JP3117707B2

JP3117707B2 - ５´―イノシン酸の製造法

Info

Publication number: JP3117707B2
Application number: JP02500062A
Authority: JP
Inventors: 達郎藤尾; 章博飯田
Original assignee: 協和醗酵工業株式会社
Priority date: 1988-11-22
Filing date: 1989-11-22
Publication date: 2000-12-18
Anticipated expiration: 2015-12-18
Also published as: EP0528794A1; EP0528794B1; JPH05503471A; WO1991010568A1; DE59007403D1; US5343773A

Description

【発明の詳細な説明】技術分野本発明は５′−イノシン酸（以下「IMP」と略記す
る）の製造方法に関する。IMPは呈味性を有し、調味料
として広く用いられている。

背景技術 IMPの製造法としては、（１）酵母菌体から抽出した
リボ核酸を酵素的に分解して得られる５′−アデニル酸
を脱アミノ化して製造する方法〔「核酸発酵」、アミノ
酸・核酸集談会編、p.59（1976）〕、（２）発酵法によ
って生産されるイノシンを化学的にリン酸化する方法
〔「核酸発酵」、アミノ酸・核酸集談会編p.209（197
6）〕、（３）ブレビバクテリウム属またはコリネバク
テリウム属の細菌の変異株を用いて直接発酵生産する方
法（特公昭50−26640）などが知られている。

IMPは、ヒポキサンチン（以下「Hyp」と略記する）と
５−フォスフォリボシル−１−ピロリン酸（以下「PRP
P」と略記する）とからサルベージ合成系を利用して合
成されることが知られている。この反応には、ヒポキサ
ンチン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（EC2.
4.2.8）が関与しており、該酵素活性を有する微生物の
培養液中にHypを存在させることにより、培養液中にIMP
が生成することが知られている〔「核酸発酵」、アミノ
酸・核酸集談会編p.35（1976）］。

従来、HypとPRPPとからIMPが生成されることは知られ
ているが、その生成量は少なく、IMPを工業的に安価に
製造できる方法ではなかった。これはHypからIMPを生成
する反応に必要な基質であるPRPPの供給が不十分である
ためと考えられる。しかし、PRPPは高価で不安定な試薬
であるため、PRPPを基質として添加するのは、経済的に
有利でない。従って、より効率よくIMPを工業的に安価
に製造する方法の開発が求められている。

発明の開示本発明者は、IMPを工業的に安価に製造する方法を開
発するために種々検討した。その結果、HypとPRPPとか
らIMPを生成させる反応において、炭素源からPRPPまた
はその前駆物質を生成する活性を有する微生物と、Hyp
とPRPPとからIMPを生成する活性を有する微生物とを併
用することにより、Hypと炭素源とから効率よくIMPを製
造できることを見出し、本発明を完成するに至った。

本発明は、PRPPまたはその前駆物質を生成する活性を
有する微生物およびHypまたはその前駆物質とPRPPまた
はその前駆物質とからIMPを生成する活性を有する微生
物（以下転換菌と称することもある）またはそれらの培
養液もしくは菌体の処理物、Hypもしくはその前駆物質
またはそれらの含有物、炭素源およびリン酸基供与体の
存在下、IMP生成反応を行わせてIMPを反応液中に生成蓄
積させ、該反応液からIMPを採取することを特徴とするI
MPの製造法を提供する。

さらに、本発明はHypのフォスフォリボシル化活性を
有する酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片とベクタ
ーDNAとの組換え体DNAおよび該組換え体DNAを保有する
微生物を提供する。該微生物を転換菌として用いること
により、さらに収率よくHypとPRPPとからIMPを製造する
ことができる。

以下に、本発明を詳細に説明する。

PRPPまたはその前駆物質を生成する活性を有する微生
物（以下PRPP生成活性保持菌と称することもある）とし
ては、該活性を有する微生物であればいずれでも使用で
きる。具体的には、ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 6871 同 ATCC 6872 同 ATCC21062 同 ATCC21295 同 ATCC21477 同 ATCC21478 同 ATCC21479 同 ATCC21480 アースロバクター・シトレウス ATCC11624 コリネバクテリウム・グルタミクム ATCC13032 バチルス・サチルス ATCC14618 エシェリヒア・コリ ATCC33525 エシェリヒア・コリ ATCC11303 スタフィロコッカス・オーレウス ATCC 4012 サッカロミセス・サケ ATCC20018 キャンディダ・ゼイラノイデス ATCC20356 トルロプシス・サイクロフィラ ATCC22163 などを例示することができる。

これらの菌株を通常の培養方法に従って培養すること
により、PRPPまたはその前駆物質を生成する活性を有す
る微生物の培養液または菌体を得ることができる。すな
わち、これらの菌株を適当な炭素源、窒素源、無機物、
アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地で、好気
的条件下にて温度、pHなどを調節しつつ培養を行えばよ
い。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的
条件下で、温度は20〜40℃、好ましくは25〜35℃におい
て、pHは中性付近に維持しつつ、通常10〜120時間行
う。

HypとPRPPまたはその前駆物質とからIMPを生成する活
性を有する微生物（転換菌）としては、該活性を有する
微生物であればいずれでも使用できる。具体的には、エシェリヒア・コリ ATCC10798 エシェリヒア・コリ ATCC11303 バチルス・サチルス ATCC14617 フラボバクテリウム・デボランス ATCC10829 セラチア・マルセッセンス FERM BP−1291 サルモネラ・ティフィムリウム ATCC19585 ラクトバチルス・カゼイ ATCC 7469 ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスATCC 6872 コリネバクテリウム・グルタミカム ATCC13032 などを例示することができる。また、これら微生物との
細胞融合などの分子育種手法によって、Hypのフォスフ
ォリボシル化活性を付与した菌株なども好適である。

上記微生物より、Hypのフォスフォリボシル化活性を
有する酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片を取得
し、該DNA断片をベクターDNAに組み込むことにより組換
え体DNAを造成し、該組換え体DNAを保有させることによ
りHypとPRPPまたはその前駆物質とからIMPを生成する活
性を強化した微生物を用いることにより、さらに効率よ
くIMPを生成させることができる。

Hypのフォスフォリボシル化活性を有する酵素をコー
ドする遺伝子としては、当該活性を有する酵素の遺伝子
であればいずれでも用いられるが、例えばヒポキサンチ
ン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（EC2.4.2.
8、以下HPRTaseと称することもある）、グアニン・キサ
ンチン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼ（EC2.
4.2.22、以下GPRTaseと称することもある）などの遺伝
子が好適である。これらHPRTaseまたはGPRTaseをコード
している遺伝子の供与体としては、上述したHypとPRPP
とからIMPを生成する活性を有する微生物であればいず
れでも用いることができる。具体的には、セラチア・マ
ルセッセンス由来のHPRTase（実施例１）またはGPRTase
（実施例２）をコードする遺伝子、およびエシェリヒア
・コリ由来のGPRTase（実施例３）をコードする遺伝子
をあげることができる。これらの遺伝子を含むDNA断片
をプラスミド・ベクターに挿入し、得られた組換え体DN
Aを用いて形質転換することにより、HPRTaseおよびGPRT
aseを強化した菌株を得ることができる。

これらの微生物を通常の培養方法によって培養するこ
とによって、HypおよびPRPPとからIMPを生成する活性を
有する培養液、菌体またはそれらの処理物を得ることが
できる。すなわち、これらの微生物を適当な炭素源、窒
素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常
の培地中において、好気的条件下で温度、pHなどを調節
しつつ培養を行えばよい。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的
条件下で行う。培養温度は20〜50℃がよく、28〜40℃が
より好ましい。培養中の培地のpHは中性付近に維持する
ことが望ましい。培養時間は通常１〜48時間である。

PRPP生成活性保持菌株、およびHypとPRPPとからIMPを
生成する活性を有する菌株の培養に用いる炭素源として
は、グルコース、フラクトース、シュークロース、マル
トース、マンニトール、ソルビトールなどの炭水化物や
糖アルコール、グリセロール、さらにピルビン酸、乳
酸、クエン酸などの各種のアルコールや有機酸、グルタ
ミン酸、メチオニン、リジンなどの各種アミノ酸などが
使用できる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜、白
糠、キャッサバ、バガス、コーン・スティープ・リカー
などの天然有機栄養源など、用いる菌株が資化しうるも
のであればいずれでも用いることができる。

窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アンモニウ
ム、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム、酢酸アンモ
ニウムなどの各種無機および有機アンモニウム塩類、グ
ルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどのアミノ酸、
あるいはペプトン、NZアミン、コーン・スティープ・リ
カー、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物、フ
ィッシュミールあるいはその消化物などの含窒素有機物
など種々の物が使用可能である。

さらに、無機物としては、リン酸二水素カリウム、リ
ン酸一水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナトリ
ウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅、塩化マンガ
ン、モリブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などを必要に応じ
て添加する。微生物の生育に必要なビタミン、アミノ
酸、ミネラル、核酸その他のものは必要に応じて添加す
る。

このようにして得られるHypもしくはその前駆物質ま
たはそれらを含有する物質、PRPP生成活性保持菌培養液
もしくはその菌株またはそれらの処理物を含有する液、
および転換菌培養液もしくはその菌体またはそれらの処
理物を含有する液を用いて、これらと炭素源、リン酸基
供与体、その他の必要な成分とを接触させることによっ
てIMPを得ることができる。なお、必要に応じてPRPP前
駆物質を添加してもよい。

PRPPもしくはその前駆物質の生成活性保持菌の培養
液、菌体もしくはそれらの処理物と、PRPPとHypとからI
MPを生成する活性を有する転換菌の培養液、菌体もしく
はそれらの処理物と、Hypもしくはその前駆物質および
炭素源やリン酸基供与体などとを接触させるには、それ
ぞれを別個に培養し培養終了後混合してもよいし、ま
た、PRPP生成活性保持菌の培養開始時点から培養終了時
点までのいずれかの時点において、Hypもしくはその前
駆物質および転換菌の培養液、菌体もしくはそれらの処
理物を混合してもよい。さらに、転換菌の培養開始時点
から培養終了時点までのいずれかの時点に、Hypもしく
はその前駆物質およびPRPP生成活性保持菌の培養液、菌
体もしくはそれらの処理物を添加してもよい。また、PR
PP生成活性保持菌および転換菌を混合培養し、Hypもし
くはその前駆物質を任意の時期に添加してもよい。

Hypの前駆物質としては、例えばイノシンがあげられ
るが、その他微生物的もしくは酵素的に同様に容易にHy
pに変換され得るものであり、かつPRPP生成活性保持
菌、転換菌のいずれかの菌株もしくはそれらの菌株が保
持する活性によりHypに変換される物であれば、いずれ
でも用いることができる。また、前駆物質を酵素処理な
どの前処理によりHypに変換して用いることも、また酵
素添加などにより転換反応と並行してHypへの変換を行
わせつつ用いることもできる。さらに、イノシンの精製
品、粗精製品、イノシン発酵液、除菌体上清液およびそ
の濃縮物など、HypからIMPへのフォスフォリボシル化反
応を妨げないものであればいずれでも用いることができ
る。

PRPP生成基質としては、炭素源とリン酸基供与体が用
いられる。炭素源としては、使用するPRPP生成活性保持
菌により利用され得るものであれば、グルコース、リボ
ース、アラビノース、ラクトース、マルトース、シュー
クロース、マンニトール、ソルビトール、トレハロー
ス、糖蜜、廃糖蜜、その他の糖質、澱粉加水分解物など
の炭水化物、ピルビン酸、乳酸、酢酸、α−ケトグルタ
ール酸などの有機酸、グリシン、アラニン、アスパラギ
ン酸、グルタミン酸、グルタミンなどのアミノ酸などい
ずれでもよい。また、アセチルリン酸、カルバミルリン
酸、クレアチンリン酸などのリン酸化化合物も用いるこ
とができる。

リン酸基供与体としては、オルソリン酸、ピロリン
酸、ポリリン酸、ポリメタリン酸などの無機リン酸のナ
トリウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などいずれで
も使用できる。また、アセチルリン酸、カルバミルリン
酸、クレアチンリン酸、フラクトース−１、６−二リン
酸などの有機リン酸化化合物も用いることができる。そ
の濃度は、10〜400mMの範囲を保つことが望ましい。

PRPP前駆物質としては、PRPPもしくはその前駆物質生
産菌が生産し得る物であり、かつ転換菌により容易にPR
PPに変換され得る物であればいずれでもよいが、例えば
５′−アデノシン−３リン酸（以下ATPと称することも
ある）、５′−アデノシン−２リン酸、５′−アデノシ
ン−１リン酸、アデノシン、アデニンなどATP関連物質
や、リボース、リボース−５−リン酸、リボース−１−
リン酸その他の五炭糖もしくはそのリン酸化物など、PR
PPの生成を促進し、HypとPRPPとからIMPへのフォスフォ
リボシル化反応を阻害しないものであればいずれでも使
用できる。なお、炭素源から生合成されるPRPPの量が十
分であれば、特に添加する必要はない。

転換菌として、Hypのフォスフォリボシル化活性を有
する酵素をコードする遺伝子を含むDNA断片とベクターD
NAとの組換え体DNAを保有する微生物を用いる場合、PRP
Pの供給源は特に限定されず、PRPP生成活性保持菌を用
いずに試薬として添加してもよい。しかし、PRPP生成活
性保持菌を用いることにより、さらに収率よくIMPを生
成させることができる。

Hypもしくはその前駆物質からIMPへのフォスフォリボ
シル化反応は、上記混合液に必要に応じてマグネシウム
イオン、界面活性剤および／または有機溶剤などを加
え、pHを６〜10、より好ましくは７〜８に調節しつつ、
かつ20〜50℃に１〜48時間保ちつつ行う。HypからIMPへ
のフォスフォリボシル化反応時のHypの濃度は、１〜100
mg/mlの範囲にあることが望ましい。

PRPP生成活性保持菌および転換菌の各培養液または菌
体の処理物としては、培養液の濃縮物および乾燥物、培
養物を遠心分離して得られる菌体、凍結菌体、さらには
菌体の乾燥物、凍結乾燥物、アセトン処理物、界面活性
剤および／または有機溶剤処理物、溶菌酵素処理物、固
定化菌体などがあげられる。また、該菌体から抽出した
PRPP生合成酵素またはフォスフォリボシル化酵素含有
液、それらの酵素の精製標品、固定化物なども用いるこ
とができる。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリ
ルアミン（例えばナイミーンＳ−215、日本油脂社製；
以下特記しない限り同社製のものを使用）、セチルトリ
メチルアンモニウム・ブロマイド、カチオンFB、カチオ
ンF2−40Eなどのカチオン性界面活性剤、ナトリウムオ
レイルアミド硫酸、ニューレックスTAB、ラピゾール80
などのアニオン系界面活性剤、ポリオキシエチレンソル
ビタン・モノステアレート（例えばノニオンST221）な
どの両性界面活性剤、その他三級アミンPB、ヘキサデシ
ルジメチルアミンなど、PRPPの生合成および／またはHy
pとPRPPとからIMPへのフォスフォリボシル化反応を促進
する物であればいずれでも使用できる。これらは通常0.
1〜50mg/ml、好ましくは１〜20mg/mlの濃度にて用いら
れる。

有機溶剤としては、トルエン、キシレン、脂肪族アル
コール、ベンゼン、酢酸エチルなどが用いられ、その濃
度は0.1〜50μ/ml、好ましくは１〜20μ/mlがよ
い。

PRPPの生合成反応およびHypとPRPPとからIMPへのフォ
スフォリボシル化反応を行う際のマグネシウムイオンの
濃度は、４〜400mMの範囲を保つことが望ましい。培養
液または菌体などから該反応系に持ち込まれるマグネシ
ウムイオンの量が、この濃度範囲を満たす場合は添加の
必要はなく、一方、不足する場合は上記の濃度範囲に入
るようにマグネシウムイオンを添加する。また過剰の場
合は希釈する。マグネシウムイオンとしては無機塩で
も、有機酸の塩でも使用できる。反応終了後、反応液中
に生成蓄積したIMPを採取するには、イオン交換樹脂な
どを用いる通常の方法を用いて行う。

図面の簡単な説明第１図は、プラスミドpAI63の制限酵素切断地図を表
す。図中、ＥはEcoR I、SmはSma I、ScはSca I、BgはBg
l II、ＫはKpn I、XhはXho I、ＭはMlu I、ＨはHind II
Iをそれぞれ表す。

以下に、本発明の実施例を示す。

実施例1. セラチア・マルセッセンス由来のHPRTase遺
伝子を含むDNA断片を含む組換え体プラスミドの取得（１） HPRTase遺伝子のクローン化のための受容菌の
造成 HPRTase遺伝子（以下hpt遺伝子と称することもある）
を取得するために用いる受容菌として、HPRTaseおよびG
PRTaseを欠損し、イノシンおよび／またはHypを含む最
少培地で生育しない菌株エシェリヒア・コリＳφ609株
〔B.Jochimsen,P.Nygaad,and T.Vestergaad:モレキュラ
ー・アンド・ジェネラル・ジェネティクス（Mol.Gen.Ge
net.），143,85（1975）、Yale大学E.coli Genetic Sto
ck Centerから入手〕をＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ
−ニトロソグアニジン（以下NTGと略記する）により突
然変異処理を行い、宿主制限系の解除されたAI675株を
造成した。

NTGによる変異処理は、以下のようにして行った。す
なわち、LB培地10mlを含む大型試験管を用い37℃にて一
夜往復振盪培養（190rpm）して得た培養液を、3000rpm
にて15分間遠心分離して菌体を集めた。沈澱した菌体を
生理食塩水（0.9％食塩水溶液）にて２回洗浄後、生理
食塩水に1ml当り５×10⁸の菌数となるように懸濁した。
この懸濁液にNTGを最終濃度が500μg/mlとなるように添
加し、45分間室温に放置した。生理食塩水にて２回洗浄
し、NTG処理菌体を得た。

宿主制限系の有無の検定は、突然変異処理を施した菌
をバクトトリプトン（ディフコ社製）10g/、酵母エキ
ス（ディフコ社製）5g/、食塩5g/の組成で、pH7.2
に調整したLB液体培地で30℃、20時間培養後、エシェリ
ヒア・コリC600（r^-m^-）株（ATCC 33525）より公知の方
法［J.H.Miller,エックスペリメンツ・イン・モレキュ
ラー・ジェネティクス（Experiments in Molecular Gen
etics）,Cold Spring Harbor Lab.（1972）］により調
整したλファージとLB平板培地（LB液体培地にディフコ
社製寒天1.5％添加）上でクロスストリークを行い、λ
ファージの菌への感受性を指標として行った。なお、AI
675の遺伝子型はara,rpsL,deoD,hsdR,purH/J.△pro−gp
t−lac,thi,hptである。

（２） hpt遺伝子のショットガンクローニングセラチア・マルセッセンス YT101（FERM BP−1291）
をLB培地に植菌し、30℃で20時間培養した。得られた培
養菌体から公知の方法〔H.Sato ＆ K.I.Miura:バイオキ
ミカ・エ・バイオフィジカ・アクタ（Biochim.Biophys.
Acta），72,619（1963）〕に従い染色体DNAを分離精製
した。ベクターは、エシェリヒア・コリ JM109株〔Y.Y
anish−Perron et al.:ジーン（Gene），33,103（198
5）〕から公知の方法［T.Maniatis et al.:モレキュラ
ー・クローニング（Molecular cloning）,Cold Spring
Harbor Lab.（1982）］により分離精製したpUC19を用い
た。なお、pUC19を保有するJM109株を以下AI623株と呼
ぶ。また、以下特記しない限り菌の培養および保存には
LB培地を用いた。

精製したセラチア・マルセッセンスYT101株の染色体D
NA5μｇを、100mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.5）、50mM
NaCl、6mM MgCl₂、1mM ジチオスレイトール、100μ
g/ml牛血清アルブミンの組成の緩衝液（以下「EcoR I緩
衝液」と称する）40μに溶かし、20単位の制限酵素Ec
oR I（宝酒造社製、以下特記しない限り制限酵素はすべ
て宝酒造社製を使用）を加え、37℃で２時間消化反応を
行ったのち、65℃で10分間の熱処理により反応を停止さ
せた。

この消化物に蒸留水140μ、3M酢酸ナトリウム（pH
5.6）20μを添加後、２倍量の氷冷エタノールを加
え、−80℃にて20分間静置した。遠心分離後上清を捨
て、DNAの沈澱を取得した（以下この方法を「エタノー
ル沈澱法」と呼ぶ）。この沈澱に20μの蒸留水を加え
て沈澱を溶解して、染色体DNA断片の濃縮液を得た。

一方、pUC19プラスミドDNA2μｇをEcoR I緩衝液40μ
に溶かし、10単位のEcoR Iを加え、37℃で２時間消化
反応を行ったのち、65℃で、10分間の熱処理により反応
を停止させた。上記と同様のエタノール沈澱法によりプ
ラスミドDNA断片の濃縮を行い、15μの蒸留水を加え
沈澱を溶解した。

このようにして得たセラチア・マルセッセンスの染色
体DNAのEcoR I消化断片とpCU19のEcoR I消化断片とを66
mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.6）、6.6mM MgCl₂、10mM
ジチオスレイトールおよび1mM ATPの組成の緩衝液50
μに溶解して、２単位のT4DNAリガーゼ（宝酒造社
製）を加えて12℃にて18時間処理した。得られた組換え
体混合物を用い、上記（１）で造成したエシェリヒア・
コリAI675株を公知の方法〔T.Maniatis et al.:モレキ
ュラー・クローニング（Molecular cloning）,Cold Spr
ing Harbor Lab.（1982）〕により形質転換し、1mM Hyp
または1mMイノシンを含むM9Ap平板培地上に生育する菌
株を選択することにより、アンピシリン耐性で、かつHy
pまたはイノシン要求性が相補された形質転換株を得
た。このようにして得られた菌株から、pUC19プラスミ
ドDNAを調製したのと同様の方法によってプラスミドDNA
を分離精製し、該DNAをEcoR Iで消化することによりプ
ラスミドの構造解析を行った結果、pUC19のEcoR I切断
部位に約15キロベース（以下kbと略記する）のセラチア
・マルセッセンス由来のDNA断片が挿入された組換え体
プラスミドであることを確認し、pAI63と名付けた。pAI
63を用いてエシェリヒア・コリAI675株を形質転換し、
得られた形質転換株の平板上での生育を調べたところ、
M9Ap平板培地（NH₄Cl 1g、Na₂HPO₄・12H₂O14.7g、KH₂P
O₄3g、NaCl5g、MgSO₄・7H₂O 0.25g、CaCl₂・2H₂O 15m
g、グルコース2g、ビタミンB₁1mg、アルギニン0.1g、プ
ロリン0.1g、アンピシリン75mgを水１に溶解し、寒天
1.5％を加えたもの）に各々1mMのHyp、イノシン、グア
ニンまたはグアノシンを含む平板上で生育し、1mMキサ
ンチンを含むM9Ap平板上では生育しなかった。この結果
は、pAI63保有株はキサンチンを基質にしないことか
ら、pAI63上にはセラチア・マルセッセンス由来のhpt遺
伝子が存在することを示唆している。得られたpAI63の
構造を、種々の制限酵素消化とアガロースゲル電気泳動
により解析した結果、第１図に示すような構造を有して
いることがわかった。

pAI63を用いて、エシェリヒア・コリJM109株を形質転
換することにより、pAI63を保有するエシェリヒア・コ
リAI690を得た。本菌株は、昭和62年11月２日付で工業
技術院微生物工業技術研究所（微工研）にFERM BP−154
5として寄託されている。

（３） HPRTase活性の測定 HPRTase活性は以下の方法により測定した。

エシェリヒア・コリAI675、AI623およびAI690の種培
養をLB液体培地にそれぞれ接種し、30℃にて20時間振盪
培養したのち菌体を遠心分離した。適当量の10mMリン酸
緩衝液（pH7.0）に懸濁し、超音波処理を行い、破砕菌
体を遠心分離により除去した後の上清画分を粗酵素液と
して活性測定に用いた。

粗酵素液を100mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.0）、10mM
MgCl₂、20mMフッ化ソーダ、5mM PRPP、2.5mM Hypの
組成の反応液中に共存させ、37℃にて静置することによ
り、HypからのIMP生成反応を行った。IMPの生成は、経
時的に反応液を採取し、100℃、２分間煮沸し遠心分離
後上清画分を希釈したものを高速液体クロマトグラフィ
ーを用い、254nmの吸光度を測定することにより定量し
た。

活性は高速液体クロマトグラフ（TRIROTOR Ｖ型、日
本分光社製）を用いて、37℃で１分間に1nMのIMPを生成
する活性を１単位として表した。結果を第１表に示す。

実施例2. セラチア・マルセッセンス由来のGPRTase遺
伝子を含むDNA断片を含む組換え体プラスミドの取得（１） GPRTase遺伝子のショットガンクローニング GPRTaseは、HPRTase活性を併せ有しているので、HPRT
ase遺伝子を取得したのと同様の方法でクローニングを
行いHPRTase活性を示す形質転換を取得し、該形質転換
株よりGPRTase活性を示す菌株を選択することにより、G
PRTase遺伝子（以下gpt遺伝子と称することもできる）
を含む組換え体プラスミド保有株を得ることができる。

実施例１と同様にセラチア・マルセッセンスYT101（F
ERM BP−1291）を培養し、得られた培養菌体から染色体
DNAを分離精製した。またベクターとしては実施例１と
同様にpUC19を用いた。

精製したセラチア・マルセッセンスYT101株の染色体D
NA5μｇをEcoR I緩衝液40μに溶かし、20単位の制限
酵素Hind IIIを加え、37℃で２時間消化反応を行ったの
ち、65℃で10分間の熱処理により反応を停止させた。

この消化物からエタノール沈澱法により沈澱を取得し
た。この沈澱に20μの蒸留水を加えて沈澱を溶解し
て、染色体のDNA断片濃縮液を得た。

一方、pUC19プラスミドDNA2μｇをEcoR I緩衝液40μ
に溶かし、10単位のHind IIIを加え、37℃で２時間消
化反応を行ったのち、65℃、10分間の熱処理により反応
を停止させた。エタノール沈澱法によりプラスミド断片
の濃縮を行い、15μの蒸留水を加え沈澱を溶解した。

このようにして得られたセラチア・マルセッセンスの
染色体DNA断片とpUC19のHind III消化断片とを実施例１
の（２）と同様に処理し、組換え体混成物を得た。得ら
れた組換え体混成物を用い、エシェリヒア・コリAI675
株を実施例１と同様に形質転換し、アンピシリン（75μ
g/ml）に耐性で、かつHypまたはイノシンを含む最少培
地で生育する形質転換株を選択した。このようにして得
られた菌株から、pUC19のDNAを調製したのと同様の方法
によってプラスミドを分離精製し、該DNAをHind IIIで
消化することによりプラスミドの構造解析を行った結
果、pUC19のHind III切断部位に約20kbのセラチア・マ
ルセッセンス由来のDNA断片が挿入された組換え体プラ
スミドであることを確認し、pAI64と名付けた。pAI64を
用いてエシェリヒア・コリAI675株を形質転換し、得ら
れた形質転換株の平板上での生育を調べたところ、M9Ap
平板培地に各々1mMのHyp、イノシン、グアニン、グアノ
シンを含む平板上および1mMのキサンチンを含む平板上
で生育した。この結果は、pAI64保有株はキサンチンを
基質にすることからpAI64上にはセラチア・マルセッセ
ンス由来のgpt遺伝子が存在することを示唆している。

pAI64を用いて、エシェリヒア・コリJM109株を形質転
換することにより、pAI64を保有するエシェリヒア・コ
リAI712を得た。本菌株は、昭和62年11月２日付で、微
工研にFERM BP−1546として寄託されている。

（２） GPRTase活性の測定 GPRTase活性は以下の方法により測定した。

活性測定実験に供試するエシェリヒア・コリの培養お
よび粗酵素液の調製は実施例１の（３）と同様に行っ
た。

粗酵素液を100mM トリス・塩酸緩衝液（pH7.0）、10
mM MgCl₂、20mM フッ化ソーダ、5mM PRPP、2.5mMグア
ニンの組成の反応液中に共存させ、37℃にて静置するこ
とにより、グアニンからのGMP生成反応を行った。

GMPの生成は、経時的に反応液を採取し、100℃、２分
間煮沸し遠心分離後上清画分を希釈したものを高速液体
クロマトグラフを用い、254nmの吸光度を測定すること
により定量した。活性は高速液体クロマトグラフ（TRIR
OTOR Ｖ型、日本分光社製）を用いて、37℃で１分間に
1nMのGMPを生成する活性を１単位として表した。

第１表にHPRTaseおよびGPRTaseの活性を示す。

実施例3. エシェリヒア・コリ由来のGPRTase遺伝子を
効率よく発現するプラスミドの造成（１）エシェリヒア・コリのGPRTase遺伝子（gpt）の
pUC19プラスミドへのサブクローニングエシェリヒア・コリの染色体DNA由来のgpt遺伝子とCo
lE1のハイブリッド・プラスミドであるpLC44−11を保有
しているエシェリヒア・コリJA200株〔セル（Cell）９,
91（1976）〕をLB培地に植菌し、30℃で18時間培養し
た。得られた培養菌体から、公知の方法〔T.Maniatis e
t al.:モレキュラー・クローニング（Molecular clonin
g）,Cold Spring Harbor Lab.（1982）〕に従ってプラ
スミドpLC44−11を分離精製した。ベクターとして用い
るpUC19も、同様の方法でエシェリヒア・コリJM109株か
ら分離精製した。pLC44−11は約30kbの大きさで、約1kb
のBgl I−Hinc II断片上にgpt遺伝子が存在すると予想
された〔R.C.Mulligan and P.Berg:サイエンス（Scienc
e）209,1422（1980）〕。

上記で調製したpLC44−11プラスミドDNA5μｇを10mM
トリス・塩酸緩衝液（pH7.5）、50mM NaCl、6mM MgCl
₂、1mMジチオスレイトールおよび100μg/ml牛血清アル
ブミンの組成の緩衝液50μに溶かし、20単位の制限酵
素Bgl Iを加え、37℃にて１時間消化反応を行った。次
に20単位のHinc IIを加え、37℃にて１時間消化反応を
行ったのち、65℃10分間の熱処理により反応を停止させ
た。この消化物を低融点アガロースゲル電気泳動法〔ア
ナリティカル・バイオケミストリィ（Analytical Bioc
hemistry），98,305（1979）〕に従い、約1kbのプラス
ミドDNA断片を精製した。

得られたDNA断片を、40μの50mM トリス・塩酸緩
衝液（pH7.6）、7mM MgCl₂、6mM ２−メルカプトエタ
ノール、0.25mM dATP、0.25mM dGTP、0.25mM dTTP、
0.25mM dCTPの組成の反応液に溶解し、続いて６単位の
エシェリヒア・コリDNAポリメラーゼＩ・Klenow断片（N
ew England Biolabs.社製、１μ）を加え、15℃にて
２時間反応させ、Bal Iによって生じた３′−突出末端
を平滑末端に変えた。その後フェノール、クロロフォル
ム抽出およびエタノール沈澱をし、DNA断片を精製し
た。

一方、pUC19プラスミドDNA2μｇを10mM トリス・塩
酸緩衝液（pH7.5）、6mM MgCl₂、1mM ジチオスレイト
ールおよび100μg/ml牛血清アルブミンの組成の緩衝液2
0μに溶かし、５単位のSma Iを加え、37℃で２時間消
化反応を行い、2.7kbのプラスミドDNA断片を精製した。

このようにして得た約0.2μｇのpLC44−11由来のDNA
断片と、約0.5μｇのpUC19由来のSma I切断DNA断片とを
20mMトリス・塩酸緩衝液（pH7.6）、10mM MgCl₂、10mM
ジチオスレイトールおよび0.5mM ATPの組成の緩衝液40
μに溶解し、２単位のT4DNAリガーゼを加えて12℃、1
8時間処理した。得られた組換え体混成物を用い、エシ
ェリヒア・コリAI675株を公知の方法により形質転換
し、アンピシリン（75μg/ml）に耐性で、かつグアニン
を含む最少培地で生育する形質転換株を選択した。この
ようにして得られた菌株から、pUC19のDNAを調製したの
と同様の方法によってプラスミドを分離精製し、該DNA
をEcoR I、Hind IIIなどの制限酵素で消化することによ
り、プラスミドの構造解析を行った結果、pUC19に約1kb
のgpt遺伝子を含むDNA断片が挿入された組換え体プラス
ミドであることを確認し、pGPT1と名付けた。pGPT1を用
いて、エシェリヒア・コリJM109株を形質転換すること
により、pGPT1を保有するエシェリヒア・コリAI737を得
た。本菌株は昭和62年11月２日付で、微工研にFERM BP
−1547として寄託されている。

（２）エシェリヒア・コリのgpt遺伝子を強化したエ
シェリヒア・コリのHPRTaseおよびGPRTase活性の発現実施例１および実施例２に記載した方法と同様にして
AI675、AI623およびAI737株のHPRTaseおよびGPRTase活
性を測定した結果を第２表に示す。

実施例4. ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872を、
ポリペプトン、肉エキス、酵母エキス、食塩をそれぞれ
１％、0.5％、0.5％、0.25％含む種培地（pH7.2）10ml
を分注した70ml容大型試験管に一白菌耳植菌し、30℃で
24時間往復振盪培養した。得られた種培養2mlを、グル
コース15％、カゼイン加水分解物、0.01％、酵母エキス
0.7％、硫安1.0％、KH₂PO₄0.3％、K₂HPO₄ 0.3％、MgSO
₄・7H₂O 0.5％、ビオチン10μg/の組成の培地をpH7.
2に調整後、300ml容バッフル付三角フラスコに20mlずつ
分注し、120℃、20分間蒸煮殺菌した培地に植菌した。
回転振盪培養にて30℃で培養中、必要に応じ尿素を添加
することによって、pHを中性付近に保ちつつ76時間培養
した。培養終了後、菌体を遠心分離により集め−20℃に
て凍結保存した。

LB液体培地（pH7.2）10mlを分注・殺菌した大型試験
管に、エシェリヒア・コリATCC10798株を一白金耳接種
し、30℃にて20時間往復振盪培養した。これを、LB液体
培地400mlを含む２容三角フラスコに10ml植菌し、37
℃にて17時間回転振盪培養したのち、菌体を遠心分離し
て集め、凍結保存（−20℃）した。

転換菌としてエシェリヒア・コリATCC 10798の凍結菌
体を最終菌体濃度が湿菌体重量にて50mg/mlとなるよう
に、またPRPP生成活性保持菌としてブレビバクテリウム
・アンモニアゲネスATCC 6872の凍結菌体を同じく最終
菌体濃度が湿菌体重量にて200mg/mlとなるように水に懸
濁した。この混合菌体溶液に、Hyp（興人社製）100mM、
グルコース80mg/ml、フィチン酸ソーダ（pH7.0）5mg/m
l、KH₂PO₄20mg/ml、MgSO₄・7H₂O 5mg/mlをそれぞれ添
加し、さらにナイミーンＳ−215 4mg/mlおよびキシレ
ン10μ/mlを添加し、200ml容ビーカーに20mlずつ分注
した。これをマグネチック・スターラーにて900rpmで攪
拌し、カセイソーダでpHを7.4付近に調節しつつ、32℃
に24時間保ち、HypからIMPへのフォスフォリボシル化反
応を行った。その結果、4.02mMのIMP（以下IMP・Na₂・7
H₂O相当量として表示）が生成蓄積した。なお、ナイミ
ーンＳ−215およびキシレンを添加しなかった場合は0.4
mMであった。また、ブレビバクテリウム・アンモニアゲ
ネスATCC6872の菌体を無添加の場合、IMPの蓄積量は0.3
mM以下であった。

実施例5. 実施例１で得られたpAI63を保有するエシェリヒア・
コリAI690株を、実施例４のエシェリヒア・コリATCC107
98を培養したのと同様の条件下で培養し、遠心分離後菌
体を−20℃にて凍結保存した。得られた凍結菌体を、エ
シェリヒア・コリATCC10798の代わりに用いた他は実施
例４と同様にHypからIMPへのフォスフォリボシル化反応
を行ったところ、反応液中に18.7mMのIMPが生成蓄積し
た。

実施例6. 実施例２で得られたpAI64を保有するエシェリヒア・
コリAI712株を、実施例４のエシェリヒア・コリATCC107
98を培養したのと同様の条件下で培養し、遠心分離後菌
体を−20℃にて凍結保存した。得られた凍結菌体を、エ
シェリヒア・コリATCC10798の代わりに用いた他は実施
例４と同様にHypからIMPへのフォスフォリボシル化反応
を行ったところ、反応液中に7.3mMのIMPが生成蓄積し
た。

実施例7. 実施例３で得られたpGPT1を保有するエシェリヒア・
コリAI737株を、実施例４のエシェリヒア・コリATCC107
98を培養したのと同様に培養し、遠心分離後菌体を−20
℃にて凍結保存した。得られた凍結菌体を、エシェリヒ
ア・コリATCC10798の代わりに用いて、実施例４と同様
にHypからIMPへのフォスフォリボシル化反応を行ったと
ころ、反応液中にIMPが6.9mM生成蓄積した。

実施例8. 実施例１で得られたpAI63を保有するエシェリヒア・
コリAI690株を、実施例４のエシェリヒア・コリATCC107
98を培養したのと同様の条件下で培養し、遠心分離後菌
体を−20℃にて凍結保存した。また、ブレビバクテリウ
ム・アンモニアゲネスATCC21480を、実施例４のブレビ
バクテリウム・アンモニアゲネスATCC6872を培養したの
と同様の条件下で培養し、遠心分離後菌体を−20℃にて
凍結保存した。エシェリヒア・コリAI690株の凍結菌体
を、最終菌体濃度が湿菌体重量にて50mg/mlとなるよう
に、またブレビバクテリウム・アンモニアゲネスATCC21
480の凍結菌体を同じく、最終菌体濃度が湿菌体重量に
て200mg/mlとなるように水に懸濁した。この混合菌体溶
液に、Hyp110mM、リボース15mg/ml、グルコース80mg/m
l、フィチン酸ソーダ（pH7.0）5mg/ml、KH₂PO₄20mg/m
l、MgSO₄・7H₂O 5mg/mlをそれぞれ添加し、さらにナイ
ミーンＳ−215 4mg/mlおよびキシレン10μ/mlを添加
し、200ml容ビーカーに20mlずつ分注した。これをマグ
ネチック・スターラーにて900rpmで攪拌し、カセイソー
ダでpHを7.4付近に調節しつつ、32℃に24時間保ち、Hyp
からIMPへのフォスフォリボシル化反応を行った。その
結果反応液中に86mMのIMPが生成蓄積した。

実施例9. 転換菌として、エシェリヒア・コリATCC10798株の代
わりに第３表に示す各菌株を用いた他は、実施例８と同
様にしてHypからIMPへのフォスフォリボシル化反応を行
った。結果を第３表に示す。

実施例10. PRPP生成活性保持菌として、ブレビバクテリウム・ア
ンモニアゲネスATCC6872株の代わりに第４表に示す各種
菌株を用いる他は、実施例４と同様にしてHypからIMPへ
のフォスフォリボシル化反応を行い、第４表に示す結果
を得た。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩ (Ｃ１２Ｎ 15/09 Ｃ１２Ｒ 1:425） (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:13） (Ｃ１２Ｐ 19/32 Ｃ１２Ｒ 1:19） (56)参考文献特公昭44−24309（ＪＰ，Ｂ１) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，（1972) Ｖｏｌ．11，Ｎｏ．25，ｐ．4723−4731 Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．Ｇｅｎｅｔ. （1984）Ｖｏｌ．196，ｐ．152−157 Ｓｃｉｅｎｃｅ，（1980）Ｖｏｌ. 209，ｐ．1422−1427 アミノ酸・核酸集談会編「核酸発酵」株式会社講談社（1976）ｐ．35 (58)調査した分野(Int.Cl.⁷，ＤＢ名) C12P 19/32 C12N 1/21 C12N 15/54 C12N 15/70 ＢＩＯＳＩＳ（ＤＩＡＬＯＧ) ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ)

Claims

(57)【特許請求の範囲】

【請求項１】（ａ）５−フォスフォリボシル−１−ピロ
リン酸もしくはその前駆物質を生成する活性を有する微
生物またはそれらの培養液もしくは菌体の処理物、（ｂ）エシェリヒア・コリ AI690（FERM BP−1545）が
保有するpAI63の約15キロベースからなるEcoR I−EcoR
I断片上に含まれるヒポキサンチン・フォスフォリボシ
ルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有するDN
A断片、またはエシェリヒア・コリ AI712（FERM BP−1
546）が保有するpAI64の約20キロベースからなるHind I
II−Hind III断片上に含まれるグアニン・キサンチン・
フォスフォリボシルトランスフェラーゼをコードする遺
伝子を含有するDNA断片とベクターDNAとの組換え体DNA
を保有する微生物またはそれらの培養液もしくは菌体の
処理物、（ｃ）ヒポキサンチンもしくはその前駆物質またはそれ
らの含有物、（ｄ）炭素源および（ｅ）リン酸基供与体の存在下、５′−イノシン酸生成反応を行わせて５′−イノシン酸
を反応液中に生成蓄積させ、該反応液から５′−イノシ
ン酸を採取することを特徴とする５′−イノシン酸の製
造法。
【請求項２】菌体の処理が、有機溶剤および／または界
面活性剤を用い、これらを菌体とあらかじめ接触させる
か、反応液中に存在させることにより行う請求項１記載
の方法。
【請求項３】エシェリヒア・コリ AI690（FERM BP−15
45）が保有するpAI63の約15キロベースからなるEcoR I
−EcoR I断片上に含まれるヒポキサンチン・フォスフォ
リボシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子を含有
するDNA断片、またはエシェリヒア・コリ AI712（FERM
BP−1546）が保有するpAI64の約20キロベースからなる
Hind III−Hind III断片上に含まれるグアニン・キサン
チン・フォスフォリボシルトランスフェラーゼをコード
する遺伝子を含有するDNA断片とベクターDNAとの組換え
体DNA。
【請求項４】請求項３記載の組換え体DNAを保有する微
生物。
【請求項５】該微生物が、エシェリヒア・コリ AI690
（FERM BP−1545）、またはエシェリヒア・コリ AI712
（FERM BP−1546）である請求項４記載の微生物。