JPH01225482A - アミノペプチダーゼ及びその使用 - Google Patents
アミノペプチダーゼ及びその使用Info
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Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
め要約のデータは記録されません。
Description
【発明の詳細な説明】
〔産業上の利用分野〕
この発明は、新規なアミノペプチダーゼ及びその製造方
法、該酵素を生産する微生物、該酵素又は該微生物を使
用するD−アミノ酸の製造法、並びに該酵素又は該微生
物を使用するアミノ酸N−置換アミドの製造法に関する
。D−アラニンアルキルアミドは、人工甘味料の合成原
料として有用である(特公昭61−9320明細書)。
法、該酵素を生産する微生物、該酵素又は該微生物を使
用するD−アミノ酸の製造法、並びに該酵素又は該微生
物を使用するアミノ酸N−置換アミドの製造法に関する
。D−アラニンアルキルアミドは、人工甘味料の合成原
料として有用である(特公昭61−9320明細書)。
アミノペプチダーゼとは、ペプチドのN末端よりアミノ
酸を順次遊離するエキソペプチダーゼのことをいう((
EC3,4,11,) r酵素ハンドブック」、p、
531−536、朝倉書店1982)、アミノペプチダ
ーゼは、通常、L−アミノ酸よりなるペプチドにL立体
特異的に作用してL−アミノ酸を遊離する。
酸を順次遊離するエキソペプチダーゼのことをいう((
EC3,4,11,) r酵素ハンドブック」、p、
531−536、朝倉書店1982)、アミノペプチダ
ーゼは、通常、L−アミノ酸よりなるペプチドにL立体
特異的に作用してL−アミノ酸を遊離する。
それらのうちD−アミノ酸をN末端とするペプチドに非
立体特異的に作用するアミノペプチダーゼもわずかに知
られているが、一般にその反応速度はL−アミノ酸より
なるペプチドに対する反応速度よりはるかに遅い。
立体特異的に作用するアミノペプチダーゼもわずかに知
られているが、一般にその反応速度はL−アミノ酸より
なるペプチドに対する反応速度よりはるかに遅い。
ロビンソンら(Journal of Biologi
cal Chemistry+202、1(1953)
) 、ホプスら(Archives of Bio−c
hemistry and Biophysics、
114.567(1966))、ミナミウラら(Jou
rnal of Fera+entation Tec
hnolo−gy、 33.653(1969))、プ
ランスコツトら(Journalof Biochem
istry+ 75+ 185(1974))は、各種
生物由来のアミノペプチダーゼが、L−アミノ酸からな
るペプチドに作用するのみならず、D−アミノ酸をN末
端とするペプチドに対してもわずかに作用することを報
告しているが、これらは、D−アミノ酸からなるペプチ
ドにのみ特異的に作用するアミノペプチダーゼではない
。
cal Chemistry+202、1(1953)
) 、ホプスら(Archives of Bio−c
hemistry and Biophysics、
114.567(1966))、ミナミウラら(Jou
rnal of Fera+entation Tec
hnolo−gy、 33.653(1969))、プ
ランスコツトら(Journalof Biochem
istry+ 75+ 185(1974))は、各種
生物由来のアミノペプチダーゼが、L−アミノ酸からな
るペプチドに作用するのみならず、D−アミノ酸をN末
端とするペプチドに対してもわずかに作用することを報
告しているが、これらは、D−アミノ酸からなるペプチ
ドにのみ特異的に作用するアミノペプチダーゼではない
。
チイエリーら(Journal of Ba5ic M
icrobiology+5、299(1986))は
、ブレビバクテリウム(Brevi−bacteriu
m )属細菌の産生ずるアシルアミド・アミドヒドロラ
ーゼ(EC3,5,1,4)がD−アラニンアミドにも
作用することを報告しているが、D立体特異的な加水分
解ではない。又、この酵素はアミノペプチダーゼではな
い。
icrobiology+5、299(1986))は
、ブレビバクテリウム(Brevi−bacteriu
m )属細菌の産生ずるアシルアミド・アミドヒドロラ
ーゼ(EC3,5,1,4)がD−アラニンアミドにも
作用することを報告しているが、D立体特異的な加水分
解ではない。又、この酵素はアミノペプチダーゼではな
い。
特開昭57−13000、特開昭59−159789、
特開昭60−36446、特開昭62−55097、特
開昭62−253397には、各種微生物によるDL−
アミノ酸アミド又は、L−アミノ酸アミドの、対応する
し一アミノ酸への酵素的加水分解法が記載されているが
、酵素化学的見地から、いかなる酵素が関与しているの
かについて記載されていない、又、D−アミノ酸アミド
含有物のD立体特異的な加水分解については全く記載さ
れていない。
特開昭60−36446、特開昭62−55097、特
開昭62−253397には、各種微生物によるDL−
アミノ酸アミド又は、L−アミノ酸アミドの、対応する
し一アミノ酸への酵素的加水分解法が記載されているが
、酵素化学的見地から、いかなる酵素が関与しているの
かについて記載されていない、又、D−アミノ酸アミド
含有物のD立体特異的な加水分解については全く記載さ
れていない。
特開昭61−96989はロドコッカス・エリスロポリ
ス(Rhodococcus et旦肚並虹n)菌体
によるD−アラニンアミド、D−バリンアミド、D−ア
ミノ酪酸アミド、D−ロイシンアミド、D−セリンアミ
ド、又はD−スレオニンアミドを対応するD−アミノ酸
へ酵素的に加水分解する方法を特許請求し、実施例にお
いては、D−アラニンアミド、D−バリンアミドおよび
D−ロイシンアミドを対応するD−アミノ酸へ酵素的に
加水分解する方法を記載しているが、酵素化学的見地か
ら、いかなる酵素が関与しているのかについて記載され
ていない、又、D−アミノ酸アミド含有物のD立体特異
的な加水分解については全く記載されていない。
ス(Rhodococcus et旦肚並虹n)菌体
によるD−アラニンアミド、D−バリンアミド、D−ア
ミノ酪酸アミド、D−ロイシンアミド、D−セリンアミ
ド、又はD−スレオニンアミドを対応するD−アミノ酸
へ酵素的に加水分解する方法を特許請求し、実施例にお
いては、D−アラニンアミド、D−バリンアミドおよび
D−ロイシンアミドを対応するD−アミノ酸へ酵素的に
加水分解する方法を記載しているが、酵素化学的見地か
ら、いかなる酵素が関与しているのかについて記載され
ていない、又、D−アミノ酸アミド含有物のD立体特異
的な加水分解については全く記載されていない。
特開昭61−274690には、シュードモナス・フロ
ーレツセンス(Pseudomonas fluor
escens )、ロドコッカス・エリスロポリス(R
hodococcuser thro olis) 、
及び、セラチア・マルセッセンス(Serratia
mercescens)菌体によるD−メチオニンア
ミド、D−グルタミンアミド、D−スレオニンアミド、
D−ロイシンアミド、D−フェニルアラニンアミド、D
−チロシンアミド、およびD−バリンアミドのそれぞれ
対応するD−アミノ酸への加水分解法が記載されている
が、酵素化学的見地からいかなる酵素が関与しているの
かについて記載されていない。又、記載されている加水
分解反応はD−アミノ酸アミドを原料とするものであり
、D−アミノ酸アミドとL−アミノ酸アミドとの混合物
のD立体特異的な加水分解については全く記載されてい
ない。
ーレツセンス(Pseudomonas fluor
escens )、ロドコッカス・エリスロポリス(R
hodococcuser thro olis) 、
及び、セラチア・マルセッセンス(Serratia
mercescens)菌体によるD−メチオニンア
ミド、D−グルタミンアミド、D−スレオニンアミド、
D−ロイシンアミド、D−フェニルアラニンアミド、D
−チロシンアミド、およびD−バリンアミドのそれぞれ
対応するD−アミノ酸への加水分解法が記載されている
が、酵素化学的見地からいかなる酵素が関与しているの
かについて記載されていない。又、記載されている加水
分解反応はD−アミノ酸アミドを原料とするものであり
、D−アミノ酸アミドとL−アミノ酸アミドとの混合物
のD立体特異的な加水分解については全く記載されてい
ない。
特公昭61−68には、D−アミノ酸を含むオリゴペプ
チドに作用するストレプトマイセス属に属する放線菌由
来のD−アミノ酸ペプチダーゼの製造法が記されている
が、本酵素はペプチドのC末端に作用するカルボキシペ
プチダーゼ様酵素であって、D−アミノ酸に特異的なア
ミノペプチダーゼではない。
チドに作用するストレプトマイセス属に属する放線菌由
来のD−アミノ酸ペプチダーゼの製造法が記されている
が、本酵素はペプチドのC末端に作用するカルボキシペ
プチダーゼ様酵素であって、D−アミノ酸に特異的なア
ミノペプチダーゼではない。
従って、D−アミノ酸誘導体に特異的なアミノペプチダ
ーゼは従来全く知られておらず、又、該酵素を用い、D
−アミノ酸アミド含有物を原料としてD立体特異的な加
水分解を行い、D−アミノ酸を合成する方法については
全く知られていない。
ーゼは従来全く知られておらず、又、該酵素を用い、D
−アミノ酸アミド含有物を原料としてD立体特異的な加
水分解を行い、D−アミノ酸を合成する方法については
全く知られていない。
酵素あるいは微生物を用いてD−アミノ酸を合成する方
法は、ストレプトマイセス属に属する放線菌由来のD立
体特異的なアミノ酸アシラーゼを用いてN−アセチルD
L−アミノ酸を光学分割し、D−フェニルグリシンやD
−バリンを合成する方法(それぞれ、特公昭53−36
035及び特開昭63−39598)、ヒダントイン化
合物のシュードモナス属細菌によるD立体特異的加水分
解による方法(特公昭56−1911) 、α−ケト酸
を原料としてD−アミノ酸トランスアミナーゼとアミノ
基供与体再生系を利用するD−アラニンを除くD−アミ
ノ酸の合成方法(特開昭62−205790)等が゛挙
げられる。
法は、ストレプトマイセス属に属する放線菌由来のD立
体特異的なアミノ酸アシラーゼを用いてN−アセチルD
L−アミノ酸を光学分割し、D−フェニルグリシンやD
−バリンを合成する方法(それぞれ、特公昭53−36
035及び特開昭63−39598)、ヒダントイン化
合物のシュードモナス属細菌によるD立体特異的加水分
解による方法(特公昭56−1911) 、α−ケト酸
を原料としてD−アミノ酸トランスアミナーゼとアミノ
基供与体再生系を利用するD−アラニンを除くD−アミ
ノ酸の合成方法(特開昭62−205790)等が゛挙
げられる。
しかしながら、D−アミノ酸アミド含有物を原料とし、
D−アミノ酸アミドに特異的な酵素を用いてD−アミノ
酸を合成する方法は全く知られていない。
D−アミノ酸アミドに特異的な酵素を用いてD−アミノ
酸を合成する方法は全く知られていない。
ところで、ペプチドの合成は化学合成法によるものが主
であるが、保護基を必要とする、ラセミ化及び副反応が
起きやすい等の問題点を有している。一方、近年、ペプ
チダーゼ、プロテアーゼ等のアミド結合加水分解酵素を
触媒として用い、逆反応条件でペプチド合成を行う技術
が開発されている。酵素によるペプチド結合合成反応は
反応条件が温和であり、化学合成法が有する上記の問題
点を回避することができる優れた方法である。
であるが、保護基を必要とする、ラセミ化及び副反応が
起きやすい等の問題点を有している。一方、近年、ペプ
チダーゼ、プロテアーゼ等のアミド結合加水分解酵素を
触媒として用い、逆反応条件でペプチド合成を行う技術
が開発されている。酵素によるペプチド結合合成反応は
反応条件が温和であり、化学合成法が有する上記の問題
点を回避することができる優れた方法である。
酵素法によるペプチド合成法は、これまでトリプシン、
α−キモトリプシン、ペプシン、パパイン、サーモライ
シン、ズブチリシン、プロナーゼ等のエンドペプチダー
ゼや、エキソペプチダーゼであるカルボキシペプチダー
ゼ等を用いてきた。
α−キモトリプシン、ペプシン、パパイン、サーモライ
シン、ズブチリシン、プロナーゼ等のエンドペプチダー
ゼや、エキソペプチダーゼであるカルボキシペプチダー
ゼ等を用いてきた。
酵素によるペプチド合成の重要な方法として、ペプチド
結合の加水分解の逆反応及び、アミノ酸アルキルエステ
ルのアミツリシス法が挙げられるが、いずれの合成法に
おいても、基質の酸部分となるアミノ酸誘導体のアミノ
基はことごとく保護されていなければならなかった。一
方、ペプチドのN末端よりアミノ酸を順次遊離するエキ
ソペプチダーゼであるアミノペプチダーゼをペプチド合
成に利用する研究は従来知られていなかった。
結合の加水分解の逆反応及び、アミノ酸アルキルエステ
ルのアミツリシス法が挙げられるが、いずれの合成法に
おいても、基質の酸部分となるアミノ酸誘導体のアミノ
基はことごとく保護されていなければならなかった。一
方、ペプチドのN末端よりアミノ酸を順次遊離するエキ
ソペプチダーゼであるアミノペプチダーゼをペプチド合
成に利用する研究は従来知られていなかった。
D−アミノ酸は天然には稀なアミノ酸である。
天然の蛋白は、L−アミノ酸から出来ており、従って、
それらの加水分解酵素をペプチド結合合成反応に用いる
手法はL−アミノ酸からなるペプチド合成法として発達
してきた。既知の蛋白質加水分解酵素を用いる、D−ア
ミノ酸を含むペプチドの合成反応が報告されている。例
えば、モリハラら(Journal of Bioch
emistry、 84.1277(1978))は、
Z−L−フェニルアラニル−D−ロイシンアミドのα−
キモトリプシンの触媒による合成法を示した。それ以来
、ストイネバとベトコツ(FEBSLetters、
183.103(1985))、ウェストとウォング(
Journal of Organic Chemis
Lry、 5L 2728(1986))、パルバスと
ウォング(Journal of Chemical
5ociety+Chemical Communin
cations、 19871533)%マルゴリンと
クリバッフ(Journal of American
ChemicalSociety、 109.380
2(1987)) 、マトスら(Bio−techno
logy Letters 9.233(1987))
は、α−キモトリプシンあるいはリパーゼを触媒として
用いるD−アミノ酸を含むペプチドの合成法を記載して
いる。しかし、これらのエンドペプチダーゼを用いる合
成法は、ことごとく酸部分のアミノ酸誘導体のアミノ基
が保護された化合物を基質としており、そのアミノ基が
遊離である化合物を基質とする合成については全く記載
されていない。又、これらの合成では、D−アミノ酸は
アミン部分に含まれており、本発明とは異なる。
それらの加水分解酵素をペプチド結合合成反応に用いる
手法はL−アミノ酸からなるペプチド合成法として発達
してきた。既知の蛋白質加水分解酵素を用いる、D−ア
ミノ酸を含むペプチドの合成反応が報告されている。例
えば、モリハラら(Journal of Bioch
emistry、 84.1277(1978))は、
Z−L−フェニルアラニル−D−ロイシンアミドのα−
キモトリプシンの触媒による合成法を示した。それ以来
、ストイネバとベトコツ(FEBSLetters、
183.103(1985))、ウェストとウォング(
Journal of Organic Chemis
Lry、 5L 2728(1986))、パルバスと
ウォング(Journal of Chemical
5ociety+Chemical Communin
cations、 19871533)%マルゴリンと
クリバッフ(Journal of American
ChemicalSociety、 109.380
2(1987)) 、マトスら(Bio−techno
logy Letters 9.233(1987))
は、α−キモトリプシンあるいはリパーゼを触媒として
用いるD−アミノ酸を含むペプチドの合成法を記載して
いる。しかし、これらのエンドペプチダーゼを用いる合
成法は、ことごとく酸部分のアミノ酸誘導体のアミノ基
が保護された化合物を基質としており、そのアミノ基が
遊離である化合物を基質とする合成については全く記載
されていない。又、これらの合成では、D−アミノ酸は
アミン部分に含まれており、本発明とは異なる。
マルゴリンら、(Journal of Amertc
an ChemicalSociety、 109.7
885(1987))には、N−ホルミルD−アラニン
2−クロロエチルエステルヲ酸部分とし、D−アラニン
アミド等をアミン部分とするズブチリシンを触媒とする
合成を報告している。
an ChemicalSociety、 109.7
885(1987))には、N−ホルミルD−アラニン
2−クロロエチルエステルヲ酸部分とし、D−アラニン
アミド等をアミン部分とするズブチリシンを触媒とする
合成を報告している。
しかしながら、これらの報告にあるD−アミノ酸アミド
の酵素的合成法においては、ことごとく酸部分に保護基
を必要としており、本発明とは異なる。又、酸部分にD
L−アミノ酸誘導体を用い、立体選択的なアミツリシス
によるD−アミノ酸アミド合成法は知られていない。
の酵素的合成法においては、ことごとく酸部分に保護基
を必要としており、本発明とは異なる。又、酸部分にD
L−アミノ酸誘導体を用い、立体選択的なアミツリシス
によるD−アミノ酸アミド合成法は知られていない。
従って本発明は、今まで存在することが全く知られてい
なかったD−アミノ酸誘導体に特異的なアミノペプチダ
ーゼ、該酵素の新規な製造方法、該酵素を利用するD−
アミノ酸の新規な製造法、並びに該酵素を用いて、酸部
分のアミノ酸誘導体を立体選択的にD−アミノ酸アミド
に導く新規なり一アミノ酸アミドの製造法を提供しよう
とするものである。
なかったD−アミノ酸誘導体に特異的なアミノペプチダ
ーゼ、該酵素の新規な製造方法、該酵素を利用するD−
アミノ酸の新規な製造法、並びに該酵素を用いて、酸部
分のアミノ酸誘導体を立体選択的にD−アミノ酸アミド
に導く新規なり一アミノ酸アミドの製造法を提供しよう
とするものである。
本発明者等は、該酵素を生産する新規な微生物及び該酵
素の新規な製造方法を開発するために、D−アミノ酸誘
導体に特異的に作用するアミノペプチダーゼ活性を有す
る菌株を広範囲にスクリーニングしたところ、多くの細
菌が新規なり一アミノ酸アミノペプチダーゼを生産する
ことを見出した。
素の新規な製造方法を開発するために、D−アミノ酸誘
導体に特異的に作用するアミノペプチダーゼ活性を有す
る菌株を広範囲にスクリーニングしたところ、多くの細
菌が新規なり一アミノ酸アミノペプチダーゼを生産する
ことを見出した。
従って本発明は、D−アミノ酸誘導体に特異的に作用す
ることを特徴とするアミノペプチダーゼ;アミノペプチ
ダーゼを生産する細菌を培養し、この培養物から前記酵
素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方法;前
記酵素又は該酵素の含有物を下でD−アミノ酸誘導体に
作用させてD−アミノ酸を生成せしめ、該D−アミノ酸
を採取することを特徴とするD−アミノ酸の製造方法;
並びに前記酵素又は該酵素の含有物の存在下でD−アミ
ノ酸誘導体とアミンとを反応せしめてD−アミノ酸N−
置換アミドを生成せしめ、これを採取することを特徴と
するD−アミノ酸N−置換アミドの製造方法を提供する
ものである。
ることを特徴とするアミノペプチダーゼ;アミノペプチ
ダーゼを生産する細菌を培養し、この培養物から前記酵
素を採取することを特徴とする前記酵素の製造方法;前
記酵素又は該酵素の含有物を下でD−アミノ酸誘導体に
作用させてD−アミノ酸を生成せしめ、該D−アミノ酸
を採取することを特徴とするD−アミノ酸の製造方法;
並びに前記酵素又は該酵素の含有物の存在下でD−アミ
ノ酸誘導体とアミンとを反応せしめてD−アミノ酸N−
置換アミドを生成せしめ、これを採取することを特徴と
するD−アミノ酸N−置換アミドの製造方法を提供する
ものである。
」上と微±1
本発明において使用する微生物としてはD−アミノ酸に
特異的なアミノペプチダーゼを生産ができるものであれ
ばよく、このような微生物は保存菌のなかから選択する
ことができる場合もあり、また自然界から分離すること
ができる。
特異的なアミノペプチダーゼを生産ができるものであれ
ばよく、このような微生物は保存菌のなかから選択する
ことができる場合もあり、また自然界から分離すること
ができる。
このような微生物としては、保存菌株中に見出されたア
クロモバクタ−・シクロクラスラス(Achromob
acter c cloclastes) IAM 1
023、アクロモバクタ−・プリカッラス(Achro
mobacterdelicatulus ) IAM
1433、フラボバクテリウム・ム・スアベロレンズ
(F、 5uaverolens) IFO3752
、バシルス・セレウス(Bacillus cere
us) IFO3001、バシルス・スフエリカス(B
、 肛匝肛圏u)IFO3341、バシルス・スフエ
リカスIFO3527、バシルス・チアミノリティカス
(肩エ 旦凰社赳江ticus) IAM 1034
、バシルス・ステアロサーモフィラス(B、 ste
arothermo hilus) IFO12550
sミクロコツカス80ゼウス(Micrococcus
roseus)IPo 376B、ミクロコツカス
・s p 、(Micrococcussp、) 5C
RC414、コリネバクテリウム・スベドニカム(−如
m助acter土明 且皿並に憇) IFO3306
、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomo
nas姐匹紅匹sa) IFO3080、シュードモナ
ス・プチダIFO12653(P、 匹旦組)、プロ
タミノバクタ−0ルーバー(Protaminobac
ter ruber ) IFO3708、マイコバ
クテリウム・スメグマヂス(」1丑肋坦μm岨 ↓」邊
atis ) IFO3082、ストレプトマイセス・
グリセオラス(Stre tom ces■1seol
us ) IFO3403、及びストレプトマイセス・
フルビシムス(S tre tow ces ful
vissimus )IFo 13482を挙げること
ができる。これらの保存菌はそれぞれ前記の寄託番号の
もとにIFO又はIAMから自由に入手することができ
る。
クロモバクタ−・シクロクラスラス(Achromob
acter c cloclastes) IAM 1
023、アクロモバクタ−・プリカッラス(Achro
mobacterdelicatulus ) IAM
1433、フラボバクテリウム・ム・スアベロレンズ
(F、 5uaverolens) IFO3752
、バシルス・セレウス(Bacillus cere
us) IFO3001、バシルス・スフエリカス(B
、 肛匝肛圏u)IFO3341、バシルス・スフエ
リカスIFO3527、バシルス・チアミノリティカス
(肩エ 旦凰社赳江ticus) IAM 1034
、バシルス・ステアロサーモフィラス(B、 ste
arothermo hilus) IFO12550
sミクロコツカス80ゼウス(Micrococcus
roseus)IPo 376B、ミクロコツカス
・s p 、(Micrococcussp、) 5C
RC414、コリネバクテリウム・スベドニカム(−如
m助acter土明 且皿並に憇) IFO3306
、シュードモナス・アエルギノーザ(Pseudomo
nas姐匹紅匹sa) IFO3080、シュードモナ
ス・プチダIFO12653(P、 匹旦組)、プロ
タミノバクタ−0ルーバー(Protaminobac
ter ruber ) IFO3708、マイコバ
クテリウム・スメグマヂス(」1丑肋坦μm岨 ↓」邊
atis ) IFO3082、ストレプトマイセス・
グリセオラス(Stre tom ces■1seol
us ) IFO3403、及びストレプトマイセス・
フルビシムス(S tre tow ces ful
vissimus )IFo 13482を挙げること
ができる。これらの保存菌はそれぞれ前記の寄託番号の
もとにIFO又はIAMから自由に入手することができ
る。
セルロモナスに属する微生物としてはセルロモナスs
p 、 5CRC631(京都大学農学部保存菌AKU
−676、ヤマダら、Agricultural an
d BiologicalChemistry、 46
.2325.1982より入手)を挙げることができる
。セルロモナスs p 、 5CRC631が工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第991δ号(F
ERM P−’1 ’l l 8)として寄託されてい
る。ミクロコツカスに属する微生物としてはミクロコツ
カスs p 、 5CRC414(京都大学農学部保作
画AKU−510,オカダら、Agricultura
l andBtological Chemistry
+ so、 176+ 1966より入手)を挙げるこ
とができる。ミクロコツカスSp。
p 、 5CRC631(京都大学農学部保存菌AKU
−676、ヤマダら、Agricultural an
d BiologicalChemistry、 46
.2325.1982より入手)を挙げることができる
。セルロモナスs p 、 5CRC631が工業技術
院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第991δ号(F
ERM P−’1 ’l l 8)として寄託されてい
る。ミクロコツカスに属する微生物としてはミクロコツ
カスs p 、 5CRC414(京都大学農学部保作
画AKU−510,オカダら、Agricultura
l andBtological Chemistry
+ so、 176+ 1966より入手)を挙げるこ
とができる。ミクロコツカスSp。
5CRC414が工業技術院微生物工業技術研究所に微
工研菌寄第9?17号(FERM P−?’7 / 7
)として寄託されている。
工研菌寄第9?17号(FERM P−?’7 / 7
)として寄託されている。
アクロモバクタ−に属する微生物としては、例えば本発
明者により分離された新菌株アクロモバクタ−s p
、 5CRCC1−38、アクロモバクタ−sp。
明者により分離された新菌株アクロモバクタ−s p
、 5CRCC1−38、アクロモバクタ−sp。
5CRCC1−16、アクロモバクタ−s p 、 5
CRCC1−17を挙げることができる。これらの菌株
の菌学的性質は非常に近似しており、これらの代表株と
して99/6> として寄託されている。アルスロバク
タ−に属する微生物としては、例えば本発明者により分
離された新菌株アルスロバクタ−sp。
CRCC1−17を挙げることができる。これらの菌株
の菌学的性質は非常に近似しており、これらの代表株と
して99/6> として寄託されている。アルスロバク
タ−に属する微生物としては、例えば本発明者により分
離された新菌株アルスロバクタ−sp。
5CRCC2−9、アルスロバクタ−s p 、 5C
RCN1−31を挙げることができる。これらの菌株の
菌学的性質は非常に近似しており、これらの代表株とじ
てアルスロバクタ−s p 、 5CRCN1−31が
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第9qノ
5号(FERM P−97i f)として寄託されてい
る。
RCN1−31を挙げることができる。これらの菌株の
菌学的性質は非常に近似しており、これらの代表株とじ
てアルスロバクタ−s p 、 5CRCN1−31が
工業技術院微生物工業技術研究所に微工研菌寄第9qノ
5号(FERM P−97i f)として寄託されてい
る。
これらの菌株の分離源はいずれも神奈川県相模市である
。
。
前記の新規な菌株は第1表に示すような菌学的性質を有
する。
する。
以下余白
上記の国学的性質に基づきチエスターとクーパー(Jo
urnal of C11nical Microbi
ology、 9+ 425(1979) )及び、M
anual of C11nical Microbi
ology4th ed、、 p 330、(1985
)の記述に従って、前記5CRCC1−38,5CRC
C1−16,5CRCC1−17の菌株を次のように同
定した。すなわち、ダラム陰性、胞子の生成無し、短桿
菌、運動性、好気的、オキシダーゼ陽性、及びグルコー
スからの酸の生成無し。
urnal of C11nical Microbi
ology、 9+ 425(1979) )及び、M
anual of C11nical Microbi
ology4th ed、、 p 330、(1985
)の記述に従って、前記5CRCC1−38,5CRC
C1−16,5CRCC1−17の菌株を次のように同
定した。すなわち、ダラム陰性、胞子の生成無し、短桿
菌、運動性、好気的、オキシダーゼ陽性、及びグルコー
スからの酸の生成無し。
このような性質からアクロモバクタ−属に属する細菌で
あることが明らかである。一方、Bergey’ sM
anual of Systematic Bacte
riology 1st ed−+Vo1.2.、 p
1266の分類基準に従って5CRCC2−9及び5
CRCN1−31を次の様に同定した。すなわち、ダラ
ム陽性、コリネホルム型、非運動性、好気性、カタラー
ゼ陽性、ペプチドグリカンにリジンが含まれるミコール
酸陰性。このような性質からアルスロバクタ−属に属す
る細菌であることが明らかである。
あることが明らかである。一方、Bergey’ sM
anual of Systematic Bacte
riology 1st ed−+Vo1.2.、 p
1266の分類基準に従って5CRCC2−9及び5
CRCN1−31を次の様に同定した。すなわち、ダラ
ム陽性、コリネホルム型、非運動性、好気性、カタラー
ゼ陽性、ペプチドグリカンにリジンが含まれるミコール
酸陰性。このような性質からアルスロバクタ−属に属す
る細菌であることが明らかである。
なお、これらの菌株に変異を生じさせて一層生産性の高
い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の細胞
中に存在するアミノペプチダーゼの生産に関与する遺伝
子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラスミド
に挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例えばエ
ッシェリッヒき同種宿主を形質転換することにより、本
発明のアミノペプチダーゼ生産株を人為的に創成するこ
ともできる。
い菌株を得ることもできる。また、これらの菌株の細胞
中に存在するアミノペプチダーゼの生産に関与する遺伝
子を切り出し、これを適切なベクター例えばプラスミド
に挿入し、このベクターを用いて適当な宿主、例えばエ
ッシェリッヒき同種宿主を形質転換することにより、本
発明のアミノペプチダーゼ生産株を人為的に創成するこ
ともできる。
(2) 、の1′ 法
前記の微生物を培養して本発明のアミノペプチダーゼを
製遺しようとする場合、基礎栄養培地として、この発明
の微生物が増殖し得るものであればいずれを使用しても
よい。この培地は、窒素源として例えば硫安、酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス等の1種類又は複数種類を含有
する。また、この培地には必要に応じて炭素源としてグ
ルコース、澱粉、グリセリン等を加えることができる。
製遺しようとする場合、基礎栄養培地として、この発明
の微生物が増殖し得るものであればいずれを使用しても
よい。この培地は、窒素源として例えば硫安、酵母エキ
ス、ペプトン、肉エキス等の1種類又は複数種類を含有
する。また、この培地には必要に応じて炭素源としてグ
ルコース、澱粉、グリセリン等を加えることができる。
この培地には無機塩類、例えばリン酸二カリウム、塩化
ナトリウム、硫酸マグネシュウム等を加えることが好ま
しい。また、酵素の誘渾物質となりうる少量のD−アミ
ノ酸アミドを添加することも好ましい。D−アミノ酸ア
ミドの添加料は基礎培地の組成、培養する菌株の性質に
より異なるが、およそ0.01〜5%である。
ナトリウム、硫酸マグネシュウム等を加えることが好ま
しい。また、酵素の誘渾物質となりうる少量のD−アミ
ノ酸アミドを添加することも好ましい。D−アミノ酸ア
ミドの添加料は基礎培地の組成、培養する菌株の性質に
より異なるが、およそ0.01〜5%である。
培養は固体培地又は液体培地のいずれを用いてもよいが
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、アミノペ
プチダーゼが生産される温度範囲内であればいずれの温
度でも良いが、好ましくは25〜45℃である。pHは
5〜11、好ましくは6〜10の範囲である。培養時間
は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好ましくは
6〜72時間である。
、目的酵素を多量に得るためには、液体培地を用い、振
盪培養、通気・撹拌培養等により好気的条件下で培養を
行なうのが好ましい。培養温度は菌が生育し、アミノペ
プチダーゼが生産される温度範囲内であればいずれの温
度でも良いが、好ましくは25〜45℃である。pHは
5〜11、好ましくは6〜10の範囲である。培養時間
は酵素活性が発現される時間を選べば良いが好ましくは
6〜72時間である。
次に得られた培養物から本発明のアミノペプチダーゼが
採取されるが、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さら
にこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを
加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等を行ない、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリ
エチレングリコール等の添加による結晶化等の公知の方
法によって均一の結晶酵素標品を単離することが出来る
。
採取されるが、精製法として通常の酵素精製法を用いる
ことが出来る。遠心分離等によって、粗酵素を得、さら
にこれに硫酸プロタミン又は硫酸ストレプトマイシンを
加えて処理を行ない、塩析、有機溶媒沈澱、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフ
ィー等を行ない、さらに硫酸アンモニウム等の塩やポリ
エチレングリコール等の添加による結晶化等の公知の方
法によって均一の結晶酵素標品を単離することが出来る
。
この方法において使用されるアミノペプチダーゼの使用
形態は特に限定されない0例えば、精製された酵素を使
用することができるのは無論のこと、細胞を含有する培
養液、培養生菌体、アセトン等によって脱水処理された
風乾菌体、菌体破砕物、種々の段階まで精製された部分
精製物を使用することが出来る。さらにこれらの酵素ま
たは酵素含有物をポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、
ポリウレタン樹脂、カッパカラギーナン、アルギン酸ナ
トリウム、イオン交換樹脂、半透膜、高分子酵素修飾剤
等により固定化したものを使用することが出来る。
形態は特に限定されない0例えば、精製された酵素を使
用することができるのは無論のこと、細胞を含有する培
養液、培養生菌体、アセトン等によって脱水処理された
風乾菌体、菌体破砕物、種々の段階まで精製された部分
精製物を使用することが出来る。さらにこれらの酵素ま
たは酵素含有物をポリアクリルアミド、光架橋性樹脂、
ポリウレタン樹脂、カッパカラギーナン、アルギン酸ナ
トリウム、イオン交換樹脂、半透膜、高分子酵素修飾剤
等により固定化したものを使用することが出来る。
のゞ
本発明においては次の方法により力価を測定した。トリ
ス−HCl(+)H8,0) 50.17+101 、
D−アラニンアミド5μmol s及び適当料のサン
プルを0.5tn1になるように混合し、30℃におい
て10分間反応せしめた後、沸騰水中に3分間浸して反
応を停止し、生成したD−アラニンを以下の方法によっ
て定量した。すなわち、上記反応液0.5−に、フェノ
ール10.6μmol % 4−アミノアンチピリン0
.79μm1101 %パーオキシダーゼ5単位を加え
て、1.5−とし、30℃において5分間保温した後、
D−アミノ酸オキシダーゼを0.14単位加えて1.6
−とし、37℃において60分間振盪した。
ス−HCl(+)H8,0) 50.17+101 、
D−アラニンアミド5μmol s及び適当料のサン
プルを0.5tn1になるように混合し、30℃におい
て10分間反応せしめた後、沸騰水中に3分間浸して反
応を停止し、生成したD−アラニンを以下の方法によっ
て定量した。すなわち、上記反応液0.5−に、フェノ
ール10.6μmol % 4−アミノアンチピリン0
.79μm1101 %パーオキシダーゼ5単位を加え
て、1.5−とし、30℃において5分間保温した後、
D−アミノ酸オキシダーゼを0.14単位加えて1.6
−とし、37℃において60分間振盪した。
これを沸騰水中に3分間浸して反応を停止し、500n
mにおける吸光度を測定して、検量線より反応液中のD
−アラニン量を求めた。1分間当り1μmolのD−ア
ラニンを生成する酵素量を1単位とした。
mにおける吸光度を測定して、検量線より反応液中のD
−アラニン量を求めた。1分間当り1μmolのD−ア
ラニンを生成する酵素量を1単位とした。
D−アラニン−p−ニトロアニリドを基質とするアミノ
ペプチダーゼ活性は次のように測定した。
ペプチダーゼ活性は次のように測定した。
すなわち、D−アラニン−p−ニトロアニリド10μm
ol、リン酸緩衝液(pH7,0)100μmol及び
酵素を含む反応液1@lを30℃において10分間保温
した後、405nmにおける吸光度を測定して、p−ニ
トロアニリンの吸光系数から反応液中のD−アラニン量
を求めた。一方し−アラニンアミドに対する酵素活性は
、次のように測定した。すなわち、L−アラニンアミド
5μlll01、トリス−塩酸(pH8,0) 50μ
taol 、、及び酵素を含む反応液0.5−を30℃
において10分間保温した後、沸騰水中に3分間浸して
反応を停止し、生成したし一アラニンを以下の方法によ
って定量した。すなわち、グリシン−MCIl −KO
H(pH10,4) 100μmol。
ol、リン酸緩衝液(pH7,0)100μmol及び
酵素を含む反応液1@lを30℃において10分間保温
した後、405nmにおける吸光度を測定して、p−ニ
トロアニリンの吸光系数から反応液中のD−アラニン量
を求めた。一方し−アラニンアミドに対する酵素活性は
、次のように測定した。すなわち、L−アラニンアミド
5μlll01、トリス−塩酸(pH8,0) 50μ
taol 、、及び酵素を含む反応液0.5−を30℃
において10分間保温した後、沸騰水中に3分間浸して
反応を停止し、生成したし一アラニンを以下の方法によ
って定量した。すなわち、グリシン−MCIl −KO
H(pH10,4) 100μmol。
NAD” 2.5 μmol %上記反応液及びL−ア
ラニン脱水素酵素0.5単位を含む反応液1mjを30
℃において5分間保温し、生成したNADHに由来する
340nmにおける吸光度の増加を分光光度計により測
定して、検量線より反応液中のし一アラニン量を求めた
。1分間当り1μmolのL−アラニンを生成する酵素
量を1単位とした。
ラニン脱水素酵素0.5単位を含む反応液1mjを30
℃において5分間保温し、生成したNADHに由来する
340nmにおける吸光度の増加を分光光度計により測
定して、検量線より反応液中のし一アラニン量を求めた
。1分間当り1μmolのL−アラニンを生成する酵素
量を1単位とした。
」]ユ」1ト閃1貫
本発明のアミノペプチダーゼの1例として、5CRCC
1−38により生産されるアミノペプチダーゼは次の性
質を有する。
1−38により生産されるアミノペプチダーゼは次の性
質を有する。
(1)作用:次式に示す反応を触媒する。
D−アミノ酸アミド+H,0
一−→ D−アミノ酸十NH。
(2)基質特異性:本酵素は、D−アラニンアミドを最
も良好な基質とする。N末端が遊離であるD−アラニン
とアンモニアとのアミド及び、D−アラニンと各種アル
キルアミンとのアミド、D−アラニンのエステル、並び
に、ペプチド等が基質となる。この1例を次の第2表に
示す。
も良好な基質とする。N末端が遊離であるD−アラニン
とアンモニアとのアミド及び、D−アラニンと各種アル
キルアミンとのアミド、D−アラニンのエステル、並び
に、ペプチド等が基質となる。この1例を次の第2表に
示す。
以下余白
第一」ニー表
基質特異性
基 質 相対活性
(3)至適pH: pH8,5付近が至適である。
(4) p)I安定性:各pHの緩衝液(0,05M
)中、30℃にて1時間保温した後の残存活性を測定し
た場合、pH7,0〜10.0付近が安定である。
)中、30℃にて1時間保温した後の残存活性を測定し
た場合、pH7,0〜10.0付近が安定である。
(5)至適温度:45℃付近における活性が最大である
。
。
(6)温度安定性: 0. I M I77酸緩衝液(
pH8,0)中、各温度において10分間処理した後の
残存活性を測定したところ、45℃で80%の活性が残
存していた。
pH8,0)中、各温度において10分間処理した後の
残存活性を測定したところ、45℃で80%の活性が残
存していた。
(7)吸収スペクトル: 278nmに極大吸収を有す
る。
る。
(8) 金属イオン、阻害剤の影響:銀、水銀等の金
属イオン及びPCMB等のSH阻害剤によって活性が阻
害される。
属イオン及びPCMB等のSH阻害剤によって活性が阻
害される。
(9)等電点:アンホラインを用いる焦点電気泳動によ
り測定した場合、約4.2である。
り測定した場合、約4.2である。
aO分子量:高速液体クロマトグラフィー(TSKG3
000SW)により約122,000と算出される。
000SW)により約122,000と算出される。
αD サブユニットの分子量: 5DS−ポリアクリル
アミドゲル電気泳動により約59.000と算出される
。
アミドゲル電気泳動により約59.000と算出される
。
亜 均一性:高速液体クロマトグラフィー(TSKPh
enyl−5P讐)により第5図Aに示す如く単一のピ
ークを与える。また、SO3−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(10,0%、pH7,2)により第1図に示
す如く単一のバンドを与える。
enyl−5P讐)により第5図Aに示す如く単一のピ
ークを与える。また、SO3−ポリアクリルアミドゲル
電気泳動(10,0%、pH7,2)により第1図に示
す如く単一のバンドを与える。
(5)D−アミノ の1′
本発明はまた、D−アミノ酸の製造方法を提供する。こ
の方法においては、アミノペプチダーゼ、又はそれを含
有する物を使用してD−アミノ酸の誘導体をD−アミノ
酸に転損し、このD−アミノ酸を採取する。
の方法においては、アミノペプチダーゼ、又はそれを含
有する物を使用してD−アミノ酸の誘導体をD−アミノ
酸に転損し、このD−アミノ酸を採取する。
本発明のアミノペプチダーゼは次の反応:(D−アミノ
酸誘導体) (D−アミノ酸)(I) を触媒することができ、この反応を利用してD−アミノ
酸誘導体からD−アミノ酸を製造することができる。
酸誘導体) (D−アミノ酸)(I) を触媒することができ、この反応を利用してD−アミノ
酸誘導体からD−アミノ酸を製造することができる。
本発明の方法はD−アラニンの製造のために最も効果的
に利用することができるが、D−2−アミノ酪酸、D−
バリン、D−ノルバリン、D−フェニルグリシン、D−
ホモフェニルアラニン等の製造のためにも適用すること
ができる。
に利用することができるが、D−2−アミノ酪酸、D−
バリン、D−ノルバリン、D−フェニルグリシン、D−
ホモフェニルアラニン等の製造のためにも適用すること
ができる。
基質としてのD−アミノ酸誘導体として、前記反応式(
I)中のXの種類に応じて、D−アミノ酸アミド、N−
置換D−アミノ酸アミド、D−アミノ酸エステル、N−
末端がD−アミノ酸であるペプチド等を使用することが
できる。N−置換D−アミノ酸の置換基の代表的なもの
としては低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基、
プロピル基等が挙げられ、従って基質としてD−アミノ
酸N−低級アルキルアミド、例えばD−アミノ酸−N−
メ、チルアミド、−N−エチルアミド、−N−プロピル
アミド等を使用することができる。さらに、N−置換基
として芳香族基を含有する基を有する誘導体、その他第
2表に示した種々のアミドを使用することができる。基
質エステルとしては、例えばD−アミノ酸のα−カルボ
キシル基が低級アルカノールによりエステル化されたも
の、例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピル
エステル等を使用することができる。基質ペプチドとし
ては、D−アミノ酸−Gly 、 D−アミノ酸−D
−Ala −D −Ala 、 D−アミノ酸−L −
Ala−L−Ala等、第2表に示した種々のペプチド
を使用することができる。
I)中のXの種類に応じて、D−アミノ酸アミド、N−
置換D−アミノ酸アミド、D−アミノ酸エステル、N−
末端がD−アミノ酸であるペプチド等を使用することが
できる。N−置換D−アミノ酸の置換基の代表的なもの
としては低級アルキル基、例えばメチル基、エチル基、
プロピル基等が挙げられ、従って基質としてD−アミノ
酸N−低級アルキルアミド、例えばD−アミノ酸−N−
メ、チルアミド、−N−エチルアミド、−N−プロピル
アミド等を使用することができる。さらに、N−置換基
として芳香族基を含有する基を有する誘導体、その他第
2表に示した種々のアミドを使用することができる。基
質エステルとしては、例えばD−アミノ酸のα−カルボ
キシル基が低級アルカノールによりエステル化されたも
の、例えばメチルエステル、エチルエステル、プロピル
エステル等を使用することができる。基質ペプチドとし
ては、D−アミノ酸−Gly 、 D−アミノ酸−D
−Ala −D −Ala 、 D−アミノ酸−L −
Ala−L−Ala等、第2表に示した種々のペプチド
を使用することができる。
しかしながら、D−アミノ酸を工業的に製造するために
は安価な基質を用いることが好ましく、このためにはN
−非置換D−アミノ酸アミド、例えばD−アラニンアミ
ド、D−2−アミノ酪酸アミド等を用いるのが好ましい
。本発明に用いられるD−アミノ酸アミドは、例えば、
公知の方法に従ってそれぞれのD−アミノ酸メチルエス
テルを合成し、続いて、アンモニアガスと反応せしめる
か、あるいは、ストレッカー決により合成したα−アミ
ノニトリルを化学的あるいは酵素的に水和して得ること
ができる。また、DL−アミノ酸アミドの酵素による光
学分割の際に副生ずるD−アミノ酸アミドを用いること
もできる。
は安価な基質を用いることが好ましく、このためにはN
−非置換D−アミノ酸アミド、例えばD−アラニンアミ
ド、D−2−アミノ酪酸アミド等を用いるのが好ましい
。本発明に用いられるD−アミノ酸アミドは、例えば、
公知の方法に従ってそれぞれのD−アミノ酸メチルエス
テルを合成し、続いて、アンモニアガスと反応せしめる
か、あるいは、ストレッカー決により合成したα−アミ
ノニトリルを化学的あるいは酵素的に水和して得ること
ができる。また、DL−アミノ酸アミドの酵素による光
学分割の際に副生ずるD−アミノ酸アミドを用いること
もできる。
原料としては前記のD−アミノ酸誘導体のみならず、D
−アミノ酸誘導体とD−アミノ酸誘導体。
−アミノ酸誘導体とD−アミノ酸誘導体。
とのL−アミノ酸誘導体との混合物を使用することもで
きる。この混合物を使用する場合、本発明の方法によれ
ば、D−アミノ酸誘導体が立体特異的にD−アミノ酸に
転換され、D、L−アミノ酸誘導体混合物を原料として
立体異性的に純粋なり一アミノ酸を容易に製造すること
ができる。
きる。この混合物を使用する場合、本発明の方法によれ
ば、D−アミノ酸誘導体が立体特異的にD−アミノ酸に
転換され、D、L−アミノ酸誘導体混合物を原料として
立体異性的に純粋なり一アミノ酸を容易に製造すること
ができる。
本発明の方法においては、反応触媒としてアミノペプチ
ダーゼ又はその含有物を使用する。ここで、アミノペプ
チダーゼとは、前記のごとき基質にD立体異性的に作用
してD−アミノ酸を生成する酵素を意味し、アミノペプ
チダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ
、アシダーゼ、アミラーゼ、等と通称されるものを含む
。この様な酵素として、前記のごとき微生物により生産
される酵素を挙げることができる。しかしながら、本発
明の方法においては、純粋に単離された酵素のほかに、
アミノペプチダーゼの酵素活性を有する任意の材料を使
用することができる。この様な酵素活性材料として、例
えば前に挙げた微生物のブロス、すなわち培養菌体と培
地との混合物、分離された培養菌体、培養上清、菌体処
理物等を使用することができる。菌体処理物としては、
乾燥菌体、アセトン、エタノールのごとき溶剤で処理さ
れた乾燥菌体、菌体破砕物、酵素の製造方法の項(2)
で記載した酵素の精製過程の任意の段階で得られる部分
精製物、等が挙げられる。また、前記の菌体又は種々の
菌体処理物を常用の酵素固定化法により固定した固定化
酵素品を使用することもできる。固定化担体は、ポリア
クリルアミド、光架橋性樹脂、ポリウレタン樹脂、カッ
パカラギーナン、アルギン酸ナトリウム、イオン交換樹
脂、高分子酵素修飾剤、あるいは半透膜等を用いること
ができる。
ダーゼ又はその含有物を使用する。ここで、アミノペプ
チダーゼとは、前記のごとき基質にD立体異性的に作用
してD−アミノ酸を生成する酵素を意味し、アミノペプ
チダーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、エステラーゼ
、アシダーゼ、アミラーゼ、等と通称されるものを含む
。この様な酵素として、前記のごとき微生物により生産
される酵素を挙げることができる。しかしながら、本発
明の方法においては、純粋に単離された酵素のほかに、
アミノペプチダーゼの酵素活性を有する任意の材料を使
用することができる。この様な酵素活性材料として、例
えば前に挙げた微生物のブロス、すなわち培養菌体と培
地との混合物、分離された培養菌体、培養上清、菌体処
理物等を使用することができる。菌体処理物としては、
乾燥菌体、アセトン、エタノールのごとき溶剤で処理さ
れた乾燥菌体、菌体破砕物、酵素の製造方法の項(2)
で記載した酵素の精製過程の任意の段階で得られる部分
精製物、等が挙げられる。また、前記の菌体又は種々の
菌体処理物を常用の酵素固定化法により固定した固定化
酵素品を使用することもできる。固定化担体は、ポリア
クリルアミド、光架橋性樹脂、ポリウレタン樹脂、カッ
パカラギーナン、アルギン酸ナトリウム、イオン交換樹
脂、高分子酵素修飾剤、あるいは半透膜等を用いること
ができる。
工業的な実施にあたっては、生菌体、固定化菌体等を用
いるのが有利である。
いるのが有利である。
反応液中のアミノペプチダーゼの量は基質、例えばD−
アミノ酸アミドの濃度等によって異なり特に限定されな
いが、通常1〜100,000単位とするのが便利であ
る。
アミノ酸アミドの濃度等によって異なり特に限定されな
いが、通常1〜100,000単位とするのが便利であ
る。
原料のD−アミノ酸誘導体、例えばアミドの添加量は、
反応液中の前記酵素の濃度等により異なり、反応を阻害
しない程度であれば特に限定されないが、1〜500g
/j2とするのが便利である。
反応液中の前記酵素の濃度等により異なり、反応を阻害
しない程度であれば特に限定されないが、1〜500g
/j2とするのが便利である。
低濃度で使用する場合には遊離塩基の形で使用すること
ができるが、比較的高濃度で使用する場合には例えば、
塩酸塩やトシル酸塩等の形で使用するのがpit調整の
観点から好ましい。D−アミノ酸誘導体もしくはその含
有物又はその塩はバッチ式反応においては反応開始時に
一度に添加することもでき、又反応の進行と共に複数回
に分割して、もしくは連続的に添加することもできる。
ができるが、比較的高濃度で使用する場合には例えば、
塩酸塩やトシル酸塩等の形で使用するのがpit調整の
観点から好ましい。D−アミノ酸誘導体もしくはその含
有物又はその塩はバッチ式反応においては反応開始時に
一度に添加することもでき、又反応の進行と共に複数回
に分割して、もしくは連続的に添加することもできる。
反応媒体としては、水、アセトン、アセニトリル、DM
SQ 、 DMF等を含む緩衝作用を有する水溶液を用
いることができる。緩衝液としては、例えば、トリス−
HCβ緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール=HC1緩
衝液、HEPES −Na011緩衝液、TRICIN
E−NaOH緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液、ホウ酸−NaOH緩衝液等を使用すること
ができる。また、ケトン、エーテル、炭化水素、芳香族
オレフィン、ハロゲン化炭化水素、有機酸エステル、ア
ルコール、ニトリル等水と混合しない有機溶媒をも用い
ることもできる0例えば、メチルブチルケトン、イソプ
ロピルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、
シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロフォルム、二塩化
メチレン、トリクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キ
シレン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ヘキサ
ノール、オクタツール等を水と共存させて使用すること
ができる。また、それらの有機溶媒の混合物を使うこと
もできるし、水を飽和させた有機溶媒、緩衝作用を有す
る水溶液との二層系あるいは、ミセル、逆ミセル、エマ
ルジョンとして反応させることもできる。
SQ 、 DMF等を含む緩衝作用を有する水溶液を用
いることができる。緩衝液としては、例えば、トリス−
HCβ緩衝液、リン酸緩衝液、イミダゾール=HC1緩
衝液、HEPES −Na011緩衝液、TRICIN
E−NaOH緩衝液、炭酸ナトリウム−炭酸水素ナトリ
ウム緩衝液、ホウ酸−NaOH緩衝液等を使用すること
ができる。また、ケトン、エーテル、炭化水素、芳香族
オレフィン、ハロゲン化炭化水素、有機酸エステル、ア
ルコール、ニトリル等水と混合しない有機溶媒をも用い
ることもできる0例えば、メチルブチルケトン、イソプ
ロピルエーテル、石油エーテル、ヘキサン、ヘプタン、
シクロヘキサン、四塩化炭素、クロロフォルム、二塩化
メチレン、トリクロロエタン、ベンゼン、トルエン、キ
シレン、酢酸エチル、酢酸ブチル、ブタノール、ヘキサ
ノール、オクタツール等を水と共存させて使用すること
ができる。また、それらの有機溶媒の混合物を使うこと
もできるし、水を飽和させた有機溶媒、緩衝作用を有す
る水溶液との二層系あるいは、ミセル、逆ミセル、エマ
ルジョンとして反応させることもできる。
反応のpHとしては、pH5〜11、好ましくはpH6
〜10とする。
〜10とする。
反応の温度も反応のpHと同様に考えることができるが
、通常は20〜60℃、好ましくは25〜50℃である
。
、通常は20〜60℃、好ましくは25〜50℃である
。
反応時間は、特に限定されないが、反応混合物の基質濃
度、酵素力価等、に依存して基質D−アミノ酸アミド含
有物が充分な収率でD−アミノ酸に転換されるまで反応
を維持する。
度、酵素力価等、に依存して基質D−アミノ酸アミド含
有物が充分な収率でD−アミノ酸に転換されるまで反応
を維持する。
生成したD−アミノ酸は任意に常法によって精製採取す
ることができる。例えば、反応終了後に、トリクロロ酢
酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体(存在する場合に
は)と共に濾過し、濾液からイオン交換樹脂等により精
製し、結晶化する。
ることができる。例えば、反応終了後に、トリクロロ酢
酸を加えて蛋白質を沈澱せしめ、菌体(存在する場合に
は)と共に濾過し、濾液からイオン交換樹脂等により精
製し、結晶化する。
(6)D−アミノ N−アミドのU合法本発明はさらに
、D−アミ人酸N−置換アミドの製造方法を提供する。
、D−アミ人酸N−置換アミドの製造方法を提供する。
この方法においては、アミノペプチダーゼ又はそれを含
有する物の存在下でD−アミノ酸の誘導体とN−置換ア
ミンとを反応せしめることによりD−アミノ酸N−置換
アミドを生成せしめ、これを採取する。
有する物の存在下でD−アミノ酸の誘導体とN−置換ア
ミンとを反応せしめることによりD−アミノ酸N−置換
アミドを生成せしめ、これを採取する。
本発明のアミノペプチダーゼは次の可逆反応:(n)
を触媒することができ、この反応を利用してD−アミノ
酸N−置換アミドを製造することができる。
酸N−置換アミドを製造することができる。
この方法は、D−アラニンN−置換アミドの製造のため
に最も効果的に利用することができるが、D−アミノ酸
部分が例えばD−2−アミノ酪酸、D−バリン、D−ノ
ルバリン、D−フェニルグリシン等であるD−アミノ酸
N−置換アミドの製造のためにも使用することができる
。
に最も効果的に利用することができるが、D−アミノ酸
部分が例えばD−2−アミノ酪酸、D−バリン、D−ノ
ルバリン、D−フェニルグリシン等であるD−アミノ酸
N−置換アミドの製造のためにも使用することができる
。
基質であるD−アミノ酸誘導体としては、D−アミノ酸
の製造方法(5)において記載したD−アミノ酸誘導体
を使用することができ、反応性の観点から、D−アミノ
酸のエステル、例えばメチルエステル、エチルエステル
、プロビルエステル等が好ましい。基質原料としては、
前記のごときD−アミノ酸誘導体を使用することができ
、またこれらのD−アミノ酸誘導体とL−アミノ酸誘導
体との混合物を使用することができる。D、L−混合物
を使用する場合、酵素がD立体特異的に作用して、D−
アミノ酸N−置換アミドが選択的に生成する。
の製造方法(5)において記載したD−アミノ酸誘導体
を使用することができ、反応性の観点から、D−アミノ
酸のエステル、例えばメチルエステル、エチルエステル
、プロビルエステル等が好ましい。基質原料としては、
前記のごときD−アミノ酸誘導体を使用することができ
、またこれらのD−アミノ酸誘導体とL−アミノ酸誘導
体との混合物を使用することができる。D、L−混合物
を使用する場合、酵素がD立体特異的に作用して、D−
アミノ酸N−置換アミドが選択的に生成する。
もう一方の基質であるアミンとしては、−級炭素、二級
炭素又は三級炭素にアミノ基が結合したアミンが使用さ
れる。N−置換基としてはアルキル基、シクロアルキル
基、シクロアルキル−アルキル基、アリール基、アラル
キル基、複素環基等が挙げられる。アルキル基は例えば
直鎖又は分岐鎖のアルキル基、例えばメチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソ
ブチル基、3−ペンチル基等を包含する、炭素原子数1
〜.20個のアルキル基であることができる。
炭素又は三級炭素にアミノ基が結合したアミンが使用さ
れる。N−置換基としてはアルキル基、シクロアルキル
基、シクロアルキル−アルキル基、アリール基、アラル
キル基、複素環基等が挙げられる。アルキル基は例えば
直鎖又は分岐鎖のアルキル基、例えばメチル基、エチル
基、プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、イソ
ブチル基、3−ペンチル基等を包含する、炭素原子数1
〜.20個のアルキル基であることができる。
またシクロアルキル基としては、シクロペンチル基、シ
クロヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキル−アル
キル基としては、例えばジシクロプロピルメチル基、フ
ェンチル基、t−ブチルシクロプロピルメチル基等が挙
げられる。また、アリール基としては、例えばフェニル
基が挙げられ、アラルキル基としてはベンジル基が挙げ
られる。
クロヘキシル基等が挙げられる。シクロアルキル−アル
キル基としては、例えばジシクロプロピルメチル基、フ
ェンチル基、t−ブチルシクロプロピルメチル基等が挙
げられる。また、アリール基としては、例えばフェニル
基が挙げられ、アラルキル基としてはベンジル基が挙げ
られる。
複素環基としては例えばテトラヒドロチオフェン−3−
イル基、チエクン−3−イル基、テトラメチル−1,1
−ジオキソエタン−3−イル基等が挙げられる。これら
の基はさらに他の置換基により置換されていてもよい。
イル基、チエクン−3−イル基、テトラメチル−1,1
−ジオキソエタン−3−イル基等が挙げられる。これら
の基はさらに他の置換基により置換されていてもよい。
この方法において使用する酵素又はその含有物としては
、D−アミノ酸の製造方法(5)において記載した種々
の形態のものを使用することができる。
、D−アミノ酸の製造方法(5)において記載した種々
の形態のものを使用することができる。
反応媒体としては、D−アミノ酸の製造方法(5)にお
いて記載した種々の媒体を使用することができる。D−
アミノ酸N−置換アミド合成反応においては基質のアミ
ノ酸エステルや生成物のD−アミノ酸N−置換アミドが
、酵素的、非酵素的に加水分解を受ける可能性があるの
で、水の存在を極力少なくした方がよく、有機溶媒中で
の反応が特に望ましい。
いて記載した種々の媒体を使用することができる。D−
アミノ酸N−置換アミド合成反応においては基質のアミ
ノ酸エステルや生成物のD−アミノ酸N−置換アミドが
、酵素的、非酵素的に加水分解を受ける可能性があるの
で、水の存在を極力少なくした方がよく、有機溶媒中で
の反応が特に望ましい。
基質であるD−アミノ酸誘導体及びアミンの添加量は、
反応液中の前記酵素の濃度等により異なり、反応を阻害
しない程度であれば特に限定されないが、1〜500g
/j!とするのが便利である。
反応液中の前記酵素の濃度等により異なり、反応を阻害
しない程度であれば特に限定されないが、1〜500g
/j!とするのが便利である。
低濃度で使用する場合には遊離塩基の形で使用すること
ができるが、比較的高濃度で使用する場合には例えば、
塩酸塩、やトシル酸塩等の形で使用するのがpH調整の
観点から好ましい、基質は、バッチ式反応においては反
応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行と
共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加すること
もできる。
ができるが、比較的高濃度で使用する場合には例えば、
塩酸塩、やトシル酸塩等の形で使用するのがpH調整の
観点から好ましい、基質は、バッチ式反応においては反
応開始時に一度に添加することもでき、又反応の進行と
共に複数回に分割して、もしくは連続的に添加すること
もできる。
反応のpHとしては、pH5〜11、好ましくはp)1
6〜10とする。
6〜10とする。
反応の温度も反応のpHと同様に考えることができるが
、通常は20〜60℃、好ましくは25〜50℃である
。
、通常は20〜60℃、好ましくは25〜50℃である
。
反応時間は、特に限定されないが、反応混合物の基質濃
度、酵素力価等に依存して基質アミノ酸アミドあるいは
アミノ酸エステルが充分な収率でD−アミノ酸N−置換
アミドに転換されるまで反応を維持する。
度、酵素力価等に依存して基質アミノ酸アミドあるいは
アミノ酸エステルが充分な収率でD−アミノ酸N−置換
アミドに転換されるまで反応を維持する。
生成したD−アミノ酸N−置換アミドは任意に常法によ
って精製採取することができる。例えば、反応終了後に
、菌体や固定化した酵素剤(存在する場合には)を濾過
し、濾液中に含まれるD−アミノ酸N−置換アミドを溶
媒抽出やイオン交換樹脂等により精製し、結晶化する。
って精製採取することができる。例えば、反応終了後に
、菌体や固定化した酵素剤(存在する場合には)を濾過
し、濾液中に含まれるD−アミノ酸N−置換アミドを溶
媒抽出やイオン交換樹脂等により精製し、結晶化する。
次に実施例によりこの発明をさらに具体的に説明する。
グルコース0.1%、トリプトン0.5%、酵母エキス
0.5%、KJPOt 0.1%を含有し、pH7,0
に調製した培地10リツターを120℃、15分間加熱
殺菌した。これにアクロモバクタ−s p .SCRC
C1−38(微工研菌寄第タクl乙号)を接種し、30
℃で約18時間振とう培養して湿重量約90gの菌体を
得た。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、0.1 mM
EDTA及び5 MM 2−メルカプトエタノ−ルを
含むリン酸緩衝液(pH7,0)300−に懸濁し、9
KHzにおける超音波処理を約20分(計約2.5時
間)行ない菌体を破砕した。破砕菌体は14,000X
g、20分間の遠心分離で除去し、アミノペプチダーゼ
を含む素抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン
硫酸を3.8g加えて、30分撹拌した後、14,00
0x g、20分間の遠心分離で沈澱を除去した。この
上清に固形硫酸アンモニウムを加え30%硫酸アンモニ
ウム飽和とした。30分撹拌の後、生成した沈澱を14
.000X gで20分間の遠心分離で除去した。この
上清に固形硫酸アンモニウムを加え90%硫酸アンモニ
ウム飽和とした。14,0OOX gで20分間の遠心
分離で得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の0.0
1Mリン酸緩衝液(pH7,0)に溶解し、さらに0.
1mMのEDTA及び5mMの2−メルカプトエタノー
ルを含む0.OIM’Jン酸緩衝液(pH7,0)で透
析した。この酵素液をあらかじめ0.1 mHのEDT
A及び5mMの2−メルカプトエタノールを含む0.0
1Mリン酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したDBAE
−1−ヨパール650Mのカラムに通過させ、0.1
a+MのEDTA、 5 mMの2−メルカプトエタノ
ール、及び0.1 MのMaceを含む0.OIMIJ
ン酸緩衝液(pH7,0)で溶出した。活性区分を集め
、0.1 mMのEDTA及び5mMの2−メルカプト
エタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、0.1 mMのf
!DTA及び5mMの2−メルカプトエタノールを含む
0.01Mから0.5Mリン酸緩衝液(pH7,0)の
直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を
集め、30%飽和となるように硫安を加えた後、あらか
じめ0.1mMのEDTA、 5 mMの2−メルカプ
トエタノール、及び30%飽和の硫安を含む0.01M
リン酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したブチルトヨバ
ールのカラムに通過させ、0.1mMのEDTA及び5
mMの2−メルカプトエタノールを含む30%から0%
飽和の硫安を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)の直線的な濃度勾配で酵゛素を溶出させた。
0.5%、KJPOt 0.1%を含有し、pH7,0
に調製した培地10リツターを120℃、15分間加熱
殺菌した。これにアクロモバクタ−s p .SCRC
C1−38(微工研菌寄第タクl乙号)を接種し、30
℃で約18時間振とう培養して湿重量約90gの菌体を
得た。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、0.1 mM
EDTA及び5 MM 2−メルカプトエタノ−ルを
含むリン酸緩衝液(pH7,0)300−に懸濁し、9
KHzにおける超音波処理を約20分(計約2.5時
間)行ない菌体を破砕した。破砕菌体は14,000X
g、20分間の遠心分離で除去し、アミノペプチダーゼ
を含む素抽出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン
硫酸を3.8g加えて、30分撹拌した後、14,00
0x g、20分間の遠心分離で沈澱を除去した。この
上清に固形硫酸アンモニウムを加え30%硫酸アンモニ
ウム飽和とした。30分撹拌の後、生成した沈澱を14
.000X gで20分間の遠心分離で除去した。この
上清に固形硫酸アンモニウムを加え90%硫酸アンモニ
ウム飽和とした。14,0OOX gで20分間の遠心
分離で得られる、酵素活性を有する沈澱を少量の0.0
1Mリン酸緩衝液(pH7,0)に溶解し、さらに0.
1mMのEDTA及び5mMの2−メルカプトエタノー
ルを含む0.OIM’Jン酸緩衝液(pH7,0)で透
析した。この酵素液をあらかじめ0.1 mHのEDT
A及び5mMの2−メルカプトエタノールを含む0.0
1Mリン酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したDBAE
−1−ヨパール650Mのカラムに通過させ、0.1
a+MのEDTA、 5 mMの2−メルカプトエタノ
ール、及び0.1 MのMaceを含む0.OIMIJ
ン酸緩衝液(pH7,0)で溶出した。活性区分を集め
、0.1 mMのEDTA及び5mMの2−メルカプト
エタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)で透析後、あらかじめ同じ緩衝液で平衡化したヒドロ
キシアパタイトのカラムに通過させ、0.1 mMのf
!DTA及び5mMの2−メルカプトエタノールを含む
0.01Mから0.5Mリン酸緩衝液(pH7,0)の
直線的な濃度勾配で酵素を溶出させた。この活性区分を
集め、30%飽和となるように硫安を加えた後、あらか
じめ0.1mMのEDTA、 5 mMの2−メルカプ
トエタノール、及び30%飽和の硫安を含む0.01M
リン酸緩衝液(pH7,0)で平衡化したブチルトヨバ
ールのカラムに通過させ、0.1mMのEDTA及び5
mMの2−メルカプトエタノールを含む30%から0%
飽和の硫安を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7,0
)の直線的な濃度勾配で酵゛素を溶出させた。
活性区分を集め、0.1 n+MのEDTA及び5mM
の2−メルカプトエタノールを含む0.01Mリン酸緩
衝液(pH7,0)で透析後、約3−に濃縮し、0.1
mMのEDTA及び5mMの2−メルカプトエタノール
及び0、1 M NaCj+を含む0.05Mリン酸緩
衝液(pH7,0)で平衡化したセファデックスG−2
00によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。こ
うして、アミノペプチダーゼを約4.400倍に精製し
た。この精製課程における比活性及び回収率を第3表に
示す。
の2−メルカプトエタノールを含む0.01Mリン酸緩
衝液(pH7,0)で透析後、約3−に濃縮し、0.1
mMのEDTA及び5mMの2−メルカプトエタノール
及び0、1 M NaCj+を含む0.05Mリン酸緩
衝液(pH7,0)で平衡化したセファデックスG−2
00によるゲル濾過クロマトグラフィーを行なった。こ
うして、アミノペプチダーゼを約4.400倍に精製し
た。この精製課程における比活性及び回収率を第3表に
示す。
1、 無細胞抽出液 339 6240
0.05432、 プロタミン処理 435
6B50 0.06353、硫安分画(30−9
0%) 344 4970 0.06924
、 DEAE−1−ヨパール 299 304
0.984この酵素はPhen、y−5PW
カラムクロマトグラフイーにより単一のピークを与え(
第1図)、及び5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において均一であることが証明された(第2図)。
0.05432、 プロタミン処理 435
6B50 0.06353、硫安分画(30−9
0%) 344 4970 0.06924
、 DEAE−1−ヨパール 299 304
0.984この酵素はPhen、y−5PW
カラムクロマトグラフイーにより単一のピークを与え(
第1図)、及び5DS−ポリアクリルアミドゲル電気泳
動において均一であることが証明された(第2図)。
グルコース0.1%、トリプトン0.5%、酵母エキス
0.5%、KJPO40,1%を含有し、pH7,0に
調製した培地20リツターを120℃、15分間加熱殺
菌した。これにアクロモバクタ−sp.SCRCC1−
38(微工研菌寄第り9/6号)を接種し、30℃で約
18時間振とう培養して湿重量約186gの菌体を得た
。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、0.1 n+M
EDTA及び5mM2−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液(pH7,0)300−に懸濁し、9 KH
zにおける超音波処理を約20分(計約5時間)行ない
菌体を破砕した。破砕菌体は14.OOOXg、20分
間の遠心分離で除去し、アミノペプチダーゼを含む素抽
出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を7.
6g加えて、30分撹拌した後、14,0OOX g、
20分間の遠心分離で沈澱を除去した。この上清に固
形硫酸アンモニウムを加え30%硫酸アンモニウム飽和
とした。30分撹拌の後、生成した沈澱を14.0OO
X gで20分間の遠心分離で除去した。この上清に固
形硫酸アンモニウムを加え90%硫酸アンモニウム飽和
とした。
0.5%、KJPO40,1%を含有し、pH7,0に
調製した培地20リツターを120℃、15分間加熱殺
菌した。これにアクロモバクタ−sp.SCRCC1−
38(微工研菌寄第り9/6号)を接種し、30℃で約
18時間振とう培養して湿重量約186gの菌体を得た
。菌体を生理的食塩水で洗浄した後、0.1 n+M
EDTA及び5mM2−メルカプトエタノールを含むリ
ン酸緩衝液(pH7,0)300−に懸濁し、9 KH
zにおける超音波処理を約20分(計約5時間)行ない
菌体を破砕した。破砕菌体は14.OOOXg、20分
間の遠心分離で除去し、アミノペプチダーゼを含む素抽
出液を得た。この無細胞抽出液にプロタミン硫酸を7.
6g加えて、30分撹拌した後、14,0OOX g、
20分間の遠心分離で沈澱を除去した。この上清に固
形硫酸アンモニウムを加え30%硫酸アンモニウム飽和
とした。30分撹拌の後、生成した沈澱を14.0OO
X gで20分間の遠心分離で除去した。この上清に固
形硫酸アンモニウムを加え90%硫酸アンモニウム飽和
とした。
14.0OOX gで20分間の遠心分離で得られる、
酵素活性を有する沈澱を少量の0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)に溶解し、さらに0.1mMのEDTA
及び5mMの2−メルカプトエタノールを含む0.01
Mリン酸緩衝液(pH7,0)で透析した。この酵素液
をあらかじめ0.1 mHのEDTA及び5mMの2−
メルカプトエタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液(
pH7,0)で平衡化したDEAE−)ヨバール650
Mのカラムに通過させ、0.1 mMのEDTA、
5 n+Mの2−メルカプトエタノール、及び0.1
MのNaC1を含む0.01MIJン酸緩衝液(pH7
,0)で溶出した。活性区分を集め、30%飽和となる
ように硫安を加えた後、あらかじめ0.1mMのEDT
A、 5 mMの2−メルカプトエタノール、及び3
0%飽和の硫安を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7
,0)で平衡化したブチルトヨパールのカラムに通過さ
せ、0.1mMのEDTA及び5mMの2−メルカプト
エタノールを含む30%から0%飽和の硫安を含む0.
01Mリン酸緩衝液(pH7,0)の直線的な濃度勾配
で酵素を溶出させた。
酵素活性を有する沈澱を少量の0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)に溶解し、さらに0.1mMのEDTA
及び5mMの2−メルカプトエタノールを含む0.01
Mリン酸緩衝液(pH7,0)で透析した。この酵素液
をあらかじめ0.1 mHのEDTA及び5mMの2−
メルカプトエタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液(
pH7,0)で平衡化したDEAE−)ヨバール650
Mのカラムに通過させ、0.1 mMのEDTA、
5 n+Mの2−メルカプトエタノール、及び0.1
MのNaC1を含む0.01MIJン酸緩衝液(pH7
,0)で溶出した。活性区分を集め、30%飽和となる
ように硫安を加えた後、あらかじめ0.1mMのEDT
A、 5 mMの2−メルカプトエタノール、及び3
0%飽和の硫安を含む0.01Mリン酸緩衝液(pH7
,0)で平衡化したブチルトヨパールのカラムに通過さ
せ、0.1mMのEDTA及び5mMの2−メルカプト
エタノールを含む30%から0%飽和の硫安を含む0.
01Mリン酸緩衝液(pH7,0)の直線的な濃度勾配
で酵素を溶出させた。
活性区分を集め、0.1mMのEDT八及び5mMの2
−メルカプトエタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)で透析した。こうして、アミノペプチダ
ーゼを約1 、500倍に、収率はぼ100%で部分精
製した。この精製課程における比活性及び回収率を第4
表に示す。
−メルカプトエタノールを含む0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)で透析した。こうして、アミノペプチダ
ーゼを約1 、500倍に、収率はぼ100%で部分精
製した。この精製課程における比活性及び回収率を第4
表に示す。
1、無細胞抽出液 1170 5920
0.1972、プロタミン処理 1490 41
70 0.3573、硫安分画(30−90%)
1430 2410 0.5944、 DE
AR−)ヨパール 1370 279 4.
925、ブチル−トヨバール 1200 40.0
30.0実隻孤3. アクロモバク −s 、 5
CRCC1−38のDL−アラニンアミド塩酸塩934
■(0,0075■ol)を0.2 Mリン酸緩衝液(
pH7,0)75−に溶解し、0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)で透析したアミノペプチダーゼ210単
位(実施例2において部分精製した比活性30単位/■
の酵素)を加えて、37℃で1時間保温した。反応液中
に生成したD−アラニンをアンバーライトIRA−40
0(C1−)カラムに吸着させ、水洗後、IN塩酸で溶
出させた。
0.1972、プロタミン処理 1490 41
70 0.3573、硫安分画(30−90%)
1430 2410 0.5944、 DE
AR−)ヨパール 1370 279 4.
925、ブチル−トヨバール 1200 40.0
30.0実隻孤3. アクロモバク −s 、 5
CRCC1−38のDL−アラニンアミド塩酸塩934
■(0,0075■ol)を0.2 Mリン酸緩衝液(
pH7,0)75−に溶解し、0.01Mリン酸緩衝液
(pH7,0)で透析したアミノペプチダーゼ210単
位(実施例2において部分精製した比活性30単位/■
の酵素)を加えて、37℃で1時間保温した。反応液中
に生成したD−アラニンをアンバーライトIRA−40
0(C1−)カラムに吸着させ、水洗後、IN塩酸で溶
出させた。
この溶液を減圧下fI縮し、Dowex 50 WX
8 (H” )カラムに吸着させ、水洗後、INアンモ
ニア水で溶出させた。減圧下:a縮し、D−アラニンを
313■(4s、j%)得た。得られたD−アラニンは
水−メタノール−イソプロビルアルコール−エーテルで
再結晶し、市販のD−アラニンとスペクトルデータを比
較した。
8 (H” )カラムに吸着させ、水洗後、INアンモ
ニア水で溶出させた。減圧下:a縮し、D−アラニンを
313■(4s、j%)得た。得られたD−アラニンは
水−メタノール−イソプロビルアルコール−エーテルで
再結晶し、市販のD−アラニンとスペクトルデータを比
較した。
JjJAυl (α) =−14,15° (c=
6.6.1N HCjt )(標品〔α)80−−14
〜−15°(C・6゜IN HCjt ))。
6.6.1N HCjt )(標品〔α)80−−14
〜−15°(C・6゜IN HCjt ))。
二重 289〜291℃ (標品291〜293℃
)。
)。
4.75(br) 。
MS、 l1le 44 (21%)、 57(22
%)、 75(29%)。
%)、 75(29%)。
90(100%1M+)。
云」しHll
計算値 実測値
C40,4440,24
I(7,928,12
N 15.72 15.55
グルコース0.1%、トリプトン0.5%、酵母エキス
0.5%、K2HPO4,0,1%を含有し、pH7,
0に調製した培地200−を120℃、15分間加熱殺
菌した後、フラボバクテリウム・スアベロレンズIFO
3752を接種し、20時間培養した。菌体を生理的食
塩水で洗浄した後、実施例1と同様にして菌体を破砕し
、破砕菌体を遠心により除去した。。
0.5%、K2HPO4,0,1%を含有し、pH7,
0に調製した培地200−を120℃、15分間加熱殺
菌した後、フラボバクテリウム・スアベロレンズIFO
3752を接種し、20時間培養した。菌体を生理的食
塩水で洗浄した後、実施例1と同様にして菌体を破砕し
、破砕菌体を遠心により除去した。。
上清を0.01Mリン酸緩衝液に1晩透析し、無細胞抽
出液を得た。
出液を得た。
DL−アラニンアミド塩酸塩2.49w (20μmo
l)、リン酸緩衝液(pH7,0)100 tt mo
l 、上記無細胞抽出液200バ、D−シクロセリン1
0μmolを1−中に含む反応液を30℃で10分反応
させた。煮沸により反応停止後、反応液中に含まれるD
−アラニンをD−アミノ酸酸化酵素を用いて定量したと
ころ0.46μmolのD−アラニンを含んでいた。
l)、リン酸緩衝液(pH7,0)100 tt mo
l 、上記無細胞抽出液200バ、D−シクロセリン1
0μmolを1−中に含む反応液を30℃で10分反応
させた。煮沸により反応停止後、反応液中に含まれるD
−アラニンをD−アミノ酸酸化酵素を用いて定量したと
ころ0.46μmolのD−アラニンを含んでいた。
一方反応液中に含まれるし一アラニンをL−アミノ酸脱
水素酵素を用いて定量したところ0.048μmolの
L−アラニンを含んでいた。
水素酵素を用いて定量したところ0.048μmolの
L−アラニンを含んでいた。
以下余白
!!flJ14. アクロモバク −s 、 5C
RCC1−38D−アラニンメチルエステル塩酸塩Q、
111111101%3−アミノペンタン0.511
1101%アミノペプチダーゼ13.2単位(実施例2
において部分精製した比活性30単位/■の酵素)を水
1−中に含む反応液を30℃で保温した0反応液中に生
成したアミノ酸アミドは、常法によりペーパークロマト
グラフィーを行い、ニンヒドリン噴霧により発色させ、
スポットを抽出した後、別途化学合成したアミノ酸アミ
ドを標準サンプルとして作成した検量線より定量した。
RCC1−38D−アラニンメチルエステル塩酸塩Q、
111111101%3−アミノペンタン0.511
1101%アミノペプチダーゼ13.2単位(実施例2
において部分精製した比活性30単位/■の酵素)を水
1−中に含む反応液を30℃で保温した0反応液中に生
成したアミノ酸アミドは、常法によりペーパークロマト
グラフィーを行い、ニンヒドリン噴霧により発色させ、
スポットを抽出した後、別途化学合成したアミノ酸アミ
ドを標準サンプルとして作成した検量線より定量した。
その結果、反応時間7.5分を経過した時、収率78%
で、D−アラニン−3−アミノペンタンアミドが生成し
ていた。
で、D−アラニン−3−アミノペンタンアミドが生成し
ていた。
実l舅5. アクロモバク −s 、 5CRCC1
−38アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−3
8由来の酵素をフクイとタナ力(Advance in
Biocheo+1cal Hngi−neerin
g/Biotechnology 2!LH1984)
)の方法に従って光架橋性樹脂ENTG−3800でフ
ィルム状に固定化し、さらに細かく裁断した。D−アラ
ニンメチルエステル塩et!塩0.1 mmol、 3
−アミノペンタンQ、 5 ff1o+ol、アミノペ
プチダーゼ0.94単位(実施例2において部分精製し
た比活性30単位/■の酵素)を含む固定化酵素0.5
gを加えて反応液1−とし、30℃で保温した。反応1
20分後、実施例4の方法に従って定量したところ、反
応液中には、収率24%でD−アラニン−3−アミノペ
ンタンアミドが生成していた。
−38アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−3
8由来の酵素をフクイとタナ力(Advance in
Biocheo+1cal Hngi−neerin
g/Biotechnology 2!LH1984)
)の方法に従って光架橋性樹脂ENTG−3800でフ
ィルム状に固定化し、さらに細かく裁断した。D−アラ
ニンメチルエステル塩et!塩0.1 mmol、 3
−アミノペンタンQ、 5 ff1o+ol、アミノペ
プチダーゼ0.94単位(実施例2において部分精製し
た比活性30単位/■の酵素)を含む固定化酵素0.5
gを加えて反応液1−とし、30℃で保温した。反応1
20分後、実施例4の方法に従って定量したところ、反
応液中には、収率24%でD−アラニン−3−アミノペ
ンタンアミドが生成していた。
同様に、光架橋性樹脂ENTP−2000で固定化した
酵素を用いて、反応180分後、収率33%でD−アラ
ニン−3−アミノペンタンアミドを合成した。
酵素を用いて、反応180分後、収率33%でD−アラ
ニン−3−アミノペンタンアミドを合成した。
同様に、ウレタン樹脂PU−6で固定化した酵素(1,
6単位)を用いて、上記の反応組成で60分反応したと
ころ、収率29%でD−アラニン−3−アミノペンタン
アミドが合成できた。
6単位)を用いて、上記の反応組成で60分反応したと
ころ、収率29%でD−アラニン−3−アミノペンタン
アミドが合成できた。
以下余白
尖l奥6.アクロモバクタ−s 、 5CRCC1−
38アクロモバクタ−s p .SCRCC1−38由
来の酵素をフクイとタナ力(Advance in B
iochemical Engi−neering/B
iotechnology 29+1(1984))の
方法に従ってウレタン樹脂PU−6で固定化し、さらに
細かく裁断した。D−アラニンメチルエステル塩酸塩0
.1 mmol、 3−アミノペンタン0.5 mmo
Lアミノペプチダーゼ1.6単位(実施例2において部
分精製した比活性30単位/■の酵素)を含む固定化酵
素0.2gを酢酸ブチル、ベンゼン、トリクロロエタン
、トルエン、及びイソプロピルエーテルのそれぞれ水飽
和溶液のうち1種、1mj中に加え、30℃で保温した
。反応60分後にD−アラニン−3−アミノペンタンア
ミドは収率それぞれ、100゜100.90,62.2
2%で合成された。
38アクロモバクタ−s p .SCRCC1−38由
来の酵素をフクイとタナ力(Advance in B
iochemical Engi−neering/B
iotechnology 29+1(1984))の
方法に従ってウレタン樹脂PU−6で固定化し、さらに
細かく裁断した。D−アラニンメチルエステル塩酸塩0
.1 mmol、 3−アミノペンタン0.5 mmo
Lアミノペプチダーゼ1.6単位(実施例2において部
分精製した比活性30単位/■の酵素)を含む固定化酵
素0.2gを酢酸ブチル、ベンゼン、トリクロロエタン
、トルエン、及びイソプロピルエーテルのそれぞれ水飽
和溶液のうち1種、1mj中に加え、30℃で保温した
。反応60分後にD−アラニン−3−アミノペンタンア
ミドは収率それぞれ、100゜100.90,62.2
2%で合成された。
1J17. アクロモバク −s 、 5CRCC
1−38−アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1
−38由来の酵素をウレタン樹脂PU−6で固定化し、
さらに細かく裁断した。D−アラニンメチルエステル塩
酸塩、DL−アラニンメチルエステル塩酸塩、L−アラ
ニンメチルエステル塩酸塩の内いずれかを0.1mmo
l、3−アミノベンクン0.51111I01、アミノ
ペプチダーゼ1.6単位(実施例2において部分精製し
た比活性30単位/■の酵素)を含む固定化酵素0.2
gと共に酢酸ブチル水飽和溶液1−中に加え、30℃で
保温した。D−アラニンメチルエステル塩酸塩を基質と
した反応液では120分後、収率95%でD−アラニン
−3−アミノペンタンアミドが生成していた。
1−38−アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1
−38由来の酵素をウレタン樹脂PU−6で固定化し、
さらに細かく裁断した。D−アラニンメチルエステル塩
酸塩、DL−アラニンメチルエステル塩酸塩、L−アラ
ニンメチルエステル塩酸塩の内いずれかを0.1mmo
l、3−アミノベンクン0.51111I01、アミノ
ペプチダーゼ1.6単位(実施例2において部分精製し
た比活性30単位/■の酵素)を含む固定化酵素0.2
gと共に酢酸ブチル水飽和溶液1−中に加え、30℃で
保温した。D−アラニンメチルエステル塩酸塩を基質と
した反応液では120分後、収率95%でD−アラニン
−3−アミノペンタンアミドが生成していた。
DL−アラニンメチルエステル塩酸塩を基質とした反応
液では12時間後、収率50%でD−アラニン−3−ア
ミノペンタンアミドが生成していた。L−アラニンメチ
ルエステル塩酸塩を基質とした反応液では12時間後で
も全くD−アラニン−3−アミノペンタンアミドが生成
しなかった。
液では12時間後、収率50%でD−アラニン−3−ア
ミノペンタンアミドが生成していた。L−アラニンメチ
ルエステル塩酸塩を基質とした反応液では12時間後で
も全くD−アラニン−3−アミノペンタンアミドが生成
しなかった。
アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38由来
の酵素をPt1−6ウレタンブレボリマーで固定化し、
0.1MのDL−アラニンメチルエステル塩酸塩及び0
.5Mの3−アミノベンクンを含む、水飽和の酢酸ブチ
ル10−に2.0g加え、30℃で6時間振とうした。
の酵素をPt1−6ウレタンブレボリマーで固定化し、
0.1MのDL−アラニンメチルエステル塩酸塩及び0
.5Mの3−アミノベンクンを含む、水飽和の酢酸ブチ
ル10−に2.0g加え、30℃で6時間振とうした。
反応液を減圧濃縮し、4NH(J/酢酸エチルを加えて
塩酸塩とした。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮後
、縮合生成物を単一に精製し、87.9■(収率45.
2%、理論収率90.4%)得た。
塩酸塩とした。無水硫酸マグネシウムで乾燥し、濃縮後
、縮合生成物を単一に精製し、87.9■(収率45.
2%、理論収率90.4%)得た。
生成物はさらにトリエチルアミン存在下、(Boc)
zOでBoc化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー (Hexane/酢酸エチル=1/1)で精製しB
oc−D−Ala−NH(を105■得た。
zOでBoc化し、シリカゲルカラムクロマトグラフィ
ー (Hexane/酢酸エチル=1/1)で精製しB
oc−D−Ala−NH(を105■得た。
得られたBoc化D−アラニン−3−アミノペンタンア
ミドはスペクトルデータに於いて標品のそれとよく一致
した。
ミドはスペクトルデータに於いて標品のそれとよく一致
した。
1.4〜1.52(s、48) 、1.46(s、9H
)、 3.70(m、 IH) 。
)、 3.70(m、 IH) 。
4.13(5th、LH) 5.23(br、1tl)
、6.10(br、IH)。
、6.10(br、IH)。
1369、1252.1169.1069.1002.
609(Kbr)。
609(Kbr)。
止立光皮 〔α〕3°= +50.56°(c=1.2
5.CHCJ 3)(標品【α) isO+ 50.9
0°(c=1.21.CHC1z’)。
5.CHCJ 3)(標品【α) isO+ 50.9
0°(c=1.21.CHC1z’)。
アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38の生
菌体200■(0,042単位)の光架橋性樹脂II!
NTG−3800固定化物、D−アラニンメチルエステ
ル塩酸塩0.1mmols 3−アミノペンタン9.5
mmolを含む水飽和の酢酸ブチルからなる反応液1
−を、30℃で保温したところ、240分後に、収率3
8%でD−アラニン−3−アミノペンタンアミドが合成
できた。
菌体200■(0,042単位)の光架橋性樹脂II!
NTG−3800固定化物、D−アラニンメチルエステ
ル塩酸塩0.1mmols 3−アミノペンタン9.5
mmolを含む水飽和の酢酸ブチルからなる反応液1
−を、30℃で保温したところ、240分後に、収率3
8%でD−アラニン−3−アミノペンタンアミドが合成
できた。
アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38のア
セトン乾燥菌体100■(4単位)、D−アラニンメチ
ルエステル塩酸塩0.1 mmoL 3−アミノペンタ
ン0、5 mmolを含む水飽和の酢酸ブチルからなる
反応液1mlを、30℃で保温したところ、240分後
に、収率5%でD−アラニン−3−アミノペンタンアミ
ドが合成できた。
セトン乾燥菌体100■(4単位)、D−アラニンメチ
ルエステル塩酸塩0.1 mmoL 3−アミノペンタ
ン0、5 mmolを含む水飽和の酢酸ブチルからなる
反応液1mlを、30℃で保温したところ、240分後
に、収率5%でD−アラニン−3−アミノペンタンアミ
ドが合成できた。
以下余白
1m1o、アクロモバク −s 、 5CRCC1−
38アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38
由来の酵素(実施例2において部分精製した比活性30
単位/■の酵素)をウレタン樹脂PU−6で固定化し、
さらに細かく裁断した。D−アラニンメチルエステル塩
酸塩0.1111101% n−ブチルアミン、あるい
はベンジルアミンの内1種Q、 5 mmoLアミノペ
プチダーゼ1.6単位を含む固定化酵素0.2gを酢酸
ブチル水飽和溶液1−中に加え、30℃で8時間保温し
た′、D−アラニンn−ブチルアミド、D−アラニンベ
ンジルアミドの収率は、それぞれ、70、及び14%で
あった。なお、収率は別途合成したD−アラニンアルキ
ルアミドを対照として算出した。すなわち、サンプルを
常法によりダンシル化し、これをヘキサンを溶媒とする
下降法でペーパークロマトグラフィーを行い、蛍光を発
するスポットを切取り、メタノール抽出して205nm
における吸光度から検量線を作成して算出した。
38アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38
由来の酵素(実施例2において部分精製した比活性30
単位/■の酵素)をウレタン樹脂PU−6で固定化し、
さらに細かく裁断した。D−アラニンメチルエステル塩
酸塩0.1111101% n−ブチルアミン、あるい
はベンジルアミンの内1種Q、 5 mmoLアミノペ
プチダーゼ1.6単位を含む固定化酵素0.2gを酢酸
ブチル水飽和溶液1−中に加え、30℃で8時間保温し
た′、D−アラニンn−ブチルアミド、D−アラニンベ
ンジルアミドの収率は、それぞれ、70、及び14%で
あった。なお、収率は別途合成したD−アラニンアルキ
ルアミドを対照として算出した。すなわち、サンプルを
常法によりダンシル化し、これをヘキサンを溶媒とする
下降法でペーパークロマトグラフィーを行い、蛍光を発
するスポットを切取り、メタノール抽出して205nm
における吸光度から検量線を作成して算出した。
以下余白
11、アクロモバク −s 、 5CRCC1−38
アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38由来
の酵素をウレタン樹脂PU−6で固定化し、さらに細か
く裁断した。D−アラニンアミド塩酸塩、DL−アラニ
ンアミド塩酸塩、L−アラニンアミド塩酸塩の内いずれ
かを0.1 mmol、 3−アミノペンクン0、5
mmolsアミノペプチダーゼ1.6単位(実施例2に
おいて部分精製した比活性30単位/■の酵素)を含む
固定化酵素0.2gと共に酢酸ブチル水飽和溶液1−中
に加え、30℃で保温した。D−アラニンアミド塩酸塩
を基質とした反応液では480分後、収率97%でD−
アラニン−3−アミノペンタンアミドが生成していた。
アクロモバクタ−s p 、 5CRCC1−38由来
の酵素をウレタン樹脂PU−6で固定化し、さらに細か
く裁断した。D−アラニンアミド塩酸塩、DL−アラニ
ンアミド塩酸塩、L−アラニンアミド塩酸塩の内いずれ
かを0.1 mmol、 3−アミノペンクン0、5
mmolsアミノペプチダーゼ1.6単位(実施例2に
おいて部分精製した比活性30単位/■の酵素)を含む
固定化酵素0.2gと共に酢酸ブチル水飽和溶液1−中
に加え、30℃で保温した。D−アラニンアミド塩酸塩
を基質とした反応液では480分後、収率97%でD−
アラニン−3−アミノペンタンアミドが生成していた。
DL−アラニンアミド塩酸塩を基質とした反応液では6
00分後、収率48%でD−アラニン−3−アミノペン
タンアミドが生成していた。L−アラニンアミド塩酸塩
を基質とした反応液では24時間後でも全くD−アラニ
ン−3−アミノペンタンアミドが生成しなかった。
00分後、収率48%でD−アラニン−3−アミノペン
タンアミドが生成していた。L−アラニンアミド塩酸塩
を基質とした反応液では24時間後でも全くD−アラニ
ン−3−アミノペンタンアミドが生成しなかった。
以下余白
次m又−
グリセロール0.1%、トリプトン0.5%・酵母エキ
ス0.5%、KtHPO& 0.19/6 D −7ラ
ニンアミド塩酸塩を含有し、pH7,0に調製した培地
100m/を、15分間加熱殺菌した後、各種の菌株を
接種し、30℃で約16時開拡とう培養した。菌体を生
理的食塩水で洗浄した後、0.1 Mリン酸緩衝液(p
H7,0)に懸濁し、9 KH,における超音波処理を
5分間行なった。破砕菌体を遠心分離で除去し、素抽出
液を得た。この素抽出液を0.01Mリン酸緩衝液(p
H7,0)に対して4℃で1晩透析した。このようにし
て得た酵素液中のD−アラニン−p−二トロアニリドお
よびL−アラニンアミドに対するアミノペプチダーゼ活
性を「〔具体的な説明〕(3)力価の測定」に記した方
法で測定した。その結果を第5表に記す。
ス0.5%、KtHPO& 0.19/6 D −7ラ
ニンアミド塩酸塩を含有し、pH7,0に調製した培地
100m/を、15分間加熱殺菌した後、各種の菌株を
接種し、30℃で約16時開拡とう培養した。菌体を生
理的食塩水で洗浄した後、0.1 Mリン酸緩衝液(p
H7,0)に懸濁し、9 KH,における超音波処理を
5分間行なった。破砕菌体を遠心分離で除去し、素抽出
液を得た。この素抽出液を0.01Mリン酸緩衝液(p
H7,0)に対して4℃で1晩透析した。このようにし
て得た酵素液中のD−アラニン−p−二トロアニリドお
よびL−アラニンアミドに対するアミノペプチダーゼ活
性を「〔具体的な説明〕(3)力価の測定」に記した方
法で測定した。その結果を第5表に記す。
皇1■建k 入m目旧m鉦店
(i)β−ベンジルオキシ−N−ベンジルオキシカルボ
ニル−L−アスパルチル−D−アラニン−3−アミノペ
ンタンアミドの合成酵素反応により合成したD−アラ;
ζフィーアミノベンタンアミド・塩酸塩85■(0,5
68mn+ol)及びZ−L−晶0:n(□67.7い
オヤウー、7.オヤウヵルボニルーし一アスパラギン酸
)203mg (0,57n+mol)をアルゴン雰囲
気下DMF 10−に溶解させた0反応部合物に水冷下
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール77 +ng(0,
57mmol)及びN−メチルモルホリン57.6mg
(0,57mmol)を加えた。次いで反応液を一20
℃に冷°却し、ジシクロへキシルカルボジイミド118
[(0,57mmol)のDMF溶液5−を滴下した。
ニル−L−アスパルチル−D−アラニン−3−アミノペ
ンタンアミドの合成酵素反応により合成したD−アラ;
ζフィーアミノベンタンアミド・塩酸塩85■(0,5
68mn+ol)及びZ−L−晶0:n(□67.7い
オヤウー、7.オヤウヵルボニルーし一アスパラギン酸
)203mg (0,57n+mol)をアルゴン雰囲
気下DMF 10−に溶解させた0反応部合物に水冷下
1−ヒドロキシベンゾトリアゾール77 +ng(0,
57mmol)及びN−メチルモルホリン57.6mg
(0,57mmol)を加えた。次いで反応液を一20
℃に冷°却し、ジシクロへキシルカルボジイミド118
[(0,57mmol)のDMF溶液5−を滴下した。
室温まで徐々に昇温し、−晩撹拌後、生成したジシクロ
ヘキシル尿素を濾別した。反応液を減圧上下濃縮し、塩
化メチレンを加え、さらに生じた結晶を濾別した。塩化
メチレン層を5%炭酸水素ナトリウム、水、2規定塩酸
、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥及び活性炭で脱色を行なった。溶媒を留去後、
塩化メチレン−ヘキサンで再結晶を行ない、無色結晶を
244■(86,4%)得た。
ヘキシル尿素を濾別した。反応液を減圧上下濃縮し、塩
化メチレンを加え、さらに生じた結晶を濾別した。塩化
メチレン層を5%炭酸水素ナトリウム、水、2規定塩酸
、水、次いで飽和食塩水で洗浄し、無水硫酸マグネシウ
ムで乾燥及び活性炭で脱色を行なった。溶媒を留去後、
塩化メチレン−ヘキサンで再結晶を行ない、無色結晶を
244■(86,4%)得た。
(m、 4H) 、 0.81〜0.95(m、28)
1.36(d、3H)、2.79(dd、LH)、
3.01〜3.22(m、2H)、 4.38〜4.4
8(m、18) 4.57〜4.63(m、IH)、
5.06〜5.18(m、4H)5.86(d、111
)、6.29(d、IH)、6.85(d、LH) 7
.29〜7.40(m、l0H)。
1.36(d、3H)、2.79(dd、LH)、
3.01〜3.22(m、2H)、 4.38〜4.4
8(m、18) 4.57〜4.63(m、IH)、
5.06〜5.18(m、4H)5.86(d、111
)、6.29(d、IH)、6.85(d、LH) 7
.29〜7.40(m、l0H)。
(ii)L−アスパルチル−〇−アラニンー3−アミノ
ペンタンアミドの合成 アルゴン雰囲気下、2保護ジペプチド252■(0,4
97mmol)をメタノール(15ml)に溶解し、1
0%Pd−C(10■)を加え、水素置換をした。−晩
室温で撹拌後、生成物をセライトで濾過し、減圧R縮し
、水−メタノールより再結晶すると無色固体のジペプチ
ド133■(99,8%)を単一品として得た。
ペンタンアミドの合成 アルゴン雰囲気下、2保護ジペプチド252■(0,4
97mmol)をメタノール(15ml)に溶解し、1
0%Pd−C(10■)を加え、水素置換をした。−晩
室温で撹拌後、生成物をセライトで濾過し、減圧R縮し
、水−メタノールより再結晶すると無色固体のジペプチ
ド133■(99,8%)を単一品として得た。
北豊光皮 Cα〕6°+ 26.92°(cml、30
cHzOH)。
cHzOH)。
旦、、p−、221〜223℃。
1.39(m、IH)、 1.55(m、18)。
2.59(dd、LH)、 2.70(m、IH)。
3.63(a+、18)、 4.08(dd、1)1)
。
。
4.33(q、IH)、 5.0(br)。
T R−ν@ax (KBr Disk) 3450.
3320゜2975、1650.1579.1460.
13B8゜1280、1230.1158.918.6
46゜肢、 m/e 29 (262) 、 44
(100χ)、 57(24χ)。
3320゜2975、1650.1579.1460.
13B8゜1280、1230.1158.918.6
46゜肢、 m/e 29 (262) 、 44
(100χ)、 57(24χ)。
88 (46χ)、 159(26χ)、 274(5
χ9M+)五m侭 計算値 実測値 C52,7352,16 H8,488,4O N 15.37 14.99
χ9M+)五m侭 計算値 実測値 C52,7352,16 H8,488,4O N 15.37 14.99
第1図は本発明の精製酵素のPhenyl−5P−カラ
ムクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示し、本発
明の酵素が均一であることを示すものである。 第2図は本発明の精製酵素の5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果をスケッチしたものであり、本発
明の酵素が均一であることを示す。 以下余白
ムクロマトグラフィーの溶出プロフィールを示し、本発
明の酵素が均一であることを示すものである。 第2図は本発明の精製酵素の5DS−ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動の結果をスケッチしたものであり、本発
明の酵素が均一であることを示す。 以下余白
Claims (1)
- 【特許請求の範囲】 1、D−アミノ酸誘導体に特異的に作用するアミノペプ
チダーゼ。 2、前記D−アミノ酸誘導体がD−アミノ酸アミド、N
末端がD−アミノ酸であるペプチド、又はD−アミノ酸
エステルである請求項1に記載のアミノペプチダーゼ。 3、微生物により生産される請求項1記載のアミノペプ
チダーゼ。 4、微生物がアクロモバクター(¥Achromoba
cter¥)属、コリネバクテリウム(¥Coryne
bacterium¥)属、フラボバクテリウム(¥F
lavobacterium¥)属、バシルス属(¥B
acillus¥)、ミクロコッカス(¥Microc
occus¥)属、セルロモナス(¥Cellulom
onas¥)属、シュードモナス(¥Pseudomo
nas¥)属、プロタミノバクター(¥Protami
nobacter¥)属、マイコバクテリウム(¥My
cobacterium¥)属、アルスロバクター(¥
Arthrobacter¥)属、又はストレプトマイ
セス(¥Strepto−myces¥)属細菌である
請求項3記載のアミノペプチダーゼ。 5、下記の物性を有する請求項1記載のアミノペプチダ
ーゼ: (イ)1モルのD−アラニンアミド及び1モルの水から
1モルのD−アラニン及び1モルのアンモニアを生成す
る反応を触媒する; (ロ)高速液体クロマトグラフィーゲル濾過法において
約122,000の分子量を有し、SDS−ポリアクリ
ルアミドゲル電気泳動により約59,000の分子量を
有するサブユニットを示す; (ハ)D−アラニンアミドを良好な基質とする。 6、請求項1に記載のアミノペプチダーゼの製造方法に
おいて、該アミノペプチダーゼを生産することができる
アクロモバクター(¥Achromobacter¥)
属、コリネバクテリウム(¥Coebacterium
¥)属、フラボバクテリウム(¥Flavobacte
rium¥)属、バシルス属(¥Bacillus¥)
、ミクロコッカス(¥Micrococcus¥)属、
セルロモナス(¥Cellulomonas¥)属、シ
ュードモナス(¥Pseudomonas¥)属、プロ
タミノバクター(¥Protaminobacter¥
)属、マイコバクテリウム(¥Mycobacteri
um¥)属、アルスロバクター(¥Arthro−ba
cter¥)属、又はストレプトマイセス(¥Stre
pto−myces¥)属の細菌を培養し、この培養物
から該アミノペプチダーゼを採取することを特徴とする
方法。 7、請求項1に記載のアミノペプチダーゼを生産するこ
とができるアクロモバクターsp.SCRCC1−38
。 8、アクロモバクター(¥Achromobacter
¥)属、コリネバクテリウム(¥Corynebact
erium¥)属、フラボバクテリウム(¥Flavo
bacterium¥)属、バシルス属(¥Bacil
lus¥)、ミクロコッカス(¥Micrococcu
s¥)属、セルロモナス(¥Cellulomonas
¥)属、シュードモナス(¥Pseudomonas¥
)属、プロタミノバクター(¥Protaminoba
cter¥)属、マイコバクテリウム(¥Mycoba
cterium¥)属、アルスロバクター(¥Arth
ro−bacter¥)属、又はストレプトマイセス(
¥Strepto−myces¥)属細菌の培養物、菌
体、又は菌体処理物をN−置換されている場合があるD
−アミノ酸アミド、N末端がD−アミノ酸であるペプチ
ド、もしくはD−アミノ酸エステル、又はこれらの塩、
あるいはこれらと、対応するL−アミノ酸誘導体との混
合物に作用させて立体特異的にD−アミノ酸を生成せし
めることを特徴とするD−アミノ酸の製造方法。 9、D−アラニンを製造するための請求項8に記載の方
法。 10、アクロモバクター(¥Achromobacte
r¥)属、コリネバクテリウム(¥Corynebac
terium¥)属、フラボバクテリウム(¥Flav
obacterium¥)属、バシルス属(¥Baci
llus¥)、ミクロコッカス(¥Micrococc
us¥)属、セルロモナス(¥Cellulomona
s¥)属、シュードモナス(¥Pseudomonas
¥)属、プロタミノバクター(¥Protaminob
acter¥)属、マイコバクテリウム(¥Mycob
acterium¥)属、アルスロバクター(¥Art
hro−bacter¥)属、又はストレプトマイセス
(¥Strepto−myces¥)属細菌の培養物、
菌体、又は菌体処理物の存在下で、N−置換されている
場合があるD−アミノ酸アミド、N末端がD−アミノ酸
であるペプチド、もしくはD−アミノ酸エステル、又は
これらの塩、あるいはこれらと、対応するL−アミノ酸
誘導体との混合物と、アミン又はその塩とを反応せしめ
て立体特異的にD−アミノ酸N−置換アミド又はその塩
を生成せしめることを特徴とするD−アミノ酸N−置換
アミドの製造方法。 11、D−アラニンN−置換アミドを製造するための請
求項10に記載の方法。 12、前記反応を水性媒体中、有機溶媒中、又は有機溶
媒を含有する水性媒体中で行うことを特徴とする請求項
10又は11に記載の方法。 13、請求項1に記載のアミノペプチダーゼを、N−置
換されている場合があるD−アミノ酸アミド、N末端が
D−アミノ酸であるペプチド、又はD−アミノ酸エステ
ル、又はこれらの塩に作用させて立体特異的にD−アミ
ノ酸を生成せしめることを特徴とするD−アミノ酸の製
造方法。 14、D−アラニンを製造するための請求項13に記載
の方法。 15、請求項1に記載のアミノペプチダーゼの存在下で
、N−置換されている場合があるD−アミノ酸アミド、
N末端がD−アミノ酸であるペプチド、もしくはD−ア
ミノ酸エステル、又はこれらの塩とアミン又はその塩と
を反応せしめて立体特異的にD−アミノ酸N−置換アミ
ド又はその塩を生成せしめることを特徴とするD−アミ
ノ酸N−置換アミドの製造方法。 16、D−アラニンN−置換アミドを製造するための請
求項15に記載の方法。 17、前記の反応を水性媒体中、有機溶媒中、又は有機
溶媒を含有する水性媒体中で行うことを特徴とする、請
求項15又は16に記載の方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63051573A JPH07106149B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | アミノペプチダーゼ及びその使用 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP63051573A JPH07106149B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | アミノペプチダーゼ及びその使用 |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JPH01225482A true JPH01225482A (ja) | 1989-09-08 |
JPH07106149B2 JPH07106149B2 (ja) | 1995-11-15 |
Family
ID=12890696
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP63051573A Expired - Lifetime JPH07106149B2 (ja) | 1988-03-07 | 1988-03-07 | アミノペプチダーゼ及びその使用 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JPH07106149B2 (ja) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012183018A (ja) * | 2011-03-04 | 2012-09-27 | Toyama Prefecture | Nad+依存型脱水素酵素を用いたl−トリプトファン定量法およびそれに用いるキット |
Families Citing this family (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
DE602005023708D1 (de) * | 2004-02-04 | 2010-11-04 | Kaneka Corp | Polypeptid mit amidaseaktivität und dessen gen |
-
1988
- 1988-03-07 JP JP63051573A patent/JPH07106149B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2012183018A (ja) * | 2011-03-04 | 2012-09-27 | Toyama Prefecture | Nad+依存型脱水素酵素を用いたl−トリプトファン定量法およびそれに用いるキット |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
JPH07106149B2 (ja) | 1995-11-15 |
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