KR100353693B1

KR100353693B1 - 키토산아제를 생성하는 오레오박테리움속 와이엘 균주를이용한 키토산 올리고당의 제조방법

Info

Publication number: KR100353693B1
Application number: KR1020000031639A
Authority: KR
Inventors: 이강만; 이민경; 이동미
Original assignee: 이강만
Priority date: 2000-06-09
Filing date: 2000-06-09
Publication date: 2002-09-27
Also published as: KR20010110914A

Abstract

본 발명은 게껍질 폐기물에서 분리한 신규의 오레오박테리움(Aureobacterium)속 YL 균주 및 상기 균주로부터 생성되는 키토산아제(chitosanase)를 이용한 키토산(chitosan) 올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

본 발명에서 게껍질 폐기물로부터 분리한 키토산아제 생성 균주인 오레오박테리움속 YL 균주를 YL배지에 종배양하고, YL배지에 0.3% 키토산이 첨가된 본배양배지에서 본배양하여 제조된 키토산아제는 단당류는 거의 생성하지 않으며 2량체 이상인 오리고당을 생성하는 특성을 나타내어 이를 이용하여 2량체 이상의 키토오리고당을 효율적으로 제조할 수 있는 효과가 있다.

Description

키토산아제를 생성하는 오레오박테리움속 와이엘 균주를 이용한 키토산 올리고당의 제조방법{Chitooligosaccharides production by using the chitosanase of Aureobacterium sp. YL}

본 발명은 게껍질 폐기물에서 분리한 오레오박테리움(Aureobacterium)속 YL 균주 및 상기 균주로부터 생성되는 키토산아제(chitosanase)를 이용한 키토산(chitosan) 올리고당의 제조방법에 관한 것이다.

키토산은 D-글루코사민이 베타-1,4 결합으로 연결된 다당류로서 일반적으로 키틴으로부터 탈아세틸화 반응에 의하여 제조된다. 이러한 키토산은 고분자 물질로서 일반적으로 폴리아민 물질로 양전하를 띠어 항세균, 항진균, 응집성, 보습성, 항암성, 면역증강성 등의 성질이 보고되고 있어, 다양한 산업적, 의약적 응용이 언급되고 있다(L.A. Hadwiger, B. Fristensky, R.C. Riggleman, 1984, Chitin, Chitosan and related Enzymes, pp. 291-302). 그러나, 고분자이기 때문에 점성이 높고, 중성이나 알카리성에 녹지 않는 물성을 가진다. 당이 2개 연결된 올리고당인 키토바이오스(chitobiose)는 비피더스 팩터(bifidus factor)로 알려지고 있어 유용 장내 미생물의 증식을 촉진하여 건강증진효과를 기대할 수 있다(L.M. Prescott, J.P. Harley, D.A. Klein, Microbiology, 1999, WCB-McGraw Hill, p.577).

키토산을 분해하여 수용성 키토산 올리고당을 제조하는 방법으로는 산분해법과 효소분해법이 알려져 있다. 산분해법은 염산을 이용하여 분해하는 방법으로 간단한 방법이지만 공정 폐기물의 처리가 문제가 될 뿐 아니라, 생성되는 올리당의 크기가 일정하지 못하고, 단당체가 주로 생성된다. 효소분해법은 효소의 반응특성에 따라 중합도가 조절된 특정 올리고당을 생산할 수 있는 이점이 있으며, 염산 같은 강산을 사용하지 않기 때문에 환경오염물질 배출의 문제가 없다. 따라서, 키토산을 특이적으로 분해하는 키토산 분해효소 개발이 요구되어 왔다.

키토산을 분해하는 효소인 키토산아제(chitosanase)를 생성하는 것으로 알려진 세균에는 Bacillus속 R-4(Tominaga, Y. 등, Biochemica et Biophysica Acta 410: 145-155(1975)), Bacillus속 7-M(일본공개특허공보 소61-280277), Bacilluscirculans LCC-1(일본공개특허공보 소63-94971), Bacillus pumilus BN-262(일본공개특허공보 소63-63382), Bacillus속 No. K-881(일본공개특허공보 평2-79972), Acinetobacter속 CHB101(Shimosaka, M. 등, Appl. Environ. Microbiol. 61: 438-442(1995)), Pseudomonas속 H-15(Yoshihara, K. 등, Biosci. Biotech. Biochem. 56: 972-973(1992)) 등이 알려져 있다. 이들 균주들은 키토산을 분해하여 키토산 올리고당을 생산할 수 있는 것으로 알려지고 있지만 반응시간이 길어지면 단당 형태인 D-글루코자민(D-glucosamine)을 주로 생성하는 문제가 있다.

본 발명은 상기와 같은 사실에 의거하여 안출한 것으로서, 본 발명자들은 고분자인 키토산으로부터 이당 이상의 키토산 올리고당을 생산하는데 이용할 수 있는 미생물 균주를 개발하고자 키토산 분해 활성 균주를 게껍질 폐기물로부터 선별하는 연구결과로서, 키토바이오스를 주생물로 생성하고 단당류인 글루코자민은 거의 생성하지 않는 키토산아제 생성 균주를 분리하여 본 발명을 완성하게 되었다. 따라서, 본 발명의 목적은 신규의 키토산 분해효소 생성 세균인 오레오박테리움(Aureobacterium) 속 YL 균주를 제공하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 균주가 생성하는 키토산아제를 이용하여 키토산 바이오스를 주로 하는 키토산 올리고당을 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

도 1은 오레오박테리움 속 YL 균주의 증식과 키토산아제 생성 곡선을 나타낸 그래프이다.

도 2는 오레오박테리움 속 YL 균주가 생성하는 키토산아제에 의한 키토산 올리고당 생성 형태를 나타내는 박층 크로마토그램이다.

도 3은 오레오박테리움 속 YL 균주가 생성하는 키토산아제에 의한 키토산 올리고당 생성형태를 나타내는 고속액체크로마토그래프이다. (그림(1): 1=1량체, 2=2량체, 3=3량체, 4=4량체, 5=5량체, 6=6량체 이고, 그림(2): 30분 반응액, 그림(3): 24시간 반응액, a=1량체, b=2량체, c=3량체, d=4량체, e=5량체의 올리고머)

이하, 본 발명을 보다 구체적으로 실시예를 들어 설명하면 다음과 같다.

균주의 채취 및 분리

한국 노량진 수산시장에서 수집한 게껍질 10g을 YL배지(배지조성: 0.05% MgSO₄, 0.1% NaCl, 0.05% K₂HPO₄, 10^-3% FeSO₄, 10^-4% ZnCl₂, 10^-3% CaCl₂, 5x10^-4% MnCl₂, 0.25% tryptone, 0.25% casitone, chitosan 0.3%, pH 7.0) 50ml에 첨가하여 7일간 30도에서 배양하고, 배양액 1ml을 YL-키토산 고체배지(배지조성: 0.05% MgSO₄, 0.1% NaCl, 0.05% K₂HPO₄, 10^-3% FeSO₄, 10^-4% ZnCl₂, 10^-3% CaCl₂, 5x10^-4% MnCl₂, 0.25% tryptone, 0.25% casitone, chitosan 0.3%, agar 1.5%, pH 7.0)에 도포하여 30도에서 배양하면서 투명대를 형성하는 균주를 분리하였다. 분리 균주의 미생물학적 특성은 하기 표 1과 같다.

분리 미생물의 미생물학적 특성

미 생 물 특 성	시 험 결 과
집락의 색깔	황색
균의 형태	간균
운동성	없음
내생포자생성능	없음
그람염색	양성
항산성염색	음성
산소요구성	호기성
2% NaCl에서 성장여부	성장
전분분해	양성
카제인분해성	양성
젤라틴분해성	음성
nitrate환원성	음성
voges-proskauer시험	음성
methyl-red 시험	양성
urease생성능	음성
oxidase생성능	음성
indole생성능	음성
catalase시험	양성
H₂S생성능	음성
포도당으로부터 산생성능	양성
acetate, succinate, lactate, propionate 이용성	양성
citrate이용성	음성
hippurate 이용성	음성
37℃에서 성장여부	양성

이러한 특성을 바탕으로 세균분류의 기준이 되는 버지스 매뉴얼(Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol 2, pp.1323-1325, 1986, Williams Wilkins, Baltimore)에 기술되어 있는 주지의 오레오박테리움 속과는 다른 신규의 오레오박테리움 속 세균으로 판단되어 오레오박테리움 속 YL 균주로 명명하고, 2000년 5월 1일에 국제기탁기관인 한국종균협회 부설 한국미생물 보존센터(KCCM)에 수탁번호_KFCC-11163 으로 기탁하였다.

균주의 배양

분리한 균주를 아래 종배양배지를 이용하여 30도에서 200rpm 진탕으로 30시간 배양하여 종배양액을 얻었다. 키토산아제 생산을 위한 본 배양에는 YL 배지에 키토산을 0.3% 농도가 되도록 첨가하고 종배양액을 5% 농도가 되도록 접종하여 30도에서 200rpm 진탕배양 조건에서 15시간 이상 배양한다(도 1 참조).

배지 조성

종배양배지로 YL 배지는 0.1% 황산암모늄, 0.05% MgSO₄, 0.1% NaCl, 0.05% K₂HPO₄, 10^-3% FeSO₄, 10^-4% ZnCl₂, 10^-3% CaCl₂, 5x10^-4% MnCl₂, 0.25% tryptone, 0.25% casitone을 포함하며, 산도는 7.0으로 조절한다.

본배양배지는 0.1% 황산암모늄, 0.05% MgSO₄, 0.1% NaCl, 0.05% K₂HPO₄, 10^-3% FeSO₄, 10^-4% ZnCl₂, 10^-3% CaCl₂, 5x10^-4% MnCl₂, 0.25% tryptone, 0.25% casitone, 0.3% chitosan을 포함하며, 산도는 7.0으로 조절한다.

실시예 1. 키토산아제의 제조

본 배양액 1000mL을 원심분리하여 상등액을 얻고, 황산암모늄을 80% 포화농도가 되도록 첨가하여 12000xg에서 원심분리로 침전물을 얻었다. 얻어진 침전물(3-6g)을 0.1M sodium acetate(pH5.0)완충액 5-20mL에 녹여 효소액으로 사용한다. 배양액 1000 mL으로부터 약 20-40Unit의 효소를 얻는다. 효소활성 1 Unit은 키토산으로부터 1분간 1 μmole의 D-글루코자민을 유리하는 효소활성에 해당한다.

실시예 2. 키토산아제에 의한 키토산 올리고당의 제조

키토산이 5mg/ml 농도로 포함되어 있는 0.1 M sodium acetate 완충액(pH 5.0) 200㎕에 효소액 800㎕를 첨가하여 30도 수욕에서 진탕하면서 30분 내지 24시간 반응시킨다. 반응액을 실리카젤 박층판에 점적하고 1-propanol과 30%암모니아수가 2:1로 혼합된 용매에서 전개하여 ninhydrin 시액으로 발색하여 생성올리고당 형태를 분석한다. 도 2에서 보여 주는 바와 같이, 이당체인 키토바이오스가 주생성물이다. 단당인 D-글루코자민은 거의 검출되지 않는다.

반응액을 냉동건조하고, N-아세틸화하여 생성된 올리고당의 종류를 탄수화물 분석 컬럼(carbohydrate analysis column, Waters Co.)이 장착된 HPLC로 72% 아세토니트릴(acetonitrile): 28% H₂O 용매로 분리하여 반응생성물을 분자량의 크기에 따라 분획한다. 도 3에서 보는 바와 같이 고속액체크로마토그래피로 확인할 때도 단당인 D-글루코자민은 반응시간의 변화에 관계없이 극히 소량 존재하며, 이량체를 주로 하여 2-5량체의 올리고당이 존재함을 볼 수 있다.

이상 설명하고 실시예를 통하여 알 수 있는 바와 같이, 본 발명에서 게껍질 폐기물로부터 분리한 키토산아제 생성 세균인 오레오박테리움속 YL 균주를 YL배지에 종배양하고, YL배지에 0.3% 키토산이 첨가된 본배양배지에서 본배양하여 이로부터 제조된 키토산아제는 단당류는 거의 생성하지 않으며 이당류인 키토바이오스를 주로 생성하는 특성을 나타내어 이를 이용하여 이당류 이상을 포함하는 키토산 올리고당을 효율적으로 제조할 수 있는 효과가 있다.

Claims

키토산아제를 생산하는 신규의 오레오박테리움(Aureobacterium)속 YL 균주(KFCC-11163).
오레오박테리움(Aureobacterium)속 YL균주로부터 유래한 키토산아제를 이용한 키토산 올리고당의 제조방법.