JPH07114698B2 - 耐熱性β−チロシナ−ゼ及びその製法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、例えばチロシン（tyrosine）、Ｌ−ドーパ
（Ｌ−dopa）などの工業的合成、その他の用途に有用な
従来公知文献未記載の耐熱性β−チロシナーゼ（β−ty
rosinase）、その醗酵法による製法及びその製法に利用
する従来公知文献未記載の耐熱性β−チロシナーゼ生産
性微生物に関する。

更に詳しくは、本発明は、その耐熱性特性において従来
公知のβ−チロシナーゼと明瞭に区別される耐熱性β−
チロシナーゼ、特に、約80℃（pH＝8.0）に作用至適温
度を有し且つ約80℃（pH＝8.0、保持時間20分）までは
熱失活しない耐熱特性を有することを特徴とする新規な
耐熱性β−チロシナーゼに関する。

本発明はまた、この新規耐熱性β−チロシナーゼの醗酵
法による製法及びこの製法の実施に使用するのに適した
新規な耐熱性β−チロシナーゼ生産性微生物にも関し、
とくに、チロシン含有合成培地において単独では生育し
ないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.stra
in S）との共生により生育する従来完全に未知の耐熱性
β−チロシナーゼ生産性桿菌をチロシン含有培地で培養
し培養物から耐熱性β−チロシナーゼを採取することを
特徴とする耐熱性β−チロシナーゼの製法にも関する。

従来、β−チロシナーゼは、ピリドキサールリン酸（PL
P）の関与のもとに、Ｌ−チロシンからピルビン酸、フ
エノール、アンモニアを生成するα，β脱離反応を触媒
する反応の他に、たとえばフエノールとＬ−セリンから
Ｌ−チロシンを合成する反応、すなわち上記反応とは逆
反応のβ置換反応も触媒する酵素として知られており、
たとえばエシエリキア・インターメデイア（Escherichi
a intermedia）、エルウイニア・ヘルビコラ（Erwinia
herbicola）などの如き腸内細菌群を中心とする微生物
から見出されている公知酵素である。

このような従来公知のβ−チロシナーゼは、約40℃（pH
＝8.0）付近に作用至適温度を有し且つ約40℃（pH＝8.
0、保持時間20分）以上では実質的に熱失活する酵素特
性を有する酵素であるため、その利用に際し、反応温
度、熱安定性などの耐熱性の点で著るしい制約を受ける
という技術的難点があつた。

本発明者等の一部の発明者等は、天然培地及びトリプト
フアン含有合成培地のいずれにおいても単独では生育し
ないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.stra
in S）との共生により生育する従来完全に未知で且つ如
何なる公知文献にも未記載の特異な生育特性を有するト
リプトフアナーゼ生産性桿菌を土壌試料より分離採取す
ることに成功し、且つ該新規桿菌が約70℃（pH＝8.0）
に作用至適温度を有し且つ約65℃（pH＝8.0、保持時間4
0分）までは熱失活しない熱安定性を示す点で、約33〜3
5℃（pH＝8.0）付近に作用至適温度を有し且つ約40℃
（pH＝8.0、保持時間40分）以上では実質的に熱失活す
る酵素特性を有する公知トリプトフアナーゼとは全く別
異の新規酵素である耐熱性トリプトフアナーゼを産生す
ることを発見して、この耐熱性トリプトフアナーゼ、そ
の製法およびその生産菌に関して既に特願昭60−124546
号（昭和60年６月８日出願）に於て詳しく提案した。

本発明者等は更に研究を続けた結果、上記提案において
詳しく開示した耐熱性トリプトフアナーゼ生産性新桿菌
は、トリプトフアン含有培地に於て上記新規酵素である
耐熱性トリプトフアナーゼを産生する他に、チロシン含
有培地に於て、約80℃（pH＝8.0）に作用至適温度を有
し且つ約80℃（pH＝8.0、保持時間20分）までは熱失活
しない熱安定性を示す点で、前述した公知β−チロシナ
ーゼとは全く別異の新規酵素である本発明に称する耐熱
性β−チロシナーゼを産生することを発見した。

従つて、本発明において、チロシン含有合成培地におい
て単独では生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株
（Bacillus sp.strain S）との共生により生育する耐熱
性β−チロシナーゼ生産性桿菌と呼称する新桿菌の菌学
的性質は、上記先の提案においてトリプトフアン含有合
成培地において単独では生育しないが、バチルス・エス
ピー・Ｓ株との共生により生育する耐熱性トリプトフア
ナーゼ生産性桿菌と呼称した新桿菌のそれと実質的に同
一であるし、該先の提案において本発明者等の一部の発
明者等によつてバクテリウム・Ｔ株（Bacterium strain
T）と命名された桿菌は本発明において利用できる桿菌
である。

本発明者等の研究によれば、本発明において耐熱性β−
チロシナーゼと呼称する該新規チロシナーゼを生産する
新桿菌は、本発明者等の試みたかぎり、公知の如何なる
微生物用培地においても単独では生育しないが、上記バ
チルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain S）との
共存下に、例えば、リン酸塩でpH調節したチロシン含有
又はトリプトフアン含有合成液体培地において、弱い撹
拌条件下もしくは静置条件下で約58〜約63℃の温度で活
発に増殖生育し、酵素活性の強い混合培養物を与えるこ
とが発見された。

更に又、本発明者等の研究によれば、該バチルス・エス
ピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain S）は、上記先の提案
において、本発明者等の一部の発明者等によつてバチル
ス・エスピー・Ｓ株と命名された微生物と同じ微生物で
あつて、胞子を形成するバチルス（Bacillus）属に属
し、一般細菌用培地を用いて純粋培養可能な新菌株であ
り、 （ｉ）′インドール生成（−） （ii）′硝酸還元（−） の生理学的性質を示し、チロシン含有又はトリプトフア
ン含有合成培地において、単独でも、また前記耐熱性β
−チロシナーゼ生産性桿菌又は耐熱性トリプトフアナー
ゼ生産性桿菌との共生条件においても、チロシナーゼ生
産能又はトリプトフアナーゼ生産能を示さない新菌株で
あることがわかつた。

従つて、本発明の目的は新規な耐熱性β−チロシナーゼ
及びその製法を提供するにある。

本発明の上記目的及び更に多くの他の目的ならびに利点
は、以下の記載から一層明らかとなるであろう。

本発明の新規酵素の製造に利用できるチロシン含有合成
培地（又はトリプトフアン含有合成培地）において単独
では生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacill
us sp.strain S）との共生により生育して、菌体内に耐
熱性β−チロシナーゼ（又は耐熱性トリプトフアナー
ゼ）を生産蓄積する耐熱性桿菌は、温泉、堆肥などの高
温環境由来の土壌試料から分離採取された。

以下、その分離採取法について述べる。

リン酸塩でpH調節したチロシナーゼ誘導培地である後記
するTyr−PEP液体培地に、温泉、堆肥など高温環境由来
の土壌試料を入れ、Ｌ型試験管を用いて約60゜〜70℃で
振盪培養を行ない、４−アミノアンチピリン試薬による
フエノール検出によつてフエノールの生成が検出された
試料培養物をβ−チロシナーゼ生産菌として分離する。
斯くて、分離採取できる約60℃で生育する、本発明に於
て、耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌と呼称する桿菌
を、希釈法、更に、バシトラシン（Bacitracin）に対す
る耐性を利用して純化したβ−チロシナーゼ生産菌を得
ることができる。

得られた耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌を、常法に
従つて、寒天固体培養によるコロニー分離を試みたが、
試験したすべての種類の寒天固体培地においてコロニー
形成は認められなかつた。上記β−チロシナーゼ生産菌
の高濃度の懸濁液（１プレート当たり100〜200コ菌体）
を、メンブレン・フイルターをその表面上に貼着したTy
r−PEP寒天培地上に塗布し、約60℃で培養して、コロニ
ーを形成させる。形成されたコロニーについて、４−ア
ミノアンチピリン試薬によるフエノールの生成を検出
し、フエノール生産菌コロニーとフエノール非生産菌コ
ロニーとを分離することができる。

該フエノール生産菌コロニーは、後に詳しく述べるとお
り、細胞の大きさの異なる二種類の桿菌の混合状態のコ
ロニーとして得られ、フエノール非生産菌コロニーは該
二種類の桿菌の一方の桿菌からなるコロニーとして得る
ことができる。

上記のチロシン含有合成培地において単独でも混合状態
でも生育するが、それ自身単独ではβ−チロシナーゼ生
産能を示さない菌株（フエノール非生産菌）は、本発明
者等の一部の発明者等によつて、前記した先の提案にお
いてバチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain
S）と命名された微生物と実質的に同一の菌学的性質を
有しており、同じ微生物と同定された。又、上述のよう
にして、バチルス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態で
分離採取でき、本発明において、チロシン含有合成培地
において単独では生育しないが、上記バチルス・エスピ
ー・Ｓ株との共生により生育する耐熱性β−チロシナー
ゼ生産性桿菌と呼称するところの、チロシン含有培地に
おいて菌体内に耐熱性β−チロシナーゼを生産蓄積する
耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌は、本発明者等の一
部の発明者等によつて、前記した先の提案においてバク
テリウム・Ｔ株（Bacterium strain T）と命名された微
生物と実質的に同一の菌学的性質を有しており、同じ微
生物と同定された。

上述のようにして高温環境由来の土壌試料からバチルス
・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態で分離採取できる本
発明において耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌と呼称
する桿菌は、リン酸塩でpH調節したチロシン含有の下記
合成液体培地〔Tyr−PEP液体倍地〕で混合菌の状態で植
継培養を続けることができるし、また、Ｌ−乾燥菌体
（混合菌）として保存可能である。なお、下記合成液体
倍地において、Ｌ−チロシンをＬ−トリプトフアンに代
換した倍地が、Trp−PEP液体倍地である。

Tyr−PEP液体培地：− 培地組成 100ml中 Ｌ−チロシン 0.2 g ポリペプトン 0.5 g 酵母エキス 0.1 g K₂HPO₄ 0.3 g KH₂PO₄ 0.1 g MgSO₄・7H₂O 0.05g ピリドキサール５′リン酸 0.05g 培地pHは6.8〜7.0になる。

更に、上述のようにして高温環境由来の土壌試料からバ
チルス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態で分離採取で
き、混合菌の状態で植継培養及びＬ−乾燥保存可能な本
発明において耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌と呼称
するバクテリウム・Ｔ株は、たとえば、以下のようにし
て共生するバチルス・エスピー・Ｓ株と分離することが
可能である。

（ａ） バクテリウム・Ｔ株とバチルス・エスピー・Ｓ
株は、その細胞の大きさの相違を利用して分別遠心分離
の手法を応用して互いに分離可能である。

（ｂ） バクテリウム・Ｔ株とバチルス・エスピー・Ｓ
株は、そのリゾチーム感受性が相違し、バチルス・エス
ピー・Ｓ株の方がより感受性が高いので、その差を利用
して該Ｓ株を選択的に溶菌させることができ、それによ
つて混合菌から該Ｔ株を分離可能である。

しかしながら、本発明において耐熱性β−チロシナーゼ
生産性桿菌と呼称する桿菌は、本発明者等の試みたかぎ
りの如何なる微生物用天然及び合成培地においても、単
独では生育しないため、その菌学的性質に関しては、形
態上の性質及び生理学的性質中カタラーゼについての性
質以外は試験不可能である。従つて、以下に試験可能な
性質について示す。

バクテリウム・Ｔ株（Bacterium strain T） ａ）形態 細胞の形及び大きさ：−桿菌（太さ0.25〜0.35μｍ、
長さ1.5〜７μｍ）。通常、単独。

細胞の多形性の有無：−なし。

運動性の有無：−なし。

胞子の有無：−なし。

グラム染色性：−不定。

ｂ）次の各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：−生育せず。

肉汁寒天斜面培養：−生育せず。

肉汁液体培養：−生育せず。

肉汁ゼラチン穿刺培養：−生育せず。

リトマス・ミルク：−生育せず。

チロシン含有合成培地〔Tyr−PEP液体培地〕：− 単独では生育せず。バチルス・エスピー・Ｓ株（微工研
条寄第809号;FERM BP−809）との共生条件下に上記培
地で生育する。

尚、本発明において、チロシン含有合成培地において単
独では生育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株との共
生により生育して、菌体内に耐熱性β−チロシナーゼを
生産蓄積するというのは、上記Tyr−PEP液体培地におい
て単独では生育せず、バチルス・エスピー・Ｓ株との共
生条件下に該培地で生育して、菌体内に耐熱性β−チロ
シナーゼを生産蓄積することを意味するものと定義され
る。

ｃ）生理学的性質 硝酸塩の還元：−試験不能。但し、バチルス・エスピ
ー・Ｓ株との共生条件下においては（＋）。

脱窒反応、MRテスト、VPテスト：−いずれも試験
不能。

フエノールの生成：−試験不能。但ち、バチルス・エ
スピー・Ｓ株との共生条件下においては（＋）。

硫化水素の生成、デンプンの加水分解、クエン酸
の利用、無機窒素源の利用、色素の生成、ウレア
ーゼ、オキシダーゼ：−いずれも試験不能。

カタラーゼ：−（＋）。

生育の範囲（pH、温度など）、酸素に対する態度
（好気性、嫌気性の区別など）、Ｏ−Ｆテスト、糖
類からの酸及びガスの生成の有無：−いずれも試験不
能。

ｄ）その他 DNA中のグアニン・シトシン（GC）含量（Tm法）が約6
5mole％。

前記ｂ）のチロシン含有合成培地において、弱い撹
拌条件下もしくは静置条件下において、温度約58゜〜63
℃で、バチルス・エスピー・Ｓ株との共生条件下で生育
増殖する。

上記性質を持つ桿菌、すなわち、チロシン含有合成培地
において単独では生育しないが、バチルス・エスピー・
Ｓ株との共生により生育して、菌体内に耐熱性β−チロ
シナーゼを生産蓄積する耐熱性β−チロシナーゼ生産性
桿菌は、バージエズ・マニユアル・オブ・デタミナテブ
・バクテリオロジイ（Bergey′s Manual of Determinat
ive Bacterialogy,8 thd）第８版、その他如何なる公知
文献にも完全に未記載の桿菌であつて、本発明者等によ
つて、バクテリウム・Ｔ株（Bacterium strain T）と命
名された。本発明者等により初めて分離された該桿菌
は、バチルス・エスピー・Ｓ株との混合菌の状態で、工
業技術院微生物工業技術研究所に、微工研条寄第810号
（FERM BP−810）として寄託されている。

更に、本発明の耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌が、
それとの共生条件下でチロシン含有合成培地で生育する
バチルス・エスピー・Ｓ株は、胞子を形成するBacillus
属に属する新菌株であつて、一般細菌用培地を用いて純
粋培養が可能である。その菌学的性質を以下に記載す
る。

バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.strain S） ａ） 形態 細胞の形及び大きさ：−桿菌（太さ0.6〜0.9μｍ、長
さ2.5〜6.0μｍ）。通常、単独。

細胞の多形性の有無：−なし。

運動性の有無：（＋）。周鞭毛。

胞子の有無：−有り。だ円、1.1×2.0μｍ、細胞の一
端に内生。

グラム染色性：−陽性。

ｂ） 次の各培地における生育状態 1. 肉汁寒天培地 円滑、無色半透明、光沢あり。

2. 肉汁液体培地 表面発育、白色菌膜を形成。

ｃ） 生理学的性質 1. 硝酸塩の還元：−（＋）。

2. MRテスト：−（＋）。

3. VPテスト：−（−）。

4. インドールの生成：−（−）。

5. 0.02％NaN₃耐性：−（＋）。

6. カタラーゼ：−（＋）。

7. ５％食塩存在下での生育：−（−）。

8. 生育の範囲：−pH5.7での生育（＋）。生育温度66
℃（上限）、40℃（下限）。

9. 酸素に対する態度：−嫌気性生育（＋）。

10. デンプン発酵性：−（＋）。

11. アラビノース、キシロース発酵性：−（−）。

12. マンニトール発酵性：−（−）。

13. グルコース発酵性：−（＋）。ガス生成（−）。

上記ｃ）の8.に記載したように、65℃で生育するところ
から、バチルス・ステアロテルモフイルス（Bacillus s
tearothermophilus）に類似するが、上記9.嫌気性生育
（＋）、5.0.02％NaN₃耐性（＋）及び8.pH5.7での生育
（＋）の各試験結果が一致せず、バージエズ・マニユア
ル・オブ・デタミナテブ・バクテリオロジイ第８版によ
り該当する菌株がない。従つて、新菌株と同定され、本
発明者等により、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus
sp.strain S）と命名された。本発明者等により初めて
分離された該菌株は、工業技術院微生物工業技術研究所
に微工研条寄第809号（FERM BP−809）として寄託され
ている。

本発明によれば、上に詳しくのべた微生物、すなわち、
チロシン含有合成培地において単独では生育しないが、
バチルス・エスピー・Ｓ株との共生により生育する耐熱
性β−チロシナーゼ生産性桿菌をチロシン含有培地で培
養し、培養物から耐熱性β−チロシナーゼを採取するこ
とからなる耐熱性β−チロシナーゼの製法が提供でき
る。

培養は、たとえば、Ｌ−チロシンのほかに、適当な炭素
源、窒素源、ミネラル類を含有する培地において、例え
ば、バチルス・エスピー・Ｓ株との共生条件下に耐熱性
β−チロシナーゼ生産性桿菌を接種して行なうことがで
きる。利用する炭素源の例としては、グルコース、デン
プン、マルトース、コハク酸ナトリウム、酢酸ナトリウ
ムなどの如き炭素源を例示でき、また窒素の例として
は、NH₄Cl、（NH₄）₂SO₄、カザミノ酸、ペプトン、酵母
エキスなどの如き有機もしくは無機窒素源を例示するこ
とができる。更に、ミネラル類の例としては、K₂HPO₄、
KH₂PO₄、MgSO₄・7H₂O、FeCl₃、ビタミン類などを例示す
ることができる。

培養は、たとえば、上記例示の如き炭素源、窒素源、さ
らにはミネラル及びビタミン類のほかに、Ｌ−チロシン
を含有する液体培地を用いて、好気的に行なうことがで
きる。培養方式も適宜に選択できるが、たとえば静置培
養、振盪培養、通気撹拌培養などの培養方式を採用して
行なうことができる。培養条件としては、pH約６〜約８
の如きpH条件下、約55〜約65℃の温度条件において、約
１〜約３日の如き条件を例示することができる。

培養終了後、例えば、遠心分離、別などによつて菌体
を採取し、たとえば、菌体を破砕たとえばアルミナ摩砕
などによつて破砕して、得られる菌体抽出液から、たと
えば硫安分画法により分画して耐熱性β−チロシナーゼ
含有分画を採取することにより、目的とする耐熱性β−
チロシナーゼを分離取得することができる。更に、たと
えばイオン交換、ゲル過、カラムクロマトグラフイー
の如き適当な精製手法を用いて精製することができる。

上述のようにして製造できる本発明の耐熱性β−チロシ
ナーゼは、約80℃（pH＝8.0）に作用至適温度を有し、
且つ約80℃（pH＝8.0、保持時間20分）までは熱失活し
ない耐熱特性を有するβ−チロシナーゼである点で、従
来公知のβ−チロシナーゼと明確に区別できる新規酵素
である。

以下に、本発明耐熱性β−チロシナーゼの性質を示す。

1. 作用：− ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−チロシンか
らピルビン酸、フエノール及びアンモニアを生成する。

2. 基質特異性：− チロシンを分解する。

3. 至適pH及び安定pH:− 至適pH＝約７（65℃）〔第１図参照〕 安定pH＝６〜11（25℃,2日間〔第２図参照〕 添付図面第１図は、（１）50mMのリン酸カリウム緩衝液 及び（２）50mMのグリシン−NaOH緩衝液 の各々を用い、各pH（65℃におけるpH）条件下に、本発
明酵素のβ−チロシナーゼ活性を測定した結果を示す図
である。至適pHは上記（１）及び（２）の結果から約７
（65℃）と決定される。

添付図面第２図は、10mMのKCl及び10μＭのピリドキサ
ール５′−リン酸を含有する50mMの各種緩衝液（図中、
クエン酸−Na₂HPO₄緩衝液 K₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液 Tris−HCl緩衝液 グリシン−NaOH緩衝液 のそれぞれを用い、各pH（25℃におけるpH）条件下に、
25℃で２日間、本発明酵素を処理した後の残存β−チロ
シナーゼ活性を測定した結果を示す図である−この結果
から安定pH範囲６〜11（25℃,2日間）と決定される。

4. 力価の測定法：− 山田ら（京大）の方法に準じた。すなわち、Ｌ−チロシ
ン10μmole、ピリドキサール・リン酸（PLP）0.4μmol
e、K₂HPO₄−KH₂PO₄（pH8.0）200μmole及び酵素を含む
反応液4.0mlを用い、70℃で20分間反応後、30％トリク
ロロ酢酸（TCA）水溶液1.0mlを加えて反応を停止する。
反応系中に生成したピルビン酸を、フリードマン−ハウ
ゲン（Friedemann−Haugen）法〔ジヤーナル・オブ・バ
イオロジカル・ケミストリー（Journal of Biological
Chemistry）147巻,415,1943年〕により定量決定する。
活性は１分間に生成するフエノールのμmole数を1U（μ
moles/min）として表わす。

5. 作用適温の範囲：− チロシン分解活性の至適温度（作用至適温度）は、約80
℃（pH＝8.0）である〔第３図参照〕。

添付図面第３図は、各測定温度におけるpHを8.0となる
ように調製した50mMのK₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液（pH8.0）
中で、10分間酵素反応を行わせることにより、β−チロ
シナーゼ活性を求めた結果を示す図である。この結果か
ら至適温度約80℃（pH＝8.0）と決定される。

6. pH、温度などによる失活の条件：− 約80℃（pH＝8.0、保持時間20分）までは熱失活しない
〔添付第４図参照〕。

約85℃（pH＝8.0、保持時間20分）で約75％の残存活性
を示す〔添付第４図参照〕。

7. 精製方法：− トリプトフアナーゼ誘導培地で培養した菌体をアルミナ
磨砕し、PLP10μＭ、２−メルカプトエタノール1mMを含
むK₂HPO₄−KH₂PO₄50mMの緩衝液（pH8.0）で、50％飽和
硫安溶液を用いて分画し、沈殿を懸濁、透析後、DEAE−
トヨパール、ハイドロキシルアパタイトHT及びセフアク
リルＳ−300を用いて精製する。

8. 分子量 約46,000（SDSゲル電気泳動による）、 第210,000（セフアクリルＳ−300、 35℃でのゲル過による）。

本発明の耐熱性β−チロシナーゼは、従来公知のβ−チ
ロシナーゼとは異つて、優れた耐熱特性を有するため、
公知β−チロシナーゼがその利用に際して反応温度や熱
安定性などの面での利用に著るしい制約を受けた技術的
難点が克服でき、工業的に有利に利用することができ
る。

以下、実施例により本発明の数態様について更に詳しく
説明する。

参考例１〔耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌バクテリ
ウム・Ｔ株の分離採取。〕 （１−１） 堆肥試料1gをTyr−PEP液体培地10mlに添加
し、Ｌ型試験管中で約60℃において１日間振盪培養し
た。４−アミノアンチピリン試薬によりフエノール生成
を確認した後、その一部0.1mlを新たなTyr−PEP液体培
地10mlに接種して同様な培養を繰り返すことにより、フ
エノール生成菌群が充分に生育した培養物を得た。この
培養物0.1mlをバシトラシン1mg/を含有するTyr−PEP
液体培地10mlに接種して、さらに上記と同様な培養を行
つた。

斯くして得られた培養液を滅菌生理食塩水を用いて約10
万倍に希釈したのち、その0.1mlをメンブラン・フイル
ター（Toyo TM−２）を貼着したTyr−PEP寒天培地（寒
天1.5％添加）に塗布することにより、バクテリウム・
Ｔ株〔以下において、Ｔ株と略記することがある〕及び
バチルス・エスピー・Ｓ株〔以下において、Ｓ株と略記
することがある〕が混合状態で生育しているコロニーと
Ｓ株の単独よりなるコロニーを分離採収した。

（１−２） 上記（１−１）により得られたＴ株とＳ株
の混合したコロニーより得られた混合培養物1mlを、チ
ロシン含有合成培地（Tyr−PEP液体培地）200mlに接種
し、60℃で約30時間培養を行うと、約４時間後にまずＳ
株の活発な増殖が起こり、次いで、Ｓ株の増殖停止とほ
ぼ同時に、Ｔ株増殖が始まり、それと同時にＳ株は急速
に死滅し、最終的には菌数の99％以上がＴ株である培養
を得ることができた。さらにＳ株の混入率を低下させ、
実質的なＴ株の純粋培養物を作るためには、Ｔ株とＳ株
の細胞壁分解酵素（リゾチーム）に対する耐性の差を利
用する方法、または分別遠心分離法を用いて、培養のど
の段階でもＴ株を分離することが可能であつた。

細胞壁分解酵素（リゾチーム）を用いる方法。

上記のＴ株とＳ株の混合培養を18時間行い、下記の条件
でリゾチームを作用させると、その時点で約25％存在し
たＳ株が選択的に溶菌して全菌数の千分の一以下に減少
し、Ｔ株の純粋培養を得ることができた。

条件：− 100mMのリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.0）中、 卵白リヂチーム 300μg/ml EDTA 200μg/ml クエン酸ナトリウム 30 mg/ml の反応液を用い35℃で15分間反応させる。

分別遠心分離による方法。

上記のＴ株とＳ株の混合培養を20時間行つた培養物を、
1,000^xg、15分間の条件で遠心分離することによりＳ株
を選択的に沈殿させ、改めて、14,000^xg、20分間の条件
で遠心分離することによりＴ株のみを沈殿分離できた。

参考例２〔Ｔ株の単独培養が不可能であることの例
証。〕 （２−１） Ｔ株とＳ株の混合培養から参考例１の（１
−２）に示した方法で分離したＴ株を、下記液体培地に
植菌し、60℃で培養を行つたが、いずれの培地でもＴ株
の生育は全く認められなかつた。

1. Tyr−PEP液体培地 2. 普通ブイヨン培地 3. ハートインフユージヨンブイヨン 4. 牛血清＋ハートインフユージヨンブイヨン 5. 酵母エキス＋ハートインフユージヨンブイヨン 6. 0.5％寒天を含有する上記１−５までの各培地 （２−２） Ｓ株の菌体生産物または菌体成分がＴ株の
生育を支持する可能性を検証するために、Ｓ菌のみをTy
r−PEP液体培地に接種し、60℃約12時間培養した後、そ
の培養上清及び菌体超音波破砕抽出液を調製し、それら
を無菌過した後、Tyr−PEP液体培地に添加し、これに
純粋分離したＴ株を接種したが、Ｔ株の増殖は全く認め
られなかつた。また、ストレプトマイシンにより細胞分
裂を止めたＳ株菌体を共存させてＴ株の培養を試みた
が、増殖は全く認められなかつた。

実施例１〔酵素生産。〕 ５三角フラスコにチロシン含有合成培地（Tyr−PEP液
体培地）を1.5入れ、Ｔ株及びＳ株の混合培養を5ml植
菌し、60℃で30時間静置培養を行つたのち、参考例１に
示すと同様に処理して50の培養液から、51gのＴ株湿
菌体を得た。これを酸化アルミニウムにより摩砕し、次
いで、下記 10μＭのピリドキサール５′−リン酸（PLP）、 1mMの２−メルカプトエタノール、 250μＭのPMSF（セリンプロテアーゼ阻害剤）〔フエニ
ルメチルスルホニルフルオライド（Phenyl methyl sluf
onyl fluoride）〕、 50mMのK₂HPO₄−KH₂PO₄緩衝液、pH6.5、 の組成の精製用緩衝液182mlを添加することにより、可
溶画分として粗酵素液を得た。これから30〜80％飽和硫
安分画を集め、得られた粗酵素分画液をストレプトマイ
シンによる除核酸処理に賦したのち透析し、DEAE−トヨ
パール（東洋曹達工業製品）カラム（2.6cm（径）×12c
m）に吸着させ、０→400mM KCl濃度勾配（400ml）で溶
出処理して活性画分を集め、次いでハイドロキシルアパ
タイトゲルHT（バイオラツド社製品）カラム（2.6cm×8
cm）に吸着させ、０〜600mM（NH₄）₂SO₄濃度勾配（300m
l）で溶出を行い、活性画分からβ−チロシナーゼ約2mg
を得た。

本酵素は約80℃（pH＝8.0）に作用至適温度を有し且つ
約80℃（pH＝8.0、保持時間20分）までは熱失活しない
耐熱特性を示した。また、本酵素のトリプトフアン分解
の比活性は市販品（37℃）の８倍以上あり、逆反応によ
るインドール、ピルビン酸、アンモニアよりのトリプト
フアン合成活性も検出された。

【図面の簡単な説明】

添付図面第１図は本発明の耐熱性β−チロシナーゼの至
適pHを示すグラフ、第２図は本発明耐熱性β−チロシナ
ーゼの安定pHを示すための各種緩衝液における残存β−
チロシナーゼ活性とpHの関係を示すグラフ、第３図は本
発明の耐熱性β−チロシナーゼの至適温度を示すグラ
フ、そして第４図は本発明の耐熱性β−チロシナーゼの
熱失活特性を示すグラフである。

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】（イ） 作用 ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−チロシンか
   らピルビン酸、フエノール及びアンモニアを生成する、 （ロ） 基質特異性 チロシンを分解する、 （ハ） 至適pH及び安定pH範囲 65℃における至適pHが約７〜7.5であり、そして25℃に
   おける安定pHが６〜11である、 （ニ） 作用至適温度 pH8.0において約80℃に作用至適温度を示す、並びに （ホ） 分子量 SDSゲル電気泳動により測定した場合に約46,000である の特性を有することを特徴とする耐熱性β−チロシナー
   ゼ。
2. 【請求項２】チロシン含有合成培地において単独では生
   育しないが、バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus sp.
   strain S）との共生により生育する耐熱性β−チロシナ
   ーゼ生産性桿菌をチロシン含有培地で培養し、培養物か
   ら （イ） 作用 ピリドキサールリン酸の関与のもとに、Ｌ−チロシンか
   らピルビン酸、フエノール及びアンモニアを生成する、 （ロ） 基質特異性 チロシンを分解する、 （ハ） 至適pH及び安定pH範囲 65℃における至適pHが約７〜7.5であり、そして25℃に
   おける安定pHが６〜11である、 （ニ） 作用至適温度 pH8.0において約80℃に作用至適温度を示す、並びに （ホ） 分子量 SDSゲル電気泳動により測定した場合に約46,000である の特性を有する耐熱性β−チロシナーゼを採取すること
   を特徴とする前記耐熱性β−チロシナーゼの製法。
3. 【請求項３】該耐熱性β−チロシナーゼ生産性桿菌がバ
   クテリウム・Ｔ株（Bacterium strain T）（微工研条寄
   第810号）である特許請求の範囲第２項記載の製法。
4. 【請求項４】該バチルス・エスピー・Ｓ株（Bacillus s
   p.strain S）がバチルス・エスピー・Ｓ株（微工研条寄
   第809号）である特許請求の範囲第２項記載の製法。