JP2001258560A - dtsR1遺伝子の発現を制御する遺伝子 - Google Patents
dtsR1遺伝子の発現を制御する遺伝子Info
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Abstract
御する活性を有する遺伝子を提供する。 【解決手段】 dtsR1遺伝子プロモーターにレポーター遺
伝子を連結した融合遺伝子を作製し、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムの染色体DNAライブラリー
から前記融合遺伝子産物の発現を制御する遺伝子をスク
リーニングし、下記タンパク質をコードするDNAを取
得する。 (A)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 (B)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌
のdtsR1遺伝子の発現を制御する活性を有するタン
パク質。
Description
の発現を制御する遺伝子に関する。本遺伝子は、L−グ
ルタミン酸生産菌の育種、遺伝子の発現制御系の構築な
ど、発酵工業において利用され得る。
は、これらのアミノ酸生産能を有するブレビバクテリウ
ム属やコリネバクテリウム属に属するコリネ型細菌を用
いて発酵法により工業生産されている。この方法では、
コリネ型細菌は生育にビオチンを要求する一方、培地中
に過剰量のビオチンが存在すると、L−グルタミン酸が
蓄積しないことが知られている。従って、従来のL−グ
ルタミン酸の製造法においては、ビオチン濃度を制限し
た培地で培養するか、あるいはビオチンを充分量含有す
る培地を用いる場合には、培養の初発または途上でビオ
チン作用抑制物質として界面活性剤またはラクタム系抗
生物質を培地に含有させて培養するかのいずれかの方法
が採用されている。しかしながら、特に培地の炭素源と
して廃糖蜜等の安価ではあるが過剰量のビオチンを含有
する原料を使用する場合、培地に添加することが必要な
ビオチン作用抑制物質が製造コスト高の原因となってい
た。
リウム属細菌に由来し、該細菌に界面活性剤に対する耐
性を付与する蛋白質(DTSR蛋白)をコードする遺伝子
(dtsR遺伝子)の存在を突き止め、この遺伝子が破壊さ
れたコリネ型L−グルタミン酸生産菌は、野生株がほと
んどL−グルタミン酸を生成しない量のビオチンが存在
する条件においても著量のL−グルタミン酸を生成する
こと、及び、L−リジン生産能を有するコリネ型L−グ
ルタミン酸生産菌は、dtsR遺伝子を増幅すると著量のL
−リジンを生産する能力が付与されることを見出してい
る(WO95/23224号国際公開パンフレット)。
ミン酸生産菌に、ビオチン作用抑制物質に対する温度感
受性を付与することにより、ビオチン存在下でも安定し
てL−グルタミン酸を発酵生産することができること、
及び、このようなビオチン作用抑制物質に対する温度感
受性株にL−リジン生産性を付与することにより、ビオ
チン存在下でも、安定してL−リジンとL−グルタミン
酸を同時に発酵生産することができることを見出してい
る(WO96/06180号国際公開パンフレット)。
て、dtsR2遺伝子が取得されている(特開平10-234371号
公報)。dtsR遺伝子は、dtsR2遺伝子との対比から、現
在ではdtsR1遺伝子と呼ばれている。
細菌のL−グルタミン酸生産量とは負の相関があること
が知られている。また、本発明者らは、DTSRタンパク質
とL−グルタミン酸生産との間にも負の相関があること
を見出している。そこで、dtsR遺伝子の制御因子の存在
を予想し、dtsR1遺伝子のプロモーターにレポーター遺
伝子を連結した融合遺伝子をマルチコピーでコリネ型細
菌に導入し、形質転換株のL−グルタミン酸生産のタイ
ムコースを調べたところ、同融合遺伝子が導入されてい
ない株に比べてL−グルタミン酸の生産が遅れることを
知見した。このことから、本発明者は、形質転換株の細
胞中のdtsR1遺伝子のプロモーターのコピー数が増加し
たため、制御因子が希釈され、dtsR1遺伝子の発現量が
増加したと考えた。そして、前記融合遺伝子が導入され
た株を用いて、同融合遺伝子産物の発現を制御する遺伝
子のスクリーニングを行った結果、本発明の遺伝子を取
得することに成功した。
る。 (1)下記(A)又は(B)に示すタンパク質をコード
するDNA。 (A)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 (B)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌
のdtsR1遺伝子の発現を制御する活性を有するタン
パク質。 (2)下記(a)又は(b)に示すDNAである(1)
のDNA。 (a)配列番号8に示す塩基配列において、塩基番号1
118〜1714で表される配列を含むDNA。 (b)配列番号8に示す塩基配列において、塩基番号1
118〜1714で表される塩基配列又は同塩基配列か
ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、コリネ型細菌のdtsR1遺伝
子の発現を制御する活性を有するタンパク質。 (3)前記ストリンジェントな条件が、1×SSC及び
0.1%SDSに相当する塩濃度で60℃で洗浄が行わ
れる条件である(2)のDNA。
活性が増強され、かつ、L−グルタミン酸生産能を有す
るコリネ型細菌。 (5)dtsR1遺伝子の発現を制御する活性の増強
が、前記細菌細胞内のdtsR1遺伝子の発現を制御す
る活性を有するタンパク質をコードする遺伝子のコピー
数を高めること、又は前記細菌細胞内の同遺伝子の発現
を増強するように発現調節配列を改変することによるも
のである(4)のコリネ型細菌。 (6)前記dtsR1遺伝子の発現を制御する活性を有
するタンパク質をコードする遺伝子が、(1)〜(3)
のいずれかのDNAである(5)のコリネ型細菌。
コリネ型細菌を培地に培養し、培地中にL−グルタミン
酸を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを
特徴とするL−グルタミン酸の製造法。
する活性を有するDNAを、dtsR1制御遺伝子というこ
とがある。また、本発明において、「dtsR1遺伝子の発
現を制御する活性」とは、本発明のDNA又はその発現
産物がdtsR1遺伝子の発現を制御する活性、例えばdtsR1
遺伝子の発現を抑制する活性をいい、「dtsR1発現制御
活性」ともいう。
メンタムの染色体DNAライブラリーから、dtsR1遺伝
子プロモーターとβ−ガラクトシダーゼ構造遺伝子(la
cZ)との融合遺伝子の発現を抑制する活性を有するDN
A断片として単離された。以下に、上記融合遺伝子を利
用して本発明の遺伝子を取得する方法を説明する。
を簡便に測定するためには、レポーター遺伝子を用いて
間接的にプロモーター活性を測定する方法が考えられ
る。レポーター遺伝子として望まれる性質として、活性
測定が簡単であること、レポーター遺伝子産物のN末端
側にある程度のアミノ酸が付加されても活性が著しく低
下しないこと、バックグランドの反応がないこと、遺伝
子操作をする上で適当な制限酵素切断部位があることが
挙げられる。
ゼ(LacZ)をコードする遺伝子(lacZ)は、広くレポー
ター遺伝子として用いられており、またコリネ型細菌に
はラクトース資化能がないことから(J. Gen. Appl. Mi
crobiol., 18, 399-416 (1972))、レポーター遺伝子と
してlacZを用いるのが好適であると考えられる。
遺伝子を保持する細菌、例えばエシェリヒア・コリは、
同プロモーターが機能すると、β−ガラクトシダーゼ活
性が上昇する。β−ガラクトシダーゼ活性は、これを産
生する細菌をX-gal(5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-
β-D-チオガラクトシド)を含む培地で生育させると、
培地が青く呈色することによって検出することができ
る。したがって、前記融合遺伝子を保持する細菌、例え
ばエシェリヒア・コリを宿主に用い、ブレビバクテリウ
ム・ラクトファーメンタムの染色体遺伝子ライブラリー
から、コロニーの色を指標として、本発明の遺伝子を選
択することができる。
列は公知であるので(WO95/23224号国際公開パンフレッ
ト)、この配列に基づいて作製したプライマー、例え
ば、配列番号3及び4に示す塩基配列を有するプライマ
ーを用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタ
ムの染色体DNAを鋳型とするPCRによって取得するこ
とができる。一方、lacZは、これを保持するプラスミ
ド、例えばpMC1871(ファルマシアバイオテク)、pRS55
2(R.W.Simons et al., Gene, 53, 85-96 (1987))等か
ら取得することができる。これらのdtsR1遺伝子プロモ
ーターとlacZを連結することにより、プロモーター活性
測定用の融合遺伝子が得られる。
コリに保持させるには、例えば、該融合遺伝子を含むプ
ラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換すればよい。
尚、この融合遺伝子は、染色体遺伝子ライブラリーの構
築に用いるプラスミドと和合性であるプラスミドを用い
てエシェリヒア・コリに導入するか、あるいは、エシェ
リヒア・コリ染色体に組み込む必要がある。エシェリヒ
ア・コリとしては、β−ガラクトシダーゼを欠損した
株、例えばJM109株等を用いる。
テリウム・ラクトファーメンタムから、例えば斎藤らの
方法(H.Saito and K.Miura Biochem. Biophys. Acta 7
2, 619 (1963))に従い染色体DNAを調製し、得られ
た染色体DNAを制限酵素を用いて切断し、コリネ型細
菌で機能するベクターに連結することによって取得する
ことができる。
むプラスミドでエシェリヒア・コリを形質転換し、得ら
れた形質転換体を染色体遺伝子ライブラリープラスミド
で形質転換し、X-galを含む培地上でコロニーの色が白
〜薄い青色を呈する株を選択することによって、dtsR1
発現制御遺伝子を保持する候補株が得られる。得られた
株をX-galを含む培地に植え継ぎ、白〜薄い青色を維持
するコロニーを選択することによって、候補株を絞るこ
とができる。さらに、候補株からプラスミドを調製し、
再度エシェリヒア・コリを形質転換し、上記と同様の操
作を繰り返すことによって、本発明の遺伝子を取得する
ことができる。
れるアミノ酸配列が明らかとなったので、その配列に基
づいてオリゴヌクレオチドを作製し、それを用いたPC
R(polymerase chain reaction)法又はハイブリダイ
ゼーションによって、ブレビバクテリウム・ラクトファ
ーメンタムの染色体DNA又は染色体遺伝子ライブラリ
ーから取得することもできる。
質のdtsR1発現制御活性が損なわれない限り、1若しく
は複数の位置での1若しくは数個のアミノ酸の置換、欠
失、挿入、付加、又は逆位を含むdtsR1発現制御活性を
有するタンパク質をコードするものであってもよい。こ
こで、「数個」とは、アミノ酸残基のタンパク質の立体
構造における位置や種類によっても異なるが、前記タン
パク質を構成する199アミノ酸残基全体に対し、30
〜50%以上、好ましくは50〜70%以上の相同性を
有し、dtsR1発現制御活性を有するものであってもよ
い。
入、付加、又は逆位を含むタンパク質をコードするDN
Aは、例えば部位特異的変異法によって、特定の部位の
アミノ酸残基が置換、欠失、挿入、付加、又は逆位を含
むように塩基配列を改変することによって得られる。ま
た、上記のような改変されたDNAは、従来知られてい
る変異処理によっても取得され得る。DNAの変異処理
としては、DNAをヒドロキシルアミン等でインビトロ
処理する方法、及びDNAを保持する微生物、例えばエ
シェリヒア・コリを、紫外線照射またはN−メチル−N'
−ニトロ−N−ニトロソグアニジン(NTG)もしくは亜硝
酸等の通常変異処理に用いられている変異剤によって処
理する方法が挙げられる。
入、付加、又は逆位等には、ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムの個体差、種の違いに基づく場合など
の天然に生じる変異(mutant又はvariant)も含まれ
る。
細胞で発現させ、発現産物のdtsR1発現制御活性を調べ
ることにより、配列番号9のアミノ酸配列を有するタン
パク質と実質的に同一のタンパク質をコードするDNA
が得られる。また、変異を有するDNAまたはこれを保
持する細胞から、例えば配列番号8に記載の塩基配列の
うち、塩基番号1118〜1714からなる塩基配列を有するD
NAとストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、
かつ、dtsR1発現制御活性を有するタンパク質をコード
するDNAを単離してもよい。ここでいう「ストリンジ
ェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが
形成され、非特異的なハイブリッドが形成されない条件
をいう。この条件を明確に数値化することは困難である
が、一例を示せば、相同性が高いDNA同士、例えば5
0〜70%以上の相同性を有するDNA同士がハイブリ
ダイズし、それより相同性が低いDNA同士がハイブリ
ダイズしない条件、あるいは通常のサザンハイブリダイ
ゼーションの洗いの条件である65℃、1×SSC,
0.1%SDS、好ましくは、0.1×SSC、0.1
%SDSに相当する塩濃度でハイブリダイズする条件が
挙げられる。
18〜1714からなる塩基配列の一部の配列を用いることも
できる。そのようなプローブは、同塩基配列に基づいて
作製したオリゴヌクレオチドをプライマーとし、同塩基
配列を有するDNA断片を鋳型とするPCR反応によっ
て作製することができる。プローブとして、300bp
程度の長さのDNA断片を用いる場合には、ハイブリダ
イゼーションの洗いの条件は、50℃、2×SSC、
0.1%SDSが挙げられる。
子の中には途中にストップコドンが発生したものや、活
性中心の変異により活性を失ったものも含まれるが、そ
れらについては、発現ベクターにつなぎdtsR1発現制御
活性を調べることによって容易に取り除くことができ
る。本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性は、前記のdts
R1遺伝子プロモーターとlacZとの融合遺伝子を用いるこ
とにより、評価することができる。
ラリーの作製、ハイブリダイゼーション、PCR、プラ
スミドDNAの調製、DNAの切断及び連結、形質転
換、プライマーとして用いるオリゴヌクレオチドの設定
等の方法は、当業者によく知られている通常の方法を採
用することができる。これらの方法は、Sambrook, J.,F
ritsch, E. F., and Maniatis, T., "Molecular Clonin
g A Laboratory Manual, Second Edition", Cold Sprin
g Harbor Laboratory Press (1989)等に記載されてい
る。
を有するので、本発明の遺伝子のdtsR1発現制御活性を
弱化もしくは欠損又は増強することにより、dtsR1遺伝
子自体を弱化もしくは欠損、又は増強するのと同様の効
果が期待できる。また、本発明の遺伝子を温度感受性に
することにより、dtsR1遺伝子を温度感受性にするのと
同様の効果が得られる。
いてdtsR1発現制御活性を増強することにより、dtsR1遺
伝子の発現が抑制され、過剰量のビオチンを含む培地で
あっても、ビオチン作用抑制物質を添加せずにL−グル
タミン酸を生産させることができる。
細菌において本発明の遺伝子を破壊することによって、
dtsR1遺伝子の発現を増強させると、L−リジンを生産
能が向上すると考えられる。
生産能を有するコリネ型細菌において、本発明の遺伝子
のdtsR1発現制御活性を制御することによって、過剰量
のビオチンを含有する培地中にてビオチン作用抑制物質
の非存在下でL−リジン及びL−グルタミン酸を同時生
産させることができると考えられる(WO96/06180号参
照)。
ジーズ・マニュアル・オブ・デターミネイティブ・バク
テリオロジー(Bergey's Manual of Determinative Bac
teriology)第8版599頁(1974)に定義されている一群
の微生物であり、好気性,グラム陽性,非抗酸性,胞子
形成能を有しない桿菌であり、従来ブレビバクテリウム
属に分類されていたが現在コリネバクテリウム属細菌と
して統合された細菌を含み(Int. J. Syst. Bacterio
l., 41, 255 (1981))、またコリネバクテリウム属と非
常に近縁なブレビバクテリウム属細菌及びミクロバテリ
ウム属細菌を含む。L−グルタミン酸の製造に好適に用
いられるコリネ型細菌の菌株としては、例えば以下に示
すものが挙げられる。
ム コリネバクテリウム・アセトグルタミカム コリネバクテリウム・アルカノリティカム コリネバクテリウム・カルナエ コリネバクテリウム・グルタミカム コリネバクテリウム・リリウム(コリネバクテリウム・
グルタミカム) コリネバクテリウム・メラセコーラ コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス コリネバクテリウム・ハーキュリス ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリ
ウム・グルタミカム) ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・
グルタミカム) ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム(コリネバ
クテリウム・グルタミカム) ブレビバクテリウム・ロゼウム ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス) ブレビバクテリウム・アルバム ブレビバクテリウム・セリヌム ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム
ことができる。 コリネバクテリウム・アセトアシドフィラム ATCC
13870 コリネバクテリウム・アセトグルタミカム ATCC1
5806 コリネバクテリウム・アルカノリティカム ATCC2
1511 コリネバクテリウム・カルナエ ATCC15991 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC1302
0、13032、13060 コリネバクテリウム・リリウム(コリネバクテリウム・
グルタミカム) ATCC15990 コリネバクテリウム・メラセコーラ ATCC1796
5 コリネバクテリウム・サーモアミノゲネス AJ123
40(FERM BP−1539) コリネバクテリウム・ハーキュリス ATCC1386
8 ブレビバクテリウム・ディバリカタム(コリネバクテリ
ウム・グルタミカム)ATCC14020 ブレビバクテリウム・フラバム(コリネバクテリウム・
グルタミカム) ATCC13826、ATCC140
67 ブレビバクテリウム・インマリオフィラム ATCC1
4068 ブレビバクテリウム・ラクトフェルメンタム(コリネバ
クテリウム・グルタミカム) ATCC13665、A
TCC13869、 ブレビバクテリウム・ロゼウム ATCC13825 ブレビバクテリウム・サッカロリティカム ATCC1
4066 ブレビバクテリウム・チオゲニタリス ATCC192
40 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス(コリネバクテ
リウム・アンモニアゲネス) ATCC6871 ブレビバクテリウム・アルバム ATCC15111 ブレビバクテリウム・セリヌム ATCC15112 ミクロバクテリウム・アンモニアフィラム ATCC1
5354 dtsR1発現制御活性を増強するには、本発明の遺伝子と
コリネ型細菌で機能するベクターを連結して組換えDN
Aを調製し、同組換えDNAでコリネ型細菌を形質転換
すればよい。
能なベクターとしては、pAM330(特開昭58-67699号公報
参照)、pHM1519(特開昭58-77895号公報参照)等が挙
げられる。また、これらのベクターからコリネ型細菌中
でプラスミドを自律複製可能にする能力を持つDNA断
片を取り出し、前記エシェリヒア・コリ用のベクターに
挿入すると、エシェリヒア・コリ及びコリネ型細菌の両
方で自律複製可能ないわゆるシャトルベクターとして使
用することができる。このようなシャトルベクターとし
ては、以下のものが挙げられる。尚、それぞれのベクタ
ーを保持する微生物及び国際寄託機関の受託番号をかっ
こ内に示した。
には、これまでに報告されている形質転換法に従って行
えばよい。例えば、エシェリヒア・コリ K−12につ
いて報告されているような、受容菌細胞を塩化カルシウ
ムで処理してDNAの透過性を増す方法(Mandel,M.and
Higa,A.,J. Mol. Biol., 53, 159 (1970))があり、バ
チルス・ズブチリスについて報告されているような、増
殖段階の細胞からコンピテントセルを調製してDNAを
導入する方法( Duncan,C.H.,Wilson,G.A.andYoung,F.
E., Gene, 1, 153 (1977))がある。あるいは、バチル
ス・ズブチリス、放線菌類及び酵母について知られてい
るような、DNA受容菌の細胞を、組換えDNAを容易
に取り込むプロトプラストまたはスフェロプラストの状
態にして組換えDNAをDNA受容菌に導入する方法
( Chang,S.and Choen,S.N.,Molec.Gen. Genet., 168,
111 (1979);Bibb,M.J.,Ward,J.M.and Hopwood,O.A.,Nat
ure, 274, 398 (1978);Hinnen,A.,Hicks,J.B.and Fink,
G.R.,Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 1929 (1978))
も応用できる。また、電気パルス法(特開平2−207
791号公報参照)も有効である。
伝子を上記宿主の染色体DNA上に多コピー存在させる
ことによっても達成できる。コリネ型細菌に属する微生
物の染色体DNA上に本発明の遺伝子を多コピーで導入
するには、染色体DNA上に多コピー存在する配列を標
的に利用して相同組換えにより行う。染色体DNA上に
多コピー存在する配列としては、レペティティブDN
A、転移因子の端部に存在するインバーティッド・リピ
ートが利用できる。あるいは、特開平2−109985
号公報に開示されているように、本発明の遺伝子をトラ
ンスポゾンに搭載してこれを転移させて染色体DNA上
に多コピー導入することも可能である。いずれの方法に
よっても形質転換株内の本発明の遺伝子のコピー数が上
昇する結果、dtsR1発現制御活性が増強される。
子増幅による以外に、染色体DNA上又はプラスミド上
の本発明の遺伝子のプロモーター等の発現調節配列を強
力なものに置換することによっても達成される。たとえ
ば、lacプロモーター、trpプロモーター、trc
プロモーター、tacプロモーター、ラムダファージの
PRプロモーター、PLプロモーター等が強力なプロモ
ーターとして知られている。これらのプロモーターへの
置換により、本発明の遺伝子の発現が強化されることに
よってdtsR1発現制御活性が増強される。
えを利用した遺伝子置換によって行うことができる。同
遺伝子の内部を欠失し、dtsR1発現制御が正常に機能し
ないように改変した遺伝子(欠失型遺伝子)を含むDN
Aでコリネ型細菌を形質転換し、欠失型遺伝子と染色体
上の正常遺伝子との間で組換えを起こさせることによ
り、染色体上の遺伝子を破壊することができる。このよ
うな相同組換えによる遺伝子破壊は既に確立しており、
直鎖DNAを用いる方法や温度感受性複製開始点を含む
プラスミドを用いる方法などがあるが、温度感受性複製
開始点を含むプラスミドを用いる方法が好ましい。
発現制御活性が増強又は抑制されたコリネ型細菌は、L
−グルタミン酸又はL−リジン等のアミノ酸の製造に利
用することができる。このようなコリネ型細菌の培養及
び培地に蓄積されたアミノ酸の採取は、通常と同様にし
て行うことができる。
る培地は、炭素源、窒素源、無機イオン及び必要に応じ
その他の有機微量栄養素を含有する通常の培地である。
炭素源としては、グルコース、ラクトース、ガラクトー
ス、フラクトースや澱粉加水分解物などの糖類、エタノ
ールやイノシトールなどのアルコール類、酢酸、フマー
ル酸、クエン酸、コハク酸等の有機酸類を用いることが
できる。
アンモニウム、リン酸アンモニウム等の無機アンモニウ
ム塩、大豆加水分解物などの有機窒素、アンモニアガ
ス、アンモニア水等を用いることができる。
酸マグネシウム、鉄イオン、マンガンイオン等が少量添
加される。有機微量栄養素としては、ビタミンB1など
の要求物質または酵母エキス等を必要に応じ適量含有さ
せることが望ましい。
するのがよく、培養温度は30℃〜45℃に、培養中p
Hは5〜8に制御する。尚、pH調整には無機あるいは
有機の酸性あるいはアルカリ性物質、更にアンモニアガ
ス等を使用することができる。
リネ型細菌に、界面活性剤やペニシリンを添加したり、
ビオチンを制限したりすることによりグルタミン酸収率
を更に向上させることができる場合がある。
常イオン交換樹脂法、沈澱法その他の公知の方法を組み
合わせることにより実施できる。
説明する。
色体DNAライブラリーの調製 ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタムの染色体D
NAライブラリーを調製した(WO95/23224号国際公開パ
ンフレット参照)。ブレビバクテリウム・ラクトファー
メンタムATCC13869から、斎藤、三浦の方法(Biochem.
Biophys. Acta., 72, 619 (1963))により染色体DNA
を得た。この染色体DNAをSau3AIで部分分解した。一
方、エシェリヒア・コリとコリネ型細菌の双方の菌体内
で自律複製可能なプラスミドベクターpSAC4をBamHIで切
断し、前記染色体DNAのSau3AI断片と連結し、連結反
応液でエシェリヒア・コリDH5を形質転換した。pSAC4
は、以下のようにして得た。pHM1519由来の複製制御領
域を持つプラスミドpHK4(特開平5-7491号)をBamHI及
びKpnIで消化して、複製制御領域を含むDNA断片を取
得し、得られた断片をDNA平滑末端化キット(宝酒造
(株)、Blunting kit)を用いて平滑末端化した後、SalI
リンカー(宝酒造(株))を結合し、これをpHSG399(宝
酒造(株))のSalIサイトに挿入した。
系の構築 上記のDNAライブラリーから、dtsR1制御遺伝子を取
得するために、スクリーニング系の構築を行った。
の構築 lacZをレポーター遺伝子として、プロモーターを搭載す
るためのプラスミドの構築を行なった。以下、その過程
を詳細に説明する(図1)。
伝子(nptII)を保持するエシェリヒア・コリME8459(M
E8459は、日本の国立遺伝学研究所から入手できる)か
ら調製した染色体DNAを調製した。一方、nptIIをPCR
により増幅するためのプライマーとして、配列番号1、
配列番号2に示す合成DNAを合成した。これらのプライ
マーを用いて、前記染色体DNAを鋳型としてPCRを行
なった。PCRは、Pyrobestpolymerase(宝酒造(株))を
用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、
72℃ 3分を、30サイクル行った。
解した後、SmaI、BamHIで切断したpGEM ベクター(Pro
mega)に挿入し、pGEMnpIIを得た。次に、pGEMnpIIをSm
aI、BamHIで切断してnptII遺伝子断片を切り出した。ク
ララムフェニコール耐性マーカーを保持するプラスミド
pKF3(宝酒造(株))をHindIIIで分解した後、平滑末端
化し、前記nptII遺伝子断片と連結した。連結反応液で
エシェリヒア・コリJM109のコンピテントセル(宝酒造
(株))を形質転換し、カナマイシン25μg/mlを含むL培
地に塗布した。一晩培養した後、出現したコロニーを釣
り上げ、単コロニー分離し、形質転換株を得た。形質転
換株からプラスミドを調製し、pKF3nptIIとした。
とのシャトルベクターを作製した。既に取得されている
コリネバクテリウム属細菌で自律複製可能なプラスミド
pHM1519(特開昭58-77895号参照)由来の複製制御領域
を持つプラスミドpHK4(特開平5-7491号)を、制限酵素
BamHI及びKpnIで消化して、複製制御領域を含むDNA
断片を取得し、得られた断片をDNA平滑末端化キット
(宝酒造(株)、Blunting kit)を用いて平滑末端化した
後、SalIリンカー(宝酒造(株))を結合した。これをpH
SG299(宝酒造(株))のSalIサイトに挿入し、プラスミ
ドpSAK4を得た。
御領域を含むDNA断片を、SalIで切断したpKF3nptII
と連結し、コリネ型細菌内で自律複製可能なシャトルベ
クターpNEOを構築した。このプラスミドは宿主にクロラ
ムフェニコール耐性およびカナマイシン耐性を付与す
る。
た。これを、pMC1871(ファルマシアバイオテク)をPst
I、SmaIで完全分解したものと連結し、pNEOLを構築し
た。pNEOLは、pMC1871由来のレポーター遺伝子として、
N末端側の8アミノ酸を欠失したLacZをコードするlacZ
を保持し、コリネ型細菌内で自律複製可能なシャトルベ
クターである。pNEOLの適当な部位、例えばSmaI部位に
プロモーター活性を有する配列を挿入し、プロモーター
活性を発現させると、LacZを産生させることができる。
したがって、同プラスミドを保持する細菌をX-gal(5-
ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-チオガラクトシ
ド)を含む培地で生育させ、LacZを発現させると、培地
が青く呈色する。
ーニング用プラスミドの構築 (i)dtsR1プロモーター領域の取得 配列番号3及び4に示す塩基配列を有するプライマーを
用いて、ブレビバクテリウム・ラクトファーメンタム13
869株の染色体DNAを鋳型とするPCRを行い、dtsR1遺
伝子のプロモーター領域を含むDNA断片を取得した。
前記プライマーは、WO95/23224号の配列番号1に記載さ
れているdtsR1遺伝子の塩基配列の塩基番号1〜24、及
び、398〜421に相当する。これらの配列は、dtsR1遺伝
子の開始コドンから数えて-358〜-335bp、及び、N末端
から数えて14番目のアミノ酸(Pro)〜21番目のア
ミノ酸(Gly)に相当する。前記プライマーは、5'側に
制限酵素NaeIサイトが付加されている。PCRは、Pyrobes
t polymerase(宝酒造(株))を用い、94℃で1分処理し
た後、98℃ 10秒、55℃ 30sec、72℃ 1分を、30サイク
ル行った。
断し、SmaIで切断したpNEOと連結した。得られたプラス
ミドをpNEOLDR1と命名した(図2)。本プラスミドが導
入されたエシェリヒア・コリJM109株及びブレビバクテ
リウム・ラクトファーメンタムは、dtsR1プロモーター
が機能すると、50μg/lカナマイシン(ブレビバクテリ
ウム・ラクトファーメンタムの場合は25μg/l)及び45m
g/l X-gal添加LB寒天培地(ブレビバクテリウム・ラク
トファーメンタムの場合はCM-2B培地(ポリペプトン10g/
L、酵母エキス 10g/L、NaCl 5g/L、ビオチン 10μg/
L))で青く呈色する。
ぎ変え 前記染色体DNAライブラリーの構築に用いたプラスミ
ドpSAC4は、エシェリヒア・コリの複製制御領域としてp
UC系のプラスミドpHSG399を用いており、プロモーター
活性制御遺伝子スクリーニング用プラスミドpNEOLDR1
も、エシェリヒア・コリの複製制御領域として、同じく
pUC系のプラスミドpHSG299を用いている。これらのプラ
スミドはエシェリヒア・コリ細胞中で不和合性を示すの
で、pNEOLDR1のdtsR1プロモーターからレポーター遺伝
子(lacZ)までの断片を、pACYC177に移し変えた。pACY
C177は、p15A由来の複製制御領域を持ち、pUC系プラス
ミドと和合性を示す。
6に示したプライマーを用いPCR法により、dtsR1プロモ
ーター及びレポーター遺伝子(lacZ)を含む断片の取得
を行った。これらのプライマーの5'側には、HindIIIサ
イトが付加されている。PCRは、Pyrobest polymerase
(宝酒造(株))を用い、94℃で1分処理した後、98℃ 10
秒、55℃ 30sec、72℃ 4分を、30サイクル行った。
acZ構造遺伝子部分を含む約3.5kbの断片をHindIII処理
した後、pACYC177のHindIIIサイトに連結した。このよ
うにして作製したプラスミドをpACYCLDR1と命名した。
以上、pACYCDR1プラスミドの作製手順は図3に示す。
て、<1>で得られたDNAライブラリーから、dtsR1
制御遺伝子をスクリーニングした。
リヒア・コリJM109に、エレクトロポレーション法によ
ってライブラリープラスミドを導入し、形質転換体をア
ンピシリン100μg/L、カナマイシン50μg/L、X-gal 45m
g/lを含むLB寒天培地にて生育させた。約5万コロニー
の中から、白及び薄い青を呈色したコロニーを200個選
択した。これらの株を、前記と同様の培地に塗りつけ、
白及び薄い青を呈色したコロニーを選択することにより
2次スクリーニングを行い、140株に絞った。その中か
ら白く呈色した8株と薄い青を示した20株、計28株から
プラスミドを抽出した。その結果、プラスミドのパター
ンが大きく6つに分かれた。白く呈色する原因には、宿
主そのものの変異も考えられたことから、これら6種類
のプラスミドを用いて、エシェリヒア・コリJM109を再
び形質転換し、コロニーの色を調べたところ、白もしく
は薄い青を再度示したプラスミドが3個に絞られた。こ
れらプラスミドのうち、白を呈したコロニーをpSAC86、
薄い青を呈したコロニーをpSAC72及びpSAC113を命名し
た。
解析を行った。それぞれ挿入断片は5668bp、2984bp、44
44bpの長さであった。それぞれの塩基配列を、配列番号
7、8、10に示す。pSAC86の挿入断片にはオープン・
リーディング・フレーム(ORF)が見出された(塩基番
号1118〜1714)。このORFがコードし得るアミノ酸配列
を配列番号9に示す。
入、及びL−グルタミン酸生産の誘導 pSAC72、pSAC86、pSAC113を、ブレビバクテリウム・ラ
クトファーメンタムATCC13869にエレクトロポレーショ
ン法により導入し、ATCC13869/pSAC72、ATCC13869/pSAC
86、ATCC13869/pSAC113を得た。
TCC13869株を、下記に示す培地にて、31.5℃で22時間培
養した。培養終了後、培地の620nmにおける吸光度(51
倍希釈)、及び培養液中に生成蓄積したL−グルタミン
酸の量を測定した。結果を表1に示す。ATCC13869/pSAC
4は、過剰量のビオチンを含む培地でL−グルタミン酸
をほとんど蓄積しなかったが、ATCC13869/pSAC86はL−
グルタミン酸を蓄積した。 〔培地組成〕 グルコース 80g KH2PO4 1g MgSO4 0.4g (NH4)2SO4 30g FeSO4 7H2O 0.01g MnSO4 7H2O 0.01g 大豆加水分解液 15ml サイアミン塩酸塩 200μg ビオチン 300μg CaCO3 50g
御する遺伝子が得られる。本遺伝子は、遺伝子の発現制
御、あるいはL−グルタミン酸生産菌の育種等に利用す
ることができる。
す図。
てlacZが連結された融合遺伝子を持つプラスミドpNEOLD
R1の構築過程を示す図。
えることによって得たプラスミドpACYCLDR1の構築過程
を示す図。
Claims (7)
- 【請求項1】 下記(A)又は(B)に示すタンパク質
をコードするDNA。 (A)配列番号9に記載のアミノ酸配列を有するタンパ
ク質。 (B)配列番号9に記載のアミノ酸配列において、1若
しくは数個のアミノ酸の置換、欠失、挿入、付加、又は
逆位を含むアミノ酸配列からなり、かつ、コリネ型細菌
のdtsR1遺伝子の発現を制御する活性を有するタン
パク質。 - 【請求項2】 下記(a)又は(b)に示すDNAであ
る請求項1記載のDNA。 (a)配列番号8に示す塩基配列において、塩基番号1
118〜1714で表される配列を含むDNA。 (b)配列番号8に示す塩基配列において、塩基番号1
118〜1714で表される塩基配列又は同塩基配列か
ら調製されるプローブとストリンジェントな条件下でハ
イブリダイズし、かつ、コリネ型細菌のdtsR1遺伝
子の発現を制御する活性を有するタンパク質。 - 【請求項3】 前記ストリンジェントな条件が、1×S
SC及び0.1%SDSに相当する塩濃度で60℃で洗
浄が行われる条件である請求項2記載のDNA。 - 【請求項4】 dtsR1遺伝子の発現を制御する活性
が増強され、かつ、L−グルタミン酸生産能を有するコ
リネ型細菌。 - 【請求項5】 dtsR1遺伝子の発現を制御する活性
の増強が、前記細菌細胞内のdtsR1遺伝子の発現を
制御する活性を有するタンパク質をコードする遺伝子の
コピー数を高めること、又は前記細菌細胞内の同遺伝子
の発現を増強するように発現調節配列を改変することに
よるものである請求項4記載のコリネ型細菌。 - 【請求項6】 前記dtsR1遺伝子の発現を制御する
活性を有するタンパク質をコードする遺伝子が、請求項
1〜3のいずれか一項に記載のDNAである請求項5記
載のコリネ型細菌。 - 【請求項7】 請求項4〜6のいずれか一項に記載のコ
リネ型細菌を培地に培養し、培地中にL−グルタミン酸
を生成蓄積せしめ、これを該培地から採取することを特
徴とするL−グルタミン酸の製造法。
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