ES2919345T3 - Variante de la acetohidroxiácido sintasa, microorganismo que comprende la misma, y método para producir L-aminoácidos de cadena ramificada mediante el uso del mismo - Google Patents

Abstract

La presente divulgación se relaciona con una nueva acetohidroxiácido sintasa, un microorganismo que comprende el mismo o un método para producir un aminoácido de cadena L-ramedia con el mismo. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Variante de la acetohidroxiácido sintasa, microorganismo que comprende la misma, y método para producir L-aminoácidos de cadena ramificada mediante el uso del mismo

Campo Técnico

La presente descripción se refiere a una nueva variante de la acetohidroxiácido sintasa y, específicamente, a una variante de acetohidroxiácido sintasa, un microorganismo que contiene la variante, o un método para producir un L-aminoácido de cadena ramificada.

Antecedentes de la técnica

Se conoce que los aminoácidos de cadena ramificada (por ejemplo, L-valina, L-leucina y L-isoleucina) aumentan los niveles de proteína en un individuo y tienen una función importante como fuente de energía durante el ejercicio, y así se usan ampliamente en medicamentos, alimentos, etc. Con respecto a la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada, las mismas enzimas se usan en rutas de biosíntesis paralelas y, así, es difícil producir un solo tipo de aminoácido de cadena ramificada a escala industrial a través de fermentación. En la preparación de aminoácidos de cadena ramificada, la función de la acetohidroxiácido sintasa (es decir, la primera enzima en la biosíntesis de aminoácidos de cadena ramificada) es muy importante; sin embargo, los estudios previos sobre la acetohidroxiácido sintasa se centraron principalmente en la liberación de la inhibición por retroalimentación debido a modificaciones de la subunidad pequeña de la acetohidroxiácido sintasa (proteína IlvN) (Protein Expr. Purif. Mayo 2015; 109:106-12, US2014-0335574, US2009-496475, US2006-303888, US2008-245610), lo que revela así una grave falta de estudios pertinentes.

La acetohidroxiácido sintasa es una enzima que tiene la función de producir ácido acetoláctico a partir de dos moléculas de piruvato y producir 2-aceto-2-hidroxi-butirato a partir de ácido cetobutírico y piruvato. La acetohidroxiácido sintasa cataliza la descarboxilación del piruvato y una reacción de condensación con otra molécula de piruvato para producir acetolactato, que es un precursor de la valina y la leucina; o cataliza la descarboxilación del piruvato y una reacción de condensación con 2-cetobutirato para producir acetohidroxibutirato, que es un precursor de la isoleucina. En consecuencia, la acetohidroxiácido sintasa es una enzima muy importante involucrada en el proceso de biosíntesis inicial de los L-aminoácidos de cadena ramificada.

Descripción

Problema técnico

Los inventores de la presente invención se han esforzado por lograr una producción eficaz de L-aminoácidos de cadena ramificada y, como resultado, han desarrollado una variante de subunidad grande. Entonces, los inventores de la presente invención confirmaron que los L-aminoácidos de cadena ramificada pueden producirse con un alto rendimiento a partir de un microorganismo que contiene la variante, lo que completa así la presente invención. Solución técnica

El alcance de la invención se describe en las reivindicaciones.

Un objeto de la presente invención es proporcionar una variante de acetohidroxiácido sintasa.

Otro objeto de la presente invención es proporcionar un polinucleótido que codifica la variante de acetohidroxiácido sintasa, un vector que contiene el polinucleótido y un transformante en el que se introduce el vector.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar un microorganismo que produce un L-aminoácido de cadena ramificada, en el que el microorganismo contiene la variante de acetohidroxiácido sintasa o en el que se introduce el vector.

Aún otro objeto de la presente invención es proporcionar un método para producir un L-aminoácido de cadena ramificada, que incluye: cultivar el microorganismo que produce el L-aminoácido de cadena ramificada en un medio; y recuperar el L-aminoácido de cadena ramificada del microorganismo o medio de cultivo de este.

Efectos ventajosos

Cuando la actividad de la variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con la presente invención se introduce en un microorganismo, el microorganismo puede aumentar significativamente la capacidad de producir un L-aminoácido de cadena ramificada. Por lo tanto, el microorganismo puede usarse ampliamente para la producción a gran escala de L-aminoácidos de cadena ramificada.

Mejor Modo

Para lograr los objetos anteriores, un aspecto de la presente invención proporciona una variante de acetohidroxiácido sintasa, en donde, en la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (subunidad grande de acetolactato sintasa; proteína IlvB) que tiene una identidad de secuencia de al menos 70 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, el aminoácido correspondiente al aminoácido 96to de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con un aminoácido distinto de la treonina, el aminoácido correspondiente al aminoácido 503ro (triptófano) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con un aminoácido distinto del triptófano, o ambos aminoácidos correspondientes al aminoácido 96to y al aminoácido 503ro de un secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituyen con otro aminoácido.

Específicamente, la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa puede tener una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Más específicamente, la variante de acetohidroxiácido sintasa puede ser una variante de acetohidroxiácido sintasa, en la que, en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, el aminoácido 96to (es decir, treonina) o el aminoácido 503ro (es decir, triptófano) del extremo N-terminal de esta se sustituye con otro aminoácido; o tanto el aminoácido 96to (es decir, treonina) como el aminoácido 503ro (es decir, triptófano) se sustituyen cada uno con otro aminoácido.

Como se usa en la presente descripción, el término "acetohidroxiácido sintasa" se refiere a una enzima involucrada en la biosíntesis de L-aminoácidos de cadena ramificada, y puede estar involucrada en la primera etapa de la biosíntesis de L-aminoácidos de cadena ramificada. Específicamente, la acetohidroxiácido sintasa puede catalizar la descarboxilación del piruvato y una reacción de condensación con otra molécula de piruvato para producir acetolactato (es decir, un precursor de la valina) o puede catalizar la descarboxilación del piruvato y una reacción de condensación con 2-cetobutirato para producir acetohidroxibutirato (es decir, un precursor de la isoleucina). Específicamente, a partir del ácido acetoláctico, la L-valina se biosintetiza mediante reacciones secuenciales catalizadas por acetohidroxiácido isomerorreductasa, dihidroxiácido deshidratasa y transaminasa B. Adicionalmente, a partir del ácido acetoláctico, la L-leucina se biosintetiza como producto final mediante reacciones secuenciales catalizadas por acetohidroxiácido isomerorreductasa, dihidroxiácido deshidratasa, 2-isopropilmalato sintasa, isopropilmalato isomerasa, 3-isopropilmalato deshidrogenasa y transaminasa B. En tanto, a partir del acetohidroxibutirato, la L-isoleucina se biosintetiza como producto final mediante reacciones secuenciales catalizadas por acetohidroxiácido isomerorreductasa, dihidroxiácido deshidratasa y transaminasa B. En consecuencia, la acetohidroxiácido sintasa es una enzima importante en la ruta de biosíntesis de los L-aminoácidos de cadena ramificada.

La acetohidroxiácido sintasa está codificada por dos genes, es decir, ilvB e ilvN. El gen ilvB codifica la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa (IlvB) y el gen ilvN codifica la subunidad pequeña de la acetohidroxiácido sintasa (IlvN).

En la presente descripción se describe que la acetohidroxiácido sintasa puede ser una derivada de un microorganismo del género Corynebacterium, y específicamente de Corynebacterium glutamicum. Más específicamente, la presente invención comprende una variante de la acetohidroxiácido sintasa, en donde la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa es cualquier proteína que tenga la actividad de la proteína IlvB y una homología o identidad de 70 % o superior, específicamente 80 % o superior, más específicamente 85 % o superior, incluso más específicamente 90 % o superior, e incluso aún más específicamente 95 %, con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 así como también con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. Adicionalmente, debido a la redundancia de codones, el polinucleótido que codifica la proteína que tiene la actividad de la proteína IlvB, puede modificarse de diversas formas en la región codificante dentro de un intervalo que no altere la secuencia de aminoácidos de la proteína expresada en la región codificante, al considerar los codones preferidos en el organismo para el que se va a expresar la proteína. La secuencia de nucleótidos puede incluirse siempre que codifique la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, y específicamente, puede ser una codificada por la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 2.

Como se usa en la presente descripción, el término "variante de acetohidroxiácido sintasa" se refiere a una proteína en la que se modifican uno o más aminoácidos (por ejemplo, se adicionan, eliminan o sustituyen) en la secuencia de aminoácidos de la proteína acetohidroxiácido sintasa. Específicamente, la variante de la acetohidroxiácido sintasa es una proteína en la que su actividad aumenta eficazmente en comparación con su tipo silvestre o antes de la modificación debido a la modificación de la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, el término "modificación" se refiere a un método común para mejorar las enzimas, y puede usarse cualquier método conocido en la técnica, que incluye estrategias tales como el diseño racional y la evolución dirigida. Por ejemplo, las estrategias para el diseño racional incluyen un método para especificar un aminoácido en una posición particular (mutagénesis dirigida al sitio o mutagénesis específica del sitio), etc., y las estrategias para la evolución dirigida incluyen un método para inducir la mutagénesis aleatoria, etc. Adicionalmente, la modificación puede ser una inducida por mutación natural sin manipulación externa. Específicamente, la variante de acetohidroxiácido sintasa puede ser una que proteína aislada, una recombinante o una que se haya producido de forma no natural.

La variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención puede ser específicamente una proteína IlvB que tiene una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, en la que el aminoácido 96to (treonina) o el aminoácido 503ro (triptófano) del extremo N de esta, está mutado; o tanto el aminoácido 96to (treonina) como el aminoácido 503ro (triptófano) se sustituyen simultáneamente con otro aminoácido. Por ejemplo, la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención puede ser una proteína IlvB, en la que el aminoácido 96to (treonina) se sustituye con serina, cisteína o alanina, o el aminoácido 503ro (triptófano) se sustituye con glutamina, asparagina o leucina. Adicionalmente, es evidente que cualquier variante de la acetohidroxiácido sintasa que tenga una secuencia de aminoácidos en la que el aminoácido 96to o el aminoácido 503ro se sustituya con otro aminoácido y, simultáneamente, se elimine, se modifique, se sustituya o se adicione parte de la secuencia de aminoácidos, puede exhibir una actividad que sea idéntica o correspondiente a la de la variante de acetohidroxiácido sintasa.

Además, las subunidades grandes en sí mismas de las variantes de acetohidroxiácido sintasa con las modificaciones descritas anteriormente, la acetohidroxiácido sintasa que incluye las subunidades grandes de las variantes de acetohidroxiácido sintasa, y la acetohidroxiácido sintasa que incluye las subunidades grandes y pequeñas de las variantes de acetohidroxiácido sintasa se describen más adelante en la presente descripción. En la presente descripción, se confirmó que la cantidad de producción de L-aminoácidos de cadena ramificada puede aumentarse mediante la sustitución del aminoácido 96to y el aminoácido 503ro de la proteína acetohidroxiácido sintasa con varios otros aminoácidos, y así se confirmó que las posiciones de aminoácidos en 96 y 503 son importantes en la modificación de la proteína acetohidroxiácido sintasa en relación con la producción de L-aminoácidos de cadena ramificada. Sin embargo, es evidente que cuando el aminoácido 96to (treonina) se sustituye con un aminoácido que no sea treonina, el aminoácido 503ro (triptófano) se sustituye con un aminoácido que no sea triptófano, o ambos, el aminoácido 96to y el aminoácido 503ro se sustituyen con un aminoácido diferente, las variantes de acetohidroxiácido sintasa pueden tener efectos correspondientes a los descritos en las modalidades. Adicionalmente, la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención puede comprender una secuencia de aminoácidos representada por cualquiera de las SEQ ID NOS: 28 a 33. Se describen adicionalmente en la presente descripción, polipéptidos que tienen una identidad de secuencia de al menos 70 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 % o al menos 99 % con las secuencias de aminoácidos anteriores, que pueden tener una actividad sustancialmente idéntica o correspondiente a la de la variante de acetohidroxiácido sintasa al incluir las modificaciones de la presente invención.

La homología y la identidad se refieren a un grado de relación entre dos secuencias de aminoácidos o secuencias de nucleótidos dadas y pueden expresarse como un porcentaje.

Los términos "homología" e "identidad" se usan a menudo indistintamente entre sí.

La homología o la identidad de secuencia de un polinucleótido o polipéptido conservado puede determinarse mediante un algoritmo de alineamiento estándar, y puede usarse en combinación las penalizaciones por espacios predeterminadas, establecidas por un programa que se va a usar. Sustancialmente, las secuencias homólogas o idénticas pueden hibridarse en condiciones moderadamente o muy rigurosas a lo largo de toda su secuencia o al menos aproximadamente 50 %, aproximadamente 60 %, aproximadamente 70 %, aproximadamente 80 % o aproximadamente 90 % de la longitud total. Con respecto a los polinucleótidos a hibridar, pueden considerarse además polinucleótidos que incluyen un codón degenerado en lugar de un codón.

Puede determinarse si dos secuencias de polinucleótidos o polipéptidos cualesquiera tienen homología, similitud o identidad entre sí mediante, por ejemplo, un algoritmo informático conocido tal como el programa "FASTA" como en Pearson y otros, (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444) mediante el uso de parámetros predeterminados. Alternativamente, puede determinarse mediante el uso del algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman y Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453), como se realiza en el programa Needleman del paquete e Mb OSS (Em Bo SS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice y otros, 2000, Trends Genet. 16: 276 a 277) (versión 5.0.0 o posterior) (que incluye el paquete de programas GCG (Devereux, J., y otros, Nucleic Acids Research 12: 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Altschul, [S.] [F.] y otros, J. Molec. Biol. 215]: 403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, [ED.,] Academic Press, San Diego, 1994, y [CARILLO y otros] (1988) SIAM J. Applied. Math. 48: 1073). Por ejemplo, la homología, similitud, o identidad puede determinarse mediante el uso de BLAST o ClustalW del Centro Nacional para la Información Biotecnológica (NCBI).

La homología, similitud o identidad de polinucleótidos o polipéptidos puede determinarse mediante comparación de la información de la secuencia mediante el uso del programa informático GAP (por ejemplo, Needleman y otros (1970), J. Mol. Biol. 48: 443) como se describe en Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. (1981) 2:482. Brevemente, el programa GAP define la similitud como el número de símbolos alineados (es decir, nucleótidos o aminoácidos) que son similares, dividido por el número total de símbolos en la secuencia más corta de las dos. Los parámetros predeterminados para el programa GAP pueden incluir: (1) una matriz de comparación unitaria (que contiene un valor de 1 para identidades y 0 para no identidades) y la matriz de comparación ponderada (o EDNAFULL (versión EMBOSS de NCBI NUC4.4) Gribskov y otros (1986), Nucl. Acids Res. 14: 6745, como se describió en Schwartz y Dayhoff, eds., Atlas of Protein Sequence and Structure, Fundación Nacional de Investigación Biomédica, págs. 353 a 358, 1979; (2) una penalización de 3,0 por cada espacio y una penalización adicional de 0,10 por cada símbolo en cada espacio (o una penalización de apertura de espacio de 10, penalización de extensión de espacio de 0,5); y (3) sin penalización por espacios en los extremos. Por lo tanto, el término "homología" o "identidad", como se usa en la presente descripción, representa relevancia entre secuencias.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un polinucleótido que codifica la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, el término "polinucleótido" tiene el significado de incluir una molécula de ADN o ARN, y un nucleótido, que es un bloque de constitución básico de este, incluye no solo un nucleótido natural sino también un análogo en el que se modifica una región de sacárido o de la base. En la presente invención, el polinucleótido puede ser un polinucleótido aislado de una célula o un polinucleótido sintetizado artificialmente.

El polinucleótido que codifica la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención puede incluir cualquier secuencia de nucleótidos que codifique la proteína que tiene una actividad de la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención. Específicamente, debido a la redundancia de codones o en consideración de los codones preferidos por un organismo en el que se va a expresar la proteína, pueden realizarse diversas modificaciones en la región codificante de la proteína que no cambien la secuencia de aminoácidos de la proteína. El polinucleótido puede incluir cualquier secuencia de nucleótidos que codifique la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 28 a 33, y específicamente, una que tenga la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NOS: 34 a 39. Se describen adicionalmente en la presente descripción, polipéptidos que tienen una homología o identidad de al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 85 %, al menos 90 %, al menos 95 %, al menos 97 % o al menos 99% de las secuencias de aminoácidos anteriores que pueden tener una actividad sustancialmente idéntica o correspondiente a la de la variante de acetohidroxiácido sintasa al incluir las modificaciones de la presente invención debido a la degeneración de codones.

Alternativamente, por hibridación en condiciones rigurosas con una sonda que puede prepararse a partir de una secuencia génica conocida (por ejemplo, una secuencia complementaria a la totalidad o parte de la secuencia de nucleótidos), puede incluirse cualquier secuencia que codifique una proteína que tenga la actividad de las proteínas que consisten en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NOS: 28 a 33.

Las "condiciones rigurosas" se refiere a condiciones que permite la hibridación específica entre polinucleótidos. Tales condiciones se describen en detalle en la literatura (por ejemplo, J. Sambrook y otros, supra). Las condiciones rigurosas pueden incluir condiciones bajo las cuales los genes que tienen una alta homología o identidad (por ejemplo, genes que tienen al menos 80 %, específicamente al menos 85 %, más específicamente al menos 90 %, incluso más específicamente al menos 95 %, incluso aún más específicamente al menos 97 %, o más específicamente al menos 99 % pueden hibridarse entre sí; condiciones bajo las cuales los genes que tienen menor homología o identidad no pueden hibridarse entre sí; o condiciones que son condiciones de lavado comunes para la hibridación Southern (por ejemplo, una concentración de sales y una temperatura correspondiente a 60 °C, 1* SSC, 0,1 % de SDS; específicamente 60°C, 0,1* SSC, 0,1 % de ^s D^s ; más concretamente 68 °C, 0,1* SSC, 0,1 % de SDS, una vez, concretamente dos o tres veces).

La hibridación requiere que dos ácidos nucleicos tengan secuencias complementarias, aunque pueden ocurrir apareamientos erróneos entre bases, en dependencia de la rigurosidad de la hibridación. El término "complementario" se usa para describir la relación entre las bases de nucleótidos que pueden hibridar entre sí. Por ejemplo, con respecto al ADN, la adenosina es complementaria a la timina y la citosina es complementaria a la guanina. Por consiguiente, en la presente descripción se describen adicionalmente fragmentos de ácidos nucleicos aislados complementarios a la secuencia completa así como también a secuencias de ácidos nucleicos sustancialmente similares.

Específicamente, un polinucleótido que tiene homología o identidad puede detectarse mediante el uso de condiciones de hibridación que incluyen una etapa de hibridación a Tm de 55 °C y mediante la utilización de las condiciones descritas anteriormente. Adicionalmente, el valor de Tm puede ser de 60 °C, 63 °C o 65 °C, y puede controlarse adecuadamente por un experto en la técnica de acuerdo con esos fines. La rigurosidad apropiada para hibridar polinucleótidos depende de la longitud de los polinucleótidos y el grado de complementariedad, y las variables son bien conocidas en la técnica (ver Sambrook y otros supra, 9.50 a 9.51, 11.7 a 11.8).

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona un vector que comprende el polinucleótido que codifica la variante de la acetohidroxiácido sintasa modificada de la presente invención.

Como se usa en la presente descripción, el término "vector" se refiere a cualquier portador para clonar y/o transferir nucleótidos a una célula huésped. Un vector puede ser un replicón que permita la replicación de un(os) fragmento(s) combinado(s) con otro(s) fragmento(s) de ADN. "Replicón" se refiere a cualquier unidad genética que funciona como una unidad autorreplicante para la replicación del ADN in vivo, es decir, replicable por autorregulación. Específicamente, el vector pueden ser plásmidos, fagos, cósmidos, cromosomas o virus en estado natural o recombinado. Por ejemplo, como vector de fago o vector de cósmido, pueden usarse pWE15, M13, AMBL3, AMBL4, AIXII, AASHII, AAPII, At10, At11, Charon4A, Charon21A, etc. y como vector de plásmido pueden usarse los basados en pBR, pUC, pBluescriptlI, pGEM, pTZ, pCL, pET, etc. Los vectores que pueden usarse en la presente invención no están particularmente limitados, sino que puede usarse cualquier vector de expresión conocido. Adicionalmente, el vector puede incluir un transposón o un cromosoma artificial.

En la presente invención, el vector no está particularmente limitado siempre que incluya un polinucleótido que codifique la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención. El vector puede ser uno que pueda replicar y/o expresar la molécula de ácido nucleico en células eucariotas o procariotas, que incluyen células de mamíferos (por ejemplo, células de seres humanos, monos, conejos, ratas, hámsteres, ratones, etc.), células vegetales, células de levaduras, células de insectos y células bacterianas (por ejemplo, E. coli, etc.), y específicamente, puede ser uno que esté unido operativamente a un promotor adecuado de manera que el polinucleótido pueda expresarse en una célula huésped e incluir al menos un marcador seleccionable.

Adicionalmente, como se usa en la presente descripción el término "unido operativamente" se refiere a una conexión funcional entre una secuencia promotora, que inicia y media la transcripción del polinucleótido que codifica la proteína diana de la presente descripción, y la secuencia génica anterior.

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona un transformante en el que se introduce el vector de la presente invención.

En la presente invención, el transformante puede ser cualquier célula transformable en la que pueda introducirse el vector anterior y en la que pueda expresarse la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención. Específicamente, el transformante puede ser cualquier célula transformada de bacteria perteneciente al género Escherichia, género Corynebacterium, género Streptomyces, género Brevibacterium, género Serratia, género Providencia, Salmonella typhimurium, etc.; células de levaduras; células fúngicas de Pichia pastoris, etc.; células transformadas de insectos (por ejemplo, Drosophila, Spodoptera Sf9, etc.); y células animales transformadas (por ejemplo, células de ovario de hámster chino (CHO), SP2/0 (mieloma de ratón), linfoblastoide humano, COS, NSO (mieloma de ratón), 293T, melanoma de bow, HT-1080, riñón de hámster bebé (BHK), riñón embrionario humano (HEK), PERC.6 (retinocitos humanos)); o células vegetales transformadas.

Aún otro aspecto más de la presente invención proporciona un microorganismo que produce L-aminoácidos de cadena ramificada, en el que el microorganismo comprende la variante de acetohidroxiácido sintasa o en el que se introduce un vector que comprende un polinucleótido que codifica la variante.

Como se usa en la presente descripción, el término "L-aminoácido de cadena ramificada" se refiere a un aminoácido con un grupo alquilo ramificado en la cadena lateral e incluye valina, leucina e isoleucina. Específicamente, en la presente invención, el L-aminoácido de cadena ramificada puede ser L-valina o L-leucina.

Como se usa en la presente descripción, el término "microorganismo" incluye todos los microorganismos de tipo silvestre y los microorganismos modificados genéticamente de forma natural o artificial, y es un concepto que incluye todos los microorganismos en los que un mecanismo particular se atenúa o mejora debido a la inserción de un gen exógeno o a la potenciación o atenuación de la actividad de un gen endógeno. El microorganismo se refiere a todos los microorganismos que pueden expresar la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención. Específicamente, el microorganismo puede ser Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium ammoniagenes, Brevibacterium lactofermentum, Brevibacterium flavum, Corynebacterium thermoaminogenes, Corynebacterium efficiens, etc., y más específicamente Corynebacterium glutamicum.

Como se usa en la presente descripción, el término "microorganismo que produce L-aminoácidos de cadena ramificada" puede referirse a un microorganismo natural o un microorganismo modificado que tiene la capacidad de producir L-aminoácidos de cadena ramificada mediante modificación, y específicamente puede referirse a un microorganismo recombinante no natural. El microorganismo que produce L-aminoácidos de cadena ramificada es un microorganismo que comprende la variante de acetohidroxiácido sintasa de la presente invención o en el que se introduce un vector que contiene un polinucleótido que codifica la variante, y el microorganismo puede tener una capacidad significativamente mayor para producir L -aminoácidos de cadena ramificada en comparación con un microorganismo de tipo silvestre, con un microorganismo que contiene una proteína acetohidroxiácido sintasa de tipo natural, con un microorganismo no modificado que contiene una proteína acetohidroxiácido sintasa y con un microorganismo que no contiene una proteína acetohidroxiácido sintasa.

Aún otro aspecto de la presente invención proporciona un método para producir L-aminoácidos de cadena ramificada, que incluye: cultivar un microorganismo que produce L-aminoácidos de cadena ramificada en un medio; y recuperar los L-aminoácidos de cadena ramificada del microorganismo o medio de cultivo en la etapa anterior. Como se usa en la presente descripción, el término “cultivo” se refiere al cultivo de un microorganismo en condiciones ambientales controladas artificialmente. En la presente invención, el método para producir un L-aminoácido de cadena ramificada mediante el uso de un microorganismo capaz de producir un L-aminoácido de cadena ramificada puede llevarse a cabo mediante un método ampliamente conocido en la técnica.

Específicamente, el cultivo puede llevarse a cabo en un proceso por lotes, un proceso semicontinuo o un proceso semicontinuo repetido.

El medio usado para el cultivo debe satisfacer los requisitos de una cepa particular usada. Por ejemplo, el medio de cultivo adecuado para usar en el cultivo de la cepa de Corynebacterium es conocido en la técnica (por ejemplo, Manual of Methods for General Bacteriology by the American Society for Bacteriology, Washington D.C., Estados Unidos, 1981).

Las fuentes de sacáridos que pueden usarse en el medio de cultivo pueden ser sacáridos y carbohidratos (por ejemplo, glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, almidón y celulosa); aceites y lípidos (por ejemplo, aceite de soja, aceite de semilla de girasol, aceite de cacahuete y aceite de coco); ácidos grasos (por ejemplo, ácido palmítico, ácido esteárico y ácido linoleico); alcoholes (por ejemplo, glicerol y etanol); y ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido acético). Estos materiales pueden usarse independientemente o en combinación.

Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno que pueden usarse en el medio de cultivo pueden incluir peptona, extracto de levadura, caldo de carne, extracto de malta, licor de maceración de maíz, harina de soja y urea; o compuestos inorgánicos (por ejemplo, sulfato de amonio, cloruro de amonio, fosfato de amonio, carbonato de amonio y nitrato de amonio). Estas fuentes de nitrógeno pueden usarse además independientemente o en combinación.

Los ejemplos de las fuentes de fósforo que pueden usarse en el medio de cultivo pueden incluir dihidrogenofosfato de potasio, hidrogenofosfato de dipotasio o las correspondientes sales que contienen sodio. Además, el medio de cultivo puede contener sales metálicas necesarias para el crecimiento de las células. Además, adicionalmente a de los materiales anteriores, pueden usarse materiales esenciales para el crecimiento (por ejemplo, aminoácidos y vitaminas). Adicionalmente, pueden usarse precursores adecuados para un medio de cultivo. Las materias primas anteriores pueden añadirse adecuadamente al cultivo durante el proceso de cultivo por lotes o de manera continua. El pH del cultivo puede ajustarse mediante el uso de un compuesto básico (por ejemplo, hidróxido de sodio, hidróxido de potasio o amoníaco) o un compuesto ácido (por ejemplo, ácido fosfórico o ácido sulfúrico) de manera apropiada. Adicionalmente, la generación de espuma puede evitarse mediante el uso de un agente antiespumante (por ejemplo, éster de poliglicol de ácido graso). Para mantener la condición aeróbica del cultivo, puede inyectarse oxígeno o gas que contiene oxígeno (por ejemplo, aire) en el cultivo. La temperatura del cultivo puede ser generalmente de 20 °C a 45 °C y específicamente de 25 °C a 40 °C. El cultivo puede continuarse hasta que se produzca la cantidad máxima del L-aminoácido de cadena ramificada, y específicamente durante 10 a 160 horas. El L-aminoácido de cadena ramificada puede liberarse en el medio de cultivo o estar contenido en las células.

El método para recuperar un L-aminoácido de cadena ramificada de un microorganismo o cultivo puede incluir los bien conocidos en la técnica; por ejemplo, pueden usarse la centrifugación, filtración, tratamiento con un precipitante de cristalización de proteínas (método de salinización), extracción, disrupción ultrasónica, ultrafiltración, diálisis, varios tipos de cromatografías (por ejemplo, cromatografía de tamiz molecular (filtración en gel), cromatografía de adsorción, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía de afinidad, etc.), HPLC y una combinación de estos. Adicionalmente, la etapa de recuperar el L-aminoácido de cadena ramificada puede incluir además un proceso de purificación, y el proceso de purificación puede realizarse mediante el uso de un método apropiado conocido en la técnica.

Descripción detallada de la invención

En lo adelante, la presente descripción se describirá con más detalle con referencia a los siguientes Ejemplos. Ejemplo 1: Preparación de una biblioteca de ADN que codifica la acetohidroxiácido sintasa modificada mediante el uso de mutagénesis artificial

En este ejemplo, se preparó una biblioteca de vectores para la inserción cruzada primaria dentro del cromosoma para obtener variantes de acetohidroxiácido sintasa mediante el siguiente método. Se realizó una PCR propensa a errores para el gen ilvB (SEQ ID NO: 2) que codifica la acetohidroxiácido sintasa (SEQ ID NO: 1) derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 y, por lo tanto, se obtuvieron las variantes del gen ilvB (2395 pb) de las variantes del gen ilvB introducidas al azar con una mutación (modificación) de sustitución de nucleótidos. La PCR propensa a errores se realizó mediante el uso del kit de mutagénesis aleatoria GenemorphII (Stratagene), con el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 como molde junto con el cebador 1 (SEQ ID NO: 3) y el cebador 2 (SEQ ID NO: 4).

cebador 1 (SEQ ID NO: 3): 5'- AACCG GTATC GACAA TCCAA T -3'

cebador 2 (SEQ ID NO: 4): 5'- GGGTC TCTCC TTATG CCTC -3'

La PCR propensa a errores se realizó de manera que se pueden introducir modificaciones en el fragmento del gen amplificado en una proporción de 0 a 3,5 mutaciones por 1 kb del fragmento del gen amplificado. La PCR se realizó por un total de 30 ciclos de la siguiente manera: desnaturalización a 96 °C durante 30 s, hibridación a 53 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 2 min.

Los fragmentos del gen amplificado se conectaron al vector pCR2.1-TOPO (en adelante, "pCR2.1") mediante el uso del kit de clonación pCR2.1-TOPO TA (Invitrogen), se transformaron en E. coli DH5a y se colocaron en placas en un medio LB sólido que contenía kanamicina (25 mg/L). Se seleccionaron 20 de las colonias transformadas y se analizaron sus secuencias de nucleótidos después de obtener sus plásmidos. Como resultado, se confirmó que se introdujeron modificaciones en diferentes lugares a una frecuencia de 2,1 mutaciones/kb. Los plásmidos se extrajeron de unas 20000 colonias de E. coli transformadas y se denominaron "pCR2. 1 -biblioteca ilvB(mt)".

Adicionalmente, se preparó un plásmido que incluía el gen ilvB de tipo silvestre para usar como control. La PCR se realizó mediante el uso del ADN genómico de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 como molde junto con el cebador 1 (SEQ ID NO: 3) y el cebador 2 (SEQ ID NO: 4), en las mismas condiciones descritas anteriormente. Para la polimerasa, se usó ADN polimerasa de alta fidelidad PfuUltra TM (Stratagene), y el plásmido preparado se denominó "pCR2.1-ilvB(WT)".

Ejemplo 2: Preparación de cepa deficiente en ilvB

Se preparó una cepa deficiente en ilvB para la introducción de la biblioteca pCR2.1-ilvB(mt) mediante el uso de la cepa KCCM1120lP (Patente KR No. 10-1117022) como la cepa madre.

Para preparar un vector deficiente en ilvB, se realizó una PCR mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum ATCC14067 de tipo silvestre como molde y un conjunto de cebadores del cebador 3 (SEQ ID NO: 5) y del cebador 4 (SEQ ID NO: 6) y un conjunto de cebadores del cebador 5 (SEQ ID NO: 7) y del cebador 6 (SEQ ID NO: 8).

cebador 3 (SEQ ID NO: 5): 5'- GCGTC TAGAG ACTTG CACGA GGAAA CG -3'

cebador 4 (SEQ ID NO: 6): 5'- CAGCC AAGTC CCTCA GAATT GATGT AGCAA TTATC C -3'

cebador 5 (SEQ ID NO: 7): 5'- GGATA ATTGC TACAT CAATT CTGAG GGACT TGGCT G -3'

cebador 6 (SEQ ID NO: 8): 5'- GCGTC TAGAA CCACA GAGTC TGGAG CC-3'

La PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización a 95 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 30 s; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

Como resultado, se obtuvieron un fragmento de ADN de 731 pb (SEQ ID NO: 9), que incluye la región en dirección del promotor del gen ilvB, y un fragmento de ADN de 712 pb (SEQ ID NO: 10), que incluye el extremo 3' del gen ilvB. La PCR se realizó mediante el uso de los fragmentos de ADN amplificados (SEQ ID NOS: 9 y 10) y un conjunto de cebadores del cebador 3 (SEQ ID NO: 5) y del cebador 6 (SEQ ID NO: 8). La PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización a 95 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 95 °C durante 30 s, hibridación a 55 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 60 s; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

Como resultado, se amplificó un fragmento de ADN de 1407 pb (SEQ ID NO: 11, en adelante "fragmento ilvB "), en el que se enlazan un fragmento de ADN que incluye la región en dirección del promotor del gen ilvB y un fragmento de ADN que incluye el extremo 3' del gen ilvB gen.

El vector pDZ (Patente KR No. 10-0924065), que no puede replicarse en Corynebacterium glutamicum, y el fragmento del gen ilvB amplificado anteriormente se trataron cada uno con la enzima de restricción Xba I, se ligaron mediante el uso de una ligasa de ADN y se clonaron. El plásmido obtenido se denominó "pDZ-ilvB".

El pDZ-ilvB se transformó en Corynebacterium glutamicum KCCM11201P por el método de electroporación (Appl. Microbiol. Biotechnol. (1999) 52: 541-545), y las cepas transformadas se obtuvieron en medios de selección que contenían kanamicina (25 mg/L) y L-valina, L-leucina y L-isoleucina 2 mM cada uno. Se obtuvo la cepa, en la que el gen se inactiva por el fragmento del gen ilvB insertado en el genoma durante el proceso de cruzamiento secundario, y la cepa se denominó KCCM11201P ilvB.

Ejemplo 3: Preparación de una biblioteca de cepas modificadas de acetohidroxiácido sintasa y selección de cepas con mayor capacidad para producir L-aminoácidos

La cepa KCCM11201PilvB preparada anteriormente se transformó mediante recombinación homóloga mediante el uso de la biblioteca de pCR2.1-ilvB(mt) preparada anteriormente, y el transformante se sembró en un medio de placa complejo que contenía kanamicina (25 mg/L) y se obtuvieron aproximadamente 10 000 colonias de eso. Las colonias se denominaron KCCM11201 P/lvB/pCR2.1-ilvB(mt)-1 a KCCM11201PilvB /pCR2.1-ilvB(mt)-10000.

Adicionalmente, el vector pCR2.1-ilvB(WT) preparado anteriormente se transformó en la cepa KCCM11201P/lvB para preparar una cepa de control y la cepa se denominó KCCM11201P/lvB /pCR2.1-ilvB(WT).

<Medio de placa complejo (pH 7,0)>:

Glucosa (10 g), Peptona (10 g), Extracto de carne (5 g), Extracto de levadura (5 g), Infusión de cerebro corazón (18,5 g), NaCl (2,5 g), Urea (2 g), Sorbitol (91 g), Agar (20 g) (basado en 1 L de agua destilada).

Aproximadamente 25000 colonias obtenidas anteriormente se inocularon cada una en un medio selectivo (300 pL) que contenía los componentes descritos más abajo y se cultivaron en una placa de 96 pocillos profundos a 32 °C a una tasa de 1000 rpm durante 24 horas. Las cantidades de L-aminoácidos producidos en el cultivo se analizaron por el método de la ninhidrina (J. Biol. Chem. 1948. 176: 367 - 388). Una vez completado el cultivo, se hicieron reaccionar 10 pL del sobrenadante del cultivo y 190 pL de una solución de reacción de ninhidrina a 65 °C durante 30 minutos. La absorbancia se midió a una longitud de onda de 570 nm mediante el uso de un espectrofotómetro y se comparó con la del control, es decir, KCCM11201P/lvB/pCR2.1-ilvB(WT), y se seleccionaron aproximadamente 213 cepas modificadas que mostraban una absorbancia con un aumento de al menos 10 %. Otras colonias mostraron una absorbancia similar o disminuida en comparación con la del control.

<Medio de selección (pH 8,0)>:

Glucosa (10 g), (NH^SO ⁴ (5,5 g), MgSO4-7H2O (1,2 g), KH²PO⁴ (0,8 g), K²HPO⁴ (16,4 g), Biotina (100 pg), tiamina HCl (1000 pg), calcio-ácido pantoténico (2000 pg) y nicotinamida (2000 pg) (basado en 1 L de agua destilada). El método anterior se realizó repetidamente para las 213 cepas seleccionadas y se seleccionaron los 60 tipos principales de cepas con una capacidad mejorada para producir L-aminoácidos en comparación con la de KCCM11201P/lvB/pCR2.1-ilvB(WT).

Ejemplo 4: Confirmación de la capacidad de producción de L-valina de cepas seleccionadas de la biblioteca de cepas modificadas de acetohidroxiácido sintasa

Los 60 tipos de cepas seleccionadas en el Ejemplo 3 se analizaron con respecto a sus capacidades de producción de L-valina después de cultivarlas mediante el siguiente método.

Cada una de las cepas se inoculó en un matraz con deflector de esquina de 250 mL que contenía 25 mL de un medio de producción, respectivamente, y se cultivó en una incubadora con agitación (200 rpm) a 30 °C durante 20 horas. Después, cada uno de los matraces con deflectores de esquina de 250 mL que contenían 24 mL del cultivo, que contenía los componentes que se describen más abajo, se inoculó con 1 mL de un caldo de cultivo de siembra y se cultivó con agitación (200 rpm) a 30 °C durante 72 horas. Se analizó la concentración de L-valina en cada cultivo mediante HPLC.

<Medio de producción (pH 7,0)>:

Glucosa (100 g), (NH⁴)²SO⁴ (40 g), proteína de soja (2,5 g), sólidos macerados de maíz (5 g), urea (3 g), KH²PO⁴ (1 g), MgSo4-7^O (0,5 g), biotina (100 pg), tiamina HCl (1000 pg), calcio-ácido pantoténico (2000 pg), nicotinamida (3000 pg y CaCO³ (30 g) (basado en 1 L de agua destilada)

Entre los 60 tipos de cepas seleccionadas, se seleccionaron 2 tipos de cepas que mostraban un aumento en la concentración de L-valina, y se realizaron repetidamente el cultivo y el análisis. Los resultados del análisis de la concentración de L-valina se muestran en la Tabla 1 más abajo. Los 58 tipos de cepas restantes en realidad mostraron una disminución en la concentración de L-valina.

Tabla 1

Como resultado del análisis de la concentración de L-valina de las 2 cepas seleccionadas, se confirmó que el rendimiento de L-valina de las dos cepas aumentó en 20,7 % como máximo en comparación con el de la cepa de control, KCCM11201P/lvB/pCR2.1-ilvB(WT).

Ejemplo 5: Confirmación de la modificación del gen /lvB en cepas seleccionadas de una biblioteca de cepas modificadas de acetohidroxiácido sintasa

Para confirmar las modificaciones aleatorias introducidas en la acetohidroxiácido sintasa de las 2 cepas seleccionadas en el Ejemplo 4, se analizaron las secuencias de nucleótidos del gen ilvB. Para determinar las secuencias de nucleótidos, se realizó PCR mediante el uso de un conjunto de cebadores del cebador 7 (SEQ ID NO: 12) y del cebador 8 (SEQ ID NO: 13).

cebador 7 (SEQ ID NO: 12): 5'-CGCTT GATAA TACGC ATG -3'

cebador 8 (SEQ ID NO: 13): 5'- GAACA TACCT GATAC GCG -3'

Cada uno de los fragmentos del gen ilvB modificado obtenido se sometió a análisis de secuencia de nucleótidos, y los resultados se compararon con la secuencia de nucleótidos del gen ilvB de tipo silvestre (es decir, SEQ ID NO: 2). Como resultado, se confirmaron las secuencias de nucleótidos modificadas del gen ilvB, y se confirmaron las secuencias de aminoácidos de las proteínas modificadas de acetohidroxiácido sintasa. La información de los dos tipos seleccionados de proteínas modificadas de acetohidroxiácido sintasa se muestra en la Tabla 2 más abajo.

Tabla 2

Ejemplo 6: Preparación de vector para introducir modificación en acetohidroxiácido sintasa

Para confirmar los efectos de las proteínas modificadas de acetohidroxiácido sintasa que se confirmaron en el Ejemplo 5, se preparó un vector capaz de introducir las proteínas modificadas de acetohidroxiácido sintasa en el cromosoma.

Sobre la base de las secuencias de nucleótidos confirmadas, se sintetizaron un conjunto de cebadores del cebador 9 (SEQ ID NO: 14) y del cebador 10 (SEQ ID NO: 15) y un conjunto de cebadores del cebador 11 (SEQ ID NO: 16) y del cebador 12 (SEQ ID NO: 17), en el que se insertó un sitio de restricción Xba I en el extremo 5'. Después, se realizó la PCR mediante el uso de cada uno de los dos tipos seleccionados de ADN cromosómico como molde mediante el uso de estos conjuntos de cebadores, y de ese modo se amplificaron los fragmentos del gen ilvB modificado. La PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 2 min; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

cebador 9 (SEQ ID NO: 14): 5'- CGCTC TAGAC AAGCA GGTTG AGGTT CC-3'

cebador 10 (SEQ ID NO: 15): 5'- CGCTC TAGAC ACGAG GTTGA ATGCG CG -3'

cebador 11 (SEQ ID NO: 16): 5'- CGCTC TAGAC CCTCG ACAAC ACTCA CC -3'

cebador 12 (SEQ ID NO: 17): 5'- CGCTC TAGAT GCCAT CAAGG TGGTG AC -3'

Los dos tipos de fragmentos génicos amplificados por PCR se trataron con Xba I para obtener los respectivos fragmentos de ADN, y se unieron estos fragmentos al vector pDZ para la introducción cromosómica, que incluye un sitio de restricción Xba I en el mismo, transformado en E. coli DH5a, y los transformantes se esparcieron en un medio sólido LB que contenía kanamicina (25 mg/L).

Las colonias transformadas con un vector insertado con un gen diana se seleccionaron mediante PCR y los plásmidos se obtuvieron mediante un método de extracción de plásmidos comúnmente conocido. Estos plásmidos se denominaron pDZ-ilvB(W503Q) y pDZ-ilvB(T96S), cada uno de acuerdo con las modificaciones insertadas en el gen ilvB.

Ejemplo 7: Preparación de cepas derivadas de KCCM11201P con modificación en acetohidroxiácido sintasa y comparación de sus capacidades de producción de L-valina

Los dos tipos de vectores introducidos con modificaciones novedosas preparados en el Ejemplo 6 se transformaron cada uno en Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, que es una cepa que produce L-valina, mediante una recombinación de cromosomas homólogos en dos etapas. Después, las cepas introducidas con la modificación del gen ilvB en el cromosoma se seleccionaron mediante el análisis de secuencias de nucleótidos. Las cepas introducidas con la modificación del gen ilvB se denominaron KCCM11201P::ilvB (W503Q) y KCCM11201P::ilvB (T96S). Adicionalmente, el vector pDZ-ilvB(T96S), entre los vectores introducidos con la modificación anterior, se transformó en la cepa KCCM11201P::ilvB (W503Q) preparada anteriormente. Después, las cepas en las que se introdujeron los dos tipos de modificaciones en el cromosoma se denominaron KCCM11201P:: ilvB (W503Q/T96S). Las cepas se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 4 y se analizaron las concentraciones de L-valina de las cepas cultivadas (Tabla 3).

Tabla 3

Como resultado, dos nuevas cepas introducidas con modificaciones (KCCM11201P:://vB (W503Q) y KCCM11201P:: ilvB (T96S)) mostraron un aumento máximo de 17,8 % en la capacidad de producción de L-valina en comparación con la cepa original, y la cepa introducida con ambas modificaciones (KCCM11201P:://vB (W503Q/T96S) mostró un aumento de 21,4 % en la capacidad de producción de L-valina en comparación con la cepa original.

En consecuencia, en consideración que la acetohidroxiácido sintasa es la primera enzima en las vías de biosíntesis de los L-aminoácidos de cadena ramificada, se espera que las variantes de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa de la presente invención tengan un efecto sobre el aumento de la producción de L-isoleucina y L-leucina y L-valina.

Los inventores de la presente invención han denominado las cepas con una capacidad mejorada de producción de L-valina (es decir, kCc M11201P:://vB (W503Q) y KCCM11201P:://vB (T96S)) como Corynebacter/um g/utam/cum KCJ-0793 y Corynebacter/um g/utam/cum KCJ-0796, y las depositaron en el Centro Coreano de Cultivo de Microorganismos (KCCM) el 25 de enero de 2016, con los números de acceso KCCM11809P y KCCM11810P. Ejemplo 8: Preparación del vector de sobreexpresión para la biosíntesis de L-valina que contiene ADN que codifica acetohidroxiácido sintasa modificada

Como grupo de control, se preparó un vector de sobreexpresión para la biosíntesis de L-valina a partir de Corynebacter/um g/utam/cum K^c CM11201P, que es una cepa que produce L-valina. Adicionalmente, se prepararon vectores de sobreexpresión para la biosíntesis de L-valina, en los que se incluyen ADN que codifican acetohidroxiácido sintasa modificada a partir de cada uno de KCCM11201P:://vB (W503^q ) y KCCM11201P:://vB (T96S) preparados en el Ejemplo 7.

Para la preparación de los vectores anteriores, se sintetizaron el cebador 13 (SEQ ID NO: 18), en el que se insertó un sitio de restricción BamHI en el extremo 5', y el cebador 14 (SEQ ID NO: 19), en el que se insertó un sitio de restricción XbaI en el extremo 3'. Con el uso del conjunto de cebadores, se realizó la PCR mediante el uso de cada uno de los ADN cromosómicos de Corynebacter/um g/utam/cum KCCM11201P (es decir, una cepa que produce L-valina) y las cepas preparadas en el Ejemplo 7 (es decir, KCCM11201P:://vB (w 503Q) y KCCM11201P:://vB (T96S)) como molde y, de esa manera, se amplificaron dos tipos de fragmentos del gen //vBN modificado. La PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 4 min; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

cebador 13 (SEQ ID NO: 18): 5'- CGAGG ATCCA ACCGG TTCG ACAAT CCAAT -3'

cebador 14 (SEQ ID NO: 19): 5'-CTGTC TAGAA ATCGT GGGAG TTAAA CTCGC -3'

Los dos tipos de fragmentos de genes amplificados por PCR se trataron con BamHI y XbaI para obtener sus respectivos fragmentos de ADN. Estos fragmentos de ADN se unieron al vector de sobreexpresión pECCG117 que tenía sitios de restricción BamHI y XbaI, se transformaron en E. co// DH5a y se sembraron en placa en un medio LB sólido que contenía kanamicina (25 mg/L).

Las colonias transformadas con un vector insertado con un gen diana se seleccionaron mediante PCR y los plásmidos se obtuvieron mediante un método de extracción de plásmidos comúnmente conocido. Estos plásmidos se denominaron pECCG117-ilvBN, pECCG117-ilvB(W503Q)N y pECCG117-ilvB(T96S)N, cada uno de acuerdo con las modificaciones insertadas en el gen //vB.

Ejemplo 9: Preparación de un vector de sobreexpresión para la biosíntesis de L-valina que contiene ADN que codifica acetohidroxiácido sintasa modificado en el que un aminoácido se sustituye con otro aminoácido en la misma posición

En las proteínas de acetohidroxiácido sintasa modificadas confirmadas en el Ejemplo 5, para confirmar los efectos de la posición en la modificación, se prepararon vectores en los que el aminoácido 96to se sustituye con un aminoácido distinto de la treonina o la serina, y el aminoácido 503ro se sustituye con un aminoácido distinto de triptófano o glutamina.

Específicamente, se prepararon vectores de sobreexpresión para la biosíntesis de L-valina, en los que una modificación en la que el aminoácido 503ro de la acetohidroxiácido sintasa se sustituye con asparagina o leucina o una modificación en la que el aminoácido 96to se sustituye con alanina o cisteína, a partir de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P, que es una cepa productora de L-valina. Los aminoácidos sustituidos son solo ejemplos de aminoácidos representativos que pueden sustituirse.

Para la preparación de estos vectores, en primer lugar, se realizó una PCR mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 15 (SEQ ID NO: 20) y un conjunto de cebadores del cebador 16 (SEQ ID NO: 21) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19) y, de esa manera, se amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 2041 pb que tiene un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' y un fragmento de ADN de 1055 pb que tiene un sitio de restricción XbaI en el extremo 3'. La PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 2 min; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

cebador 15 (SEQ ID NO: 20): 5'- CTTCA TAGAA TAGGG TCTGG TTTTG GCGAA CCATG CCCAG -3' cebador 16 (SEQ ID NO: 21): 5'- CTGGG CATGG TTCGC CAAAA CCAGA CCCTA TTCTA TGAAG -3' Después, se realizó la PCR mediante el uso de los dos fragmentos de ADN amplificados como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19). La PCR se realizó de la siguiente manera: desnaturalización a 94 °C durante 5 min; 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 30 s, hibridación a 56 °C durante 30 s y polimerización a 72 °C durante 4 min; y polimerización a 72 °C durante 7 min.

Como resultado, se obtuvo un fragmento del gen ilvBN con una modificación en la que el aminoácido 503ro de la acetohidroxiácido sintasa se sustituyó con asparagina.

De la misma manera, la PCR se realizó mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 17 (SEQ ID NO: 22) y un conjunto de cebadores del cebador 18 (SEQ ID NO: 23) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19), y de esta manera se amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 2041 pb que tiene un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' y un fragmento de ADN de 1055 pb que tiene un sitio de restricción XbaI en el extremo 3'.

cebador 17 (SEQ ID NO: 22): 5'- CTTCA TAGAA TAGGG TCTGC AGTTG GCGAA CCATG CCCAG -3' cebador 18 (SEQ ID NO: 23): 5'- CTGGG CATGG TTCGC CAACT GCAGA CCCTA TTCTA TGAAG -3' Después, se realizó la PCR mediante el uso de los dos fragmentos de ADN amplificados como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19).

Como resultado, se obtuvo un fragmento del gen ilvBN con una modificación en la que el aminoácido 503ro de la acetohidroxiácido sintasa se sustituyó con leucina.

De la misma manera, la PCR se realizó mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 19 (SEQ ID NO: 24) y un conjunto de cebadores del cebador 20 (SEQ ID NO: 25) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19), y de esta manera se amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 819 pb que tiene un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' y un fragmento de ADN de 2276 pb que tiene un sitio de restricción XbaI en el extremo 3'.

cebador 19 (SEQ ID NO: 24): 5'- GGTTG CGCCT GGGCC AGATG CTGCA ATGCA GACGC CAAC -3' cebador 20 (SEQ ID NO: 25): 5'- GTTGG CGTCT GCATT GCAGC ATCTG GCCCA GGCGC AACC -3' Después, se realizó la PCR mediante el uso de los dos fragmentos de ADN amplificados como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19).

Como resultado, se obtuvo un fragmento del gen ilvBN con una modificación en la que el aminoácido 96to de la acetohidroxiácido sintasa se sustituyó con alanina.

De la misma manera, la PCR se realizó mediante el uso del ADN cromosómico de Corynebacterium glutamicum KCCM11201P como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 21 (SEQ ID NO: 26) y un conjunto de cebadores del cebador 22 (SEQ ID NO: 27) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19), y de esta manera se amplificaron un fragmento de ADN de aproximadamente 819 pb que tiene un sitio de restricción BamHI en el extremo 5' y un fragmento de ADN de 2276 pb que tiene un sitio de restricción XbaI en el extremo 3'.

cebador 21 (SEQ ID NO: 26): 5'- GGTTG CGCCT GGGCC AGAGC ATGCA ATGCA GACGC CAAC -3' cebador 22 (SEQ ID NO: 27): 5'- GTTGG CGTCT GCATT GCATG CTCTG GCCCA GGCGC AACC -3' Después, se realizó la PCR mediante el uso de los dos fragmentos de ADN amplificados como molde y un conjunto de cebadores del cebador 13 (SEQ ID NO: 18) y del cebador 14 (SEQ ID NO: 19).

Como resultado, se obtuvo un fragmento del gen ilvBN con una modificación en la que el aminoácido 96to de la acetohidroxiácido sintasa se sustituyó con cisteína.

Con el uso del mismo método que en el Ejemplo 8, los cuatro tipos de fragmentos de genes modificados amplificados por PCR se trataron con las enzimas de restricción BamHI y XbaI, y de esta manera se obtuvieron los respectivos fragmentos de ADN. Cada uno de estos fragmentos de ADN se unió al vector de sobreexpresión pECCG117 que tenía sitios de restricción BamHI y XbaI, se transformó en E. coli DH5a y se sembró en medio LB sólido que contenía kanamicina (25 mg/L).

Las colonias transformadas con un vector insertado con un gen diana se seleccionaron mediante PCR y los plásmidos se obtuvieron mediante un método de extracción de plásmidos comúnmente conocido. Cada uno de estos plásmidos se denominó pECCG117-ilvB(W503N)N, pECCG117-ilvB(W503L)N, pECCG117-ilvB(T96A)N y pECCG117-ilvB(T96C)N, cada uno de acuerdo con la secuencia de modificaciones insertadas en el gen ilvB.

Ejemplo 10: Preparación de cepas en las que se introduce acetohidroxiácido sintasa modificada de tipo silvestre y comparación de las capacidades de producción de L-valina

Los vectores de sobreexpresión para la biosíntesis de L-valina preparados en los Ejemplos 8 y 9 (es decir, pECCG117-ilvBN, pECCG117-ilvB(W503Q)N, pECCG117-ilvB(T96S)N y pECCG117-ilvB(W503N)N, pECCG117-ilvB(W503L)N, pECCG117-ilvB(T96A)N y pECCG117-ilvB(T96C)N) se insertaron cada uno en la cepa de Corynebacterium glutamicum de tipo silvestre (ATCC13032) mediante electroporación. Cada una de las cepas preparadas se denominaron Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvBN, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503Q)N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96S)N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503N)N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB(W503L)N, Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96A)N, y Corynebacterium glutamicum ATCC13032::pECCG117-ilvB(T96C)N.

Dado que aquellas cepas que se transformen con estos vectores serán resistentes a la kanamicina, la presencia de transformación se confirmó mediante comprobación del crecimiento de estas cepas en un medio que contenía kanamicina a una concentración de 25 mg/L.

Cada una de las cepas se inoculó en un matraz con deflector de esquina de 250 mL que contenía 25 mL del medio de producción y se cultivó con agitación a 200 rpm, a 30 °C durante 72 horas. La concentración de L-valina en cada cultivo se analizó por HPLC (Tabla 4).

Tabla 4

Como resultado, se confirmó que las nuevas modificaciones en las que el aminoácido 96to o 503ro de la acetohidroxiácido sintasa se sustituye con otro aminoácido, mostraron un aumento máximo de 700 % en la capacidad de producción de L-valina en comparación con el grupo control. Este resultado confirmó la importancia de las posiciones de aminoácidos 96to y 503ro de la acetohidroxiácido sintasa, y se espera que estas posiciones de aminoácidos afecten la capacidad de producir otros aminoácidos de cadena ramificada así como también la L-valina. Ejemplo 11: Preparación de cepas en las que se introduce acetohidroxiácido sintasa modificada y comparación de las capacidades de producción de L-valina

Para confirmar si las variantes de la subunidad grande de la acetohidroxiácido sintasa de la presente descripción tienen una influencia en el aumento de la capacidad de producción de otros L-aminoácidos de cadena ramificada, se examinó la capacidad de producción de L-leucina como otra modalidad de los L-aminoácidos de cadena ramificada.

Específicamente, los dos vectores en los que se introdujeron nuevas modificaciones preparadas en el Ejemplo 6 se transformaron cada uno mediante una recombinación homóloga de dos etapas en Corynebacterium glutamicum KCCM11661P (Solicitud de Patente Coreana núm. 10-2015-0119785 y Publicación de solicitud de patente coreana núm. 10-2017-0024653), que es una cepa productora de L-leucina. Después, las cepas en las que se introduce la modificación del gen ilvB en el cromosoma de estas se seleccionaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos, y las cepas en las que se introduce la modificación del gen ilvB se denominaron KCCM11661P::ilvB (W503Q) y KCCM11661P::ilvB (T96S).

El Corynebacterium glutamicum KCCM11661P que tiene resistencia a la norleucina (NL) es una cepa mutante derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 y se obtuvo como sigue.

Específicamente, Corynebacterium glutamicum ATCC 14067 se cultivó en un medio de activación durante 16 horas, y la cepa activada se inoculó en un medio de siembra, que se esterilizó a 121 °C durante 5 minutos, y se cultivó durante 14 horas, y 5 mL del cultivo que se recuperó. El cultivo recuperado se lavó con tampón de ácido cítrico 100 mM y se le añadió A/-metil-W-nitro-W-nitrosoguanidina (NTG) hasta una concentración final de 200 mg/L y se trató durante 20 minutos y se lavó con tampón de fosfato 100 mM. Las cepas tratadas con NTG se sembraron en placas en un medio mínimo y se calculó la tasa de mortalidad y, como resultado, se demostró que la tasa de mortalidad era de 85 %.

Para obtener una cepa mutante que tiene resistencia a la norleucina (NL), las cepas tratadas con NTG se sembraron en placas en un medio mínimo que contenía NL a una concentración final de 20 mM, 30 mM, 40 mM y 50 mM, respectivamente. Después, las cepas se cultivaron a 30 °C durante 5 días y, de esta manera, se obtuvo una cepa mutante resistente a NL.

<Medio de activación>:

Caldo de carne (1 %), polipeptona (1 %), NaCl (0,5 %), extracto de levadura (1 %), agar (2 %), pH 7,2.

<Medio de siembra>:

Glucosa (5 %), bactopeptona (1 %), NaCl (0,25 %), extracto de levadura (1 %), urea (0,4 %), pH 7,2.

<Medio mínimo>:

Glucosa (1 %), sulfato de amonio (0,4 %), sulfato de magnesio (0,04 %), fosfato de monopotasio (0,1 %), urea (0,1 %), tiamina (0,001 %), biotina (200 pg/L), agar (2 %), pH 7,0

La cepa mutante así obtenida se denominó Corynebacterium glutamicum KCJ-24 y se depositó en el Centro Coreano de cultivos de microorganismos (KCCM), una autoridad de depósito internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 22 de enero de 2015, con el número de acceso KCCM11661P.

KCCM11661P::ilvB (W503Q) y KCCM11661P::ilvB (T96S) se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 4, y se analizó la concentración de L-leucina en cada cultivo (Tabla 5).

Tabla 5

Las dos cepas en las que se introdujeron nuevas modificaciones (es decir, KCCM11661P::ilvB (W503Q) y KCCM11661P::ilvB (T96S)) mostraron un aumento máximo de 26,9 % en la capacidad de producción de L-leucina en comparación con su cepa original.

Ejemplo 12: Preparación de cepas en las que se introduce acetohidroxiácido sintasa modificada derivada de KCCM11662P y comparación de las capacidades de producción de L-leucina

Los dos vectores en los que se introdujeron nuevas modificaciones preparados en el Ejemplo 6 se transformaron cada uno mediante una recombinación homóloga de dos etapas en Corynebacterium glutamicum KCCM11662P (Solicitud de Patente Coreana núm. 10-2015-0119785 y Publicación de solicitud de patente coreana núm.10-2017-0024653), que es una cepa productora de L-leucina. Después, las cepas en las que se introduce la modificación del gen ilvB en el cromosoma de estas se seleccionaron mediante análisis de secuencia de nucleótidos, y las cepas en las que se introduce la modificación del gen ilvB se denominaron KCCM11662P::/lvB (W503Q) y KCCM11662P::/lvB (T96S).

El Corynebacterium glutamicum KCCM11662P que tiene resistencia a la norleucina (NL) es una cepa mutante derivada de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 y se obtuvo como sigue.

Específicamente, mediante el uso de Corynebacterium glutamicum ATCC 13869 como cepa original, la cepa se cultivó de la misma manera para obtener el KCCM11662P del Ejemplo 11 y finalmente se obtuvo una cepa mutante resistente a NL.

La cepa mutante así obtenida se denominó Corynebacterium glutamicum KCJ-28 y se depositó en el Centro Coreano de cultivo de microorganismos (KCCM), una autoridad de depósito internacional en virtud del Tratado de Budapest, el 22 de enero de 2015, con el número de acceso KCCM11662P.

KCCM11662P::ilvB (W503Q) y KCCM11662P::ilvB (T96S) se cultivaron de la misma manera que en el Ejemplo 4, y se analizó la concentración de L-leucina en cada cultivo (Tabla 6).

Tabla 6

Las dos cepas en las que se introdujeron nuevas modificaciones (es decir, KCCM11662P::ilvB (W503Q) y KCCM11662P::ilvB (T96S)) mostraron un aumento máximo de 13,3 % en la capacidad de producción de L-leucina en comparación con su cepa original.

TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL

RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

A LOS EFECTOS DEL PROCEDIMIENTO DE PATENTE

FORMULARIO INTERNACIONAL

r 1

A. CJ CHEILJEDANG

CENTRO CJ CHEILJEDANG, RECIBO EN EL CASO DE UN ORIGINAL

330 DONGHO-RO, emitido de conformidad con la Regla 7.1 por la

JUNG-GU, SEÚL 100-400, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL:

REPÚBLICA DE COREA identificado en la parle inferior de esta página

L J

1 Donde se aplique la Regla 6.4(d), dicha fecha es la fecha en la que se adquirió la condición de autoridad depositaria internacional; donde un depósito realizado fuera del Tratado de Budapest después de la adquisición de la condición de autoridad depositaria internacional se convierte en depósito en virtud del Tratado de Budapest, dicha fecha es la fecha en que la autoridad depositaria internacional recibió el microorganismo.

Formulario BP/4 página única

— m c m m s L m ím

— •• :: :;y

TRATADO DE BUDAPEST SOBRE EL

RECONOCIMIENTO INTERNACIONAL DEL DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS

A LOS EFECTOS DEL PROCEDIMIENTO DE PATENTE

FORMULARIO INTERNACIONAL

r 1

A. CJ CHEILJEDANG RECIBO EN EL CASO DE UN ORIGINAL

CENTRO CJ CHEILJEDANG, emitido de conformidad con la Regla 7.1 por la

330 DONGHO-RO, AUTORIDAD DEPOSITARIA INTERNACIONAL:

JUNG-GU, SEÚL 100-400, identificada en la parle inferior de esta página

REPÚBLICA DE COREA L J

1 Donde se aplique la Regla 6.4(d), dicha fecha es la fecha en la que se adquirió la condición de autoridad depositaria internacional; donde un depósito realizado fuera del Tratado de Budapest después de la adquisición de la condición de autoridad depositaria internacional se convierte en depósito en virtud del Tratado de Budapest, dicha fecha es la fecha en que la autoridad depositaria internacional recibió el microorganismo.

Formulario BP/4 página única

Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Una variante de acetohidroxiácido sintasa, en donde, en la subunidad grande de acetohidroxiácido sintasa (subunidad grande de acetolactato sintasa; proteína IlvB) que tiene una identidad de secuencia de al menos 70 % con la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, el aminoácido correspondiente al aminoácido 96to (treonina) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, se sustituye con un aminoácido distinto de la treonina, el aminoácido correspondiente al aminoácido 503ro (triptófano) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituye con un aminoácido distinto del triptófano, o ambos aminoácidos correspondientes al aminoácido 96to (treonina) y al aminoácido 503ro (triptófano) de una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 se sustituyen con otro aminoácido.

2. La variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la proteína IlvB comprende una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1.

3. La variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aminoácido 96to (treonina) se sustituye con serina, cisteína o alanina.

4. La variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el aminoácido 503ro (triptófano) se sustituye con glutamina, asparagina o leucina.

5. La variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con la reivindicación 1, en donde la variante de acetohidroxiácido sintasa comprende una secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID NOS: 28 a 33.

6. Un polinucleótido que codifica la variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Un vector que comprende el polinucleótido que codifica la variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

8. Un transformante en el que se introduce el vector de la reivindicación 7.

9. Un microorganismo que produce un L-aminoácido de cadena ramificada, que comprende la variante de acetohidroxiácido sintasa de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, o en el que se introduce el vector de la reivindicación 7.

10. El microorganismo que produce un L-aminoácido de cadena ramificada de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el microorganismo es un microorganismo del género Corynebacterium.

11. El microorganismo que produce un L-aminoácido de cadena ramificada de acuerdo con la reivindicación 10, en donde el microorganismo del género Corynebacterium es Corynebacterium glutamicum.

12. El microorganismo que produce un L-aminoácido de cadena ramificada de acuerdo con la reivindicación 9, en donde el L-aminoácido de cadena ramificada es L-valina o L-leucina.

13. Un método para producir un L-aminoácido de cadena ramificada, que comprende:

(a) cultivar el microorganismo que produce el L-aminoácido de cadena ramificada de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12 en un medio; y

(b) recuperar el L-aminoácido de cadena ramificada del microorganismo o medio de cultivo en la etapa (a).

14. El método para producir un L-aminoácido de cadena ramificada de acuerdo con la reivindicación 13, en donde el L-aminoácido de cadena ramificada es L-valina o L-leucina.