BR112019020183B1

BR112019020183B1 - Variante de aceto-hidroxiácido sintase, micro-organismo que compreende a mesma e método de produção de aminoácido de cadeia ramificada l com o uso da mesma

Info

Publication number: BR112019020183B1
Application number: BR112019020183-1A
Authority: BR
Inventors: Ae Ji Jeon; Byeong Cheol Song; Ji Hye Lee; Jong Hyun Kim; Hye Won Kim
Original assignee: Cj Cheiljedang Corporation
Priority date: 2017-07-11
Filing date: 2018-07-10
Publication date: 2023-03-21
Also published as: CA3064569C; EP3553171A4; JP2020505023A; BR112019020183A2; CN110724679A; KR20190007142A; AU2018301879B2; JP6794555B2; MX2019015056A; US10844359B2; US20200263149A1; EP3553171B1; AU2018301879A1; CN110506112B; US11085029B2; CA3064569A1; ES2919345T3; CN110724679B; WO2019013532A2; EP3553171A2

Abstract

A presente revelação refere-se a uma aceto-hidroxiácido sintase inovadora, um micro-organismo que compreende a mesma ou um método para produzir um aminoácido de cadeia ramificada L com o uso da mesma

Description

[CAMPO TÉCNICO]

[0001] A presente revelação refere-se a uma nova variante de aceto-hidroxiácido sintase e um uso da mesma, e especificamente, a uma variante de aceto-hidroxiácido sintase, um micro-organismo que contém a variante ou um método para produzir um aminoácido de cadeia ramificada L.

[ANTECEDENTES DA TÉCNICA]

[0002] Sabe-se que os aminoácidos de cadeia ramificada (por exemplo, L-valina, L-leucina e L-isoleucina) aumentam os níveis de proteína em um indivíduo e desempenham um papel importante como fonte de energia durante o exercício, sendo amplamente usados em medicamentos, alimentos, etc. No que diz respeito à biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada, as mesmas enzimas são usadas em vias de biossíntese paralelas e, portanto, é difícil produzir um único tipo de aminoácido de cadeia ramificada em escala industrial por fermentação. Na preparação de aminoácidos de cadeia ramificada, o papel da aceto-hidroxiácido sintase (isto é, a primeira enzima na biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada) é mais importante; no entanto, estudos anteriores sobre a aceto- hidroxiácido sintase se concentraram principalmente na liberação da inibição do feedback devido a modificações da subunidade pequena da aceto-hidroxiácido sintase (proteína IlvN) (Protein Expr Purif. maio de 2015; 109:106-12, US2014- 0335574, US2009-496475, US2006-303888, US2008-245610), revelando assim uma séria falta de estudos relevantes.

[0003] A aceto-hidroxiácido sintase é uma enzima que tem como função produzir ácido acetolático a partir de duas moléculas de piruvato e produzir 2-aceto-2-hidroxi-butirato a partir de ácido cetobutírico e piruvato. A aceto- hidroxiácido sintase catalisa a descarboxilação do piruvato e uma reação de condensação com outra molécula de piruvato para produzir acetolactato, que é um precursor da valina e leucina; ou catalisa a descarboxilação do piruvato e uma reação de condensação com 2-cetobutirato para produzir aceto-hidroxibutirato, que é um precursor da isoleucina. Consequentemente, a aceto-hidroxiácido sintase é uma enzima muito importante envolvida no processo de biossíntese inicial dos aminoácidos de cadeia ramificada L.

[REVELAÇÃO] [PROBLEMA TÉCNICO]

[0004] Os presentes inventores fizeram esforços para a produção eficaz de aminoácidos de cadeia ramificada L e, como resultado, os mesmos desenvolveram uma grande variante de subunidade. Em seguida, os presentes inventores confirmaram que os aminoácidos de cadeia ramificada L podem ser produzidos com alto rendimento a partir de um micro-organismo contendo a variante, completando assim a presente revelação.

[SOLUÇÃO TÉCNICA]

[0005] Um objetivo da presente revelação é fornecer uma variante de aceto-hidroxiácido sintase.

[0006] Outro objetivo da presente revelação é fornecer um polinucleotídeo que codifica a variante da aceto- hidroxiácido sintase, um vetor contendo o polinucleotídeo e um transformante no qual o vetor é introduzido.

[0007] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um micro-organismo que produz um aminoácido de cadeia ramificada L, no qual o micro-organismo contém a variante de aceto-hidroxiácido sintase ou no qual o vetor é introduzido.

[0008] Ainda outro objetivo da presente revelação é fornecer um método para produzir um aminoácido de cadeia ramificada L, que inclui: cultivar o micro-organismo que produz o aminoácido de cadeia ramificada L em um meio; e recuperar o aminoácido de cadeia ramificada L do micro-organismo ou meio de cultura do mesmo.

[EFEITOS VANTAJOSOS]

[0009] Quando a atividade da variante de aceto- hidroxiácido sintase de acordo com a presente revelação é introduzida em um micro-organismo, o micro-organismo pode aumentar significativamente a capacidade de produzir um aminoácido de cadeia ramificada L. Portanto, o microorganismo pode ser amplamente usado para a produção em larga escala de aminoácidos de cadeia ramificada L.

[MELHOR MODO]

[0010] Para atingir os objetivos acima, um aspecto da presente revelação fornece uma variante de aceto- hidroxiácido sintase, em que, na subunidade grande aceto- hidroxiácido sintase (isto é, subunidade grande de acetolactato sintase; proteína IlvB), o 96o aminoácido iisto é, treonina) é substituído por um aminoácido diferente de treonina, o 503o aminoácido iisto é, triptofano) é substituído por um aminoácido diferente de triptofano, ou tanto a 96o aminoácido iisto é, treonina) e o 503o aminoácido (isto é, triptofano) são substituídos por outro aminoácido.

[0011] Especificamente, a subunidade grande da aceto-hidroxiácido sintase pode ter uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Mais especificamente, a variante de aceto-hidroxiácido sintase pode ser uma variante de aceto- hidroxiácido sintase, em que, na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o 96o aminoácido iisto é, treonina) ou o 503o aminoácido iisto é, triptofano) do seu terminal N é substituído por outro aminoácido; ou tanto o 96o aminoácido i isto é, treonina) como o 503o aminoácido i isto é, o triptofano) são, cada um, substituídos por um outro aminoácido.

[0012] Como usado aqui, o termo “aceto-hidroxiácido sintase” se refere a uma enzima envolvida na biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada L e pode estar envolvido na primeira etapa da biossíntese de aminoácidos de cadeia ramificada L. Especificamente, a aceto-hidroxiácido sintase pode catalisar a descarboxilação do piruvato e uma reação de condensação com outra molécula de piruvato para produzir acetolactato (isto é, um precursor da valina) ou pode catalisar a descarboxilação do piruvato e uma reação de condensação com 2-cetobutirato para produzir aceto- hidroxibutirato (isto é, precursor da isoleucina). Especificamente, a partir do ácido acetolático, a L-valina é biossintetizada por reações sequenciais catalisadas pela aceto-hidroxiácido isomerorredutase, di-hidroxiácido desidratase e transaminase B. Além disso, a partir do ácido acetolático, a L-leucina é biossintetizada como produto final por reações sequenciais catalisadas aceto-hidroxiácido isomerorredutase, di-hidroxiácido desidratase, 2- isopropilmalato sintase, isopropilmalato isomerase, 3- isopropilmalato desidrogenase e transaminase B. Enquanto isso, a partir de aceto-hidroxibutirato, L-isoleucina é biossintetizada como um produto final por reações sequenciais catalisadas por aceto-hidroxiácido isomerorredutase, di-hidroxiácido desidratase e transaminase B.. Consequentemente, a aceto-hidroxiácido sintase é uma enzima importante na via da biossíntese dos aminoácidos de cadeia ramificada L.

[0013] A aceto-hidroxiácido sintase é codificada por dois genes, isto é, ilvB e ilvN. O gene ilvB codifica a subunidade grande da aceto-hidroxiácido sintase (IlvB), e o gene ilvN codifica a subunidade pequena da aceto- hidroxiácido sintase (IlvN).

[0014] Na presente revelação, a aceto-hidroxiácido sintase pode ser uma derivada de um micro-organismo do gênero Corynebacterium e, especificamente, de Corynebacterium glutamicum. Mais especificamente, como subunidade grande da aceto-hidroxiácido sintase, qualquer proteína que possua atividade de proteína IlvB e homologia ou identidade de 70% ou mais, especificamente 80% ou mais, mais especificamente 85% ou mais, ainda mais especificamente 90% ou superior, e ainda mais especificamente 95%, à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, bem como à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1, pode ser incluída sem limitação. Além disso, devido à degenerescência do códon, o polinucleotídeo que codifica a proteína que tem a atividade da proteína IlvB pode ser modificado de várias maneiras na região de codificação dentro de um intervalo que não altera a sequência de aminoácidos da proteína expressa na região de codificação, considerando os códons preferenciais em o organismo para o qual a proteína deve ser expressa. A sequência nucleotídica pode ser incluída sem limitação, desde que codifique a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 1 e, especificamente, pode ser uma codificada pela sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 2.

[0015] Como usado aqui, o termo “variante de aceto- hidroxiácido sintase” se refere a uma proteína na qual um ou mais aminoácidos são modificados (por exemplo, adicionados, excluídos ou substituídos) na sequência de aminoácidos da proteína aceto-hidroxiácido sintase. Especificamente, a variante de aceto-hidroxiácido sintase é uma proteína na qual sua atividade é efetivamente aumentada em comparação com sua modificação do tipo selvagem ou antes da modificação devido à modificação da presente revelação.

[0016] Como usado aqui, o termo “modificação” se refere a um método comum para melhorar enzimas, e qualquer método conhecido na técnica pode ser usado sem limitação, incluindo estratégias como design racional e evolução direcionada. Por exemplo, as estratégias para o design racional incluem um método para especificar um aminoácido em uma posição específica (mutagênese sítio-dirigida ou mutagênese sítio-específica), etc., e as estratégias para evolução direcionada incluem um método para induzir mutagênese aleatória, etc. Além disso, a modificação pode ser induzida por uma mutação natural, sem manipulação externa. Especificamente, a variante de aceto-hidroxiácido sintase pode ser uma que é isolada, uma proteína recombinante ou uma que tenha ocorrido de maneira não natural, mas as variantes aceto-hidroxiácido sintase não estão limitadas a isso.

[0017] A variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação podem ser especificamente uma proteína IlvB tendo uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, em que o 96o aminoácido (treonina) ou o 503o aminoácido (triptofano) a partir do N terminal do mesmo é mutado; ou tanto o 96o aminoácido (treonina) como o 503o aminoácido (triptofano) são simultaneamente substituídos por um outro aminoácido, mas a variante de aceto-hidroxiácido sintase não está limitado a isso. Por exemplo, a variante de aceto- hidroxiácido sintase da presente revelação pode ser uma proteína IlvB, em que o 96o aminoácido (treonina) é substituído por serina, cisteína ou alanina, ou o 503o aminoácido (triptofano) é substituído por glutamina, asparagina ou leucina. Além disso, é evidente que qualquer variante de aceto-hidroxiácido sintase que tem uma sequência de amino ácido em que o 96o aminoácido ou o 503o aminoácido é substituído por um outro aminoácido e, simultaneamente, uma parte da sequência de aminoácidos é deletada, alterada, substituída ou adicionada, pode exibir uma atividade que é idêntica ou correspondente àquela da variante de aceto- hidroxiácido sintase da presente revelação.

[0018] Além disso, as próprias subunidades grandes das variantes aceto-hidroxiácido sintase com as modificações descritas acima, aceto-hidroxiácido sintase incluindo as subunidades grandes das variantes aceto-hidroxiácido sintase e aceto-hidroxiácido sintase incluindo as subunidades grandes e pequenas das variantes aceto-hidroxiácido sintase podem estar todas incluídas no escopo da variante de aceto- hidroxiácido sintase da presente revelação, mas a variante de aceto-hidroxiácido sintase não está limitada a isso.

[0019] Na presente revelação, foi confirmado que a quantidade de produção de aminoácido de cadeia ramificada L pode ser aumentada pela substituição do 96o aminoácido e o 503o aminoácido da proteína aceto-hidroxiácido sintase por vários outros ácidos aminados, e assim foi confirmado que as posições de aminoácidos em 96 e 503 são importantes na modificação da proteína aceto-hidroxiácido sintase em conexão com a produção de aminoácidos de cadeia ramificada L. No entanto, uma vez que os aminoácidos substituídos em modalidades da presente revelação são modalidades meramente representativas que mostram os efeitos da presente memória descritiva, o escopo da presente revelação não deve ser limitado a essas modalidades, e é evidente que, quando o 96o aminoácido (treonina) é substituído por um aminoácido diferente de treonina, o 503o aminoácido (triptofano) é substituído por um aminoácido diferente de triptofano, ou tanto o 96o aminoácido como o 503o aminoácido são substituídos por um grupo amino diferente ácido, as variantes aceto-hidroxiácido sintase podem ter efeitos correspondentes àqueles descritos nas modalidades.

[0020] Além disso, a variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação pode ter uma sequência de aminoácidos representada por qualquer uma das SEQ ID NO: 28 a 33, mas a sequência de aminoácidos da variante de aceto- hidroxiácido sintase não está limitada a isso. Além disso, qualquer polipeptídeo que tenha uma homologia ou identidade de pelo menos 70%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95% ou pelo menos 99% das sequências de aminoácidos acima também pode ser incluídos sem limitação, desde que esses polipeptídeos tenham uma atividade substancialmente idêntica ou correspondente àquela da variante da aceto-hidroxiácido sintase, incluindo as modificações da presente revelação.

[0021] Homologia e identidade se referem a um grau de parentesco entre duas sequências de aminoácidos ou sequências nucleotídicas e podem ser expressas como uma porcentagem.

[0022] Os termos “homologia” e “identidade” podem frequentemente ser usados de forma intercambiável.

[0023] A homologia ou identidade de sequência de um polinucleotídeo ou polipeptídeo conservado pode ser determinada por um algoritmo de alinhamento padrão, e as penalidades de intervalo padrão estabelecidas por um programa a ser usado podem ser usadas em combinação. Substancialmente, sequências homólogas ou idênticas podem hibridizar sob condições moderadas ou altamente estringentes ao longo de toda a sua sequência ou pelo menos cerca de 50%, cerca de 60%, cerca de 70%, cerca de 80% ou cerca de 90% de todo o comprimento. No que diz respeito aos polinucleotídeos a serem hibridizados, também podem ser considerados polinucleotídeos incluindo um códon degenerado em vez de um códon.

[0024] Se quaisquer duas sequências polinucleotídicas ou polipeptídicas têm homologia, similaridade ou identidade podem ser determinadas por, por exemplo, um algoritmo de computador conhecido como o programa “FASTA” com o uso de parâmetros padrão, como em Pearson et al. (1988) (Proc. Natl. Acad. Sci. EUA 85]:2444). Alternativamente, os mesmos podem ser determinados com o uso do algoritmo Needleman - Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443 a 453), como realizado no programa Needleman do pacote EMBOSS (EMBOSS: Conjunto Europeu de Software Aberto para Biologia Molecular, Rice et al., 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versão 5.0.0 ou posterior) (incluindo o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12:387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, [S.][F.] et al., J. Molec Biol 215]: 403(1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, EUA, 1994, e [CARILLO ETA/.] (1988) SIAM J Applied Math 48:1073). Por exemplo, a homologia, a similaridade ou a identidade podem ser determinadas com o uso de o BLAST ou o ClustalW do National Center for Biotechnology Information.

[0025] A homologia, similaridade ou identidade de polinucleotídeos ou polipeptídeos pode ser determinada pela comparação de informações de sequência com o uso de o programa de computador GAP (por exemplo, Needleman et al. (1970), J Mol Biol 48: 443) como revelado em Smith e Waterman, Adv. Appl. Math (1981) 2: 482. Resumidamente, o programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (isto é, nucleotídeos ou aminoácidos) que são similares, dividido pelo número total de símbolos na menor das duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não- identidades) e a matriz de comparação ponderada (ou substituição EDNAFULL (versão EMBOSS do NCBI NUC4. 4)) de Gribskov et al. (1986) Nucl. Acids Res. 14: 6745, como revelado por Schwartz e Dayhoff, eds., Atlas Of Protein Sequence And Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, páginas 353 a 358 (1979); (2) uma penalidade de 3,0 para cada intervalo e uma penalidade adicional de 0,10 para cada símbolo em cada intervalo (ou penalidade de intervalo aberto 10, penalidade de extensão do intervalo 0,5); e (3) nenhuma penalidade por intervalos finais. Portanto, o termo “homologia” ou “identidade”, como aqui usado, representa relevância entre as sequências.

[0026] Outro aspecto da presente revelação fornece um polinucleotídeo que codifica a variante da aceto- hidroxiácido sintase da presente revelação.

[0027] Como usado aqui, o termo “polinucleotídeo” tem um significado para incluir uma molécula de DNA ou RNA, e um nucleotídeo, que é um bloco de construção básico do mesmo, inclui não apenas um nucleotídeo natural, mas também um análogo no qual um sacarídeo ou região base é modificado. Na presente revelação, o polinucleotídeo pode ser um polinucleotídeo isolado de uma célula ou um polinucleotídeo sintetizado artificialmente, mas o polinucleotídeo não está limitado a isso.

[0028] O polinucleotídeo que codifica a variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação pode incluir, sem limitação, qualquer sequência nucleotídica que codifique a proteína que tem uma atividade da variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação. Especificamente, devido à degenerescência do códon ou em consideração aos códons preferenciais por um micro-organismo no qual a proteína deve ser expressa, várias modificações podem ser feitas na região de codificação da proteína dentro do escopo que não altera a sequência de aminoácidos da proteína. proteína. O polinucleotídeo pode incluir, sem limitação, qualquer sequência nucleotídica que codifique a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO: 28 a 33 e, especificamente, uma que tenha a sequência nucleotídica da SEQ ID NO: 34 a 39. Além disso, qualquer polipeptídeo que tenha uma homologia ou identidade de pelo menos 70%, pelo menos 75%, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90%, pelo menos 95%, pelo menos 97% ou pelo menos 99 % das sequências de aminoácidos acima também pode ser incluída sem limitação, desde que esses polipeptídeos tenham uma atividade substancialmente idêntica ou correspondente à da variante de aceto-hidroxiácido sintase, incluindo as modificações da presente revelação devido à degeneração do códon.

[0029] Alternativamente, por hibridização sob condições estringentes com uma sonda que pode ser preparada a partir de uma sequência genética conhecida (por exemplo, uma sequência complementar à totalidade ou parte da sequência nucleotídica), qualquer sequência que codifique uma proteína com a atividade das proteínas que consistem no amino a sequência ácida de SEQ ID NO: 28 a 33 pode ser incluída sem limitação.

[0030] As “condições estringentes” se referem a condições que permitem a hibridização específica entre polinucleotídeos. Tais condições são descritas em detalhes na literatura (por exemplo, J. Sambrook et al., Supra). As condições estringentes podem incluir condições sob as quais genes com alta homologia ou identidade (por exemplo, genes com pelo menos 80%, especificamente pelo menos 85%, mais especificamente pelo menos 90%, ainda mais especificamente pelo menos 95%, ainda mais especificamente em pelo menos 97%, ou mais especificamente pelo menos 99%) podem hibridar um com o outro; condições sob as quais os genes com menor homologia ou identidade não podem hibridar entre si; ou condições que são condições comuns de lavagem para hibridização Southern (por exemplo, uma concentração de sal e uma temperatura correspondente a 60 °C, 1 x SSC, SDS a 0,1%; especificamente 60 °C, 0,1 x SSC, SDS a 0,1%; mais especificamente 68 °C, 0,1 x SSC, SDS a 0,1%, uma vez, especificamente, duas ou três vezes).

[0031] A hibridização requer que dois ácidos nucleicos possuam sequências complementares, embora possam ser possíveis diferenças entre as bases, dependendo da estringência da hibridização. O termo “complementar” é usado para descrever a relação entre bases nucleotídicas que podem hibridar. Por exemplo, em relação ao DNA, a adenosina é complementar à timina e a citosina é complementar à guanina. Por conseguinte, a presente revelação também pode incluir fragmentos de ácido nucleico isolados complementares à sequência inteira, bem como sequências de ácido nucleico substancialmente similares.

[0032] Especificamente, um polinucleotídeo com homologia ou identidade pode ser detectado com o uso de condições de hibridização, incluindo uma etapa de hibridização a Tm de 55 °C e utilizando as condições descritas acima. Além disso, o valor de Tm pode ser de 60 °C, 63 °C ou 65 °C, mas não está limitado a isso, e pode ser adequadamente controlado pelos especialistas na técnica de acordo com a finalidade. A estringência apropriada para a hibridização de polinucleotídeos depende do comprimento dos polinucleotídeos e do grau de complementaridade, e as variáveis são bem conhecidas na técnica (consultar Sambrook et al., supra, 9.50- 9,51, 11.7-11.8).

[0033] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um vetor que inclui o polinucleotídeo que codifica a variante modificada da aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação.

[0034] Como usado aqui, o termo “vetor” se refere a qualquer transportador para clonagem e/ou transferência de nucleotídeos para uma célula hospedeira. Um vetor pode ser um replicon para permitir a replicação de um fragmento (ou fragmentos) com outro fragmento de DNA (ou fragmentos). “Replicon” se refere a qualquer unidade genética funcionando como uma unidade autorreplicante para replicação de DNA in vivo, isto é, replicável por autorregulação. Especificamente, o vetor pode ser plasmídeos, fagos, cosmídeos, cromossomos ou vírus em um estado natural ou recombinado. Por exemplo, como um vetor fágico ou vetor cosmídeo, pWE15, M13, AMBL3, AMBL4, ÀIXII, ÀASHII, ÀAPII, Àt10, Àt11, Charon4A, Charon21A, etc. podem ser usados e, como vetor plasmídico, aqueles baseados em Podem ser usados pBR, pUC, pBluescriptII, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. Os vetores que podem ser usados na presente revelação não são particularmente limitados, mas qualquer vetor de expressão conhecido pode ser usado. Além disso, o vetor pode incluir um transposon ou cromossomo artificial.

[0035] Na presente revelação, o vetor não é particularmente limitado desde que inclua um polinucleotídeo que codifique a variante da aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação. O vetor pode ser aquele que pode replicar e/ou expressar a molécula de ácido nucleico em células eucarióticas ou procarióticas, incluindo células de mamíferos (por exemplo, células de humanos, macacos, coelhos, ratos, hamsters, camundongos, etc.), células vegetais, células de levedura, células de inseto e células bacterianas (por exemplo, E. coli, etc.) e, especificamente, pode ser uma que esteja operacionalmente ligada a um promotor adequado, de modo que o polinucleotídeo possa ser expresso em uma célula hospedeira e incluir pelo menos um marcador selecionável.

[0036] Além disso, como aqui usado, o termo “operacionalmente ligado” se refere a uma conexão funcional entre uma sequência promotora, que inicia e medeia a transcrição do polinucleotídeo que codifica a proteína alvo da presente revelação e a sequência genética acima.

[0037] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um transformante no qual o vetor da presente revelação é introduzido.

[0038] Na presente revelação, o transformante pode ser qualquer célula transformável na qual o vetor acima possa ser introduzido e na qual a variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação possa ser expressa. Especificamente, o transformante pode ser qualquer célula transformada de bactérias pertencentes ao gênero Escherichia, o gênero Corynebacterium, o gênero Streptomyces, o gênero Brevibacterium, o gênero Serratia, o gênero Providencia, Salmonella typhimurium, etc; células de leveduras; células fúngicas de Pichia pastoris, etc.; células transformadas de insetos (por exemplo, Drosophila, Spodoptera Sf9, etc.); e células animais transformadas (por exemplo, células de ovário de hamster chinês (CHO), SP2/0 (mieloma de camundongo), linfoblastoide humano, COS, NSO (mieloma de camundongo), 293T, melanoma de arco, HT-1080, rim de hamster de bebê (BHK), rim embrionário humano (HEK), PERC. 6 (retinócitos humanos)); ou células vegetais transformadas, mas o transformante não está particularmente limitado a isso.

[0039] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um aminoácido produtor de cadeia ramificada L, em que o micro-organismo contém a variante de aceto- hidroxiácido sintase ou no qual é introduzido um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica a variante.

[0040] Como usado aqui, o termo “aminoácido de cadeia ramificada L” se refere a um aminoácido com um grupo alquila ramificado na cadeia lateral e inclui valina, leucina e isoleucina. Especificamente, na presente revelação, o aminoácido de cadeia ramificada L pode ser L-valina ou L- leucina, mas não está limitado a isso.

[0041] Conforme usado aqui, o termo “microorganismo” inclui todos os micro-organismos do tipo selvagem e um micro-organismo geneticamente modificado natural ou artificialmente, e é um conceito que inclui todos os micro-organismos nos quais um determinado mecanismo é atenuado ou aprimorado devido à inserção de um gene exógeno ou aumento ou atenuação da atividade de um gene endógeno. O microorganismo se refere a todos os micro-organismos que podem expressar a variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação. Especificamente, o micro-organismo pode ser Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium amônia, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc., e mais especificamente Corynebacterium glutamicum, mas o micro-organismo não se limita a isso.

[0042] Como usado aqui, o termo “micro-organismo que produz aminoácidos de cadeia ramificada L” pode se referir a um micro-organismo natural ou um micro-organismo modificado que tem a capacidade de produzir aminoácidos de cadeia ramificada L via modificação e, especificamente, pode se referir a um micro-organismo recombinante de ocorrência não natural, mas o micro-organismo não está limitado a isso. O micro-organismo que produz aminoácidos de cadeia ramificada L é um micro-organismo que contém a variante de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação ou na qual é introduzido um vetor contendo um polinucleotídeo que codifica a variante, e o micro-organismo pode ter uma capacidade significativamente maior de produzir L aminoácidos de cadeia ramificada em comparação com um microorganismo de tipo selvagem, um micro-organismo contendo uma proteína aceto-hidroxiácido sintase de tipo natural, um micro-organismo não modificado contendo uma proteína aceto- hidroxiácido sintase e um micro-organismo que não contém uma proteína aceto-hidroxiácido sintase.

[0043] Ainda outro aspecto da presente revelação fornece um método para a produção de aminoácidos de cadeia ramificada L, que inclui: cultivar um micro-organismo que produz aminoácidos de cadeia ramificada L; e recuperar os aminoácidos de cadeia ramificada L a partir do microorganismo ou meio cultivado na etapa acima.

[0044] Como usado aqui, o termo “cultura” se refere à cultura de um micro-organismo sob condições ambientais artificialmente controladas. Na presente revelação, o método para a produção de um aminoácido de cadeia ramificada L com o uso de um micro-organismo capaz de produzir um aminoácido de cadeia ramificada L pode ser realizado por um método amplamente conhecido na técnica. Especificamente, a cultura pode ser realizada em um processo em lote, processo em lote alimentado ou processo repetido em lote alimentado, mas o processo em lote não é limitado a isso.

[0045] O meio usado para a cultura deve atender aos requisitos de uma cepa específica usada. Por exemplo, o meio de cultura adequado para uso na cultura da cepa de Corynebacterium é conhecido na técnica (por exemplo, Manual de Métodos para Bacteriologia Geral da Sociedade Americana de Bacteriologia, Washington DC, EUA, 1981).

[0046] As fontes de sacarídeos que podem ser usadas no meio de cultura podem ser sacarídeos e carboidratos (por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, amido e celulose); óleos e lipídios (por exemplo, óleo de soja, óleo de semente de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco); ácidos graxos (por exemplo, ácido palmítico, ácido estérico e ácido linoleico); álcoois (por exemplo, glicerol e etanol); e ácidos orgânicos (por exemplo, ácido acético). Esses materiais podem ser usados independentemente ou em combinação, mas os modos de uso não estão limitados a isso.

[0047] Exemplos de fontes de nitrogênio que podem ser usadas no meio de cultura podem incluir peptona, extrato de levedura, suco de carne, extrato de malte, aguardente de milho, farelo de soja e ureia ou compostos inorgânicos (por exemplo, sulfato de amônio, cloreto de amônio, fosfato de amônio, carbonato de amônio e nitrato de amônio). Essas fontes de nitrogênio também podem ser usadas independentemente ou em combinação, mas os modos de uso não estão limitados a isso.

[0048] As fontes de fósforo que podem ser usadas no meio de cultura podem incluir di-hidrogenofosfato de potássio, hidrogenofosfato dipotássico ou sais contendo sódio correspondentes. Além disso, o meio de cultura pode conter sais metálicos necessários para o crescimento das células. Além disso, além dos materiais acima, podem ser usados materiais essenciais para o crescimento (por exemplo, aminoácidos e vitaminas). Além disso, podem ser usados precursores adequados para o meio de cultura. As matérias- primas acima podem ser adicionadas adequadamente à cultura durante o processo de cultura de maneira descontínua ou contínua, mas o método de adição não está limitado a isso.

[0049] O pH da cultura pode ser ajustado com o uso de um composto básico (por exemplo, hidróxido de sódio, hidróxido de potássio ou amônia) ou um composto ácido (por exemplo, ácido fosfórico ou ácido sulfúrico) de uma maneira apropriada. Além disso, a geração de espuma pode ser evitada com o uso de um agente antiespumante (por exemplo, éster de poliglicol de ácidos graxos). Oxigênio ou gás contendo oxigênio (por exemplo, ar) podem ser injetados na cultura de modo a manter a condição aeróbica da cultura. A temperatura da cultura pode estar geralmente na faixa de 20 °C a 45 °C, e especificamente de 25 °C a 40 °C. A cultura pode continuar até que a quantidade máxima de aminoácidos de cadeia ramificada L seja produzida, e especificamente por 10 a 160 horas. O aminoácido de cadeia ramificada L pode ser liberado no meio de cultura ou contido nas células, mas não está limitado a isso.

[0050] O método de recuperação de um aminoácido de cadeia ramificada L de um micro-organismo ou cultura pode incluir aqueles bem conhecidos na técnica; por exemplo, centrifugação, filtração, tratamento com um precipitante de cristalização de proteínas (método de salga), extração, interrupção ultrassônica, ultrafiltração, diálise, vários tipos de cromatografias (por exemplo, cromatografia de peneira molecular (filtração em gel), cromatografia de adsorção, troca iônica cromatografia de afinidade, etc.), HPLC e uma combinação dos mesmos podem ser usados, mas os métodos não estão limitados a isso. Além disso, a etapa de recuperar o aminoácido de cadeia ramificada L pode ainda incluir um processo de purificação, e o processo de purificação pode ser realizado com o uso de um método apropriado conhecido na técnica.

[DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO]

[0051] A seguir, a presente revelação será descrita em mais detalhes com referência aos seguintes Exemplos. No entanto, esses exemplos são apenas para fins ilustrativos, e a presente revelação não se destina a ser limitada por esses exemplos. EXEMPLO 1: PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA DE DNA QUE CODIFICA A ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE MODIFICADA COM O USO DE MUTAGÊNESE ARTIFICIAL

[0052] Nesse exemplo, uma biblioteca de vetores para inserção cruzada primária no cromossomo para obter variantes de aceto-hidroxiácido sintase foi preparada por meio do método a seguir. A PCR propensa a erros foi realizada para o gene ilvB (SEQ ID NO: 2) que codifica a aceto-hidroxiácido sintase (SEQ ID NO: 1) derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 e, portanto, variantes do gene ilvB (2.395 bp) das variantes do gene ilvB, introduzidas aleatoriamente com uma mutação (modificação) da substituição nucleotídica. A PCR propensa a erros foi realizada com o uso de o kit de mutagênese aleatória GenemorphII (Stratagene), com o uso de o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 como modelo juntamente com o primer 1 (SEQ ID NO: 3) e o primer 2 (SEQ ID NO: 4). primer 1 (SEQ ID NO: 3): 5’- AACCG GTATC GACAA TCCAA T -3’ primer 2 (SEQ ID NO: 4): 5’- GGGTC TCTCC TTATG CCTC - 3’

[0053] A PCR propensa a erros foi realizada de modo que modificações podem ser introduzidas no fragmento de gene amplificado a uma razão de 0 a 3,5 mutações por 1 kb do fragmento de gene amplificado. A PCR foi realizada por um total de 30 ciclos da seguinte forma: desnaturação a 96 °C por 30 s, recozimento a 53 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 2 min.

[0054] Os fragmentos de genes amplificados foram conectados ao vetor pCR2.1-TOPO (doravante, “pCR2.1”) com o uso de o kit de clonagem pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), transformado em E. coli DH5α, e plaqueados em um LB sólido meio contendo canamicina (25 mg/l). 20 das colônias transformadas foram selecionadas e suas sequências de nucleotídeos foram analisadas após a obtenção de seus plasmídeos. Como resultado, foi confirmado que modificações foram introduzidas em sítios diferentes, com uma frequência de 2,1 mutações/kb. Os plasmídeos foram extraídos de cerca de 20.000 colônias de E. coli transformadas e receberam o nome de “biblioteca pCR2.1-ilvB (mt)”.

[0055] Além disso, foi preparado um plasmídeo incluindo o gene ilvB de tipo selvagem a ser usado como controle. A PCR foi realizada utilizando o DNA genômico de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 como um modelo juntamente com o primer 1 (SEQ ID NO: 3) e o primer 2 (SEQ ID NO: 4), nas mesmas condições descritas acima. Para a polimerase, foi usada a polimerase de DNA de alta fidelidade PfuUltraÔ (Stratagene), e o plasmídeo preparado foi denominado “pCR2.1-ilvB (WT)”. EXEMPLO 2: PREPARAÇÃO DE CEPA DEFICIENTE EM ilvB

[0056] Uma cepa deficiente em ilvB para a introdução da biblioteca pCR2.1-ilvB (mt) foi preparada com o uso da cepa KCCM11201P (patente KR n° 10-1117022) como cepa mãe.

[0057] Para preparar um vetor deficiente em ilvB, a PCR foi realizada com o uso de o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum de tipo selvagem ATCC14067 como modelo e um conjunto de primers do primer 3 (SEQ ID NO: 5) e do primer 4 (SEQ ID NO: 6) e um conjunto de primers do primer 5 (SEQ ID NO: 7) e primer 6 (SEQ ID NO: 8). primer 3 (SEQ ID NO: 5): 5’- GCGTC TAGAG ACTTG CACGA GGAAA CG -3’ primer 4 (SEQ ID NO: 6): 5’- CAGCC AAGTC CCTCA GAATT GATGT AGCAA TTATC C -3’ primer 5 (SEQ ID NO: 7): 5’- GGATA ATTGC TACAT CAATT CTGAG GGACT TGGCT G -3’ primer 6 (SEQ ID NO: 8): 5’- GCGTC TAGAA CCACA GAGTC TGGAG CC -3’

[0058] A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C por 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 30 s; e polimerização a 72 °C por 7 min.

[0059] Como resultado, um fragmento de DNA de 731 pb (SEQ ID NO: 9), que inclui a região a montante do promotor do gene ilvB e um fragmento de DNA de 712 pb (SEQ ID NO: 10), que inclui o terminal 3’ de o gene ilvB foi obtido.

[0060] A PCR foi realizada com o uso dos fragmentos de DNA amplificado (SEQ ID NO: 9 e 10) e um conjunto de primers do primer 3 (SEQ ID NO: 5) e do primer 6 (SEQ ID NO: 8). A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 95 °C por 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 95 °C por 30 s, recozimento a 55 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 60 s; e polimerização a 72 °C por 7 min.

[0061] Como resultado, um fragmento de DNA de 1. 407 pb (SEQ ID NO: 11, daqui em diante “fragmento ilvB”), no qual um fragmento de DNA incluindo a região a montante do promotor do gene ilvB e um fragmento de DNA incluindo o terminal 3’ dos genes ilvB estão ligados, foi amplificado.

[0062] O vetor pDZ (Patente KR No. 10-0924065), que não pode se replicar em Corynebacterium glutamicum, e o fragmento do gene ilvB amplificado acima foram tratados com a enzima de restrição XbaI, ligados com o uso de uma ligase de DNA e clonados. O plasmídeo obtido foi denominado “pDZ- ilvB”.

[0063] O pDZ-ilvB foi transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11201P por meio do método de eletroporação (Appl. Microbiol. Biothcenol. (1999) 52: 541545), e as cepas transformadas foram obtidas em meios de seleção contendo canamicina (25 mg/l) e 2 mM cada de L- valina, L-leucina e L-isoleucina. A cepa, na qual o gene é inativado pelo fragmento do gene ilvB inserido no genoma durante o processo de cruzamento secundário, foi obtida e a cepa foi denominada KCCM11201P ilvB. EXEMPLO 3: PREPARAÇÃO DA BIBLIOTECA DE CEPAS MODIFICADAS DE ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE E SELEÇÃO DE CEPAS COM MAIOR CAPACIDADE DE PRODUZIR L-AMINOÁCIDOS

[0064] A cepa KCCM11201PilvB acima preparada foi transformada por recombinação homóloga com o uso de a biblioteca pCR2.1-ilvB (mt) acima preparada e o transformante foi plaqueado em um meio de placa complexo contendo canamicina (25 mg/l) e foram obtidas cerca de 10.000 colônias daí. As colônias foram nomeadas KCCM11201P ilvB /pCR2.1-ilvB(mt)-1 a KCCM11201P ilvB /pCR2.1-ilvB(mt)-10000.

[0065] Além disso, o vetor pCR2.1-ilvB (WT) acima preparado foi transformado na cepa KCCM11201P ilvB para preparar uma cepa controle e a cepa foi denominada KCCM11201P ilvB /pCR2.1-ilvB(WT). < MEIO DE PLACA COMPLEXO (pH 7,0)>

[0066] Glicose (10 g), Peptona (10 g), Extrato de carne (5 g), Extrato de levedura (5 g), Infusão cerebral no coração (18,5 g), NaCl (2,5 g), Ureia (2 g), Sorbitol (91 g)), Ágar (20 g) (à base de 1 l de água destilada)

[0067] Cerca de 25.000 colônias obtidas acima foram inoculadas em um meio seletivo (300 μl) contendo os componentes descritos abaixo e cultivadas em uma placa de 96 poços a 32 °C a uma taxa de 1. 000 rpm por 24 horas. As quantidades de L-aminoácidos produzidos na cultura foram analisadas por meio do método da ninidrina (J. Biol. Chem. 1948176: 367 - 388). Após a conclusão do cultivo, 10 μl do sobrenadante da cultura e 190 μl de uma solução de reação com ninidrina reagiram a 65 °C por 30 minutos. A absorvância foi medida no comprimento de onda 570 nm com o uso de um espectrofotômetro e foi comparada com a do controle, ou seja, KCCM11201P ilvB /pCR2.1-ilvB(WT), e cerca de 213 cepas modificadas mostrando uma absorvância com um aumento de pelo menos 10% foram selecionados. Outras colônias mostraram absorvância semelhante ou reduzida em comparação com a do controle. <MEIO SELETIVO (pH 8,0)>

[0068] Glicose (10 g), (NH4)2SO4 (5,5 g), MgSO4 7H2O (1,2 g), KH2PO4(0,8 g), K2HPO4 (16,4 g), Biotina (100 μg), HCl de tiamina (1.000 μg), ácido pantotênico e cálcio (2.000 μg) e nicotinamida (2.000 μg) (à base de 1 l de água destilada)

[0069] O método acima foi realizado repetidamente para as 213 cepas selecionadas e os 60 principais tipos de cepas com uma capacidade aprimorada de produzir os L- aminoácidos comparados àqueles de KCCM11201P ilvB /pCR2.1- ilvB(WT) foram selecionados. EXEMPLO 4: CONFIRMAÇÃO DA CAPACIDADE DE PRODUÇÃO DE L- VALINA DE CEPAS SELECIONADAS DA BIBLIOTECA DE CEPAS MODIFICADAS DE ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE

[0070] Os 60 tipos de cepas selecionados no Exemplo 3 foram analisados em relação às suas habilidades de produção de L-valina após cultivá-las por meio do método a seguir.

[0071] Cada uma das cepas foi inoculada em um balão de defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml de um meio de produção, respectivamente, e cultivada em uma incubadora com agitação (200 rpm) a 30 °C por 20 horas. Em seguida, cada um dos frascos de 250 ml contendo 24 ml da cultura, que continha os componentes descritos abaixo, foi inoculado com 1 ml de caldo de cultura de sementes e cultivado com agitação (200 rpm) a 30 °C por 72 horas. A concentração de L-valina em cada cultura foi analisada por HPLC. < MEIO DE PRODUÇÃO (pH 7,0)>

[0072] Glicose (100 g), (NH4)2SO4 (40 g), Proteína de soja (2,5 g), Sólidos íngremes de milho (5 g), Ureia (3 g), KH2PO4 (1 g), MgSO4 7H2O (0,5 g), Biotina (100 μg), Tiamina HCl (1.000 μg), Ácido cálcio-pantotênico (2.000 μg), Nicotinamida (3.000 μg) e CaCO3 (30 g) (à base de 1 l de água destilada).

[0073] Entre os 60 tipos de cepas selecionados, foram selecionados 2 tipos de cepas mostrando um aumento na concentração de L-valina e o cultivo e a análise foram realizados repetidamente. Os resultados da análise da concentração de L-valina são mostrados na Tabela 1 abaixo. Os 58 tipos restantes de cepas realmente mostraram uma diminuição na concentração de L-valina.

[0074] Como resultado da análise da concentração de L-valina das 2 cepas selecionadas, confirmou-se que o rendimento de L-valina das duas cepas aumentou 20,7% no máximo em comparação ao da cepa de controle, KCCM11201P ilvB/pCR2.1-ilvB (WT). EXEMPLO 5: CONFIRMAÇÃO DE MODIFICAÇÃO DO GENE ilvB EM CEPAS SELECIONADAS DE UMA BIBLIOTECA DE CEPAS MODIFICADAS DE ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE

[0075] Para confirmar as modificações aleatórias introduzidas na aceto-hidroxiácido sintase das 2 cepas selecionadas no Exemplo 4, foram analisadas as sequências nucleotídicas do gene ilvB. Para determinar as sequências nucleotídicas, a PCR foi realizada com o uso de um conjunto de primers do primer 7 (SEQ ID NO: 12) e primer 8 (SEQ ID NO: 13). primer 7 (SEQ ID NO: 12): 5’- CGCTT GATAA TACGC ATG - 3’ primer 8 (SEQ ID NO: 13): 5’- GAACA TACCT GATAC GCG - 3’

[0076] Os fragmentos do gene ilvB modificado obtidos foram submetidos a análise de sequência nucleotídica e os resultados foram comparados com a sequência nucleotídica do gene ilvB do tipo selvagem (isto é, SEQ ID NO: 2). Como resultado, as sequências nucleotídicas do gene ilvB modificado foram confirmadas e as sequências de aminoácidos das proteínas modificadas de aceto-hidroxiácido sintase. A informação dos dois tipos selecionados de proteínas aceto- hidroxiácido sintase modificada é mostrada na Tabela 2 abaixo.

EXEMPLO 6: PREPARAÇÃO DO VETOR PARA INTRODUÇÃO DE MODIFICAÇÃO NA ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE

[0077] Para confirmar os efeitos das proteínas de aceto-hidroxiácido sintase modificadas que foram confirmadas no Exemplo 5, foi preparado um vetor capaz de introduzir as proteínas de aceto-hidroxiácido sintetase modificadas no cromossomo.

[0078] Com base nas sequências nucleotídicas confirmadas, um conjunto de primers do primer 9 (SEQ ID NO: 14) e o primer 10 (SEQ ID NO: 15) e um conjunto de primers do primer 11 (SEQ ID NO: 16) e o primer 12 (SEQ ID NO: 17), na qual um sítio de restrição XbaI foi inserido na extremidade 5 ‘, foram sintetizados. Em seguida, a PCR foi realizada com o uso de cada um dos dois tipos selecionados de DNA cromossômico como modelo com o uso de esses conjuntos de primers, e assim os fragmentos do gene ilvB modificado foram amplificados. A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 94 °C por 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 2 min; e polimerização a 72 °C por 7 min. primer 9 (SEQ ID NO: 14): 5’- CGCTC TAGAC AAGCA GGTTG AGGTT CC -3’ primer 10 (SEQ ID NO: 15): 5’- CGCTC TAGAC ACGAG GTTGA ATGCG CG -3’ primer 11 (SEQ ID NO: 16): 5’- CGCTC TAGAC CCTCG ACAAC ACTCA CC -3’ primer 12 (SEQ ID NO: 17): 5’- CGCTC TAGAT GCCAT CAAGG TGGTG AC -3’

[0079] Os dois tipos de fragmentos de genes amplificados por PCR foram tratados com XbaI para obter os respectivos fragmentos de DNA e vincularam esses fragmentos ao vetor pDZ para introdução cromossômica, que inclui um sítio de restrição XbaI, transformado em E. coli DH5α, e os transformantes foram espalhados em um meio sólido LB contendo canamicina (25 mg/l).

[0080] As colônias transformadas com um vetor inserido com um gene alvo foram selecionadas por PCR, e os plasmídeos foram obtidos por um método de extração de plasmídeo comumente conhecido. Esses plasmídeos foram denominados pDZ-ilvB (W503Q) e pDZ-ilvB (T96S), cada um de acordo com as modificações inseridas no gene ilvB. EXEMPLO 7: PREPARAÇÃO DE CEPAS DERIVADAS DE KCCM11201P COM MODIFICAÇÃO NA ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE E COMPARAÇÃO DE SUAS HABILIDADES DE PRODUÇÃO DE L-VALINA

[0081] Os dois tipos de vetores introduzidos com novas modificações preparadas no Exemplo 6 foram cada um transformado em Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, que é uma cepa produtora de L-valina, por uma recombinação cromossômica homóloga em duas etapas. Em seguida, as cepas introduzidas com a modificação do gene ilvB no cromossomo foram selecionadas pela análise de sequências de nucleotídeos. As cepas introduzidas com a modificação do gene ilvB foram denominadas KCCM11201P::ilvB (W503Q) e KCCM11201P::ilvB (T96S). Além disso, o vetor pDZ-ilvB (T96S), entre os vetores introduzidos com a modificação acima, foi transformado na cepa KCCM11201P::ilvB (W503Q) preparada acima. Em seguida, as linhagens nas quais os dois tipos de modificações no cromossomo foram introduzidas foram denominadas KCCM11201P::ilvB (W503Q/T96S).

[0082] As cepas foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 4, e as concentrações de L-valina foram analisadas a partir das cepas cultivadas (Tabela 3).

[0083] Como resultado, duas novas cepas introduzidas com modificações (KCCM11201P::ilvB (W503Q) e KCCM11201P::ilvB (T96S)) mostraram um aumento máximo de 17,8% na capacidade de produção de L-valina em comparação com a cepa-mãe e a cepa introduzido com ambas as modificações (KCCM11201P::ilvB (W503Q/T96S)) mostrou um aumento de 21,4% na capacidade de produção de L-valina em comparação com a cepa-mãe.

[0084] Por conseguinte, considerando que a aceto- hidroxiácido sintase é a primeira enzima nas vias de biossíntese dos aminoácidos de cadeia ramificada L, espera- se que as grandes subunidades da aceto-hidroxiácido sintase variantes da presente revelação tenham um efeito no aumento da produção de L-isoleucina e L-leucina, bem como L-valina.

[0085] Os presentes inventores nomearam as linhagens com uma capacidade aprimorada de produção de L-valina (ou seja, KCCM11201P::ilvB (W503Q) e KCCM11201P::ilvB (T96S)) como Corynebacterium glutamicum KCJ-0793 e Corynebacterium glutamicum KCJ-0796 e depositaram em 25 de janeiro de 2016, sob os números de acesso KCCM11809P e KCCM11810P. EXEMPLO 8: PREPARAÇÃO DO VETOR DE SUPEREXPRESSÃO PARA A BIOSSÍNTESE DE L-VALINA CONTENDO DNA QUE CODIFICA ACETO- HIDROXIÁCIDO SINTASE MODIFICADA

[0086] Como grupo controle, um vetor de superexpressão para biossíntese de L-valina foi preparado a partir de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, que é uma cepa produtora de L-valina. Adicionalmente, foram preparados vetores de superexpressão para biossíntese de L-valina, nos quais DNAs codificando aceto-hidroxiácido sintase modificados a partir de cada um dos KCCM11201P::ilvB (W503Q) e KCCM11201P::ilvB (T96S) preparados no Exemplo 7.

[0087] Para a preparação dos vetores acima, o primer 13 (SEQ ID NO: 18), em que um sítio de restrição BamHl foi inserido na extremidade 5’, e o primer 14 (SEQ ID NO: 19), em que um sítio de restrição XbaI foi inserido na extremidade 3’, foram sintetizados. Com o uso do conjunto de primers, a PCR foi realizada com o uso de cada um dos DNAs cromossômicos de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P (isto é, uma cepa produtora de L-valina) e as cepas preparadas no Exemplo 7 (isto é, KCCM11201P::ilvB (W503Q) e KCCM11201P::ilvB (T96S)) como modelo e, assim, dois tipos de fragmentos de genes ilvBN modificados foram amplificados. A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 94 °C por 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 4 min; e polimerização a 72 °C por 7 min. primer 13 (SEQ ID NO: 18): 5’- CGAGG ATCCA ACCGG TATCG ACAAT CCAAT -3’ primer 14 (SEQ ID NO: 19): 5’- CTGTC TAGAA ATCGT GGGAG TTAAA CTCGC -3’

[0088] Os dois tipos de fragmentos de genes amplificados por PCR foram tratados com BamHI e XbaI para obter seus respectivos fragmentos de DNA. Esses fragmentos de DNA foram ligados ao vetor de superexpressão pECCG117 Tendo BamHI e os sítios de restrição Xbal, transformado em E. coli DH5a, e plaqueadas em meio LB um sólido contendo canamicina (25 mg/l).

[0089] As colônias transformadas com um vetor inserido com um gene alvo foram selecionadas por PCR e os plasmídeos foram obtidos por um método de extração de plasmídeo comumente conhecido. Esses plasmídeos foram denominados pECCG117-ilvBN, pECCG117-ilvB (W503Q) N e pECCG117-ilvB (T96S) N, cada um de acordo com as modificações inseridas no gene ilvB. EXEMPLO 9: PREPARAÇÃO DO VETOR DE SUPEREXPRESSÃO PARA BIOSSÍNTESE DE L-VALINA CONTENDO DNA QUE CODIFICA ACETO- HIDROXIÁCIDO SINTASE MODIFICADA NA QUAL UM AMINOÁCIDO É SUBSTITUÍDO POR OUTRO AMINOÁCIDO NA MESMA POSIÇÃO

[0090] Nas proteínas de aceto-hidroxiácido sintase modificadas confirmadas no Exemplo 5, para confirmar os efeitos de posição em modificação, foram preparados os vetores em que o 96o aminoácido é substituído por um aminoácido diferente de treonina ou serina e o 503o aminoácido é substituído por um aminoácido diferente de triptofano ou glutamina.

[0091] Especificamente, os vetores de superexpressão para a biossíntese de L-valina, em que uma modificação em que o 503o aminoácido de aceto-hidroxiácido sintase é substituído por asparagina ou leucina ou uma modificação em que o 96o aminoácido é substituído por alanina ou cisteína, foram preparados a partir de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, que é uma cepa produtora de L-valina. Os aminoácidos substituídos são apenas exemplos de aminoácidos representativos que podem ser substituídos e os aminoácidos não estão limitados a isso.

[0092] Para a preparação desses vetores, primeiro, a PCR foi realizada utilizando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e do primer 15 (SEQ ID NO: 20) e um conjunto de primers do primer 16 (SEQ ID NO: 21) e o primer 14 (SEQ ID NO: 19), e desse modo uma sobre 2041 fragmento de DNA pb que tem um sítio de restrição BamHI na extremidade 5’ e um DNA de 1055 pb o fragmento que tem um sítio de restrição XbaI na extremidade 3’ foi amplificado. A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 94 °C por 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 2 min; e polimerização a 72 °C por 7 min. primer 15 (SEQ ID NO: 20): 5’- CTTCA TAGAA TAGGG TCTGG TTTTG GCGAA CCATG CCCAG -3’ primer 16 (SEQ ID NO: 21): 5’- CTGGG CATGG TTCGC CAAAA CCAGA CCCTA TTCTA TGAAG -3’

[0093] Em seguida, a PCR foi realizada com o uso dos dois fragmentos de DNA amplificado como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e do primer 14 (SEQ ID NO: 19). A PCR foi realizada da seguinte forma: desnaturação a 94 °C por 5 min; 30 ciclos de desnaturação a 94 °C por 30 s, recozimento a 56 °C por 30 s e polimerização a 72 °C por 4 min; e polimerização a 72 °C por 7 min.

[0094] Como resultado, um fragmento do gene ilvBN em que foi obtida uma modificação em que o 503o aminoácido de aceto-hidroxiácido sintase é substituído por asparagina.

[0095] Da mesma maneira, a PCR foi realizada utilizando o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e o primer 17 (SEQ ID NO: 22) e um conjunto primer de o primer 18 (SEQ ID NO: 23) e o primer 14 (SEQ ID NO: 19) e, assim, um fragmento de DNA de cerca de 2. 041 pb com um sítio de restrição BamHI na extremidade 5 ‘e um fragmento de DNA de 1. 055 pb com um sítio de restrição XbaI na extremidade 3’ foi amplificado. primer 17 (SEQ ID NO: 22): 5’- CTTCA TAGAA TAGGG TCTGC AGTTG GCGAA CCATG CCCAG -3’ primer 18 (SEQ ID NO: 23): 5’- CTGGG CATGG TTCGC CAACT GCAGA CCCTA TTCTA TGAAG -3’

[0096] Em seguida, a PCR foi realizada com o uso dos dois fragmentos de DNA amplificado como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e do primer 14 (SEQ ID NO: 19).

[0097] Como resultado, um fragmento do gene ilvBN em que foi obtida uma modificação em que o 503o aminoácido de aceto-hidroxiácido sintase é substituído por leucina.

[0098] Da mesma maneira, a PCR foi realizada com o uso de o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e do primer 19 (SEQ ID NO: 24) e um conjunto primer de o primer 20 (SEQ ID NO: 25) e o primer 14 (SEQ ID NO: 19), e desse modo um fragmento de DNA de cerca de 819 pb com um sítio de restrição Bam Hl na extremidade 5’ e um fragmento de DNA de 2276 pb, que tem uma Xba O sítio de restrição I na extremidade 3’ foi amplificado. primer 19 (SEQ ID NO: 24): 5’- GGTTG CGCCT GGGCC AGATG CTGCA ATGCA GACGC CAAC -3’ primer 20 (SEQ ID NO: 25): 5’- GTTGG CGTCT GCATT GCAGC ATCTG GCCCA GGCGC AACC -3’

[0099] Em seguida, a PCR foi realizada com o uso dos dois fragmentos de DNA amplificado como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e do primer 14 (SEQ ID NO: 19).

[0100] Como resultado, um fragmento do gene ilvBN em que foi obtida uma modificação em que o 96o aminoácido de aceto-hidroxiácido sintase é substituído por alanina.

[0101] Da mesma maneira, a PCR foi realizada com o uso de o DNA cromossômico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como um modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e o primer 21 (SEQ ID NO: 26) e um conjunto primer de o primer 22 (SEQ ID NO: 27) e o primer 14 (SEQ ID NO: 19), e desse modo um fragmento de DNA de cerca de 819 pb com um sítio de restrição Bam Hl na extremidade 5’ e um fragmento de DNA de 2276 pb, que tem uma Xba O sítio de restrição I na extremidade 3’ foi amplificado. primer 21 (SEQ ID NO: 26): 5’- GGTTG CGCCT GGGCC AGAGC ATGCA GACGC CAAC -3’ primer 22 (SEQ ID NO: 27): 5’- GTTGG CGTCT GCATT GCATG CTCTG GCCCA GGCGC AACC -3’

[0102] Em seguida, a PCR foi realizada com o uso dos dois fragmentos de DNA amplificado como modelo e um conjunto de primers do primer 13 (SEQ ID NO: 18) e do primer 14 (SEQ ID NO: 19).

[0103] Como resultado, um fragmento do gene ilvBN em que foi obtida uma modificação em que o 96o aminoácido de aceto-hidroxiácido sintase é substituído por cisteína.

[0104] Utilizando o mesmo método que no Exemplo 8, os quatro tipos de fragmentos de genes modificados por PCR amplificados foram tratados com as enzimas de restrição BamHI e XbaI e, assim, foram obtidos os respectivos fragmentos de DNA. Esses fragmentos de DNA foram cada um ligado aos pECCG117 superexpressão vetor com Bam HI e os sítios de restrição Xbal, transformado em E. coli DH5a, e plaqueadas em meio LB um sólido contendo canamicina (25 mg/l).

[0105] As colônias transformadas com um vetor inserido com um gene alvo foram selecionadas por PCR, e os plasmídeos foram obtidos por um método de extração de plasmídeo comumente conhecido. Esses plasmídeos foram nomeados, cada um, pECCG117-ilvB (W503N) N, pECCG117-ilvB (W503L) N, pECCG117-ilvB (T96A) N e pECCG117-ilvB (T96C) N, cada um de acordo com a sequência de modificações inseridas no gene ilvB. EXEMPLO 10: PREPARAÇÃO DE CEPAS NAS QUAIS ACETO- HIDROXIÁCIDO SINTASE MODIFICADA DERIVADA DE TIPO SELVAGEM É INTRODUZIDA E COMPARAÇÃO DE CAPACIDADES DE PRODUÇÃO DE L- VALINA

[0106] Os vetores de superexpressão para a biossíntese de L-valina preparados nos Exemplos 8 e 9 (ou seja, pECCG117-ilvBN, pECCG117-ilvB (W503Q) N, pECCG117-ilvB (T96S) N e pECCG117-ilvB (W503N) N, pECCG117-ilvB (W503N) N50, pECCG117-ilvB (W503N)) N, pECCG117-ilvB (T96A) N e pECCG117-ilvB (T96C) N) foram inseridos na cepa de Corynebacterium glutamicum do tipo selvagem (ATCC13032) por eletroporação. As cepas preparadas foram nomeadas, cada uma, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvBN, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB (W503Q) N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB (T96S) N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117- ilvB (W503N) N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB (W503L) N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB (T96A) N e Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117

[0107] Uma vez que as cepas que são transformadas com esses vetores terão resistência à canamicina, a presença de transformação foi confirmada através da verificação do crescimento destas cepas em um meio contendo canamicina a uma concentração de 25 mg/l.

[0108] Cada uma das cepas foi inoculada em um balão de defletor de canto de 250 ml contendo 25 ml do meio de produção e cultivada com agitação a 200 rpm a 30 °C por 72 horas. A concentração de L-valina em cada cultura foi analisada por HPLC (Tabela 4).

[0109] Como resultado, confirmou-se que as novas modificações no qual o 96o ou 503o aminoácido de aceto- hidroxiácido sintase é substituído por outro aminoácido mostraram um aumento máximo de 700% na capacidade de L- produzindo-valina em comparação com o controle grupo. Este resultado confirmou a importância das posições de aminoácidos 96 a 503 e Rd de aceto-hidroxiácido sintase, e estas posições de aminoácidos se espera que afetem a capacidade de produzir outros aminoácidos de cadeia ramificada assim como de L-valina. EXEMPLO 11: PREPARAÇÃO DE CEPAS NAS QUAIS É INTRODUZIDA ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTASE MODIFICADA E COMPARAÇÃO DAS CAPACIDADES DE PRODUÇÃO DE L-VALINA

[0110] Para confirmar se as variantes de subunidades grandes de aceto-hidroxiácido sintase da presente revelação influenciam o aumento da capacidade de produzir outros aminoácidos de cadeia ramificada L, como outra modalidade dos aminoácidos de cadeia ramificada L, a capacidade de examinou-se a produção de L-leucina.

[0111] Especificamente, os dois vetores nos quais novas modificações foram introduzidas preparadas no Exemplo 6 foram transformados por uma recombinação homóloga de duas etapas no Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (Pedido de Patente n° KR 10-2015-0119785 e Publicação de Pedido de Patente n° KR 10- 2017-0024653), que é uma cepa produtora de L-leucina. Em seguida, as cepas nas quais a modificação do gene ilvB é introduzida no cromossomo do mesmo foram selecionadas por análise de sequência de nucleotídeos, e as cepas nas quais a modificação do gene ilvB é introduzida foram denominadas KCCM11661P::ilvB (W503Q) e KCCM11661P::ilvB (T96S)

[0112] O Corynebacterium glutamicum KCCM11661P com resistência à norleucina (NL) é uma cepa mutante derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 e foi obtida como se segue.

[0113] Especificamente, o Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 foi cultivado em um meio de ativação por 16 horas, e a cepa ativada foi inoculada em um meio de semente, que foi esterilizado a 121 °C por 5 minutos e cultivado por 14 horas e 5 ml de a cultura foi recuperada. A cultura recuperada foi lavada com tampão de ácido cítrico 100 mM e N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (NTG) foi adicionada a uma concentração final de 200 mg/l e tratada por 20 minutos e lavada com tampão fosfato 100 mM. As cepas tratadas com GTN foram plaqueadas em um meio mínimo e a taxa de mortalidade foi calculada e, como resultado, a taxa de mortalidade foi de 85%.

[0114] Para obter uma cepa mutante com resistência à norleucina (NL), as cepas tratadas com NTG foram plaqueadas em um meio mínimo contendo NL a uma concentração final de 20 mM, 30 mM, 40 mM e 50 mM, respectivamente. Em seguida, as cepas foram cultivadas a 30 °C por 5 dias e, assim, uma cepa mutante resistente a NL foi obtida.

[0115] Suco de carne (1%), polipeptona (1%), NaCl (0,5%), extrato de levedura (1%), ágar (2%), pH 7,2

[0116] Glicose (5%), Bactopeptona (1%), NaCl (0,25%), Extrato de levedura (1%), Ureia (0,4%), pH 7,2

[0117] Glicose (1%), sulfato de amônio (0,4%), sulfato de magnésio (0,04%), fosfato monopotássico (0,1%), ureia (0,1%), tiamina (0,001%), biotina (200 μg/l), ágar (2) %), pH 7,0

[0118] A cepa mutante assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum KCJ-24 e depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos (KCCM), que é reconhecida como autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 22 de janeiro de 2015, sob o Número de Acesso KCCM11661P.

[0119] O KCCM11661P::ilvB (W503Q) e o KCCM11661P::ilvB (T96S) foram cultivados da mesma maneira que no Exemplo 4, e a concentração de L-leucina em cada cultura foi analisada (Tabela 5).

[0120] As duas linhagens nas quais foram introduzidas novas modificações (ou seja, KCCM11661P::ilvB (W503Q) e KCCM11661P::ilvB (T96S)) mostraram um aumento máximo de 26,9% na capacidade de produção de L-leucina em comparação com a linhagem original. EXEMPLO 12: PREPARAÇÃO DE CEPAS NAS QUAIS É INTRODUZIDA ACETO-HIDROXIÁCIDO SINTETASE MODIFICADA DERIVADA DE KCCM11662P E COMPARAÇÃO DAS CAPACIDADES DE PRODUÇÃO DE L- LEUCINA

[0121] Os dois vetores nos quais foram introduzidas novas modificações preparadas no Exemplo 6 foram transformados por uma recombinação homóloga de duas etapas no Corynebacterium glutamicum KCCM11662P (Pedido de Patente n° KR 10-2015-0119785 e Publicação de Pedido de Patente n° KR 10-2017- 0024653), que é uma cepa produtora de L-leucina. Em seguida, as cepas nas quais a modificação do gene ilvB é introduzida no cromossomo do mesmo foram selecionadas por análise de sequência de nucleotídeos, e as cepas nas quais a modificação do gene ilvB é introduzida foram denominadas KCCM11662P::ilvB (W503Q) e KCCM11662P::ilvB (T96S)

[0122] O Corynebacterium glutamicum KCCM11662P com resistência à norleucina (NL) é uma cepa mutante derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 e foi obtida como se segue.

[0123] Especificamente, com o uso de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 como cepa parental, a cepa foi cultivada da mesma maneira para obter o KCCM11662P do Exemplo 11 e finalmente foi obtida uma cepa mutante resistente a NL.

[0124] A cepa mutante assim obtida foi denominada Corynebacterium glutamicum KCJ-28 e depositada no Centro de Cultura Coreana de Micro-organismos (KCCM), que é reconhecida como autoridade depositária internacional sob o Tratado de Budapeste, em 22 de janeiro de 2015, sob o Número de Acesso KCCM11662P.

[0125] As KCCM11662P::ilvB (W503Q) e KCCM11662P::ilvB (T96S) foram cultivadas da mesma maneira que no Exemplo 4, e a concentração de L-leucina em cada cultura foi analisada (Tabela 6).

[0126] As duas linhagens nas quais novas modificações foram introduzidas (isto é, KCCM11662P::ilvB (W503Q) e KCCM11662P::ilvB (T96S)) mostraram um aumento máximo de 13,3% na capacidade de produção de L-leucina em comparação com a linhagem original.

[0127] Pelo exposto, uma pessoa habilitada na técnica à qual a presente revelação se refere será capaz de entender que a presente revelação pode ser incorporada em outras formas específicas sem modificar os conceitos técnicos ou características essenciais da presente revelação. Nesse aspecto, as modalidades exemplificadoras reveladas neste documento são apenas para fins ilustrativos e não devem ser interpretadas como limitativas do escopo da presente revelação. Pelo contrário, a presente revelação pretende abranger não apenas as modalidades exemplificadoras, mas também várias alternativas, modificações, equivalentes e outras modalidades que podem ser incluídas dentro do espírito e escopo da presente revelação, conforme definido pelas reivindicações anexas.

Claims

1. Variante de aceto-hidroxiácido sintase caracterizada pelo fato de que, na subunidade grande de aceto-hidroxiácido sintase (subunidade grande de acetolactato sintase; proteína IlvB) consistindo na sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o 96o aminoácido (treonina) é substituído por serina, cisteína ou alanina.

2. Variante de aceto-hidroxiácido sintase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o 503o aminoácido (triptofano) da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 é adicionalmente substituído por glutamina.

3. Variante de aceto-hidroxiácido sintase, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a variante de aceto-hidroxiácido sintase consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 28 a 30.

4. Variante de aceto-hidroxiácido sintase caracterizada pelo fato de que, na subunidade grande de aceto-hidroxiácido sintase (subunidade grande de acetolactato sintase; proteína IlvB) da sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, o 503o aminoácido (triptofano) do N-terminal é substituído por glutamina, asparagina ou leucina.

5. Variante de aceto-hidroxiácido sintase, de acordo com a reivindicação 4, caracterizada pelo fato de que a variante de aceto-hidroxiácido sintase consiste na sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQ ID NO: 31 a 33.

6. Polinucleotídeo caracterizado pelo fato de que codifica a variante de aceto-hidroxiácido sintase conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que, na sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 2 ou sequência degenerada da mesma, (i) o códon consistindo nos nucleotídeos 286° a 288° é substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em serina, cisteína ou alanina; (ii) o códon consistindo nos nucleotídeos 1507° a 1509° é substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em glutamina, asparagina ou leucina; ou (iii) o códon consistindo nos nucleotídeos 286° a 288° é substituído por um códon que codifica um aminoácido, selecionado do grupo que consiste em serina, cisteína ou alanina e o códon consistindo nos nucleotídeos 1507° a 1509° é substituído por um códon que codifica glutamina.

7. Vetor caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 6.

8. Micro-organismo do gênero Corynebacterium que produz um aminoácido de cadeia ramificada L caracterizado pelo fato de que compreende pelo menos um dentre a variante de aceto- hidroxiácido sintase conforme definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 5; o polinucleotídeo conforme definido na reivindicação 6; ou o vetor conforme definido na reivindicação 7.

9. Micro-organismo que produz um aminoácido de cadeia ramificada L, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o micro-organismo do gênero Corynebacterium é Corynebacterium glutamicum.

10. Micro-organismo que produz um aminoácido de cadeia ramificada L, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o aminoácido de cadeia ramificada L é L- valina ou L-leucina.

11. Método para produzir um aminoácido de cadeia ramificada L caracterizado pelo fato de que compreende: (a) cultivar o micro-organismo que produz o aminoácido de cadeia ramificada L conforme definido em qualquer uma das reivindicações 8 a 10 em um meio; e (b) recuperar o aminoácido de cadeia ramificada L do micro-organismo ou meio cultivado na etapa (a).

12. Método para produzir um aminoácido de cadeia ramificada L, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que o aminoácido de cadeia ramificada L é L- valina ou L-leucina.