양 조건의 최적화를 위하여 OFAT( One Factor at a Time )법을 이용한 확인
<1-1> 사용 균주 및 배지
본 발명에서는 생물 계면활성제 생산 균주로 Bacillus pumilus IJ-1을 사용하였다. B. pumilus IJ-1은 Luria-Bertani(LB) [1.0%(w/v) tryptone(Difco, USA), 0.5%(w/v) yeast extract(Bioshop, Canada), 1.0%(w/v) NaCl(Bioshop), and 1.5% agar(w/w)(Difco), pH 7.0] 배지에서 배양하였다. 생물계면활성제 생산을 위한 배지로는 무기염류 배지인 A-배지 [0.3%(w/v) KNO3, 0.22%(w/v) Na2HPO4, 0.014%(w/v) KH2PO4, 0.001%(w/v) NaCl, 0.06%(w/v) MgSO4, 0.004%(w/v) CaCl2, 0.002%(w/v) FeSO4, 및 0.1 mL의 trace element solution(g/L)(2.32 g ZnSO4H2O, 1.78 g MnSO4H2O, 0.56 g H3BO3, 1 g CuSO4H2O, 0.39 g Na2MoO4H2O, 0.42 g CoCl2H2O 및 1 g EDTA 포함)]를 사용하였다.
한편, 본 발명에서 사용한 질소원은 각각 beef extract는 Difco, casein은 usb(USA), malt extract는 Difco, peptone은 Difco, skim milk는 Difco, soytone은 Bio Basic, tryptone은 Difco, yeast extract는 Bioshop, (NH4)H2PO4는 Junsei(Japan), NH4Cl는 Bio Basic, NH4NO3는 Junsei, (NH4)O2SO4는 Sigma, KNO3는 Sigma, NaNO2는 Junsei, NaNO3는 Junsei, CH3COONH4는 Yakuri에서 구입하여 사용하였다.
또한, 본 발명에서 사용한 탄소원은 각각 arabinose는 Bio Basic, carboxymethyl cellulose (CMC)는 Sigma, dextrose는 Difco, fructose는 Daejung(Korea), galactose는 Daejung, glucose는 Bioshop, glycerol은 Junsei, lactose는 Daejung, maltose는 Yakuri, mannitol은 Junsei, mannose는 Acros(USA), raffinose는 Wako(Japan), soluble starch는 Yakuri, sucrose는 Daejung, trehalose는 Wako, xylose는 Junsei, pentane은 Alfa Aesar(USA), hexane은 Alfa Aesar, heptane은 Carlo Erba(Italy), octane는 Carlo Erba, nonane는 Alfa Aesar, decane은 Carlo Erba, tetradecane는 Alfa Aesar, hexadecane는 Alfa Aesar, crude oil(쿠웨이트산)은 (주) SK 에너지(울산공장), benzene은 Alfa Aesar, toluene은 Carlo Erba, paraffin은 Carlo Erba에서 구입하여 사용하였다.
한편, A-배지는 참고문헌 Hur SH, Yang JS, and Hong JH (2002) Production of biosurfactant using Bacillus spp..JKorean Soc Food Sci Nutr 31, 389-93에 기재된 방식에 따라 제조하였으며, 이 때 사용한 KNO3 는 Junsei(Japan), Na2HPO4는 Junsei, KH2PO4는 Yakuri(Japan), NaCl은 Promega, MgSO4는 Yakuri, CaCl2는 Yakuri, FeSO4는 Sigma, ZnSO4H2O 는 Junsei, MnSO4H2O 는 Yakuri, H3BO3 는 Sigma, CuSO4H2O 는 Sigma, Na2MoO4H2O는 Yakuri, CoCl2H2O 는 Sigma, EDTA는 Bioshop에서 구입하여 사용하였다.
<1-2> 배양 조건
생물계면활성제 생산을 위해 B. pumilus IJ-1을 LB 액체 배지(pH 7.0)에 접종하여 균주 생장의 최적 온도인 35℃에서 200 rpm으로 16시간 동안 종 배양(seed culture)하였다. 생장된 균주는 A-배지에 1.0%(v/v) 되게 접종하고, 35℃에서 200 rpm으로 96시간 동안 배양하였다.
<1-3> 균주 생장 측정
B. pumilus IJ-1의 생장 측정은 간접계수 방법으로 BioPhotometer 6131 spectrophotometer(Eppendorf AG, Eppendorf, Germany)를 이용한 흡광도(optimal density)를 600nm에서 측정하였다.
<1-4> 생물계면활성제 분리
종 배양액을 생물계면활성제 생산배지에 1.0%(v/v) 접종하여 35℃에서 4일간 진탕 배양하였다. 배양액을 원심분리(4℃, 10,000 rpm, 20분)하여 균체를 제거한 후 상등액을 여과(0.45, Minisart, Sartorius Stedium Biotech GmbH, Goettingen, Germany)하여 생물계면활성제로 사용하였다.
<1-5> 표면장력 측정
미생물이 생물계면활성제를 생산하면 표면장력은 떨어진다. 이 사실을 이용해 표면장력 값으로 미생물이 생산하는 생물계면활성제의 표면장력 활성을 확인하였다. 표면장력은 Surface Tension Analyzer DST-60(Surface Electro Optics Co., Suwon, Korea)을 사용, Ring 방법으로 25℃에서 3회 반복하여 측정하고, 그 평균값을 계산하였다.
<1-6> 생물계면활성제 생산을 위한 최적 탄소원 조사
생물계면활성제 생산을 위한 탄소원의 효과를 조사하기 위해 A-배지에 각종 탄소원(총 28종)으로 당류(sugars) 또는 탄수화물(carbohydrates)인 arabinose, carboxymethyl cellulose(CMC), dextrose, fructose, galactose, glucose, glycerol, lactose, maltose, mannitol, mannose, raffinose, soluble starch, sucrose, trehalose, xylose와 hydrocarbon류인 pentane(C5), hexane(C6), heptane(C7), octane(C8), nonane(C9), decane(C10), tetradecane(C14), hexadecane(C16), crude oil(produced in Kuwait), polyaromatic hydrocarbons(PAH)류인 benzene(C6H6), toluene(C7H8), paraffin(CnH2n +2)을 각 1.0%(w/v 또는 v/v)씩 첨가하여 35℃, 200 rpm으로 96시간 동안 배양하여 균주의 생장과 표면장력을 측정하였다. 또한 최적 탄소원의 농도를 각 0.5 1.0, 1.5, 2.0%(w/v)로 변화시키면서 35℃, 200 rpm으로 96시간 동안 배양하여 균주의 생장과 표면장력을 측정하였다. 그리고 결정된 최적 질소원에 대한 최적 탄소원을 조사하기 위하여 0.5%(w/v) tryptone이 첨가된 A-배지에 위의 각종 탄소원을 각 0.5%(w/v 또는 v/v)씩 첨가하여 35℃, 200 rpm으로 96시간 동안 배양하여 균주의 생장과 표면장력을 측정하였다. 표면장력을 측정한 값은 각 탄소원에 따라 초기 표면장력 값이 다르므로 초기 표면장력 값과 최종 표면장력의 값의 차이 즉, 표면장력 감소율을 계산하여 표기하였다.
그 결과, 하기 표 1에서 볼 수 있는 바와 같이 균주 생장은 탄화수소(hydrocarbon)류보다 당이나 탄수화물을 첨가한 배지에서 높게 나타났다. 그리고 glycerol, mannose, tetradecane, 원유(crude oil)를 탄소원으로 첨가하였을 때 표면장력 감소율이 높았으며, 그 중에서도 glycerol은 표면장력 감소율이 43.3%로 가장 높아 생물계면활성제 생산을 위한 최적 탄소원으로 결정하였다. 특히, tetradecane의 표면장력 감소율은 40.3%로 탄화수소류 중에서는 가장 높은 표면장력 감소율을 나타내었으며, 원유는 39.6%의 표면장력 감소율을 보였다. 반면에 arabinose, soluble starch, pentane, hexane, octane은 표면장력 감소율이 대조구(control)보다 낮게 조사되었다.
Figure pat00001

한편, 생물계면활성제 생산을 위한 최적 탄소원으로 결정된 glycerol의 최적 농도를 조사하였다. 그 결과 하기 표 2와 같이, glycerol의 농도가 1.0%(v/v)일 때 최고의 균주 생장을 보였다. 그리고 0.5%(v/v) glycerol을 첨가하였을 때 표면장력 감소율은 45.2%로 가장 높게 나타났다.
Figure pat00002
<1-7> 생물계면활성제 생산을 위한 최적 질소원 조사
생물계면활성제 생산을 위한 질소원의 영향을 조사하기 위해 A-배지에 각종 유기 질소원(beef extract, casein, malt extract, peptone, skim milk, soytone, tryptone, yeast extract)과 무기 질소원 [(NH4)H2PO4, NH4Cl, NH4NO3, (NH4)O2SO4, KNO3, NaNO2, NaNO3, CH3COONH4]을 각 0.5%(w/v)씩 첨가하여 35℃, 200 rpm으로 96시간 동안 배양하여 균주의 생장과 표면장력을 측정하였다. 또한 최적 질소원의 농도를 각 0.3, 0.5 1.0, 1.5%(w/v)로 변화시키면서 35℃, 200 rpm으로 96 시간 동안 배양하여 균주의 생장과 표면장력을 측정하였다. 그리고 결정된 최적 탄소원에 대한 최적 질소원을 조사하기 위하여 0.5%(v/v) glycerol이 첨가된 A-배지에 위의 각종 질소원을 각 0.5%(w/v) 첨가하여 35℃, 200 rpm으로 96시간 동안 배양하여 균주의 생장과 표면장력을 측정하였다. 표면장력을 측정한 값은 각 질소원에 따라 초기 표면장력 값이 다르므로 초기 표면장력 값과 최종 표면장력의 값의 차이 즉, 표면장력 감소율을 계산하여 표기하였다.
그 결과, 하기 표 3에서 보는 바와 같이 균주 생장은 peptone에서 OD600 값이 2.853으로 가장 높았으며, skim milk(OD600=2.772), beef extract(OD600=2.432) 순으로 나타났다. 무기 질소원에서는 유기 질소원에서보다 상대적으로 낮은 생장을 보였다. 질소원으로 tryptone을 사용한 경우 표면장력 감소율은 52.0%로 가장 높았으며, yeast extract(46.1%), soytone(45.9%), peptone(43.9%) 순으로 나타났다. 생물계면활성제 생산에는 무기 질소원 보다 유기 질소원이 더 적합한 것으로 조사되었으며, 그 중에서 tryptone을 최적 질소원으로 결정하였다.
Figure pat00003

또한, 하기 표 4와 같이, 최적 질소원으로 결정된 tryptone의 농도를 0.3, 0.5, 1.0, 1.5%(w/v)로 변화시키면서 배지에 첨가하여 균주 생장과 표면장력을 측정하였다. 균주의 생장은 최적 질소원인 tryptone의 농도가 높을수록 높게 나타났으며, 표면장력 감소율은 0.5%(w/v)의 tryptone에서 가장 높았다.
Figure pat00004

결정된 최적 탄소원 0.5%(v/v) glycerol에 대한 최적 질소원을 조사하였다. 그 결과, 하기 표 5에서와 같이 균주 생장은 tryptone에서 가장 높게 나타났다. 그리고 유기 질소원에서의 생장이 무기 질소원에서보다 높게 나타났다. 한편, 표면장력 감소율은 대조구보다 모두 낮은 것으로 확인되었다. 특히, 최적 질소원인 0.5%(w/v) tryptone을 첨가한 배지에서는 표면장력 감소율이 2.2%로 가장 낮게 나타났다. 따라서 탄소원인 0.5%(v/v) glycerol에 각종 질소원을 첨가한 배지는 생물계면활성제 생산에 적합하지 않은 것으로 나타났다.
Figure pat00005

결정된 최적 질소원 0.5%(w/v) tryptone에 대한 최적 탄소원을 조사한 결과는 하기 표 6에서 보는 바와 같이, 균주 생장은 원유(OD600=6.728)와 soluble starch(OD600=5.290)에서 높게 나타났다. 표면장력 감소율은 대조구보다 모두 낮은 것으로 확인되었다. 따라서 질소원인 0.5%(w/v) tryptone에 각종 탄소원을 첨가한 배지는 생물계면활성제 생산에 적합하지 않은 것으로 나타났다.
Figure pat00006

<1-8> 생물계면활성제 생산을 위한 최적 무기염류 조사
생물계면활성제 생산을 위한 무기염류의 영향을 조사하기 위해 생물계면활성제 생산에 가장 큰 영향을 미치는 최적 질소원인 0.5%(w/v) tryptone이 첨가된 A-배지에 각종 무기염류 총 15종(CaCl2, CaCO3, CoCl2, CuSO4, K2HPO4, KCl, KH2PO4, MgSO4, MnSO4, NaCl, KNO3, Na2HPO4, FeSO4, H3BO3, Na2MoO4)을 각 0.1%(w/v) 농도가 되도록 첨가하여 35℃, 200 rpm으로 96시간 동안 배양하여 균주 생장과 표면장력을 측정하였다. 표면장력을 측정한 값은 각 무기염류에 따라 초기 표면장력 값이 다르므로 초기 표면장력 값과 최종 표면장력의 값의 차이 즉, 표면장력 감소율을 계산하여 표기하였다.
그 결과, 하기 표 7에서 볼 수 있듯이, B. pumilus IJ-1은 각종 무기염류가 첨가된 배지에서 낮은 생장을 보였다. 또한 각종 무기염류가 첨가된 배지에서는 표면장력 감소율이 대조구보다 낮게 나타나 무기염류가 첨가된 배지는 생물계면활성제 생산에 부적합한 것으로 나타났다. 따라서 B. pumilus IJ-1의 생물계면활성제 생산에 가장 적합한 배지 조성은 0.5%(w/v) tryptone을 함유한 A-배지로 결정하였다.
Figure pat00007

<1-9> 생물계면활성제 생산을 위한 NaCl 농도의 영향 조사
다양한 NaCl 농도에 따른 생물계면활성제 생산을 조사하기 위하여 0.5%(w/v) tryptone이 첨가된 A-배지에 NaCl의 농도가 각각 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10%(w/v)가 되도록 준비하였다. 종 배양액을 다양한 NaCl 농도의 배지에 각각 1.0%(v/v)로 접종하여 35℃, 200 rpm으로 진탕 배양하면서 12시간 간격으로 균주의 생장과 생물계면활성제의 표면장력을 측정하였다.
그 결과, 본 균주는 0-2%(w/v) NaCl 농도에서 배양하였을 때 가장 잘 생장하여, 배양 48시간에 최고의 생육도를 나타내었다. 배지 내 NaCl 농도가 높아질수록 균주 생장이 둔화되어 10%(w/v) NaCl에서는 최저로 확인되었다(도 1 참조). 배지에 첨가된 NaCl 농도에 따른 균주의 생장과 생물계면활성제 생산은 거의 일치함을 확인하였다. 또한 NaCl 농도는 B. pumilus IJ-1의 생물계면활성제 생산에 영향을 미치는 것으로 조사되었다. 0-1%(w/v) NaCl을 첨가한 배양액의 표면장력 값은 배양 72시간에 32.3-32.7 dyne/cm였다. 그리고 2-3%(w/v)의 NaCl 농도에서는 최대 감소 표면장력 값 33.6-34.3 dyne/cm을 유지하였고, 4-5%(w/v) NaCl 농도에서는 34.9-35.5 dyne/cm을 나타내었다(도 2 참조).
<1-10> 생물계면활성제 생산을 위한 pH의 영향 조사
배지의 다양한 초기 pH에 따른 생물계면활성제 생산을 조사하기 위하여 0.5%(w/v) tryptone이 첨가된 배지에 1.0 N HCl과 1.0 N NaOH를 각각 첨가하여 pH 3에서 pH 10까지 각각 pH 1.0 간격으로 조정하였다. 종 배양액을 다양한 pH 범위의 배지에 각 1.0%(v/v)로 접종하여 35℃, 200 rpm으로 진탕배양하면서 12시간 간격으로 균주의 생장과 생물계면활성제의 표면장력을 측정하였다.
현장에 적용되는 미생물은 다양한 pH 환경을 접하게 된다. B. pumilus IJ-1은 pH 5-10의 배지에서 생장하였으며, pH 9인 배지에서 가장 높은 생육도를 나타내었다. 반면에 초기 pH 3-4의 배지에서는 거의 생장하지 못하였다(도 3 참조). 배지의 초기 pH에 따른 표면장력을 측정한 결과, B. pumilus IJ-1은 pH 5부터 10까지 넓은 pH 범위에서 높은 표면장력 활성을 나타내었다. 특히, pH 9에서는 배양 72시간에 30.5 dyne/cm로 가장 우수한 표면장력 활성을 확인할 수 있었다. 이와는 달리, pH 3과 4에서 배양한 경우 배양 시간이 경과할수록 표면장력 값이 감소하지 않아 산성 조건은 생물계면활성제 생산에 적합하지 못하다고 판단되었다(도 4 참조).
<1-11> 생물계면활성제 생산을 위한 온도의 영향 조사
다양한 배양 온도에 따른 생물계면활성제 생산을 조사하기 위하여 B. pumilus IJ-1 종 배양액을 0.5%(w/v) tryptone이 첨가된 배지에 1.0%(v/v) 접종하여 각각 15-50℃까지 5℃간격으로 96 시간 동안 200 rpm으로 진탕배양하면서 12시간 마다 균주의 생장과 생물계면활성제의 표면장력을 측정하였다.
미생물의 유류 분해 활성은 적정 온도 이하나 이상의 온도에서는 감소하기 때문에 생분해 효율이 온도 변화에 많은 영향을 받는 것으로 알려져 있다. B. pumilus IJ-1은 비교적 넓은 범위의 온도(20-45℃)에서 생장하였으며, 그 중 35℃에서 가장 잘 생장하였다. 그리고 20, 25, 30℃에서는 유사한 생장 패턴을 나타내었으며, 40℃와 45℃에서는 상대적으로 낮은 생장을 보였다. 반면에 15와 50℃에서는 거의 생장하지 않는 것으로 확인되었다(도 5 참조). 배양 온도에 따른 표면장력을 시간대별로 조사한 결과, 균주 생장이 좋은 20-35℃에서 표면장력 활성은 높게 나타났다. 특히, 20℃에서의 표면장력은 배양 72시간에 28.4 dyne/cm로 측정되어 가장 우수한 표면활성을 나타내었다. 또한, 25와 30, 35℃에서의 최저 표면장력 값은 29.4 dyne/cm(72 h), 32.1 dyne/cm(60 h)와 35.5 dyne/cm(72 h)로 각각 측정되었다. 반면에 15와 50℃는 생물계면활성제 생산에 적합하지 않은 온도로 확인되었다(도 6 참조).
<실시예 2>
유류분해능을 갖는 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생물계면활성제 생산을 위한 배양 조건의 최적화를 위하여 반응표면분석법을 이용한 확인
본 발명자들은 상기 실시예 1의 OFAT(One Factor at a Time)법을 이용하여 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생물계면활성제 생산을 위한 배양 조건의 최적화를 확인하였다.
그러나, 상기 방법은 요인변수들(탄소원, 질소원, 무기염, 배양온도, 배지의 초기 pH 및 NaCl 농도) 중 한 가지를 지정하고 나머지 요인 변수들을 일정하게 변화시켜 하나의 요인에 따른 조건을 확립하는 방법에 관한 것이어서, 본 발명자들은 여러 개의 독립변수가 복합적인 작용을 함으로써 종속변수에 영향을 주는 경우 실험 횟수를 최소화하면서 반응의 변화를 폭넓게 평가할 수 있는 반응표면분석법(response surface methodology, RSM)을 이용하여 보다 더 확실하고 정확하게 바실러스 퓨밀러스 IJ-1의 생물계면활성제 생산에 적합한 최적 배양 조건을 확인하고자 하였다.
<2-1> 사용균주 및 배지
본 발명에서는 생물 계면활성제 생산 균주로 Bacillus pumilus IJ-1을 사용하였다. B. pumilus IJ-1은 Luria-Bertani(LB) [1.0%(w/v) tryptone(Difco, USA), 0.5%(w/v) yeast extract(Bioshop, Canada), 1.0%(w/v) NaCl(Bioshop), and 1.5% agar(w/w)(Difco), pH 7.0] 배지에서 배양하였다. 생물계면활성제 생산을 위한 배지로는 무기염류 배지인 A-배지 [0.3%(w/v) KNO3, 0.22%(w/v) Na2HPO4, 0.014%(w/v) KH2PO4, 0.001%(w/v) NaCl, 0.06%(w/v) MgSO4, 0.004%(w/v) CaCl2, 0.002%(w/v) FeSO4, 및 0.1 mL의 trace element solution(g/L)(2.32 g ZnSO4H2O, 1.78 g MnSO4H2O, 0.56 g H3BO3, 1 g CuSO4H2O, 0.39 g Na2MoO4H2O, 0.42 g CoCl2H2O 및 1 g EDTA 포함)]를 사용하였다.
그리고, 생물계면활성제 생산을 위한 본 발명의 배지로는 다양한 농도의 트립톤과 NaCl를 첨가하여 사용하였다.
<2-2> 배양조건
생물계면활성제 생산을 위해 B. pumilus IJ-1을 5 mL의 A-배지 (pH 9.0)에 접종하여 균주 생장의 최적 온도인 35℃에서 200 rpm으로 6 ~ 14시간동안 종 배양 하였다. 생장된 균주는 각종 농도의 요인 변수들(트립톤과 NaCl)이 포함된 배지에 1.0% (v/v) 되게 접종하고, 다양한 온도(20-30℃범위, 5℃간격)에서 200 rpm으로 72시간 동안 진탕 배양하였다.
<2-3> 생물계면활성제 분리
생물계면활성제는 Ghojavand 등 (2008)의 방법을 변형하여 분리하였다. 진탕 배양한 균주의 배양액을 4℃의 온도에서 10,000rpm의 속도로 20분간 원심분리하여 균체를 제거한 상등액에 6.0 M HCl을 서서히 가하면서 pH가 2.0이 되게 조정하여 4oC에 하룻밤 방치하면서 생물계면활성제를 침전시켰다. 이를 원심분리하여 침전물을 회수하고, 알칼리성 수용액 (0.1 N NaOH)에 최종 pH 8.0이 되게 용해하여 동결건조 시켰다. 건조된 물질을 10 mL의 methanol로 3회 추출하여 농축한 것을 생물계면활성제로 사용하였다.
<2-4> 표면장력 측정
표면장력은 성격이 다른 두 상이 서로 인접하고 있을 때 액체의 자유표면에서 표면을 작게 하려고 작용하는 장력이며, 미생물이 생물계면활성제를 생산하면 표면장력은 떨어진다. 이 사실을 이용해 표면장력 값으로 미생물이 생산하는 생물계면활성제의 표면장력 활성을 확인하였다(Lang, 2002). 표면장력은 Surface Tension Analyzer DST-60 (Surface Electro Optics Co., Suwon, Korea)을 사용, Ring 방법으로 25oC에서 3회 반복하여 측정하고, 그 평균값을 계산하였다 (Pagilla 등, 2002).
<2-5> 3 3 요인실험계획
본 발명자들은 실시예 1의 결과로 NaCl과 배양 온도, 트립톤이 B. pumilus IJ-1의 생물계면활성제 생산에 가장 큰 영향을 미치는 인자임을 알 수 있었다.
모델의 유효성을 검증하기 위해, 변수의 범위는 실시예 1의 결과에 준하여 선택하였으며, 33요인실험계획법을 이용하여 실험을 계획하였다. 독립변수는 NaCl 농도 (0, 0.5, 1%, w/v)와 배양 온도 (20, 25, 30oC),트립톤 농도(0, 0.5, 1%, w/v)를 3개의 요인으로 설정하였으며, 각 요인들의 수준을 -1, 0, 1의 3단계로 부호화하였다(표 8 참조).
Figure pat00008

회귀식을 만들기 위해 각 인자들은 다음 식에 따라 코드화하였다.
Figure pat00009

상기에서 i-번째 변수에 대해서 Xi는 표준화 실험점, X i는 실제 실험점, xi 0는 실험점의 중심, 그리고 △xi는 범위이다. X i의 범위는 1≤X i≤1가 된다.
배양 조건의 작성은 33요인실험계획법으로 실험을 설계하였으며, 세 가지 요인을 조합하여 총 30 가지 배양 조건을 설정하여 3회 이상 반복 실험을 실시하여 각 배양조건에 따른 표면장력 감소율(%)을 측정한 결과를 표 9에 나타내었다.
Run
order 		Factor 1:
NaCl
(w/v) 		Factor 2:
온도
( o C ) 		Factor 3:
트립톤
(w/v) 		Response
Reduction ratio of surface tension
Experimental (%) Predicted (%)
1 0.0 30 0.0 0.00 1.2682
1 0.0 30 0.0 0.41 1.2682
1 0.0 30 0.0 3.35 1.2682
2 1.0 25 0.5 47.45 48.8031
2 1.0 25 0.5 49.83 48.8031
2 1.0 25 0.5 50.20 48.8031
3 0.5 30 0.0 2.42 1.8815
3 0.5 30 0.0 4.06 1.8815
3 0.5 30 0.0 4.58 1.8815
4 1.0 20 0.0 1.03 3.5476
4 1.0 20 0.0 1.31 3.5476
4 1.0 20 0.0 2.39 3.5476
4 1.0 20 0.0 3.75 3.5476
5 1.0 25 1.0 47.70 49.1804
5 1.0 25 1.0 48.20 49.1804
5 1.0 25 1.0 49.24 49.1804
6 0.5 30 0.5 42.11 44.6031
6 0.5 30 0.5 43.02 44.6031
6 0.5 30 0.5 43.31 44.6031
7 0.0 25 0.5 46.60 48.5098
7 0.0 25 0.5 46.70 48.5098
7 0.0 25 0.5 47.98 48.5098
8 1.0 30 1.0 40.47 40.9706
8 1.0 30 1.0 42.07 40.9706
8 1.0 30 1.0 43.58 40.9706
9 0.5 20 0.5 49.68 50.4565
9 0.5 20 0.5 52.47 50.4565
9 0.5 20 0.5 52.85 50.4565
10 0.5 20 0.0 2.16 3.0429
10 0.5 20 0.0 2.88 3.0429
10 0.5 20 0.0 3.01 3.0429
11 0.0 25 0.0 1.52 3.0298
11 0.0 25 0.0 5.25 3.0298
11 0.0 25 0.0 5.46 3.0298
12 1.0 30 0.0 1.15 0.6303
12 1.0 30 0.0 2.56 0.6303
12 1.0 30 0.0 4.07 0.6303
13 0.0 20 0.5 46.02 48.4995
13 0.0 20 0.5 50.48 48.4995
13 0.0 20 0.5 50.84 48.4995
14 0.0 30 0.5 41.59 44.4021
14 0.0 30 0.5 41.68 44.4021
14 0.0 30 0.5 44.42 44.4021
15 0.5 25 1.0 49.37 50.3785
15 0.5 25 1.0 50.80 50.3785
15 0.5 25 1.0 50.83 50.3785
16 1.0 25 0.0 2.78 4.1479
16 1.0 25 0.0 4.31 4.1479
16 1.0 25 0.0 4.69 4.1479
17 0.0 20 1.0 48.97 52.0477
17 0.0 20 1.0 51.14 52.0477
17 0.0 20 1.0 51.54 52.0477
17 0.0 20 1.0 52.65 52.0477
18 0.5 25 0.5 50.00 49.5888
18 0.5 25 0.5 50.77 49.5888
18 0.5 25 0.5 51.45 49.5888
19 1.0 20 1.0 51.92 53.2721
19 1.0 20 1.0 52.35 53.2721
19 1.0 20 1.0 52.87 53.2721
19 1.0 20 1.0 53.79 53.2721
20 0.5 25 0.5 50.20 49.5888
20 0.5 25 0.5 51.43 49.5888
20 0.5 25 0.5 51.51 49.5888
21 0.0 30 1.0 43.52 43.2582
21 0.0 30 1.0 44.98 43.2582
21 0.0 30 1.0 45.91 43.2582
22 0.0 25 1.0 50.36 49.7119
22 0.0 25 1.0 50.53 49.7119
22 0.0 25 1.0 51.03 49.7119
23 1.0 20 0.5 53.22 50.5488
23 1.0 20 0.5 53.50 50.5488
23 1.0 20 0.5 53.88 50.5488
24 0.5 25 0.0 2.00 4.5212
24 0.5 25 0.0 2.67 4.5212
24 0.5 25 0.0 4.26 4.5212
25 0.5 20 1.0 52.37 53.5922
25 0.5 20 1.0 52.42 53.5922
25 0.5 20 1.0 53.10 53.5922
26 0.5 25 0.0 2.17 4.5212
26 0.5 25 0.0 3.60 4.5212
26 0.5 25 0.0 4.18 4.5212
27 1.0 30 0.5 39.01 42.9394
27 1.0 30 0.5 40.34 42.9394
27 1.0 30 0.5 41.28 42.9394
28 0.5 30 1.0 40.06 43.0467
28 0.5 30 1.0 43.23 43.0467
28 0.5 30 1.0 45.82 43.0467
29 0.0 20 0.0 0.78 0.6735
29 0.0 20 0.0 1.11 0.6735
29 0.0 20 0.0 1.43 0.6735
30 0.5 25 1.0 49.25 50.3785
30 0.5 25 1.0 51.36 50.3785
30 0.5 25 1.0 51.40 50.3785
반응 항목으로 표면장력 감소율(%)을 측정항목으로 설정하였다. 표면장력을 측정한 값은 각 배양 조건에 따라 초기 표면장력 값이 다르므로 초기 표면장력 값과 최종 표면장력의 값의 차이 즉, 표면장력 감소율을 계산하였다. 표면장력 감소율을 구하는 식은 아래와 같다.
Figure pat00010

<2-6> 반응표면분석법을 이용한 배양 조건의 최적화
B. pumilus IJ-1을 이용한 생물계면활성제 생산의 최적 배양 조건을 설정하기 위하여 반응표면분석법을 적용하였다. 각각의 독립변수와 실험결과인 반응변수와의 관계를 2차 다항 회귀식으로 구하였고, 1차 선형 효과, 2차 곡선 효과 및 인자간의 교호작용을 살펴보았으며, 독립변수에 대한 반응변수의 반응표면 상태를 3차원 그래프와 등고선 분석을 통하여 최적화를 수행하였다.
이 때 독립변수 X i와 X j에 대한 반응변수 Y i (표면장력 감소율, %)는 다음과 같은 2차 회귀식으로 나타내었으며, β 0는 상수이고 β i, β ii,β ij는 회귀계수이다.
Figure pat00011
상기에서 Yi는 반응변수의 예측값, 첨자 i와 j는 1에서 k 사이의 값, β0는 상수, βi들은 선형회귀계수, βii들은 이차회귀계수, βij들은 교호작용의 효과, 그리고 Xi와 Xj는 표준화 실험점이다.
모델식의 예측을 위한 회귀분석은 SAS(Statistical Analysis System) 9.2 software(SAS Institute, Cray, NC, USA)를 이용하였고, 모델의 적합성 여부는 ANOVA test를 이용하여 검증하였다. 그리고 독립변수에 대한 반응변수의 반응표면상태를 3차원 그래프와 등고선분석을 실시하여 분석하였다.
분산분석표(Analysis of variance, ANOVA) 효과 리스트와 각 변수들의 통계 값을 표 10에 나타내었다. 분산분석결과 결정계수 (R2)는 0.9938로 1에 매우 가까운 값을 나타내어 반응모형이 신뢰할 수 있음을 나타내었으며, 전체적인 실험 모델의 유의성을 확인해 본 결과 유의확률(probability value, P value) 값이 0.0001보다 작으므로 매우 유의성이 있는 것으로 인정되었으며 가정된 모형반응이 자료에 적합하다고 할 수 있다.
Figure pat00012

t-statistic에 근거하여 반응변수 Y의 일차항 (X1,X2,X3), 이차항 (X1 2,X2 2,X3 2), 교호작용항(X1X2,X1X3,X2X3)의 계수와 유의성을 나타낸 결과(표 11 참조), 교호작용항 중 X1X3를 제외하고는 모두 유의한 것으로 나타났다 (<0.05).
Figure pat00013

배양 조건 최적화에 세 가지 요인변수인 NaCl 농도 (%, w/v), 배양 온도 (oC), 트립톤 농도(%, w/v)가 표면장력 감소율(%)에 미치는 영향을 관계식으로 구하기 위하여 반응표면분석을 실시한 결과 도출된 이차방정식은 다음과 같다.
Figure pat00014
또한, 변환된 독립변수(coded factors)를 사용하여 도출된 식은 다음과 같다.
Figure pat00015

유의확률(P-value) 값이 가지는 의미는 일반적으로 0.05보다 작으면 '통계적으로 유의하다(significant)'라고 하며, 이 값이 0.01보다 작으면, '통계적으로 매우 유의하다(highly significant)'라고 말한다. 여기서 ‘유의하다’란 용어는 가정한 모형이 데이터 해석에 의미가 있다는 뜻이다.
B. pumilus IJ-1의 생물계면활성제 생산에 가장 중요한 영향을 미치는 요인은 트립톤(p-value<0.0001), 배양 온도 (p-value<0.0001), NaCl (p-value=0.0036) 순으로 나타났다(표 12 참조).
Figure pat00016

표면장력 감소율에 대한 실험 plot 대 예측된 plot에서는 실제 값들이 직선 근처에 분포되어 있었으며(도 7 참조), 이는 실제 값이 예측 값에 매우 가깝다는 것을 의미한다(R2=0.9938).
따라서 상기 <식 4>는 상술한 실험 조건 하에서 생물계면활성제 생산 효율을 예측하기에 적합한 모델임을 알 수 있다.
또한, 본 발명자들은 독립변수에 대한 반응변수의 반응표면상태를 도 2에 3차원 그래프와 등고선 분석으로 나타내었으며, 0.5% (w/v)의 트립톤 농도에서 생물계면활성제 생산에 대한 NaCl농도와 배양 온도의 상관관계를 반응표면과 contour plot으로 살펴본 결과, 온도가 감소할수록 표면장력 감소율은 증가하는 경향을 나타내었으며, NaCl 농도는 온도에 비해 생물계면활성제 생산에 큰 영향을 보이지 않았다. NaCl농도가 높고 배양 온도가 낮은 곳에서 최고점을 나타내었다. 생물계면활성제 생산을 위한 최적의 NaCl농도는 0.73% (w/v), 배양 온도는 21.0℃임을 알 수 있었다(도 8A 참조).
배양 온도 20℃에서 생물계면활성제 생산에 대한 NaCl 농도와 트립톤 농도의 상관관계를 반응표면과 contour plot으로 나타낸 결과, 낮은 트립톤 농도 범위에서는 NaCl 농도에 따른 생물계면활성제 생산에 큰 차이가 없었으며 트립톤 농도가 높은 범위에서 NaCl 농도가 증가할수록 생물계면활성제 생산이 증가하는 경향을 나타내었다. NaCl 농도에 비해 트립톤 농도가 더 많은 영향을 미치는 것으로 나타났다. 생물계면활성제 생산을 위한 최적 NaCl농도는 0.71% (w/v), 트립톤 농도는 0.76% (w/v)임을 알 수 있었다(도 8B 참조).
0.5% (w/v)의 NaCl 농도에서 생물계면활성제 생산에 대한 배양 온도와 트립톤 농도의 상관관계를 반응표면과 contour plot으로 나타낸 결과, 트립톤의 농도가 낮은 범위에서는 배양 온도가 증가할수록 생물계면활성제 생산이 저하되었고, 트립톤의 농도가 높은 범위에서는 배양 온도에 큰 영향을 받지 않음을 알 수 있었다(도 8C 참조).
따라서, 트립톤(Tryptone)의 농도가 높고 배양 온도가 낮은 범위에서 생물계면활성제 생산이 가장 높게 나타났으며, 생물계면활성제 생산을 위한 최적의 배양 온도는 20℃, 트립톤 농도는 0.79% (w/v)임을 알 수 있었다.
이를 통해 생물계면활성제 생산은 NaCl 농도에는 큰 영향을 받지 않고, 배양 온도가 낮을수록 그리고 트립톤의 농도가 높을수록 생물계면활성제 생산이 높아지며, 그 중에서도 트립톤의 농도가 더 큰 영향을 주는 요인으로 나타났다.
나아가, 반응표면분석으로부터 구한 회귀식의 예측치들과 실험치들간의 비교를 표 13에 나타내었으며, 생물계면활성제 생산을 위한 최적 배양 조건에서 NaCl 농도는 0.745% (w/v), 배양 온도는 19.29℃, 트립톤의 농도는 0.787% (w/v)로 예측되어 확인을 위한 실험치 간에 다소의 차이가 있었으나 90% 이상의 정확도는 확보할 수 있어 생물계면활성제 생산의 예측에 유용하게 쓰일 수 있으리라 생각된다.
Figure pat00017

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

Claims (11)

  1. (A) 바실러스 퓨밀러스(B. pumilus) IJ-1 균주를 LB 액체 배지에 접종하여 종 배양(seed culture)하는 단계; 및
    (B) 상기 종 배양된 바실러스 퓨밀러스(B. pumilus) IJ-1 균주를 A-배지에 0.1 ~ 5.0%(v/v) 되게 접종하여 추가 배양하는 단계를 포함하는,
    바실러스 퓨밀러스(B. pumilus ) IJ-1 균주로부터 생물계면활성제를 생산하기 위한 IJ-1 균주 배양방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 (A) 단계는 pH 6.5~7.5의 액체 배지를 사용하여 33~37℃에서 150~250 rpm으로 14~18시간 동안 배양하고,
    상기 (B) 단계는 33~37℃에서 150~250 rpm으로 72~120시간 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 탄소원으로 카르복시메틸 셀루로오스( c arboxymethyl cellulose, CMC), 덱스트로오즈(dextrose), 프룩토오즈(fructose), 갈락토오즈(galactose), 글루코오즈(glucose), 글리세롤(glycerol), 락토오즈(lactose), 말토오즈(maltose), 만니톨(mannitol), 만노오즈(mannose), 라피노오즈(raffinose), 수크로오즈(sucrose), 트레할로오즈(trehalose), 자일로오즈(xylose), 노난(nonane), 데칸(decane), 테트라데칸(tetradecane), 헥사데칸(hexadecane), 원유(crude oil), 벤젠(benzene), 톨루엔(toluene) 및 파라핀(paraffin)으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 탄소원으로 글리세롤(glycerol)이 더 포함되고, 상기 글리세롤은 총 배지 조성물의 0.1~1.5%(v/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 유기 질소원을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 유기 질소원은 고기 추출물(beef extract), 카제인(casein), 맥아 추출물(malt extract), 펩톤(peptone), 스킴 밀크(skim milk), 소이톤(soytone), 트립톤(tryptone) 및 효모 추출물(yeast extract)로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 무기 질소원으로 KNO3를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  8. 제6항에 있어서,
    상기 유기 질소원은 트립톤(tryptone)이고, 상기 트립톤은 총 배지 조성물의 0.3~1.5%(w/v)로 포함되는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서는 상기 A-배지에 NaCl을 0~2%(w/v) 농도로 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  10. 제8항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서 A-배지의 pH는 5~10인 것을 특징으로 하는 배양방법.
  11. 제8항에 있어서,
    상기 (B) 단계에서 배양 온도는 15 ~ 40℃인 것을 특징으로 하는 배양방법.
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