KR100751099B1

KR100751099B1 - 5'-크산틸산 아미나아제 변이체

Info

Publication number: KR100751099B1
Application number: KR1020050123393A
Authority: KR
Inventors: 반재구; 정흥채; 김의중; 이한승; 박영훈; 김형석; 한종권; 이진남; 오기훈; 김정환; 오윤석; 심재익; 홍국기; 최경오; 김현수; 백민지; 강태선
Original assignee: 씨제이 주식회사
Priority date: 2004-12-14
Filing date: 2005-12-14
Publication date: 2007-08-22
Also published as: KR20060067894A; WO2006065076A1; TWI323283B; TW200637912A

Abstract

본 발명은 인공 돌연변이법을 이용한 활성이 증진된 5'-크산틸산 (xanthosine 5'-monophosphate: XMP) 아미나아제 돌연변이체의 개발 및 5'-크산틸산 아미나아제의 유전자에 돌연변이를 도입하여 단위 배양액에서의 활성을 증진시킨 5'-크산틸산 아미나아제(5'-XMP aminase)의 개발에 관한 것으로, 구체적으로는, 돌연변이 유발형 PCR을 통하여 돌연변이를 도입하여 얻어진 5'-크산틸산 아미나아제 라이브러리로부터 고역가의 5'-크산틸산 아미나아제를 스크리닝하고, 여기서 얻어진 고역가 5'-크산틸산 아미나아제를 모유전자로 하여 유전자 서열 분석과 비교를 통한 분자 진화기술을 통해 더욱 고역가의 5'-크산틸산 아미나아제를 개발한 것이다. 이러한 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제보다 활성이 증가하여 5'-크산틸산을 보다 효과적으로 5'-구아닐산으로 전환시킬 수 있다.

5'-크산틸산, 5'-구아닐산, 5'-크산틸산 아미나아제

Description

5'-크산틸산 아미나아제 변이체{5'-XMP AMINASE MUTANT}

도 1은 무작위적인 돌연변이 도입을 통해 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 라이브러리를 제조하고 고활성 5'-크산틸산 아미나아제를 스크리닝 하는 방법를 개략적으로 나타낸 것이다.

도 2a는 고활성 5’-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3의 유전자를 지니는 발현벡터 pG3를 나타낸다.

도 2b는 고활성 5’-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12의 유전자를 지니는 발현벡터 pF12를 나타낸다.

도 2c는 고활성 5’-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63의 유전자를 지니는 발현벡터 pF63를 나타낸다.

도 2d는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ-G3-1 을 나타낸다.

도 2e는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ-F12-1 을 나타낸다.

도 2f는 고활성 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63-1 유전자를 포함하는 발현벡터 pCJ-F63-1 을 나타낸다.

본 발명은 5'-크산틸산 아미나아제 변이체, 이를 코딩하는 핵산 분자, 이러한 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터, 이러한 발현벡터로 형질전환된 형질전환체, 이러한 형질전환체를 배양하여 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제조하는 방법, 및 이러한 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 사용하여 5'-크산틸산 아미나아제를 생산하는 방법에 관한 것이다.

5'-구아닐산(GMP)은 5'-이노신산(IMP)과 더불어 식품 조미 첨가제로 널리 이용되고 있는 물질이다. 5'-구아닐산은 자체로 버섯 맛을 내는 것으로 알려져 있으나, 주로 모노소디움 글루탐산(MSG)의 풍미를 강화하는 것으로 알려져 있다. 이러한 성질은 특히 5'-이노신산과 같이 쓰일 때 강하게 나타난다.

지금까지 알려진 5'-구아닐산의 제조방법은 (1) 효모세포로부터 추출한 리보핵산(RNA)를 효소학적으로 분해하는 방법, (2) 미생물 발효법으로 5'-구아닐산을 직접 발효하는 방법, (3) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 화학적으로 인산화 시키는 방법, (4) 미생물 발효법으로 생산한 구아노신을 효소적 방법으로 인산화 시키는 방법, (5) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산(5'-크산틸산)를 코리네형 미생물을 이용하여 5'-구아닐산으로 전환하는 방법, (6) 미생물 발효법으로 생산한 5'-크산틸산을 에세리키아 콜리를 이용하여 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법을 들 수 있다. 이 중 (1)의 방법은 원료 수급 및 경제성에 문제가 있으며, (2)의 방법은 GMP의 세포막 투과성의 문제로 인하여 수율이 낮다는 단점이 있어 그 외의 방법이 공업적으로 주로 이용되고 있다.

전기 (5)와 (6)의 방법에서와 같이 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시킬 때 5'-크산틸산 아미나아제라는 효소가 관여하며, 이 효소의 기작은 다음과 같다 (Pantel et al. (1975), J. Biol. Sci., 250(7), 2609-2613).

1) 5'-크산틸산 + ATP + NH₃

GMP + AMP + PPi

5'-크산틸산 아미나아제

2) 5'-크산틸산 + ATP + L-글루타민

GMP + AMP + PPi + L-글루탐산

5'-크산틸산 아미나아제

5'-크산틸산 아미나아제는 글루타민 아미도트랜스퍼라제 (glutamine amidotransferase)의 일종이다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제는 글루타민의 감마-아미드 (g-amid) 부위를 가수분해하여 암모니아를 발생시키고 이를 아미노산, 핵산, 당, 조효소 등에 중합 반응을 거쳐 도입하게 된다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제의 대상 물질은 매우 다양하지만, 글루타민을 가수분해하여 암모니아를 얻는 방식은 진화적으로 잘 보존되어 왔다. 글루타민 아미도트랜스퍼라제는 다시 class I 과 class II로 나누어 지는데, class I의 경우는 안스라닐산 신타제(anthranilate synthase), 카바모일 포스페이트 신서타제(carbamoyl phosphate synthetase), CTP 신서타제 (CTP synthetase), 포밀그리신아미딘 신서타제(formylglycinamidine synthetase), 5'-크산틸산 아미나아제, 이미다졸 글리세롤 포스페이트 신타제(Imidazole glycerol phosphate synthase), 아미노디옥시코리스메이트 신타제(aminodeoxychorismate synthasea) 등이 속한다. 이들은 공히 글루타민 외에 외부의 암모니아를 아민 공여체(amine donor)로 이용할 수 있다(Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998). 이때 암모니아는 글루타민에서 유리된 암모니아가 기질에 전달되는 방식과 다르게 트랜스퍼라제에 직접 전달되는 것으로 생각된다. 단백질의 구조를 볼 때, 글루타민 아미도트랜스퍼라제는 글루타민을 분해하는 글루타미나제 (glutaminase) 활성을 지니는 도메인(domain)과 트랜스퍼라제 활성을 지니는 도메인으로 잘 구별되어 있다. 글루타미나제(glutaminase)의 활성은 시스테인, 히스티딘, 글루탐산의 활성 트라이어드(catalytic triad)에 의해 주요하게 이뤄지며, 이는 시스테인 프로티아제(cysteine protease)의 기작과 유사하다(Cell Mol. Life Sci. 54, 205-222, 1998).

통상 야생형의 효소는 세포에 적합한 정도로 진화되어 왔기 때문에, 실제 산업적으로 이용되는 경우 활성이 낮아 적합하지 않은 결과를 보이는 경우가 많다. 이를 극복하기 위해 일반적으로 사용되는 방법은 효소의 유전자를 클로닝하고 이를 이용하여 과발현시키는 방법이다. 5'-크산틸산 아미나아제의 경우 최근의 논문 (Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997)에 의하면 야생의 에세리키아 콜리로부터 얻어진 5'-크산틸산 아미나아제 유전자(guaA)를 유도발현 플라스미드에 클로닝하여 과발현시킨 후 이를 이용 5'-크산틸산으로부터 5'-구아닐산을 생산하는 것을 발표하였다.

일반적으로 이용되는 유도발현벡터의 경우 IPTG와 같은 고가의 발현 유도체 (inducer)를 요구하기 때문에, 산업적으로 대량의 단백질이 요구되는 경우에 있어 적합하지 못한 경우가 많다. 이를 극복하기 위해서 상시 발현벡터 시스템 (constitutive expression system)이 요구된다. 상시 발현 벡터 시스템은 다수가 보고되고 있으며, 특히 핵산을 발효하는 균주로 알려진 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에서도 신규의 상시 발현 프로모터가 개발되었다 (대한민국 특허 출원 2004-107215). 상시 발현시스템의 경우는 발현 유도체의 도입 없이 숙주의 배양기간 동안 도입된 단백질을 지속적으로 발현시키기 때문에 유용하다. 그러나, 도입된 단백질의 과발현이 숙주 세포의 생장에 영향을 미치는 경우는 세포의 생장이 중지되거나 세포에 도입된 벡터가 제거되어 결과적으로 낮은 발현율을 보이게 된다. 5'-크산틸산 아미나아제의 경우에도 이러한 현상이 보고되고 있다(Biosci. Biotech. Biochem. 61(5), 840-845, 1997).

야생형 균주의 발현을 강화시키는 다른 방법으로서, 약제 내성을 이용하여 해당 유전자의 발현을 증대시키는 에세리키아 콜리 야생주로부터 데코이닌 내성을 지닌 돌연변이균주를 통해 5'-크산틸산 아미나아제의 활성을 증대시키는 방법 역시 보고된 바 있다(대한민국 특허 공개번호 특2000-0040840).

야생형의 효소를 개량하는 방법 중, 야생형 유전자에 인공적으로 돌연변이를 도입하여 돌연변이 라이브러리를 구축한 후 스크리닝을 통하여 원하는 형질을 지니고 있는 효소를 구하는 방법이 있다. 이러한 경우 화학 물질을 이용하거나, 또는 PCR을 이용하여 타겟 유전자의 증폭시 DNA 합성효소의 에러(error)로 인한 돌연변이가 이용된다. 특히 써무스 아쿠아틱스(Thermus aquatics)로부터 유래한 DNA 합성효소는 3'-5' 엑소누클라아제 활성이 결여되어 DNA 합성시 돌연변이율이 높아 널리 이용되고 있다(Leung et al. Technique, 1989, 1, 11-15). Taq DNA 폴리머라제를 이용한 돌연변이 유발형 PCR은 대량의 돌연변이 라이브러리를 만들 수 있다는 장점을 지니고 있어 유용하다.

본 발명자들은 배양액 상에서 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제를 개발하기 위하여 노력한 결과, 돌연변이 유발형 PCR 및 분자 생물학적 기술을 통한 분자 진화 기법을 이용하여, 에세리키아 콜리로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나아제의 활성을 증진시킨 변이체를 개발하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 주요한 목적은 활성이 증진된 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제공함에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현시키는 핵산 분자를 포함하는 발현 벡터를 제공함에 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 발현 벡터로 형질전환된 형질전환체를 제공하는 데 있다.

본 발명의 또 다른 목적은 상기의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 사용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법을 제공하는 데 있다.

하나의 양태로서, 본 발명은 활성이 증진된 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제공한다.

본 발명자는 에세리키아 콜리 유래의 5'-크산틸산 아미나아제를 포함하는 벡터를 수득하기 위해서, 에세리키아 콜리 K12에서 유래된 1578 bp의 유전자(서열번호 1)를 포함하는 벡터를 제조한 후, 이를 주형으로 하여 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응(error-prone PCR)을 수행하였다. 이로부터 무작위적으로 돌연변이가 도입된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 DNA들을 수득하였다. 그 후 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현시키기 적합한 발현 벡터에 상기 변이체 DNA들을 접합시킨 후, 이를 이용하여 5'-크산틸산 아미나아제 유전자가 결핍된 에세리키아 콜리를 형질전환시켜 돌연변이 라이브러리를 제작하였다.

5'-크산틸산 아미나아제 유전자가 결핍된 에세리키아 콜리의 경우 5'-크산틸산 아미나아제의 활성을 갖고 있는 변이체를 지닌 벡터에 의해 형질전환된 경우만 성장이 가능하기 때문에, 돌연변이 라이브러리 중 활성이 있는 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이만이 얻어진다.

돌연변이 라이브러리로부터 성장이 이뤄진 에세리키아 콜리 중 활성이 높은 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이를 갖고 있는 벡터로 형질전환된 에세리키아 콜리를 선별하기 위하여, 98 웰 마이크로 플레이트에서 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 반응을 수행하였다. 상기 반응 후 흡광 정도를 비교하여 활성이 증가된 5'-크산틸산 아미나아제를 생산하는 에세리키아 콜리를 선별하였다.

활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 유전자의 염기 서열은 공지된 방법을 통해 결정하였다. 이로부터, 유래된 5'-크산틸산 아미나아제의 염기서열을 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제의 염기서열과 비교할 경우, 각각 2 개, 2 개, 4 개, 4 개, 3 개 및 6 개의 아미노산이 변환된 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질들임을 확인하고, 이들을 각각 '5'-크산틸산 아미나아제 G3', '5'-크산틸산 아미나아제 F12', '5'-크산틸산 아미나아제 F63', '5'-크산틸산 아미나아제 G3-1', '5'-크산틸산 아미나아제 F12-1' 및 '5'-크산틸산 아미나아제 F63-1'로 명명하였다.

각 변이체의 아미노산 배열의 변화를 구체적으로 설명하면, G3의 경우 52번째 및 191 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴 및 쓰레오닌으로 치환된 변이체(서열번호 4)이고, F12의 경우 93번째 및 152번째 아미노산 서열이 각각 발린 및 프롤린으로 치환된 변이체(서열번호 6)이며, F63의 경우 93번째, 113번째, 191번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 알라닌, 쓰레오닌, 및 글리신으로 치환된 변이체(서열번호 8)임을 확인할 수 있었다. G3-1의 경우 52번째, 191 번째, 253 번째, 및 454 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴, 쓰레오닌, 아르기닌, 및 이소로이신으로 치환된 변이체(서열번호 10)이고, F12-1의 경우 93번째, 152번째, 및 454번째 아미노산 서열이 각각 발린, 프롤린, 및 이소로이신으로 치환된 변이체(서열번호 12)이며, F63-1의 경우 93번째, 100번째, 113번째, 191번째, 454번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 이소로이신, 알라닌, 쓰레오닌, 이소로이신, 및 글리신으로 치환된 변이체(서열번호 14)임을 확인할 수 있었다.

따라서, 구체적 양태에서, 본 발명은 서열번호 4, 6, 8, 10, 12 및 14의 아미노산 서열을 갖는 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제공한다.

본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 상기한 서열번호 4, 6, 8, 10, 12 또는 14의 아미노산 서열을 갖는 단백질 뿐만 아니라 이러한 변이체 단백질과 기능적으로 동등한 활성을 나타낼 수 있는 이의 등가물을 포함한다. 본원에서 용어 "기능적 등가물"이란, 본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 아미노산 서열과 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 삽입, 비보전적 또는 보전적 치환 또는 이들의 조합에 의하여 상이한 서열을 가지되 동등한 정도의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 활성을 나타내는 단백질을 의미한다.　 분자의 활성을 전체적으로 변경시키지 않는 단백질 및 펩티드에서의 아미노산 교환은 당해 분야에 공지되어 있다(H.Neurath, R.L.Hill, The Proteins, Academic Press, New York, 1979).

본 발명에 따른 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 합성(Merrifleld, J. Amer. chem. Soc.. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다(Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).　 유전자 재조합 기술을 이용할 경우,　5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산을 적절한 발현 벡터에 삽입하고, 재조합 발현 벡터를 숙주세포로 형질전환하여 5'-크산틸산 아미나아제 변이체가 발현되도록 숙주 세포를 배양한 뒤, 숙주세포로부터 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 회수하는 과정으로 수득할 수 있다.

본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 상시발현 시스템을 이용하여 발현시켰을 때, 이의 반응액 당 활성이 야생형에 비해, 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G3는 1.8 배, 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F12는 3.1 배, 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F63은 2.3 배 높으며, 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G3-1는 3 배, 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F12-1은 3.8 배, 그리고 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F63-1은 3.07 배가 높아, 이들을 5'-구아닐산의 생성에 효율적으로 이용할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자에 관한 것이다.

바람직하게는, 무작위적 돌연변이 도입에 의한 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 본 발명의 서열번호 4의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G3은 서열번호 3의 핵산 분자에 의해 코딩되며, 서열번호 6의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F12는 서열번호 5의 핵산 분자에 의해 코딩되고, 서열번호 8의5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F63은 서열번호 7의 핵산 분자에 의해 코딩된다. 서열번호 10의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 G3-1은 서열번호 9의 핵산 분자에 의해 코딩되며, 서열번호 12의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F12-1은 서열번호 11의 핵산 분자에 의해 코딩되고, 서열번호 14의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 F63-1은 서열번호 13의 핵산 분자에 의해 코딩된다. 이러한 핵산 분자의 서열은 단쇄 또는 이중쇄일 수 있으며, DNA 분자 또는 서열상의 티민(T)이 우라실(U)로 치환된 RNA (mRNA) 분자일 수 있다.　

본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 서열은 이를 발현하는 벡터에 의해 제공되어 단백질로 발현될 수 있다.　

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자를 포함하는 발현벡터에 관한 것이다.

본 발명에서 "발현벡터"란 적당한 숙주세포에서 목적 단백질을 발현할 수 있는 벡터로서, 유전자 삽입물이 발현되도록 작동가능하게 연결된 필수적인 조절 요소를 포함하는 유전자 작제물을 말한다.　

본원에서 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현 조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어(functionally linked) 있는 것을 말한다.　 예를 들어 프로모터와 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩하는 핵산 서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다.　　 재조합 발현벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다. 발현벡터에 사용되는 프로모터에는, 예를 들어 숙주가 에세리키아 속 균인 경우에는 trc 프로모터, trp 프로모터, lac 프로모터, recA 프로모터, λP L 프로모터, lpp 프로모터, T7 프로모터 등이, 숙주가 바실러스 속 균인 경우에는 SPO1 프로모터, SPO2 프로모터, penP 프로모터 등이 바람직하다.　 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.　 발현벡터는 또한 벡터를 함유하는 숙주 세포를 선택하기 위한 선택성 마커를 포함하고, 복제가능한 발현벡터인 경우 복제 기원을 포함할 수 있다.

본 발명의 구체적 실시에서는 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 유전자를 포함하는 발현 벡터 pG3, pF12, pF63, pCJ-G3-1, pCJ-F12-1 및 pCJ-F63-1을 제작하고, 이들 발현벡터를 각각 에세리키아 콜리 JM105에 도입하여 최종적으로 형질전환된 에세리키아 콜리를 수득하였다. 전기 형질전환체를 각각 "Escherichia coli JM105/pG3(KCCM-10626)", "Escherichia coli JM105/pF12(KCCM-10627)", "Escherichia coli JM105/pF63(KCCM-10625)", "Escherichia coli JM105/pCJ-G3-1", "Escherichia coli JM105/pCJ-F12-1" 및 "Escherichia coli JM105/pCJ-F63-1"로 명명하였다. 이 중 "Escherichia coli JM105/pG3(KCCM-10626)", "Escherichia coli JM105/pF12(KCCM-10627)" 및 "Escherichia coli JM105/pF63(KCCM-10625)"은 2004년 11월 30일자로 KCCM(Korean Culture Center of Microorganisms, 대한민국 서울시 서대문구 홍제1동 유림빌딩 361-221)에 기탁하였으며, 나머지 형질전환체들, Escherichia coli JM105/pCJ-G3-1(KCCM-10716P)", "Escherichia coli JM105/pCJ-F12-1(KCCM-10718P)" 및 "Escherichia coli JM105/pCJ-F63-1(KCCM-10719P)"은 2005년 12 월 2일자로 한국종균협회에 각각 기탁번호 KCCM-10716P, KCCM-10718P 및 KCCM-10719P로 기탁하였다.

아울러 본 발명의 효소 활성이 개량된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 제조하는 바람직한 실시예를 도 1에 개략적으로 도시하였다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 발현벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이다.

형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.　 이런 방법에는 전기충격유전자전달법(electroporation), 원형질 융합, 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 실리콘 카바이드 섬유를 이용한 교반, 아그로 박테리아 매개된 형질전환, PEG, 덱스트란 설페이트, 리포펙타민 등이 포함되나 이들로 제한되지 않는다.　

본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현하는 발현벡터로　형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다.　 숙주세포로는 원핵세포가 바람직하며, 예를 들어 에세리키아 콜리(Escherichia coli), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 스트렙토마이세스(Streptomyces), 슈도모나스(Pseudomonas), 프로테우스 미라빌리스(Proteus mirabilis) 또는 스타필로코쿠스(Staphylococcus)와 같은 원핵 숙주 세포가 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.　 또한, 진균(예를 들어, 아스페르길러스(Aspergillus)), 효모(예를 들어, 피치아 파스토리스(Pichia pastoris), 사카로마이세스 세르비시애(Saccharomyces cerevisiae), 쉬조사카로마 세스(Schizosaccharomyces), 뉴로스포라 크라사(Neurospora crassa)) 등과 같은 하등 진핵세포 등도 이용할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 상기한 형질전환체를 배양한 후, 이로부터 5'-크산틸산 아미나아제의 변이 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 발현하는 발현벡터로 형질전환된 숙주세포(형질전환체)의 배양은 목적 단백질인 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 발현을 가능하게 하는 적절한 조건하에서 수행하며, 이러한 조건은 당업자에게 익히 공지된 방법에 따라 수행할 수 있다.

숙주세포에서 발현시킨 단백질은 통상의 방식으로 정제될 수 있으며,　예를 들어, 염석(예를 들어 황산암모늄 침전, 인산나트륨 침전), 용매 침전(아세톤, 에탄올 등을 이용한 단백질 분획 침전), 투석, 겔 여과, 이온 교환, 역상 칼럼 크로마토그래피와 같은 칼럼 크로마토그래피 및 한외여과 등의 기법을 단독 또는 조합시켜 적용하여 본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 단백질을 정제할 수 있다.

이하, 본 발명의 바람직한 실시예를 구체적으로 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오직 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위는 이들 실시예에 국한되지 않는다.

실시예 1: 5'- 크산틸산 아미나아제 돌연변이 라이브러리 구축

5'-크산틸산 아미나아제의 유전자에 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응(error-prone PCR)을 수행하여 무작위적인 돌연변이를 유발함으로써 다양한 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이를 다음과 같이 제조하였다.

우선, 에세리키아 콜리로부터 유래된 1,578bp의 5'-크산틸산 아미나아제 유전자(서열번호 1)를 trc 프로모터를 지니고 에세리키아 콜리에서 증폭이 가능한 복제 기원을 지닌 발현벡터인 pTrc99a에 작동가능하도록 연결한 재조합 플라스미드 pG1을 제작하여 이를 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응의 주형으로 준비하였다. 돌연변이 유발형 중합효소 연쇄반응에 사용된 프라이머는 서열번호 15의 N-말단 프라이머와 서열번호 16의 C-말단 프라이머를 사용하였으며, 이는 에세리키아 콜리로부터 유래된 5'-크산틸산 아미나아제 유전자의 염기서열에 근거하여 합성하였다.

서열번호 15: 5' CGCGAATTCATGACGGAAAACATTCATAA 3'

서열번호 16: 5' CTAGTCTAGATCATTCCCACTCAATGGT 3'

PCR 반응액은 각각 0.4 mM의 상기 N-프라이머 및 C-프라이머, 주형으로서는 재조합 플라스미드 pG1 5 ng, 10 mM 트리스 완충액 (Tris-HCl, pH 8.3), 50 mM KCl, 7 mM MgCl2, 0.1 mM MnCl2, 0.2 mM dATP, 0.2 mM dGTP, 1 mM dCTP, 1 mM dTTP 및 Taq 중합효소 5 효소단위(unit)를 포함하도록 50 mL를 조제하였다. 이어 반응액을 94^oC에서 1분, 50^oC에서 1분, 72^oC에서 1분의 조건으로 25회 수행 후 72^oC에서 7분간 돌연변이 유발형 PCR을 수행하여 돌연변이 유전자를 얻었다.

상기와 같이 증폭된 PCR 산물들은 한천 겔 전기 영동법을 통해 분리하였고, 증폭 분리된 DNA 단편을 제한효소 EcoRI 과 HindIII으로 절단한 후, 5'-크산틸산 아미나아제 발현 벡터로 유용한 pTrc99a에 접합시켜 재조합 플라스미드를 제작하였다. 전기 제작된 돌연변이 유전자를 함유하는 벡터들을 에세리키아 콜리 BW(guaA knock-out 균주)에 도입하여 5'-크산틸산 아미나아제 변이체 라이브러리를 제작하였다. guaA 유전자가 제거된 균주인 에세리키아 콜리 BW는 통상의 분자 생물학적 방법을 통하여 얻어졌다(Datsenko KA, 2000, Proc. Nat l Acad. Sci., 97(12), 6640-6645).

실시예 2: 5'- 크산틸산 아미나아제의 변이체의 탐색

실시예 1에서 제조된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 라이브러리를 0.5 % 박토 트립톤, 1 % 효모 추출물, 1 % NaCl, 1.5 % 아가, 및 0.2 mM IPTG를 포함하는 LB 평판배지에 도말하였다. 이어 성장이 일어난 에세리키아 콜리 콜로니를 K웰 마이크로플레이트(deep well microplate)에 LB 배지를 넣어 배양한 후, 세포의 성장 정도에 따라 100 mL로 희석하였다. 각 웰에 크실렌 5 mL를 첨가하고 37^oC에서 30분간 처리한 후, 42^oC로 미리 예열한 기질 혼합물을 100 mL 첨가하고 42^oC에서 20분간 반응시켰다. 기질 혼합물은 30 mM XMP, 13 mM ATP, 16 mM MgSO₄ 7H₂O, 40 mM (NH₄)₂SO₄를 16 mM Trizma HCl 완충액(pH 8.6)에 녹인 반응액이다. 3.5%의 퍼클로릭산 800 mL를 첨가하여 반응을 종료시킨 후, 200 mL를 UV 측정용 96 웰 플레이트로 옮겨 290 nm 파장에서의 흡광도를 측정하였다. 5'-구아닐산의 생성량을 측정하고 효소 활성을 비교하여, 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 지닌 에세리키아 콜리 JM105 형질전환체를 획득하였다.

전기의 탐색과정을 통하여 얻어진 5'-크산틸산 아미나아제 돌연변이 유전자를 지닌 플라스미드 pG3와 야생형의 5'-크산틸산 아미나아제 유전자를 지닌 플라스미드 pG1을 적절한 제한 효소 처리 및 라이게이션을 수행하고 실시예 1과 동일한 조건으로 돌연변이 유발형 PCR을 수행한 후, 전기의 활성 비교 스크리닝법을 통해, 활성이 모 효소에 비해 증진된 유전자를 지닌 플라스미드 pF12, pF63, pCJ-G3-1, pCJ-F12-1 및 pCJ-F63-1을 얻었다.

전기 실시예 1과 실시예 2에 기술된 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 제조하는 과정을 도1에 개략적으로 도시하였다.

실시예 2에 기술된 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체의 라이브러리 규모 및 변이체에 대한 기술을 표 1에 정리하였다.

5'-크산틸산 아미나아제의 분자 진화 과정 및 선택된 변이체

	1R	2R
모계 유전자	guaA 야생형 유전자	야생형 유전자, G3
라이브러리 제조법	돌연변이 유발형 PCR	제한 효소 절단, 돌연변이 유발형 PCR
라이브러리 크기	> ~ 10 ⁵	> ~ 1,500
1차 스크리닝	~ 2 X 10 ³	~ 1,500
2차 스크리닝	73 개 콜로니	66 개 콜로니
얻어진 변이체	G3	F12, F63, G3-1, F12-1, F63-1

실시예 3: 5'- 크산틸산 아미나아제 변이체를 암호화하는 유전자의 염기서열 결정

5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 유전자 서열은 Applied Biosystem 사의 automatic sequencer ABI3730xl을 사용하여 결정하였다. 각각의 염기서열은 서열번호 3(G3), 서열번호 5(F12), 서열번호 7(F63), 서열번호 9(G3-1), 서열번호 11(F12-1) 및 서열번호 13(F63-1)으로 확인되었는 바, 각각의 아미노산 서열을 추정하여 서열번호 4(G3), 서열번호 6(F12), 서열번호 8(F63), 서열번호 10(G3-1), 서열번호 12(F12-1), 및 서열번호 14(F63-1)로 나타내었다. 아울러, 전기 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1을 각각 포함하는 플라스미드 지도를 도 2a, 2b, 2c, 2d, 2e, 및 2f에 각각 나타내었다.

전기 pG3에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3 유전자의 염기배열로부터 G3의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 4로 나타내었다. 또한, pF12에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12 유전자의 염기배열로부터 F12의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 6으로 나타내었다. 마찬가지로, pF63에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63 유전자의 염기배열로부터 F63의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 8로 나타내었다. 또한, pG3-1에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 G3-1 유전자의 염기배열로부터 G3-1의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 10으로 나타내었다. 또한, pCJ-F12-1에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F12-1 유전자의 염기배열로부터 F12-1의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 12로 나타내었다. 마찬가지로, pCJ-F63-1에 포함된 고활성의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체인 F63-1 유전자의 염기배열로부터 F63-1의 아미노산 배열을 추정하여 이를 서열번호 14로 나타내었다.

본 발명의 고활성 5'-크산틸산 아미나아제인 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1의 아미노산 서열을 서열번호 2의 야생형 5'-크산틸산 아미나아제의 아미노산 서열과 비교할 경우, 각각 2개, 2개, 4개, 4개, 3개 및 6개의 아미노산이 치환되어 새로운 아미노산 배열을 갖는 단백질임을 확인할 수 있었다.

즉, G3의 경우 52번째 및 191 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴 및 쓰레오닌으로, F12의 경우 93번째 및 152번째 아미노산 서열이 각각 발린 및 프롤린으로, F63의 경우 93번째, 113번째, 191번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 알라닌, 쓰레오닌, 및 글리신으로 치환되었음을 확인할 수 있었고, G3-1의 경우 52번째, 191 번째, 253 번째, 및 454 번째 아미노산 서열이 각각 시스틴, 쓰레오닌, 아르기닌, 및 이소로이신으로, F12-1의 경우 93번째, 152번째, 및 454번째 아미노산 서열이 각각 발린, 프롤린, 및 이소로이신으로, 그리고 F63-1의 경우 93번째, 100번째, 113번째, 191번째, 454번째, 및 467번째 아미노산 서열이 각각 발린, 이소로이신, 알라닌, 쓰레오닌, 이소로이신, 및 글리신으로 치환되었음을 확인할 수 있었다.

상술한 아미노산 서열 및 활성 측정 탐색법에 의하여, 본 발명의 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1은 아미노산 배열이 기존의 에세리키아 콜리 5'-크산틸산 아미나아제와 상이할 뿐 아니라 고활성을 지닌 신규의 5'-크산틸산 아미나아제로 판단할 수 있다.

실시예 4: 5'- 크산틸산 아미나아제 변이체의 활성 평가

5'-크산틸산 아미나아제의 비활성 증가를 확인하기 위하여 우선 SDS-PAGE 겔상의 단백질 발현 양을 농도 분석기를 통하여 확인하였다. 이 때, 각 변이체의 발현량은 유사한 것으로 나타나 5'-크산틸산 아미나아제 활성의 증가가 비활성의 증가에 의한 것임을 알 수 있었다.

5'-크산틸산 아미나아제 변이체의 활성을 비교하기 위하여 아래의 과정을 진행하였다. 우선 박토 트립톤 16 g/L, 효모 추출물 10 g/L, NaCl 5 g/L, 암피실린 100 mg/L 로한 30 mL 배지에 각 변이체를 접종하고 37 ^oC에서 배양한 후 0.5 mM의 IPTG를 첨가하고 37도에서 1시간 동안 추가배양 하였다. 변이체를 회수한 후, 1mL의 변이체 배양액에 20 mL의 크실렌을 첨가하고 이를 37^oC에서 20 분간 250 rpm으로 방치하였다. 이를 1/10 희석하고 암모니아에 대한 반응 활성을 측정하기 위하여 30 mM XMP, 13 mM ATP, 16 mM MgSO₄ 7H₂O, 10 mM (NH₄)₂SO₄를 200 mM Trizma HCl 완충액(pH 8.6)에 녹인 반응액 800 mL에 200 mL의 효소액을 섞고, 42 ^oC에서 15 분간 반응을 진행시켰다. 시료 200 μL를 0.175 % TCA 용액 3.8 mL에 섞어 반응을 중지시켰다. 상기 반응액을 HPLC를 이용해서 생성된 GMP 량을 비교하였다. 이 때, 5'-크산틸산 아미나아제의 효소활성은 1 분당 1 mmol의 5'-구아닐산이 생성되는 조건을 1 단위활성으로 정하였다. HPLC 분석 조건은 다음과 같다.

Eluent: A: 0.02 % 테트라부틸암모늄 디히드로젠인산,

0.2 % 암모늄 디히드로젠인산, pH 2.4

Eluent B: 아세토니트릴

A : B = 97 : 3

측정 파장: 254 nm

유속 : 1.0 mL/min

분석된 활성은, 암모니아를 기질로 이용하였을 경우, 각각 단위액 1 mL 및 1 OD 당 야생형 에세리키아 콜리 JM105/pG1은 0.39 단위활성(U/ml/OD)이었고, 변이체인 에세리키아 콜리 JM105/pG3는 0.712 단위활성(U/ml/OD), 변이체인 에세리키아 콜리 JM105/pF12는 1.22 단위활성(U/ml), 변이체 에세리키아 콜리 JM105/pF63은 0.90 단위활성(U/ml), 변이체인 에세리키아 콜리 JM105/pCJ-G3-1는 1.17 단위활성(U/ml/OD), 변이체인 에세리키아 콜리 JM105/pCJ-F12-1는 1.47 단위활성(U/ml), 변이체 에세리키아 콜리 JM105/pCJ-F63-1은 1.20 단위활성(U/ml)이었다.

상기 분석된 5'-크산틸산 아미나아제 활성의 개량 효과를 비교 하였을 때, 변이체의 활성이 야생형 5'-크산틸산 아미나아제 활성에 비하여 1.8 배 내지 3.8 배 증가되었음을 알 수 있다. 따라서, 본 발명의 활성이 증진된 5'-크산틸산 변이체는 활성이 증진된 신규의 5'-크산틸산 변이체임을 재차 확인할 수 있었다.

이상 상세히 설명하고 입증한 바와 같이, 본 발명은 조미 성분으로 유용한 5'-구아닐산을 효과적으로 생산하기 위하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 5'-크산틸산 아미나아제 변이체로서 활성이 증진된 5'-크산틸산 아미나아제 G3, F12, F63, G3-1, F12-1 및 F63-1을 제공한다. 또한, 이를 암호화하는 유전자, 전기 변이체의 유전자를 포함하는 재조합 발현벡터로 형질전환된 형질전환체 및 그로부터 5'-크산틸산 아미나아제의 변이체를 제조하는 방법을 제공한다. 본 발명의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체는 야생형에 비하여 활성이 증진되었으므로 5'-구아닐산을 생산하는 생물공정에 유용하게 활용될 수 있을 것이다.

서열목록 전자파일 첨부

Claims

서열번호 4, 6, 8, 10, 12 및 14 중 어느 하나의 아미노산 서열을 갖는 5'-크산틸산 아미나아제 변이체.
제1항의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 코딩하는 핵산 분자.
제2항의 핵산 분자를 포함하는 발현벡터.
제3항의 발현벡터로 형질전환된 원핵세포인 형질전환체.
제1항의 5'-크산틸산 아미나아제 변이체를 사용하여 5'-크산틸산을 5'-구아닐산으로 전환시키는 방법.