KR19980703254A - 핵산의 제조 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 이노신 또는 구아노신으로부터 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 형성할 수 있는 활성을 가진 단백질을 암호화하고 있는 DNA를 수반하며 아데노신 트리포스페이트(ATP)를 재생성할 수 있는 미생물을 이용함으로써 이노신 또는 구아노신이나 이들의 전구체로부터 조미료 등에 유용한 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 제조하는 방법, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 신규한 단백질, 이러한 단백질을 암호화하는 유전자, 이러한 유전자를 포함하는 재조합 DNA 및 이에 의해 형질전환된 미생물에 관한 것이다.

Description

핵산의 제조 방법
기술분야
본 발명은 이노신 또는 구아노신으로부터 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 형성하는 활성을 갖는 단백질 암호화하는 DNA를 함유하는 아데노신 트리포스페이트(ATP)-생산 미생물을 사용하여 이노신 또는 구아노신 또는 이의 전구체로부터 조미료 등에 사용하는 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 제조하는 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 신규한 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 및 상기 재조합 DNA로 형질전환된 미생물에 관한 것이다.
배경기술
미생물을 사용하여 이노신을 포스포릴화시킴으로써 5'-이노신산을 생산하기 위해, p-니트로페닐 포스페이트를 사용하는 방법[참조 문헌: Japanese Patent Publication No. 29,858/1964], 무기 인산을 사용하는 방법[참조 문헌: Japanese Patent Publication No. 1,186/1967 및 44,350/1974], 아세틸 포스페이트를 사용하는 방법[참조 문헌: Japanese Patent Application Laid-Open No. 82,908/1981], 및 ATP를 사용하는 방법[참조 문헌: Japanese Patent Application Laid-Open No. 230,094/1988]을 지금까지 계발하여 왔다. 그러나, 이들 방법에 의해 생산되는 5'-이노신산의 축적이 반드시 충분하지는 않았다. ATP를 사용하여 이노신을 포스포릴화시키는 개선된 방법으로서, 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli)의 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 수득하고, 재조합 DNA 기술에 의해 증가된 이노신-구아니딘 키나제 활성을 갖는 이. 콜라이 균주를 제조하고, 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 생산하는 이들 균주를 사용하여 이노신 또는 구아노신을 포스포릴화시키는 것을 포함하는 방법도 계발하여 왔다(WO 91/08286). 그러나, 이들 방법은 반응에서 소비될 ATP를 생성하는 미생물를 별개로 배양시키고 이의 세포를 반응액에 첨가하는 것을 필요로 한다. 따라서, 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 보다 효율적으로 수득하는 방법이 요망되고 있다.
또한, 이노신-구아노신 키나제 유전자가 이. 콜라이와 같은 특정 미생물내에 존재한다는 것이 단지 공지되어 있다[참조 문헌: J. Gen. Microbiol., 135, 1263-1273(1989)].
본 발명자들은 5'-이노신산 및/또는 5'-구아닐산을 보다 효율적으로 제조하는 방법을 계발하였다. 결과적으로, 본 발명자들은 이노신-구아노신 키나제를 암호하는 유전자를 반응에서 소비될 ATP를 재생성하는 충분한 능력을 갖는 미생물에 도입시킴으로써 5'-이노신산 및/또는 5'-구아닐산을 고수율로 용이하게 생산할 수 있음을 밝혀내었다. 또한, 이들은 이. 콜라이로부터 유래된 이노신-구아노신 키나제와는 상이한 아미노산 서열을 갖는 신규한 이노신-구아노신 키나제를 밝혀내었다.
발명의 상세한 설명
본 발명은 이노신 또는 구아노신 또는 이의 전구체로부터 조미료 등에 사용하는 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 고수율로 용이하게 제조하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 이노신 및/또는 구아노신을 5'-이노신산 및/또는 5'-구아닐산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 반응에서 소비될 ATP를 재생성하는 충분한 능력을 갖는 미생물에 도입시키는 방법을 제공하여, 반응에서 소비될 ATP를 재생성하는 또 다른 미생물을 별개로 배양시키고 이를 반응액에 첨가시키지 않으면서 여기에 도입된 유전자를 갖는 미생물만의 존재로 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 고수율로 효율적으로 수득하는 것을 목적으로 한다.
또한, 본 발명은 엑시구오박테리움 아세틸리쿰(Exiguobacrerium acetylicum)에 속하는 미생물로부터 수득할 수 있고 이노신 및 구아노신을 각각 5'-이노신산 및 5'-구아닐산으로 전환시키는 활성을 갖는 신규한 단백질, 상기 단백질을 암호화하는 유전자, 상기 유전자를 함유하는 재조합 DNA, 상기 재조합 DNA로 형질전환된 미생물, 및 상기 미생물을 사용하여 5'-이노신산 및/또는 5'-구아닐산을 제조하는 방법을 제공한다.
본 발명의 단백질은 본 발명의 단백질의 아미노산 서열이 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 공지된 단백질과는 매우 상이하다는 점에서 신규한다. 이. 콜라이로부터 유래된 이노신-구아노신 키나제는 이미 공지되어 있다. 본 발명자들은 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질은 이전에는 이노신-구아노신 활성을 갖는 것으로 공지되지 않았던 엑시구오박테리움 속에 속하는 미생물에서 생산된다는 것을 밝혀내었고, 이들은 이들 단백질을 분리하고 단백질을 암호화하는 유전자를 클로닝하는데 성공하였다. 이들 단백질은 아미노산 서열의 관점에서 공지된 단백질과 매우 상이하다.
이노신-구아노신 활성을 갖는 공지된 단백질과는 매우 상이한 아미노산 서열을 갖는 단백질이 공지된 단백질과 동일한 활성을 갖는다는 것을 본 발명자들에 의해 최초로 밝혀졌다.
즉, 본 발명은 다음에 관한 것이다:
(1) 이노신 또는 구아노신 또는 이의 전구체, 에너지원 및 포스페이트 제공자를 사용하여 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 ATP를 재생성시킬 수 있는 미생물에 도입시킴으로써 수득된 형질전환체에 접촉시키고, 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 반응액에 축적시키고, 이로부터 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 수집함을 포함하는 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조 방법.
(2) ATP 생성 가능한 미생물이 코리네박테리움, 에스케리키아, 사카로마이세스, 스타필로코쿠스 및 칸디다로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종인, (1)에 따른 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법,
(3) ATP 생성 가능한 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스에 속하는, (1)에 따른 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법,
(4) 아노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에서 유도된 유전자 또는 이 유전자를 하이브리드화시킬 수 있는 유전자인, (1) 내지 (3) 중의 어느 하나에 따른 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법,
(5) 이노신-구아노신 키나제활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜리에서 유도된 유전자 또는 이 유전자를 하이브리드화시킬 수 있는 유전자인, (1) 내지 (3) 중의 어느 하나에 따른 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법,
(6) 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 ATP 생성가능한 미생물에 도입하여 수득한 형질전환체,
(7) ATP 생성 가능한 미생물이 코리네박테리움, 에스케리키아, 사카로마이세스, 스타필로코쿠스 및 칸디다로 이루어진 그룹으로부터 선택된 종인, (6)에 따른 형질전환체,
(8) ATP 생성 가능한 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스에 속하는, (6)에 따른 형질전환체,
(9) 이노신-구아노신 키나제활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에서 유도된 유전자 또는 이 유전자를 하이브리드화시킬 수 있는 유전자인, (6) 내지 (8) 중의 어느 하나에 따른 형질전환체,
(10) 이노신-구아노신 키나제활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이에서 유도된 유전자 또는 이 유전자를 하이브리드화시킬 수 있는 유전자인, (6) 내지 (8) 중의 어느 하나에 따른 형질전환체,
(11) 코리네박테리움 암모니아게네스에서 복제되고 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유할 수 있는 재조합 DNA,
(12) 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에서 유도된 유전자 또는 이 유전자를 하이브리드화시킬 수 있는 유전자인, (11)에 따른 재조합 DNA,
(13) 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이에서 유도된 유전자 또는 이 유전자를 하이브리드화시킬 수 있는 유전자인, (11)에 따른 재조합 DNA,
(14) 이노신-구아니신 키나제 활성 및 하기 특성을 갖는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에 속하는 미생물로부터 수득가능한 단백질:
1. 작용
효소는 인산염 그룹을 인산염 도너의 존재하에 뉴클레오사이드로 전이시키고 뉴클레오사이드 5'-일인산염을 형성한다.
2. 기질 특이성
뉴클레오사이드 삼인삼염의 γ-위치의 인산염 그룹은 다른 뉴클레오사이드로 전이된다.
3.적정 pH
pH 7.7 내지 9.9
4.pH 안정성
pH 6.7 내지 12.1
5.적정 온도
30 내지 50℃
6.금속 요건
마그네슘 이온, 망간 이온, 코발트 이온 또는 철 이온
7.금속 이온의 영향
효소의 활성은 구리 이온 및 수은 이온에 의해 강하게 억제되고 아연 이온 및 카드뮴 이온에 의해서도 억제된다.
8. Km 값
Km가는 구아노신에 0.03mM, 이노신에 1mM 및 구아노신이 기질로서 사용되는 경우의 ATP에 1.6mM이다.
9. 분자량
효소의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동법으로 측정하여 약 36킬로달톤이다.
(15)이노신-구아노신 키나제 활성을 갖고 서열 2로 나타내어지거나 아미노산의 일부가 삭제되거나, 치환되거나, 서열 2로 나타내어진 아미노산 서열에 첨가된 아미노산 서열을 갖는 단백질,
(16) (14) 또는 (15)에 따르는 단백질을 암호화하는 유전자 및
(17)이노신-구아노신 활성을 갖고 서열 1으로 나타내어진 뉴클레오사이드 서열을 갖거나 뉴클레오사이드 서열을 갖는 유전자를 하이브리드화할 수 있는 단백질을 암호화하는 유전자.
본 명세서에서 이노신 및 구아노신을 ATP로 인산염화하고 5'-이노신산 및 5'-구아닐산을 각각 형성하는 활성을 이노신-구아노신 키나제 활성이라 한다. 이러한 활성을 갖는 단백질은 이노신-구아노신 키나제라 한다. 반응에서 소비되는 ATP를 생성하기에 충분한 능력을 갖는 미생물을 ATP-생성 균주라 한다.
본 발명을 하기에서 더 상세히 설명한다.
본 발명에서 언급된 이노신-구아노신 키나제는 이노신 및 구아노신을 ATP 등으로 인산염화하는 반응을 촉매화하여 5'-이노신산 및 5'-구아닐산을 각각 형성하는 효소이다. 이 효소의 오리진은 특별히 제한되지는 않지만, 미생물로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제가 바람직하다. 이는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 등에 속하는 미생물로부터 수득된 신규한 효소 뿐만 아니라 이. 콜라이로부터 수득된 공지된 이노신-구아노신 키나제도 포함한다.
엑시구오박테리움 아세틸리쿰 등에 속하는 미생물로부터 수득될 수 있고 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 신규 단백질은 미생물을 배양하고 조효소 추출물을 제조하기 위하여 수득된 세포를 분열시키고 효소를 조효소 추출물로부터 정제하여 수득할 수 있다. 상기한 미생물의 예로서, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 (ATCC 953)이 언급될 수 있다.
분류학적으로, 엑시구오바테리움 아세틸리쿰은 브레비박테리움 아세틸리쿰(Brevibacterium acetylicum)[참고: Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, pp. 1301-1313(1986)]이라 불린다. 그러나, 유전학적 분석의 결과로서, 브레비박테리움 아세틸리쿰은 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로서 엑시구오박테리움속으로 형질전환되어야 한다고 제안된다[참고: Int. J. Syst. Bacteriol., 44, 74-82(1994)].
이노신-구아노신 키나제는 이노신-구아노신 키나제 활성을 손상시키지 않는 방법으로 정제할 수 있다. 정제는 일반적으로 액체 칼럼 크로마토그래피를 통해 수행한다. 구체적으로, 염화칼륨 농도 구배를 사용하는 이온 교환 칼럼 크로마토그래피, 황산암모늄 농도 구배를 사용하는 소수성 칼럼 크로마토그래피 및 인산염 완충액 농도 구배를 사용하는 흡착 칼럼 크로마토그래피를 배합하여 사용할 수 있다.
본 발명에서, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에 속하는 미생물로부터 수득될 수 있고 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 효소는 다음과 같은 특성을 갖는다.
1. 작용
효소는 포스페이트 공여체의 존재하에 포스페이트 그룹을 뉴클레오사이드로 이전시키고 뉴클레오사이드 5'-모노포스페이트를 형성한다.
포스페이트 공여체는 뉴클레오사이드 트리포스페이트이다. 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 예에는 ATP, 2'-데옥시아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 2'-데옥시구아노신 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트가 포함된다.
포스페이트 그룹이 이전되는 뉴클레오사이트의 예에는 이노신, 구아노신 및 2'-데옥시구아노신이 포함된다.
뉴클레오사이드 5'-모노포스페이트의 예에는 상기한 뉴클레오사이드의 5'-모노포스페이트 에스테르, 및 5'-이노시네이트, 5'-구아닐레이트 및 2'-데옥시-5'구아닐레이트 등이 포함된다.
2. 기질 특이성
뉴클레오사이드 트리포스페이트의 Υ-위치에서 포스페이트 그룹은 다른 뉴클레오사이드로 이전된다.
뉴클레오사이드 트리포스페이트의 예에는 ATP, 2'-데옥시아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 2'-데옥시구아노신 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트가 포함된다.
포스페이트 그룹이 이전되는 다른 뉴클레오사이드의 예에는 이노신, 구아노신 및 2'-데옥시구아노신이 포함된다.
3. 최적 pH
최적 pH는 7.7 내지 9.9이다.
4. pH 안정성
활성도는 6.7 내지 12.1의 pH 범위에서 안정하다.
5. 최적 온도
최적 온도는 30 내지 50℃이다.
6. 온도 안정성
효소는 40℃ 이상에서 불활성화된다.
7. 필요 금속
금속 이온은 반응을 진행시키는데 필요하다. 반응은 마그네슘 이온, 망간 이온, 코발트 이온 또는 철 이온의 존재하에 진행된다.
8. 금속 이온의 영향
효소의 활성은 구리 이온 및 수은 이온에 의해 강하게 억제되고 아연 이온 및 카드뮴 이온에 의해서도 또한 억제된다.
9. Km 값
Km 값은 구아노신이 기질로서 사용될 경우, 구아노신에 대하여 0.03mM, 이노신에 대하여 1mM 및 ATP에 대하여 1.6mM이다.
10. 분자량
효소의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 측정할 때 약 36킬로달톤이다.
이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 구조적 유전자를 함유하는 DNA 단편은 정제된 단백질을 사용하여 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 공지된 방법의 예에는 상기한 단백질에 대한 항체가 제조되고 염색체 유전자 발현 라이브러리가 스트리닝되는 방법 및 정제된 단백질의 아미노산 서열이 분석되고 염색체 라이브러리가 상기 아미노산 서열을 기본으로 하여 합성되는 프로브를 사용하여 스크리닝되는 방법이 포함된다. 아미노산 서열로서, 내부 아미노산 서열은 단백질의 N-말단 아미노산 서열외에, 단백질의 적합한 프로테나아제 소화에 의해 발생되는 폴리펩티드로부터 결정된다. 프로브의 예에는 N-말단 아미노산 서열 또는 내부 아미노산 서열을 기준으로 하여 합성되는 올리고뉴클레오타이드, 서열을 기준으로 하여 합성되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 폴리머라제 쇄 반응(PCR)을 통해 N-말단 아미노산 서열 또는 내부 아미노산 서열에 상응하는 영역을 증폭시켜 수득되는 것들 및 프라이머로서 N-말단 아미노산 서열 및 내부 아미노산 서열을 기준으로 하여 합성되는 올리고뉴클레오타이드를 사용하여 N-말단 내지 내부 아미노산의 부분에 상응하는 영역을 증폭시켜 수득되는 것들이 포함된다. 또한, 염색체를 카세트라 불리는 이본쇄 올리고뉴클레오타이드로 연결하고, 목적한 단편을 N-말단 아미노산 서열에 따라 형성된 올리고뉴클레오타이드의 프라이머 및 카세트 서열에 따라 형성된 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 수득되는 방법이 있다[참고: Molecular and Cellular Probes, 6, 467(1992)].
구체적으로, 엑시구아박테리움 아세틸리쿰의 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 유전자 암호화 단백질은 PCR을 사용하여 N-말단 영역에 상응하는 DNA 단편을 증폭시키고 DNA 단편을 기준으로 하는 프라이머를 합성하고 PCR을 사용하여 단편을 카세트와 함께 증폭시켜 수득할 수 있다.
엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953으로부터 수득된 단백질의 N-말단에서 28개 아미노산의 측정된 서열은 서열 리스트 중 서열 3으로 나타난다. 18번 아미노산은 동정할 수 없다.
이러한 N-말단 아미노산 서열로 미루어 보건데, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰은 WO 91/08286에 기술된 바와 같은 이. 콜라이로부터 유도된 공지된 이노신-구아노신과 매우 상이하다.
목적 유전자를 수득하기 위하여, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질의 N-말단 단백질을 암호화하는 DNA는 상기 언급한 N-말단 아미노산 서열에 근거하여 합성된 프라이머 및 주형으로서 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에 속하는 미생물의 염색체를 사용하여 PCR에 의해 증폭시키고 클론화한다. 염기 조성이 랜덤하고, G+C 함량이 약 50%이고, 특이 2차 구조가 생성되지 않고, 쇄가 서로 상보적이지 않으며, 길이가 16 내지 30개의 염기를 갖는 프라이머를 통상 사용한다. 프라이머의 서열은 단백질의 N-말단 영역에 상응하는 뉴클레오타이드 서열의 양 말단에 위치하고, 서열 리스트 중 서열 4 및 5에 나타내었다.
서열 4에서, 6번째 뉴클레오타이드는 T 및 C의 혼합물이고, 9번째 뉴클레오타이드는 A 및 G의 혼합물이고, 12번째 뉴클레오타이드는 T, C 및 A의 혼합물이고, 15번째 뉴클레오타이드는 T, C, A 및 G의 혼합물이다. 서열 5에서, 3번째 및 12번째 뉴클레오타이드는 T 및 C의 혼합물이고, 6번째 뉴클레오타이드는 T, C, A 및 G의 혼합물이고, 15번째 뉴클레오타이드는 A 및 G의 혼합물이다.
엑시구오박테리움 아세틸리쿰에 속하는 미생물의 염색체를 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 분해한다. 분해된 물질을 카세트로 연결시켜 주형을 형성시킨다. 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질의 구조 유전자 단백질 또는 업스트림 영역을 함유하는 DNA 단편을 카세트에 따라 합성된 프라이머 및 N-말단 아미노산 서열에 상응하는 뉴클레오타이드 서열에 따라 합성된 프라이머 및 상기 언급한 주형을 사용하여 증폭시키고 클론화한다. 서열 리스트 중 서열 6 및 7에 나타낸 바와 같은 상기 언급한 조건에 부합되는 프라이머를 사용할 수 있다.
숙주로서 사용되는 이. 콜라이에서 자동 복제 가능한 벡터를 유전자를 클론화하기 위한 벡터로서 사용할 수 있다. 벡터의 예는 pUC19, pHSG298, pHSG398 및 pBR322를 포함한다. 벡터의 복제에 적합한 임의의 균주를 생성된 재조합 DNA의 수용 균주로서 사용할 수 있다. 수용 균주의 예는 이. 콜라이 균주, 예를 들면, HB101, JM109 및 DH5를 포함한다.
벡터에 삽입된 DNA 단편에 존재하는 이노신-구아노신 키나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열 및 이러한 유전자에 의해 암호화되는 단백질의 아미노산 서열을 이러한 DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 분석하여 측정할 수 있다. 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953의 이노신-구아노신 키나제의 아미노산 서열 및 뉴클레오타이드 서열은 각각 서열 리스트 중 서열 1 및 2에 나타내었다.
본 발명의 단백질은 303개의 아미노산을 포함하고, 분자량은 약 32.5kd이다.
본 발명의 단백질은 서열 목록 중 서열 2에 나타낸 단백질 및 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에 속하는 기타 균주 및 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 기타 천연 돌연변이체로부터 수득된 단백질을 포함한다.
또한, 아미노산 서열의 한 부분이 치환되거나 결실된 단백질, 아미노산이 가해진 단백질 및 부분적으로 변형된 단백질이, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질인 한 사용될 수 있다는 것을 당해 분야의 숙련가들에게는 자명할 것이다.
엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로 부터 유도된 유전자대신에, 유전자를 하이브리드화할 수 있는 유전자가, 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자인 한 사용될 수 있다.
엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 유전자를 하이브리드화할 수 있는 유전자는 다음의 균주로부터 수득할 수 있다.
엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATCC 35652
쿠르티아 기브소니 ATCC 43195
쿠르티아 조프피 JCM 6101
상기에서 언급한 유전자는 상동성을 사용하여 공지된 방법에 의해 수득할 수 있다.
우선, 상기 언급한 미생물 중의 하나의 염색체 DNA를 적합한 제한 엔도뉴클레아제로 분해하고, 분해된 단편을 아가로스 겔 전기이동시킨다. 분해된 단편을 적합한 전이 필터상에 블롯팅한다. 상동 단편을 프로브로서 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자를 사용하여 서던 하이브리드화에 의해 검출하여 길이를 측정한다.
제한 엔도뉴클레아제로 분해된 단편 중에서, 목적 길이의 단편을 정제한다. 정제는 일반적으로는 슈크로즈 밀도 구배 원심분리 또는 유리 분말을 사용하는 아가로즈 겔로부터의 회수를 통해 수행한다. 정제된 단편을 적합한 벡터로 연결시키고, 이. 콜라이 균주를 수득된 재조합 벡터로 형질 전환시킨다. 이노신-구아노신 키나제 유전자를 갖는 목적 단편을 함유하는 클론을 콜로니 하이브리드 방법을 사용하여 생성된 형질 전환체로부터 선별할 수 있다.
본 발명에서, 공지된 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 신규한 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 상기 언급한 유전자 대신에 사용할 수 있다.
공지된 이노신-구아노신 키나제 유전자로서, 이. 콜라이로부터 유도된 유전자를 사용할 수 있으며[참조: J. Gen. Microbiol., 135, 1263-1273(1989); J. Bacteriol. 177, 2236-2240 (1995)], 예를 들면, 이. 콜라이 ATCC 27325로부터 수득할 수 있다.
이노신-구아노신 키나아제를 암호화하는 공지된 유전자는 공지된 방법을 사용하여 수득될 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자는 또한 하기의 방법을 사용하여 이. 콜라이 ATCC 27325의 cDNA로 부터 수득한다.
먼저 프라이머는 서열 기록(WO 91/08286)의 서열 10으로 대표되는 이. 콜라이로 부터 추출된 이노신-구아노신 키나제 유전자 서열에 의해서 합성된다. 일반적으로 염기 조성이 무작위적이고, G+C 함량이 액 50%이고, 특이적 2차 구조가 형성되지 않고, 쇄가 서로 상보적이지 않고, 길이가 15 내지 30 염기인 프라이머가 사용된다. 프라이머의 서열은 서열 11 및 12에서 나타낸 바대로 이노신-구아노신 키나제 구조 유전자의 양 말단에 위치한다.
그 후 이노신-구아노신 키나제 구조 유전자는 이러한 프라이머와 단일 개체를 사용하는 PCR 로 이. 콜라이의 cDNA로부터 증폭된다. 이. 콜라이로 부터 추출된 벡터, 예를 들면 pUC19 및 pBR322가 사용된다. 벡터의 복제에 적합한 수용 균주는 이로써 수득한 재조합 DNA로 사용될 수 있다. 이 수용 균주의 예는 이. 콜라이, 예를 들면 HB101, JM109 및 DH5를 포함한다. 이러한 방법으로 이. 콜라이의 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 DNA 단편의 삽입을 갖는 재조합 벡터를 수득한다.
이. 콜라이로 부터 추출한 상기 언급된 유전자와 동일하고, 하이브리드화 유전자일 수 있는 유전자는 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 한, 엑시구오박테리움 아세틸리컴으로 사용될 수 있다.
이노신-구아노신 키나아제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유하는 이와같이 수득한 DNA 단편은 그것을 다시 다른 적합한 벡터로 재조합하거나 복제 오리진을 삽입한 후에 ATP를 재생성할 수 있는 숙주 세포로 도입된다.
ATP를 재생성하고, ATP 전구체로 부터 반응으로 소모되는 충분한 능력(ATP-생성 능력)을 갖는 미생물이 숙주 세포로서 사용된다.
본 발명에 있어서, ATP-생성 능력을 갖는 미생물은 ATP를 재생성하고, 반응이 진행될 수 있는 반응 시스템 내의 ATP 전구체로 부터 이노신 및/또는 구아노신을 5'-이노신산 및/또는 5'-구아닐린산으로 전환시키는 반응에서 소모되는 능력을 갖는 어떤 미생물일 수 있다. 이러한 미생물의 예는 코리네박테리움, 에스케리키아, 스타필로코커스, 사카로마이세스 또는 캔디다 속의 미생물을 포함한다. 우수한 ATP 생성능을 갖는 코리네박테리움 암모니아게네스를 호함하는 미생물은 특히 바람직하다. 우연히 코리네박테리움 암모니아게네스는 이전에 브레비박테리움 암모니아게네스로 분류된다.
본 발명에서 사용된 우수한 ATP 생성능을 갖는 미생물의 특정 예는 하기에 나열한 균주와 이로부터 유도된 돌연변이체이다.
코리네박테리움 암모니아게네스(이전 명칭: 브레비박테리움 암모니아게네스) ATCC 6872
코리네박테리움 암모니아게네스(이전 명칭: 브레비박테리움 암모니아게네스) ATCC 21295
코리네박테리움 암모니아게네스(이전 명칭: 브레비박테리움 암모니아게네스) ATCC 21477
코리네박테리움 글루타미컴 ATCC 13020
코리네박테리움 글루타미컴(이전 명칭: 브레비박테리움 플라범) ATCC 14067
코리네박테리움 글루타미컴(이전 명칭: 브레비박테리움 플라범) ATCC 13869
에스케리키아 콜라이 B (ATCC 11303)
사카로마이세스 세레비지아에 ATCC 20018
스태필로코커스 아우레우스 ATCC 4012
캔디다 제일라노이데스 ATCC 20356
캔디다 사이크로필라 (이전 명칭: 톨루롭시스 사이크로필라) ATCC 22163
추가로 이노신 및/또는 구아노신의 분해 활성이 약하거나 불충분한 우수한 ATP 생성능을 갖는 미생물이 바람직하다. 하기의 미생물은 상기 언급된 미생물로 부터 후처리된다.
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21295
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477
본 발명의 ATP 생성 미생물로서, 이노신 또는 구아노신의 전구체로 부터 이오신 또는 구아노신을 생성하는 능력을 갖고, 또한 ATP 생성능을 갖는 균주는 또한 사용될 수 있다. 이 경우에 5'-이노신산 또는 5'-구아닐린산은 이노신 또는 구아노신 대신 이노신 구아노신 전구체로 부터 생성될 수 있다. 이러한 전구체의 예는 당류(예: 글루코스, 수크로스, 몰라스 및 전분 가수분해물), 유기산(예: 초산), 및 알콜(예: 글리세롤 및 에탄올)을 포함한다.
이노신 또는 구아노신을 생성할 수 있는 ATP-생성 균주는 하기를 포함한다.
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21478
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21479
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21480
이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 구성하는 벡터는 수용 균주인 ATP-생성 균주에서 복제될 수있는한 제한하진 않는다. 예를 들면 코리네박테리움 속에 속하는 세균이 ATP-생성 균주로 사용될 경우, 이러한 세균에서 자동적으로 복제되는 플라스미드는 언급되었다. 이의 특정 실시예는 pAM330(일본 특허 제67,699/1983호), pHM1519(일본 특허 제77,895/1983), pAJ655, pAJ611, pAJ1844(일본 특허 제192,900/1983), pCG1(일본 특허 제134,500/1982), pCG2(일본 특허 제35,197/1983), pCG4, pCG11(일본 특허 제183,799/1982), pGA1[Gene, 107, 69(1991)], pHK4 및 pHC4(일본 특허 제7,491/1993)을 포함한다. 에스케리키아 콜라이가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 예를들어 ColE1 플라스미드, P15A 플라스미드, R-인자 플라스미드, F-인자 플라스미드 및 파아지 플라스미드가 사용될 수 있다. 이의 특정 예는 pBR322[Gene, 2, 95(1977)], pUC19[Gene, 33, 103(1985)], pACYC184[J. Bacteriol, 134, 1141(1978)], 및 pSC101[Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 70, 3240(1973]을 포함한다. 사카로마이세스 세레비지애가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, YEp 플라스미드, YCp 플라스미드, YRp 플라스미드 및 YLp 플라스미드가 사용될 수 있다. 이의 특정 예는 YEp24, YRp7 및 YCp50을 포함한다. 스타필로코커스 아우레스가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, pRIT5[EMBO J., 4, 1075(1985)]가 사용될 수 있다.
높은 빈도수로 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 발현하기 위해 프로모터 서열 및 SD 서열이 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자의 업스트림에 위치되는 것이 바람직하다. 이들 서열이 오입되는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 프로모터 서열 및 SD 서열은 상기 언급된 유전자가 이들 서열을 가지는 벡터를 사용하여 이들 서열의 다운스트림에 삽입되는 방법 또는 이들 서열이 상기 언급된 유전자의 다운스트림에 합성되고 삽입되는 방법으로 도입될 수 있다. 프로모터 서열 및 SD 서열은 특별이 한정되지 않는다. 속 코리네박테리움의 세균이 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 이. 콜라이에서 유래하는 tac, lac 및 trp프로모터, 코리네박테리움속의 세균에서 유래하는 trp프로모터[Gene, 53, 191(1987)], fda 프로모터[Mol. Microbiol., 3, 1625(1989)], ppc 프로모터[Gene, 77, 237, (1989)], lysC 프로모터[Mol. Microbiol., 5, 1197(1991), gdh 프로모터[Mol. Microbiol., 6, 317(1992)], 및 cspl 및 csp2 프로모터(일본 공개 특허 공보 제502, 548/1994호)가 언급될 수 있다. 에스케리키아 콜 리가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 이. 콜라이에서 유래하는 tac, lac 및 trp 프로모터 및 λ파아지의 PL프로모터가 언급될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, ADH1, ENO1, PGK1, GAP-DH, GAL1, GAL10, GAL7, PH05 및 MFα1 프로모터가 언급될 수 있다. 스타필로코커스 아우레스가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, spa 프로모터[J. Bacteriol., 159, 713(1984)]가 언급될 수 있다.
이노신 및/또는 구아노신을 5'이노신산 및/또는 5'구아닐산으로 전환시키는 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA를 ATP 생산 균주로 도입하는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 유용한 방법으로 도입될 수 있다. 예를들어, 코리네박테리움속의 세균이 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 원형질 방법(일본 공개 특허 공보 제 183,799/1982호) 및 일렉트로포레이션(일본 공개 특허 공보 제207,791/1990호)이 특히 유효하다. 에스케리키아 콜라이가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 염화칼슘 방법[J. Mol. Biol., 53, 159(1970)], 하나한의 방법[J. Mol. Biol., 166, 557(1983)], SEM 방법[Gene, 96, 23(1990)], 청 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2172(1989)], 및 일렉트로포레이션[Nucleic Acids Res., 16, 6172(1988)]이 사용될 수 있다. 각각의 바시러스 서브티리스[Gene, 1, 153(1977)]에서 보고된 바와 같이 증식 단계에서 세포로부터 수용 세포를 제조함으로써 DNA가 도입되는 방법이 있다. 이와는 달리 각각의 바실러스 서브티리스, 액티노마이세테스 및 효모에서 보고된 바와 같이 DNA 수용 균주의 세포가 재조합 DNA가 용이하게 도입되는 원형질체 또는 스페로플라스트(spheroplast)로 형성되어 재조합 DNA가 상기 DNA 수용 균주로 도입되는 방법[Molec, Gen. Genet., 168, 111(1979), Nature, 274, 398(1978), and Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929(1978)]이 또한 사용될 수 있다. 사카로마이세스 세레비지애가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 재조합 DNA가 스페로플래스트 방법[Proc, Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75, 1929(1978)], 리튬 아세테이트 방법[J. Bateriol., 153, 163(1983)], 또는 일렉트로포레이션[Method in Enzymology, 194, 182(1991)]에 의해 도입될 수 있다. 스타필로코커스 아우레우스가 ATP 생산 균주로서 사용되는 경우, 재조합 DNA의 도입은 원형질 방법[Plasmid, 5, 292(1981)]에 의해 수행된다.
원형질 방법에서 바실러스 서브틸리스에서 사용되는 상기 언급된 방법에 의해 높은 빈도수가 수득될 수 있다. 하지만, 일본 공개 특허 공보 제183,799/1982호에서 기술된 바와 같이 코리네박테리움속에 속하는 세균 세포의 원형질체가 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 알콜중 하나 및 2가 금속 이온과 접촉하게 되는 상태에 DNA가 도입되는 방법이 또한 사용될 수 있다. DNA의 도입은 폴리에틸렌 글리콜 또는 폴리비닐 알콜 대신에 카복시메틸 셀룰로즈, 덱스트란, 피콜 또는 플루로닉(Serva Co에서 제조)을 첨가함으로써 증진될 수 있다.
재조합 DNA는 일렉트로포레이션 방법(일본 공개 특허 공보 제207,791/1991호)에의해 수용 균주로 도입될 수 있다. 본 발명의 실시예에서 사용되는 형질전환 방법은 일렉트로포레이션이다.
추가로, 이노신-구아노신 키나제 유전자는 ATP 생산 미생물의 염색체 DNA와 융합될 수 있다. 상기 유전자를 염색체 DNA로 융합시키는 방법은 특별히 한정되지 않는다. 예를 들어, 코리네박테리움 속의 세균에서 유래하는 온도 민감성 복제 오리진, 이노신-구아노신 키나제 유전자 및 클로로람페니콜과 같은 항생제에 대해 저항성을 부여하는 마아커가 플라스미드 벡터에 도입되어 재조합 DNA를 형성한다. 코리네박테리움 속의 세균은 상기 재조합 DNA로 형질전환된다. 형질전환체는 온도 민감성 복제 오리진이 작용하지 않는 온도에서 항생제를 포함하는 배지에서 배양되어 재조합 DNA가 염색체 DNA와 융합되는 형질전환체 균주를 형성한다[J. Bacteriol., 162, 1196(1985),and Japanese Patent Application Laid-Open No 7,491/1993]. 코리네박테리움 속의 세균에서 유래하는 이동성 유전 요소를 사용한 방법이 또한 사용될 수 있다[Movable Genetic Eliment, Academic Press, New York(1983), and WO 93/18151].
이노신-구아노신 키나제 활성은 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 포함하는 재조합 DNA가 도입되는 본 발명의 수득한 형질전환체를 탄소원, 질소원, 무기염 및 선택적으로 소량의 유기 영양물을 포함하는 통상적인 배지중에서 배양시켜 고농도로 발현될 수 있다.
탄소 공급원의 예는 사카라이드, 예를 들면, 글루코스, 슈크로즈, 당밀 및 전분 가수분해물; 유기산, 예를 들면, 아세트산 및 시트르산; 및 알콜, 예를 들면, 에탄올을 포함한다. 질소 공급원의 예는 우레아, 암모늄 염, 수성 암모니아 및 암모니아 기체르 포함한다. 무기염의 예는 인산염, 칼륨염, 마그네슘염, 철염 및 망간염을 포함한다. 트랜스 유기 영양물의 예는 아미노산, 비타민, 지방산 및 핵산 뿐만 아니라 펩톤, 효모 추출물 및 이들을 포함하는 대두 단백질 가수분해물을 포함한다.
배양은 pH를 5 내지 9로 유지시키면서 25 내지 37℃의 온도에서 10 내지 40 시간 동안 호기적으로 수행한다.
배양을 완결한 후에, 배양물중에 축적된 이노신-구아노신 키나제의 활성을 측정하여 적가를 확인한다. 활성은 초음파 처리 또는 프렌치-프레스 처리를 사용하는 원심분리 등을 통해 배양물로부터 회수한 세포를 분열시키고, 분열된 세포를 원심분리시켜 세포 잔사를 제거시킨 다음, 겔 투과를 통해 저분자량 물질을 제거시킴으로써 수득한 물질을 사용하는 문헌[참조: Molec. Gen. Genet. 143, 85-91(1975)]에 기재된 방법으로 측정할 수 있다.
이노신-구아노신 키나제를 암호화하고 ATP 전구체로부터 ATP를 생물학적으로 합성하는 능력을 갖는 유전자를 포함하는 미생물의 배양액, 이러한 배양액으로부터 분리된 세포, 또는 세포의 처리 생성물을 에너지 공급원의 존재하에 이노신 또는 구아니신 또는 이의 전구체와 접촉시킴으로써 반응 용액중에서 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 형성시킨다. 세포는 원심분리 등을 통해 배양액으로부터 분리시킨다. 세포의 처리된 생성물은 아세톤 처리된 세포, 고정화 세포, 분열 세포 등을 포함한다.
본 발명에서 바람직하게 사용되는 물질은 다음에 언급한다.
이노신 또는 구아니신의 전구체의 예는 사카라이드, 예를 들면, 글루코스, 슈크로즈, 당밀, 전분 가수분해물 등; 유기산, 예를 들면, 아세트산 등; 및 알콜, 예를 들면, 에탄올 등을 포함한다.
에너지 공급원 예는 사카라이드, 예를 들면, 글루코스, 슈크로즈, 전분 가수분해물 등; 유기산, 예를 들면, 아세트산, 시트르산 등; 및 알콜, 예를 들면, 에탄올 등을 포함한다.
인산염 그룹 공여체의 예는 무기 인산, 예를 들면, 오르토 인산, 피로인산, 폴리인산, 트리폴리인산, 폴리메타인산, 헥사메타인사산 등; 이들 무기산들의 염; 및 유기 인산, 예를 들면, 페닐 인산염, 아세틸 인산염, 카바밀 인산염 등을 포함한다.
반응 효율은 ATP 전구체, 계면활성제, 금속 이온 등을 반응 용액에 가함으로써 증진시킬 수 있다.
ATP 전구체의 예는 아데노신 이인산염, 아데닐산, 아데노신, 아뎨닌 무기산 염, 리보핵산 가수분해물 등을 포함한다.
계면활성제는 양이온성, 음이온성 또는 양쪽성 계면활성제를 포함하여 이노신 또는 구아노신의 포스포릴화를 증진시키도록 할 수 있다. 금속 이온의 예는 마그네슘 이온, 망간 이온 등을 포함한다.
이노신-구아노신 키나제 및 ATP 생성용 균주의 혼합물을 사용하는 통상적인 포스포릴화 반응에서, 일반적으로 반응 시스템에 유기 용매를 가한다.[참조: 일본 특허공개공보 제230,094/1988호 및 WO 제91/08286호]. 한편, 본 발명에서는, 반응은 반응 시스템에서 유기 용매가 생략된 경우에도 효과적으로 수행된다.
반응은 pH를 6 내지 8로 유지시키면서 25 내지 37℃의 온도에서 10 내지 30 시간 동안 호기성적으로 수행한다.
반응을 완결시킨 후에, 이온 교환처리, 결정화 등의 방법으로 반응 용액중에 축적된 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 회수할 수 있다.
본 발명은 다음 실시예를 참조로 하여 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 이러한 실시예로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1
이. 콜라이로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자를 발현시키고 동일한 것을 코리네박테리움 암모니아게네스로 도입시키기 위한 플라스미드의 작제
(1) PCR 및 이의 클로닝에 의한 이노신-구아니신 키나제의 증폭
DNA 합성기(모델 394, 제조원: Applied Biosystem Co.)를 사용하는 포스포르아미디트의 방법으로 서열 11 및 12에 나타낸 바와 같이, 각각 이. 콜라이 및 제한 엔도뉴클레아제 PstI 및 HindIII 절단 부위로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자의 5'- 및 3'-프랭킹 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.
프라이머로서 이들 올리고뉴클레오타이드 0.25㎍, 주형으로서 사이토 및 무라의 방법[Biochem. Biophys. Acta., 72, 619,(1963)]으로 제조한 이. 콜라이 W3110(ATCC 27325)의 염색체 DNA 0.1㎍ 및 타그 DNA 폴리머라제(제조원: Takara Shuz Co.)를 가하여 200μM dATP, 200μM dGTP, 200μM DTTP, 50mM 염화칼륨, 1.5mM 염화마그네슘 및 0.0001% 제라틴을 포함하는 10mM N-트리스(하이드록시메틸)메틸-2-아미노에탄(이후에는, 트리스라고 함)-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3) 0.1ml에 가한다. PCR은 3회의 온도 사이클, 즉 94℃에서 30초간, 55℃에서 30초간 및 72℃에서 30초간을 25회 반복하여 수행한다. 반응 용액을 에어로겔 전기영동 처리한 다음, 목적는 DNA 단편을 유리 분말(제조원: Takara Shuzo Co.)을 사용하여 회수한다. 이 DNA DIR 2μg, 엔도뉴클레아제 PstI 20 단위 및 HindIII 20 단위를 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륩 및 1mM 디티오트레이톨을 포함하는 50mM트리스-하이드로크로라이드 완충제(pH 7.5)와 혼합한 다음, 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. 이 분해물을 페놀로 추출하고 통상적인 방법으로 에탄올로 침전시킨다.
플라스미드 pHSG298(제조원: Takara Shuzo Co.) DNA 1μg, 제한 엔도뉴클레아제PstI 20단위 및 제한 뉴클레아제HindIII 20단위를 염화마그네슘 10mM, 염화나트륨 100mM 및 디티오트레이톨 1mM을 함유하는 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7,5) 50mM과 혼합시키고, 이 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 배양을 종결시킨 후, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 통상적인 방법으로 에탄올로 침전시켜PstI 및HindIII으로 분해된 플라스미드 pHSG298을 수득한다. 이와 같이PstI 및HindIII으로 분해된 플라스미드 pHSG298 0.1μg,PstI 및HindIII으로 분해된 PCR-증폭된 단편 0.5μg 및 T4 DNA리가제 1단위를 염화마그네슘 6.6mM, 디티오트레이톨 10mM 및 ATP 10mM를 함유하는 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5) 66mM에 가하고, 생성된 혼합물을 16℃에서 8시간 동안 배양하여 DNA를 연결시킨다. 후속적으로, 이. 콜라이(E. coli) JM109[제조원: Takara Shuzo CO.]를 상기 DNA 혼합물을 사용하여 통상적인 방법으로 형질전환시키고, 카나마이신 100μg/ml를 함유하는 L-아가 플레이트 배지에서 배양시켜 형질전환체를 수득한다.
플라스미드를 상기와 같이 수득한 형질전환체로부터 문헌에 기재된 알칼리 분해 방법에 의해 추출[참조: Molecular Cloning 2nd edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour, Laboratory Press, p. 1.25(1989)]하고, 통상적인 방법으로 아가로즈 겔 전기영동시킨다. 이노신-구아노신 키나제 유전자가 플라스미드 pHSG298로 삽입되는 재조합 플라스미드를 선택한다. 이러한 플라스미드를 pIGK-1로 지칭한다.
(2) 이. 콜라이의 trp 프로모터의 삽입
서열 13에 나타낸 바와 같이 5'- 및 3'- 말단에 각각 제한 엔도뉴클레아제BamHI 및PstI 분해 부위를 갖는 올리고뉴클레오타이드와, 상보성 서열을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 각각 1μg의 함량으로 이들 올리고뉴클레오타이드를 혼합하고 100℃에서 5분 동안 처리한 다음 서서히 냉각시켜 어닐링시킨다. 이러한 올리고뉴클레오타이드 용액과BamHI 20단위를 염화마그네슘 10mM, 염화칼륨 100mM 및 디티오트레이톨 1mM을 함유하는 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.5) 20mM과 혼합시키고, 이 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양한다. 생성된 분해물을 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 이와 같이 수득된 침전물을 (1)에서와 동일한 방법으로PstI로 분해시킨 후, 분해물을 페놀로 추출하고, 추출물을 에탄올로 침전시켜 이. 콜라이의 trp 프로모터를 함유하고BamHI 및PstI로 분해된 DNA 단편을 수득한다.
(1)에서 수득된 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 재조합 플라스미드 pIGK-1 1μg 역시BamHI 및PstI로 분해된다. 반응 용액을 페놀로 추출하고 통상적인 방법으로 에탄올로 침전시켜BamHI 및PstI로 분해된 플라스미드를 수득한다.BamHI 및PstI로 분해된 pIGK-1 0.1μg,BamHI 및PstI로 분해된 상기 수득한 단편 0.5μm 및 T4 DNA 리가제[제조원: Takara Shuzo CO.] 1단위를 염화마그네슘 6.6mM, 디티오트레이톨 10mM 및 ATP 10mM를 함유하는 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5) 66mM에 가하고, 생성된 혼합물을 16℃에서 8시간 동안 배양하여 DNA를 연결시킨다. 후속적으로, 이. 콜라이 JM109[제조원: Takara Shuzo CO.]를 상기 DNA 혼합물을 사용하여 형질전환시키고, 가나마이신 100μg/ml를 함유하는 L-한천 평판 배지에서 배양시켜 형질전환체를 수득한다.
플라스미드를 상기와 같이 수득한 형질전환체로부터 알칼리 분해 방법에 의해 추출하고, 통상적인 방법으로 아가로즈 겔 전기영동시켜 이. 콜라이 trp 프로모터가 플라스미드 pIGK-1에 삽입되는 재조합 플라스미드를 선택한다. 이러한 플라스미드를 pIGK-2로 지칭한다.
(3) 코리네박테리움으로부터 유도된 복제 오리진의 삽입
(2)에서 수득된 이노신-구아노신 키나제 유전자 및 trp 프로모터를 함유하는 재조합 플라스미드 pIGK-2 1μg을 (2)에서와 동일한 방법으로BamHI로 분해시키고, 분해물을 페놀로 추출하고, 추출물을 에탄올로 침전시킨다. 재결합을 방지하기 위해,BamHI로 분해된 플라스미드 pIGK-2를 문헌에 기재된 방법에 따라 박테리아성 알칼리 포스페이타제를 사용하여 처리함으로써 DNA 분획을 탈인산화시킨다[참조: Molecular Cloning 2nd edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour, Laboratory Press, p. 1.60(1989)].
한편, 코리네박테리움 글루타미쿰(Corynebacterium glutamicum)으로부터 유도된 복제 오리진 영역을 pHSG399[제조원: Takara Shuzo CO.]에 삽입시켜 수득한 플라스미드 pHC4(일본국 공개특허공보 7,491/1993) 1μg 및 제한 엔도뉴클레아제KpnI 10단위를 염화마그네슘 10mM 및 디티오트레이톨 1mM를 함유하는 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5) 10mM에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 배양시킨다. 반응 용액을 페놀로 추출하고, 추출물을 통상적인 방법으로 에탄올로 침전시킨다. KpnI으로 분해된 pHC4의 말단을 DNA 평활말단화 키트[제조원: Takara Shuzo CO.]를 사용하여 전술한 방법에 의해 평활말단화한다. 인산화BamHI 연결제[제조원: Takara Shuzo CO.]를 T4 폴리뉴클레오타이드 리가제를 사용하여 상기 플라스미드에 연결시켜 코리네박테리움 글루타미쿰으로부터 유도된 플라스미드 복제 오리진을 함유하는 영역의 양쪽에BamHI 분해 부위를 갖는 DNA 분획을 수득한다. 이러한 DNA 분획 및BamHI 20단위를 (2)에서 사용된 것과 동일한 완충액에서 혼합시키고, 생성된 혼합물을 30℃에서 2시간 동안 항온처리한다. 반응 용액을 페놀로 추출하고, 추출물을 에탄올로 침전시킨다.
BamHI로 분해된 상기 수득한 pIGK-2 0.1μg,BamHI로 분해된 플라스미드 pHC4로부터 유도된 DNA 단편 0.2μg 및 T4 DNA리가제[제조원: Takara Shuzo CO.] 1단위를 (1)에서 사용된 것과 동일한 완충액에 혼합시킨다. 생성된 혼합물을 16℃에서 8시간 동안 항온처리하여 DNA를 연결시킨다. 후속적으로, 이. 콜라이 JM109[제조원: Takara Shuzo CO.]를 상기 DNA 혼합물을 사용하여 형질전환시키고, 가나마이신 100μg/ml를 함유하는 L-아가 플레이트 배지에서 항온처리하여 형질전환체를 수득한다.
플라스미드를 상기와 같이 수득한 형질전환체로부터 알칼리 분해 방법에 의해 추출하고, 통상적인 방법으로 아가로즈 겔 전기영동시켜 코리네박테리움 내에 자율적으로 복제 가능한 DNA 단편이 플라스미드 pIGK-2에 삽입되는 재조합 플라스미드를 선택한다. 이러한 플라스미드를 pIGK-3으로 지칭한다.
플라스미드 pHC4를 함유하는 이. 콜라이 AJ 12617은 1991sus 4월 24일에 기탁번호 제FERM P-12215호로, 기탁기관(the National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan)에 기탁되었다.
(4) pIGK-3의 코라인박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477로의 도입
(3)에서 수득한 pIGK-3 0.1㎍을 일렉트로포레이션을 사용하는 통상적인 형질전환 방법으로써 코라인박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477로 도입한다(일본 공개 특허원 제207,791호/1990). 세포는 펩톤 1%, 효모 추출물 1%, 염화나트륨 0.5%, 글루코스 0.5% 및 가나마이신 50㎍/㎖를 포함하는 아가 플레이트 배지위에 접종하여 형질전환 ATCC 21477/pIGK-3을 수득한다.
(5) 형질전환체의 이노신-구아노신 키나제 활성의 측정
(4)에서 수득한 코라인박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477/pIGK-3을, 폴리펩톤 1%, 이스트 추출물 1%, 글루코스 5%, 이수소인산칼륨 0.4%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 우레아 0.5%, 황산철 0.001%, 황산마그네슘 0.001%, 염산트리아민 0.005g/ℓ, 칼슘 판토테네이트 0.01g/ℓ, 비오틴 30㎍, 아데닌 0.05% 및 가나마이신 50㎎/ℓ를 포함하는 배지(pH 7.2) 50㎖에 접종하고, 32℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양액을 통상적인 방법으로 원심분리하고 세포를 수집한다.
염화나트륨 용액 0.9%에 세포를 현탁시키고, 현탁액을 원심분리하는 단계를 2번 반복하여 세포를 세척한다. 수득한 세포를 글리세롤 20%, 염화칼륨 100mM 및 2-메타캡토에탄올 5mM을 포함하는 트리스-염산 완충액(pH 7.9)에 현탁시키고, 현탁액을 구토바(Kutoba) K. K.에서 제조한 장치를 사용하여 150W에서 20분 동안 초음파처리한다. 이와 같이 처리한 현탁액을 15,000rpm에서 30분 동안 원심분리하여 상층액을 수득한다. 이 상층액을 세파덱스(Sepadex) G-15 칼럼(파마시아 컴퍼니에서 제조함)을 사용하여 칼럼 크로마토그래피시켜 저분자량 물질을 제거하고, 수득한 용액을 조 효소액으로서 사용한다.
수득한 조 효소액의 이노신-구아노신 키나제 활성을 트리스 100mM, 염화마그네슘 10mM, ATP 1mM, 염화칼륨 250mM 및 [8-18C]-이노신을 포함하는 반응 혼합물에서 측정한다. 조 효소액을 반응 혼합물에 첨가하고, 30℃에서 30분 동안 접종한다. 반응 혼합물의 일부를 실리카 겔 플레이트(머크 컴퍼니에서 제조함)에 찍어 반응을 종결시키고, n-부탄올, 에탄올 및 물을 용적비 2:1:1로 포함하는 용출액으로 전개한다. 5'-이노신산의 점을 검출하고 바이오-이미지 분석기(푸지 포토 필름 컴퍼니에서 제조함)를 사용하여 측정한다. 조 효소액의 단백질 농도를 표준물로서 보바인 세륨 알부민을 사용하여 프로테인 분석 키트(바이오-라드 캄파니에서 제조함)에 의해서 측정하고, 효소의 특정 활성 계산한다. 대조 표준으로서, ATCC 21477/pHK4의 특정 활동도, 즉 플라스미드 pHK4를 사용한 형질전환을 측정한다. 결과를 표 1에 나타낸다. 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477/pIGK-3은 활성이 높은 수준인 반면, ATCC 21477/pHK4의 활성은 검출되지 않는다. 이들 결과로부터, 이. 콜라이로부터 유도된 도입된 유전자는 코리네박테리움 암모니아게네스에서 이노신-구아노신 키나제 활성을 나타낸다.
플라스미드 pHK4는 trp 프로모터 및 이오신-구아노신 키나제 유전자가 pIGK-3으로부터 제거되는 구조를 갖고, 대조 표준으로 사용된다.
이. 콜라이에서 균주 함유 pHK4는 기탁번호 제AJ 13136호로 지정되고, 기탁기관(the National Institute of Bioscience and Human Technology of the Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japan)에 기탁번호 제FERM BP-5186호로 부다페스트 조약하에 1995년 8월 1일에 기탁되었다.
균주 특정 활성(nmol/분/mg·단백질)
ATCC 21477/pHK4ATCC 21477/pIGK-3 검출되지 않음186.6
실시예 2
이. 콜라이로부터 기원한 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 균주를 사용한 이노신으로부터 5'-이소신산의 제조
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477/pIGK-3을 폴리펩톤 1%, 이스트 추출물 1%, 글루코스 5%, 인산이수소 칼륨 0.4%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.55, 우레아 0.5%, 황산철 0.001%, 황산마그네슘 0.001%, 염산 티아민 0.001%, 칼슘 판토티네이트 0.01g/ℓ, 바이오틴 30㎍/ℓ, 아데닌 0.05% 및 가나마이신 50mg/ℓ를 포함한 매질(pH 7.2) 450㎖DP 접종하고, 32℃에서 24시간 동안 배양한다. 이 배양액을 7,000rpm에서 10분 동안 원심분리하여 침전물로서 습식 세포 20g을 수득한다.
이와 같이 수득된 세포를 이노신 50g/ℓ, 인산이수소칼륨 20g/ℓ, 황산마그네슘 5g/ℓ, 파이트산(중량비 50%) 10g/ℓ, 나이민(Nymeen) S-215 4g/ℓ 및 아데닌 1g/ℓ를 포함하는 반응 용액(pH 7.2) 20㎖에 200g/ℓ의 양으로 형탁시킨다. 이 혼합물을 32℃에서 교반하면서 접종한다. pH를 4N 염화나트륨을 사용하여 한 번에 7.2로 조정하고, 인산이수소칼륨의 감소된 양을 반응 혼합물에 첨가한다. 반응을 대조 표준으로서 ATCC 21477/pHK4를 사용하여 수행한다. 반응 30시간 후, 반응 용액 중의 5'-이노신산의 양을 고성능 액체 크로마토그래피로 측정한다. 결과를 표 2에 나타낸다. 축척된 5'-이노신산의 양을 이나트륨 5'-이노시에이트 7.5-수화물에 대하여 나타낸다. 이 결과로부터, 이노신이 이. 콜라이로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 기탁번호 제ATCC 21477호의 pIGK-3에 의해서 5'-이노신산으로 전환된다는 것이 밝혀졌다.
균주 축적된 5'-이노신산의 양(g/ℓ)
ATCC 21477/pHK4ATCC 21477/pIGK-3 검출되지 않음72.9
실시예 3
이. 콜라이로부터 기원하는 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 균주를 사용한 이노신으로부터 5'-이노신산의 제조방법
실시예 2에서 수득한 세포를 이노신 60g/l, 인산 이수소 칼륨 20g/l, 글루코오즈 30g/l, 황산마그네슘 5g/l, 피트산 10g/l(중량비 50%), 니민 S-215 4g/l 및 아데닌 1g/l를 함유하는 반응 용액(pH 7.2) 50ml에 200g/l의 양으로 현탁시킨다. 생성된 혼합물을 32℃에서 호기성 교반하여 배양한다. 반응 동안 pH 메터에 의해 모니터링하여 4N 수산화나트륨을 사용해서 pH를 7.2로 조정하고 반응 혼합물에 인산 이수소칼륨을 감소량으로 가한다. 반응을 시작한지 22시간 후에, 5'-이노신산의 축적량은 113.8g/l이고, 첨가된 이노신을 기준으로 한 이의 몰 수율은 대략 100%이다.
실시예 4
이. 콜라이로부터 기원하는 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 균주를 사용한 구아노신으로부터 5'-구아닐산의 제조방법
반응 용액 중의 이노신 대신에 구아노신 1g/l를 사용하는 것을 제외하고는 반응을 실시예 2와 동일한 방식으로 반응을 수행한다. 반응을 시작한지 30시간 후에 반응 혼합물 중의 5'-구아닐산의 양을 고성능 액체 크로마토그라피로 측정한다. 그 결과, ATCC 21477/pIGK-3을 사용한 반응 혼합물 중의 이나트륨 5'-구아닐레이트 6.5수화물로서 계산하여, 5'-구아닐산이 0.05g/l 축적되었다.
실시예 5
엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터의 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질의 정제 및 이의 특성
(1) 세포 및 조효소 추출물의 제조
엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953을 폴리펩톤 1%, 박토 이스트 추출물 1%, 글루코오즈 0.5% 및 염화나트륨 0.5%를 함유하는 배지(pH 7.2) 100ml 속에서 접종하고 30℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양물을 상기한 배지 2l 속에서 접종하고 30℃에서 8시간 동안 배양한다. 수득된 배양물을 7,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 침전물을 0.9% 염화나트륨으로 2회 세척하여 습윤 세포 10g을 수득한다. 세포를 100mM 염화칼슘 및 1mM 디티오트레이톨(완충액 A)을 함유하는 100mM 트리스-염화수소 완충액 (pH 7.5) 10ml 속에 현탁시키고 직경이 0.1mm인 유리 비드를 사용하는 비드 비터(바이오스펙 캄파니 제품)를 사용하여 밀링시킨다. 현탁액을 15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 상기한 완충액에 대해 투석시켜 조효소 추출물을 대략 20ml 수득한다.
조효소 추출물의 이노신-구아노신 키나제 활성은 다음 방법으로 측정한다. 조효소 추출물 5μl를 5mM 염화마그네슘, 5mM ATP, 100mM 염화칼슘 및 0.2mM [8-14C]-이노신을 함유하는 100mM 트리스-염화수소 완충액 (pH 7.5) 50μl에 가한다. 반응 혼합물을 30℃에서 30분 동안 항온처리한다. 반응 혼합물 2μl를 실리카-겔 플레이트(머크 캄파니에 의해 제조됨)에 스포팅하여 반응을 종결하고 n-부탄올, 에탄올 및 물을 용량비 2:1:1로 함유하는 용출제로 전개시킨다. 5'-이노신산의 스폿을 검출하고 바이오-이메이지 분석기(후지 포토 필름 캄파니 제품)를 사용하여 5'-이노신산의 양을 측정한다. 조효소 용액중의 단백질의 농도를 표준물로서 소 혈청 알부민을 사용한 단백질 분석표(바이오-래드 캄파니 제품)를 사용하여 측정하고 효소의 특이활성을 계산한다. 조효소 추출물의 이노신-구아노신 키나제 활성은 0.45nmol/분/mg 단백질이다.
(2) 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질의 정제
(1)에서 수득한 조 추출물을 완충액 A로 평형화된 DEAE-토요펄 칼럼(토소 캄파니 제품)에 도말한다. 완충액 A로 세척한 후, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 200mM 염화칼슘을 함유하는 완충액 A로 용출한다. 수득된 활성 분획 25ml에 황산 암모늄을 가하여 30% 포화도에 이르게 한다. 혼합물을 4℃에서 30분 동안 교반한 후, 원심분리하여 침전물을 제거한다. 수득한 상청액을 30% 황산 암모늄을 함유하는 완충액 A로 평형화된 부틸-토요펄 칼럼(토소 캄파니 제품)에 도말한다. 완충액 A로 세척한 후, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 황산 암모늄을 15 내지 30% 함유하는 완충액 A 200ml의 선형 농도 구배를 사용하여 용출한다. 생성된 활성 분획 약 15ml를 50mM 염화칼슘, 1mM 디티오트레이톨 및 20% 글리세롤을 함유하는 25mM 트리스-염화수소 완충액 (pH 7.5)(완충액 B) 2μl에 대해 투석한다.
당해 용액을 15,000rpm에서 10분 동안 원심분리하고 생성된 상층액을 100mM 염화칼륨을 함유하는 완충액 B를 사용하여 평형화시킨 MonoQ FPLC HR5/5(파르마시아 코포레이션의 제품) 칼럼에 적용한다. 완충액 B를 세척한 후, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질은 100mM 내지 500mM의 황산암모늄의 직선 농도 구배를 이용하여 평가한다. 이와 같이 수득된 활성 분획을 1mM 디티오트레이톨 및 20% 글리세롤(완충액 C)을 함유하는 10mM 인산칼륨 완충액(pH 7.4) 2ℓ에 대해 투석하고, 상기 언급된 완충액을 사용하여 평형화시킨 하이트록실라파티트 TSK-GEL HA-100(토소 코포레이션의 제품) 칼럼에 적용한다. 상기 완충액을 세척한 후, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질은 10mM 내지 500mM의 인산칼륨을 함유하는 완충액 C 30ml의 직선 농도 구배를 이용하여 평가한다.
이와 같이 수득된 활성 분획 약 6ml를 각각 하이드록실라파티트 칼럼에 적용하고 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질은 10mM 내지 200mM 인산칼륨을 함유하는 완충액 C 30ml의 직선 농도 구배를 이용하여 평가한다. 이와 같이 수득된 활성 분획중에서 활성이 높은 분획 2mml를 1mM 디티오트레이톨, 20% 글리세롤 및 100mM 염화칼륨을 함유하는 25mM 트리스-하이드로클러라이드 완충액 (pH 7.5)으로 평형화시킨 겔 여과 Hiload Superdex 200pg 16/60 (파르마시아 코포레이션의 제품) 칼럼에 적용하고 상기 완충액을 이용하여 평가한다. 활성이 높은 분획 2ml중 5㎕를 SDS 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분해시킨다. 그 결과, 분자량이 대략 36킬로달톤인 단백질을 은 오염 (나칼라이 테스퀴 코포레이션)에 의해 검출한다. 따라서, 엑시구오박테리륨 아세틸리컴으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제의 활성를 갖는 단백질을 정제하고, 이의 분자량은 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동 분해에 의해 측정한 바와 같은 36킬로달톤으로 밝혀졌다.
(3) 엑시구오박테리움 아세틸리컴으로부터 기원한 이노신-구아노신 키나제의 특성
정제된 이노신-구아노신 키나제를 5mM 염화마그네슘, 5mM ATP, 100mM 염화칼륨, 0.16mM 구아노신 및 0.04 mM [8-14C]-구아노신을 함유하는 100mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액 (pH 7.5)에 가한다. 당해 반응 혼합물 50㎕를 염기성 조성물로서 사용하고 반응을 30℃에서 10분 동안 수행한다. 효소는 다음 특성을 갖는다.
1. 작용
효소는 포스페이트 공여체로서 ATP, 2＇-데옥시아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 2＇-데옥시구아노신 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 이용하여 구아노신, 이노신 및 2＇-데옥시구아노신으로 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오사이드에 포스페이트 그룹을 이동시키고 5＇-구아닐레이트, 5＇-이노신에이트 및 2＇-데옥시-5＇-구아닐레이트로 각각 이루어진 그룹으로부터 선택된 뉴클레오사이드의 5＇-모노포스페이트를 형성한다.
2. 기질 특이성
반응은 구아노신 대신에 각각 여러 종류의 뉴클레오사이드 0.5mM 및 ATP 대신에 [γ-32P]-ATP를 사용하여 수행한다. 이와 같이 형성된 뉴클레오사이드 5＇-포스페이트를 측정한다. 결과는 표 3에 나타냈다. 구아노신, 이노신 및 2＇-데옥시구아노신을 포스페이트 수용체로서 사용한다.
뉴클레오사이드 (0.5mM) 비교 활성 (%)
구아노신 100
2＇-데옥시구아노신 4
이노신 5
크산토신 0
아데노신 0
2＇-데옥시아데노신 0
반응은 ATP 대신에 각각 다양한 뉴클레오사이드 트리포스페이트를 사용하여 수행하고 가능한 포스페이트 공여체를 평가한다. 결과는 표 4에 나타냈다.
ATP 이외에, 2＇-데옥시아데노신 트리포스페이트, 구아노신 트리포스페이트, 2＇-데옥시구아노신 트리포스페이트 및 티미딘 트리포스페이트를 포스페이트 공여체로서 사용한다.
뉴클레오사이드 트리포스페이트(5mM) 비교 활성 (%)
아데노신 트리포스페이트 100
2＇-데옥시아데노신 트리포스페이트 71
구아노신 트리포스페이트 59
2＇-데옥시구아노신 트리포스페이트 61
사이티딘 트리포스페이트 6
우리딘 트리포스페이트 4
티미딘 트리포스페이트 35
첨가하지 않음 0
3. 최적 pH
반응은 완충액을 100mM 나트륨 아세테이트-아세트산 완충액(pH 4.2-5.6), 2-모르포린에탄설폰산(이하, MES로서 언급됨)-수산화나트륨 완충액(pH 5.4-6.3), 3-모르포린프로판설폰산(MOPS)-수산화나트륨 완충액(pH 7.2-8.8), 사이클로헥실아미노프로판설폰산(이하, CAPS로서 언급됨)-수산화나트륨 완충액(pH 8.8-10.4) 또는 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 10.3-11.0)으로 변화시켜 수행한다. 최적의 pH는 7.7 내지 9.9이다.
4. pH 안정성
효소를 실온에서 250mM 나트륨 아세테이트-아세트산 완충액(pH 1.5-5.6), MES-수산화나트륨 완충액(pH 5.4-6.4), MOPS-수산화나트륨 완충액(pH 6.3-7.3), 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.2-8.8), CAPS-수산화나트륨 완충액(pH 8.9-10.4) 또는 글리신-수산화나트륨 완충액(pH 10.5-13.3)으로 30분 동안 처리하는데, 각각의 완충액은 소 혈청 알부민 2.5mg/ml, 25mM 염화칼륨, 0.25mM 디티오트레이톨 및 5% 글리세롤을 함유한다. 이어서, 효소의 활성을 측정한다. 그 결과, 효소의 활성은 pH 6.7 내지 12.1의 범위에서 안정하다.
5.최적 온도
16 내지 60℃의 온도 범위 내에서 반응을 수행한다. 그 결과, 최적 온도는 30 내지 50℃이다.
6. 온도 안정성
4 내지 60℃에서 소의 혈청 알부민 5mg/ml, 50mM 염화칼륨, 0.5mM 디티오트레이톨 및 10% 글리세롤을 함유하는 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5)로 효소를 처리하고, 효소의 잔류 활성을 측정한다. 50% 이상의 활성이 25℃ 이하의 온도에서 처리시에 유지되고 효소는 40℃ 이상의 온도에서는 탈활성화된다.
7. 금속 조건
반응 용액 속에서 염화마그네슘을 각종 금속 이온으로 바꾸어 반응을 수행한다. 결과를 표 5에 나타낸다. 금속 이온이 활성에 필요하고, 반응은 마그네슘 이온보다도 망간 이온, 코발트 이온 및 철 이온에 의해 진행된다.
금속 염(5mM) 상대 활성(%)
가하지 않음 1
MgCl2·6H2O 100
MgCl2·4H2O 55
ZnCl2 1
NiCl2·6H2O 1
CaCl2·2H2O 1
CoCl2·6H2O 36
MgSO2·7H2O 107
FeSO2·7H2O 24
8. 금속 이온의 효과
반응 혼합물 속에 각종 금속 이온이 1mM 존재하는 경우 효소의 상대 활성을 표 6에 나타낸다. 효소는 구리 이온과 수은 이온에 의해 강하게 억제되고 아연 이온과 카드뮴 이온에 의해서도 억제된다.
금속 이온(1mM) 상대 점도(%)
가하지 않음 100
MnCl2·4H2O 81
ZnCl2 58
NiCl2·6H2O 113
CaCl2·2H2O 71
CoCl2·6H2O 103
BaCl2 106
CuCl2·2H2O 25
CdCl2 43
HgCl2 22
MgSO4·7H2O 110
FeSO4·7H2O 95
9. Km값
반응 조성물의 기질 농도를 변화시킴으로써 측정된 효소의 Km값은 구아노신을 기질로서 사용하는 경우, 0.03mM 구아노신, 1mM 이노신 및 1.6mM ATP 이다.
10. 분자량
효소는 SDS-폴리아크릴아미드 겔 엘렉트로포르시스로 측정한 바에 의하면 약 36킬로달톤이다.
실시예 6
엑시구오박테리아 아세틸리쿰의 염색체로부터 유전자의 분리
(1) N-말단 아미노산의 서열 측정
실시예 5(2)로부터 수득한 활성 분획 약 2ml를 센트리콘-10(아미콘 캄파니에서 제조)을 사용하여 3시간 동안 6,000rpm에서 원심분리를 통해 약 0.2ml로 농축시킨다. 단백질을 프로스핀(바이오시스템 캄파니에서 제조)을 사용한 원심분히를 통해 여액을 블롯한다. 여액을 20% 메탄올로 3회 세척한 후, 건조시킨다. N-말단 아미노산 서열을 단백질 서열기 476A(바이오시스템 캄파니에서 제조)를 사용하여 측정한다. 측정된 아미노산 서열을 서열 리스트에 서열 3으로 나타낸다. 서열 리스트에서 Xaa는 미확인 아미노산이다. N-말단에 하나의 미확인 아미노산을 포함하여 28개의 아미노산을 측정한다.
(2) 엑시구오박테리아 아세틸리쿰의 염색체 DNA의 제조 및 N-말단 영역의 확장
엑시구오박테리아 아세틸리쿰 ATCC 953의 습윤 세포 3g을 실시예 5(1)에서와 동일한 방식으로 배양액 500ml로부터 수득한다. 염색체 DNA를 사이토와 미우라법[Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)]에 의해 세포로부터 추출한다.
(1)에서 수득한 N-말단 아미노산 서열에 따라서, 올리고뉴클레오타이드를 합성한다. 올리고뉴클레오타이드 서열에 있어서, 서열 4 및 5로 나타낸 올리고뉴클레오타이드의 혼합물을 코돈의 변성을 고려하여 사용한다.
프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 0.25μmol, 주형으로서 엑시구오박테리아 아세틸리쿰의 염색체 DNA 0.1μg 및 taq DNA 폴리머라제 2.5단위(다카라 수조 캄파니 제조)를 dATP 200μM, dCTP 200μM, dTTP 200μM, 염화칼륨 50mM, 염화마그네슘 1.5mM 및 젤라틴 0.0001%를 함유하는 10mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3) 0.1ml에 가한다. PCR을 3온도 주기, 즉 94℃에서 30초 동안, 55℃에서 30초 동안 및 72℃에서 1분 동안 30회 반복한다. 반응 용액을 아가로즈 겔 일렉트로포르시스에 적용하고, 약 80개의 염기 길이를 갖는 확장된 DNA 단편을 유리 분말(다카라 수조 캄파니에서 제조)을 사용하여 회수한다. 이 DNA 단편 약 0.2μg을 클레나우 단편 2단위, dATP 200μM, dCTP 200μM, dGTP 200μM, dTTP 200μM, 1mM 20머캅토에탄올 및 7mM 염화마그네슘을 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5) 50μl에 가한다. 혼합물을 37℃에서 30분 동안 블런팅 반응시킨다. 반응 용액을 페놀로 추출하고, 추출액을 에탄올로 침전시킨다. 이렇게 침전시킨 블련트 말단을 갖는 DNA 단편을 T4 폴리누클레오타이드 키나제 10단위, 10mM 염화마그네슘, 5mM 디티오트레이톨, 0.1mM 스퍼미딘 및 0.1mM EDTA를 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.6)에 용해시키고 37℃에서 1시간 동안 말단을 포스포릴화하는 반응을 수행한다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고, 추출액을 에탄올로 침전시킨다. 포스포릴화된 평활 말단을 갖는 PCR 생성물을 침전물로서 회수한다.
플라스미드 벡터 pUC18(제조원: 다카라 쓰조 캄파니) 1μg과 제한 엔도뉴클레아제SmaI 20단위를 10mM 아세트산마그네슘, 66mM 아세트산칼륨, 0.5mM 디티오트레이톨 및 0.01% 소혈청 알부민을 함유하는 33mM 트리스-아세테이트 완충액(pH 9.9)와 혼합하고 혼합물을 30℃에서 2시간 항온처리하여 분해물을 수득한다. 이 소화물을 통상적인 방법으로 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 이어서 플라스미드 벡터에서 유래된 DNA 단편의 재결합을 막기 위해서 DNA 단편을 탈인산화한다. 생성된 단편을 통상적인 방법으로 페놀로 추출하고 에탄올로 침전화시킨다.
SmaI로 분해시킨 본 pUC18 0.1㎍, 인산화된 평활 말단을 갖는 PCR 생성물 0.1㎍ 및 T4 DNA 리가제(제조원: 다카라 쓰조 캄파니)를 6.6mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨 및 10mM ATP를 함유하는 66mM 트리스-염산염 완충액(pH 7.5) 20㎕를 가한다. 혼합물을 16℃에서 8시간 항온처리하여 DNA를 연결한다. 이어서, 이. 콜라이 JM109(제조원: 다카라 쓰조 캄파니)를 통상적인 방법으로 DNA 혼합물로 형질전환시키고 암피실린 100㎍/ml를 함유하는 L-아가 배지에 접종시켜 형질전환체를 수득한다.
플라스미드를 알칼리분해법으로 형질전환체로부터 추출한다.
염기가 약 80개의 DNA 단편이 함유된 플라스미드는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATTC 953의 염색체성 DNA에서 유래한다. DNA 단편의 뉴클레오타이드 서열을 이 플라스미드 DNA를 사용하여 결정한다. 뉴클레오타이드 서열의 결정은 택 다이데옥시 말단기 사이클 시퀀싱 킷(Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit, 제조원: 퍼킨 엘머 캄파니)을 사용하는 상거(Sanger)법[J. Mol. Biol., 143, 161(1980)]에 따라 실시한다. 따라서, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATTC 953의 이노신-구아노신 키나제의 N말단 부위에 상응하는 DNA의 83개 염기의 뉴클레오타이드 서열을 결정한다.
(3) 엑시구오박테리움 아세틸리쿰의 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자를 함유하는 DNA 단편의 분리
(2)에서 제조한 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATTC 953의 염색체 DNA 10μgDMFEcoRI 40단위, 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륨 및 1mM 디티오트레이톨을 함유하는 50mM 트리스-염삼염 완충액(pH 7.5)에 가하고 혼합물을 37℃에서 2시간 항온배양한다. 반응 혼합물을 통상적인 방법으로 페놀로 추출하고 에탄올로 침전화시켜EcoRI로 분해된 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATTC 953의 염색체 DNA를 수득한다.EcoRI로 분해시킨 이 DNA의 1μg,EcoRI 카셋트(제조원: 다카라 쓰조 캄파니) 0.05μg 및 T4 DNA 리가제 10단위를 6.6mM 염화마그네슘, 10mM 디티오트레이톨 및 10mM ATP를 함유하는 66mM 트리스-염산염 완충액(pH 7.5)에 가한다. 혼합물을 16℃에서 8시간 항온처리하여 DNA를 연결한다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 추출물을 에탄올로 침전시켜EcoRI 카셋트로 연결된 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATTC 953의 염색체 DNA를 수득한다.
서열 6 및 7로 나타낸 뉴클레오타이드 서열을 갖는 올리소뉴클레오타이드 S1 및 S2를 (2)에서 결정된 서열에 따라 합성한다.
프라이머로서 올리고뉴크 뉴클레오타이드 0.2μmol과 카셋트 프라이머 C1(제조원: 다카라 쓰조 캄파니) 0.2μmol, 주형으로서EcoRI 카셋트로 연결시킨 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATTC 953의 염색체 DNA 소화물 0.2μg 및 택 DNA 폴리머라제(제조원: 다카라 쓰조 캄파니) 2.5단위를 200μM dATP, 200μM dCTP, 200μM, dGTP, 200μM, dTTP, 50mM 염화칼륨, 1.5mM 염화마그네슘 및 0.0001% 젤라틴을 함유하는 10mM 트리스-염산염 완충액(pH 8.3) 0.1ml에 가한다. PCR을 3회 온도 사이클, 즉, 94℃에서 30초, 55℃에서 2분 및 72℃에서 3분을 25회 반복하는 것으로 수행한다. PCR을 앞에서 언급한 조건하에 주형으로서 반응 혼합물 1㎕과 프라이머로서 올리고뉴클레오타이드 S2 0.2μmol 및 카셋트 프라이머 C2(제조원: 다카라 쓰조 캄파니) 0.2μmol을 사용하여 수행한다. 반응 혼합물 일부분을 아가로스 겔 전기영동시킨다. 결과로서, 대략 1,000개의 염기싸이 특이적으로 증폭된다. 단백질의 N말단으로부터EcoRI 개열 부위까지 유전자의 아래로 연장되는 DNA 단편이 수득된다.
이 DNA 단편을 유리 분말(지조워: 다카라 쓰조 캄파니)을 사용하여 회수한다. 이 DNA 단편 0.2μg을 클레노 단편을 사용하여 37℃에서 30분 동안 평활말단화 반응시킨다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 추출물을 에탄올로 침전화시킨다. 침전물로서 회수된 DNA 단편을 T4 폴리뉴클레오타이드 키나제를 사용하여 37℃에서 1시간 동안 인산화 말단을 반응시킨다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 추출물을 에탄올로 침전화시킨다. 인산화된 평활 말단을 갖는 PCR 생성물을 침전물로서 회수한다.
플라스미드 벡터 pUC18(제조원: 다카라 쓰조 캄파니)제한 엔도뉴클레아제 SmaI로 30℃에서 2시간 처리하여 분해물을 수득한다. 이 소화물을 통상적인 방법으로 페놀로 추출하고 에탄올로 침전화시킨다. 이어서 DNA 단편을 세균성 알칼리성 포스파타제로 처리하여 탈인산화하고, 페놀로 추출하여 에탄올로 침전시킨다.
SmaI로 분해시킨 pUC18 0.1㎍, 포스포릴화된 평활 말단을 갖는 PCR생성물 0.1㎍ 및 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo Co.에서 제조) 1단위를 16℃에서 8시간 동안 반응시켜 DNA를 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이 JM109(Takara Shuzo Co.에서 제조)를 상기한 DNA 혼합물로 형질전환시키고, 암피실린 100㎍/ml를 함유하는 L-아가 플레이트 배지 상에 접종시켜 형질전환체를 수득한다.
이렇게 수득한 형질전환체로 부터 알칼리 분해법으로 플라스미드를 추출하고, PCR-증식된 단편을 함유하는 플라스미드를 선별한다. 이 플라스미드를 pCS2로 표시한다.
올리고뉴클레오타이드 S1 및 S2에 상보적인 올리고뉴클레오타이드를 합성하고 각각 S4 및 S3으로 표시한다. 증식은, 프라이머로서의 올리고뉴클레오타이드 S3과 카세트 프라이머(Takara Shuzo Co.에서 제조)를 사용하고 주형으로서 EcoRI에 연결된 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953의 염색체 DNA 분해물을 사용하여 상기와 동일한 조건하에서 PCR로 수행한다. 이렇게 수득한 반응 혼합물을 주형으로서 사용하고 올리고뉴클레오타이드 S4 및 카세트 프라이머 C2(Takara Shuzo Co.에서 제조)를 프라이머로서 사용하여 PCR을 수행한다. 유전자의 상부 스트림에서 단백질의 N-말단 영역으로부터 EcoRI 분해 영역으로 연장되어 있는 약 2,300개의 기본쌍의 DNA 단편을 증식시킨다.
이러한 DNA 단편 약 0.2㎍을 클레노우(Klenow) 단편을 사용하여 37℃에서 30분동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 추출물을 에탄올로 침전시킨다. 침전물로서 회수한 DNA 단편을 제한 엔도뉴클레아제 KpnI 10단위, 염화마그네슘 10mM 및 디티오트레이톨 1mM을 함유하는 10mM 트리스 하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5) 50㎕와 혼합한다. 이 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 분해물을 수득한다. 분해물을 페놀로 추출하고, 추출물을 에탄올로 침전시킨다.
플라스미드 벡터 pUC18(Takara Shuzo Co.에서 제조) 1㎍, 제한 엔도뉴클레아제 KpnI 5단위 및 제한 엔도뉴클아제 HincII 5단위를 10mM 염화마그네슘, 50mM 염화나트륨 및 1mM 디티오트레이톨을 함유하는 33mM 트리스 아세테이트 완충액(pH 7.9) 50㎕와 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 분해물을 수득한다. 분해물을 페놀로 추출시키고 추출물을 에탄올로 침전시킨다.
KpnI와 HincII로 분해시킨 pUC18 0.1㎍과, 완만한 반응에 적용시키고 KpnI로 분해시킨 PCR생성물 0.1㎍를 T4 DNA 리가제(Takara Shuzo Co.에서 제조)를 사용하여 16℃에서 8시간 동안 반응시켜 DNA를 연결시킨다. 이어서, 이러한 DNA 혼합물로 이. 콜라이 JM109(Takara Shuzo Co.에서 제조)을 형질전환시키고, 암피실린 100㎍/ml를 함유하는 L-아가플레이트 배지상에 접종시켜 형질전환체를 수득한다.
이렇게 수득한 형질전환체로부터 알칼리 분해법에 의해 플라스미드를 추출한다. 유전자의 상부 스트림에서 단백질의 N-말단 영역으로부터 KpnI 분해 영역으로 연장되어 있는 약 600개의 기본쌍의 DNA 단편을 함유한느 플라스미드를 선별한다. 이러한 플라스미드를 pKS4로 표시한다.
(4) 엑시구오박테리움 아세틸리쿰의 이노신-구아노신 키나제 유전자의 뉴클레오타 이드 서열의 측정
(3)에서 수득한 플라스미드 pCS2 및 pKS4의 뉴클레오타이드 서열을 측정한다. 이로 부터 추정되는 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드를 서열 리스트에서 서열 2로 표시한다. 즉, 서열 리스트에서 서열 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953의 이노신-구아노신 키나제이다.
뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열을 상동성에 대해 공지된 서열과 비교한다. EMBL 및 SWISS-PROT를 데이터 베이스로서 이용한다. 그 결과, 서열 리스트에서 서열 1로 표시되는 DNA외 이러한 DNA로 암호화되는 단백질은 신규하며, 뉴클레오타이드 서열은 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 유전자로서 유일하게 공지되어 있는 이. 콜라이 이노신-구아노신 키나제를 암호화하는 서열에 대해 보다 덜 상보적이고 이와는 상당히 상이하다는 사실이 밝혀졌다.
이러한 유전자에 의해 암호화된 단백질은 303개의 아미노산으로 이루어져 있으며, 이러한 아미노산 서열로 부터 추정되는 단백질의 분자량은 32.5kD이다.
실시예 7
엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953으로부터 기원한 이노신-구아노신 키나제 발현을 위한 플라스미드의 작제 및 이의 코리네박테리움 암모니아게네스로의 도입
(1) 이노신-구아노신 키나제 유전자의 PCR에 의한 증폭 및 이의 클로닝
각각 서열 8 및 9인, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰의 이노신-구아노신 키나제 유전자의 5'- 및 3'- 측면 서열과 제한 엔도뉴클레아제 PstI 및 SphI을 갖는 올리고뉴클레오타이드를 합성한다.
프라이머로서의 올리고뉴클레오타이드 0.25μmole, 주형으로서의 실시예6(2)에서 제조된 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 ATCC 953의 염색체 DNA 0.1μg 및 taq DNA 폴리머라제(다카라스조가부시키가이샤가 생산) 2.5단위를 dATP 200μM, dCTP 200μM, dGTP 200μM, dTTP 200μM, 염화칼륨 50mM, 염화마그네슘 1.5mM 및 젤라틴 0.001%를 함유하는 10mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 8.3) 0.1ml에 가한다. 3가지 온도의 순환, 즉 94℃에서 30초, 55℃에서 30초 및 72℃에서 30초의 PCR을 25회 반복한다. 반응 혼합물을 아가로스 겔 전기영동시키고 목적한 DNA 단편을 유리 분말(다카라스조가부시키가이샤가 생산)을 사용하여 수집한다. DNA 단편 약 2μg, 제한 엔도뉴클레아제 PstI 10단위 및 제한 엔도뉴클레아제 SphI 10단위를 염화마그네슘 10mM, 염화나트륨 100mM 및 디티오트레이톨 1mM을 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5) 50μl와 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리하여 분해물을 수득한다.
플라스미드 pHSG298(다카라스조가부시키가이샤가 생산) 1μg, 제한 엔도뉴클레아제 PstI 20단위 및 제한 엔도뉴클레아제 SphI 20단위를 염화마그네슘 10mM, 염화나트륨 100mM 및 디티오트레이톨 1mM을 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5)과 혼합한다. 혼합물을 37℃에서 2시간 동안 항온처리한다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 통상의 방법으로 에탄올로 침전시켜 PstI과 SphI로 분해된 플라스미드 pHSG298을 수득한다. PstI과 SphI로 분해된 플라스미드 pHSG298 0.1μg, PstI과 SphI로 분해된 PCR 증식된 단편 0.5μg 및 T4 DNA 리가제(다카라스조가부시키가이샤가 생산) 1단위를 염화마그네슘 6.6mM, 디티오트레이톨 10mM 및 ATP 10mM을 함유하는 66mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5)에 가한다. 혼합물을 16℃에서 8시간 동안 배양하여 DNA를 연결한다. 이어서, 이. 콜라이 JM109(다카라스조가부시키가이샤가 생산)를 통상의 방법으로 DNA 혼합물로 형질변형시키고 가나마이신 100μg/ml를 함유하는 L-아가 플레이트 배지에 접종한다.
이렇게 수득한 형질변형체부터 알칼리분해법으로 플라스미드를 추출하고 아가로스 겔 전기영동시킨다. 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자가 벡터 플라스미드 pHSG298에 삽입되어 있는 재조합 플라스미드를 선택한다. 당해 플라스미드를 pBA-1이라고 명명한다.
(2) E. 콜라이 trp 프로모터의 삽입
BamHI와 PstI를 사용하여 분리한 E. 콜라이 trp 프로모터를 함유하는 DNA를 실시예1(2)와 동일한 방법으로 제조한다.
(1)에서 수득한 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 DNA 단편이 삽입되어 있는 재조합 플라스미드 pBA-1을 PstI와 BamHI로 분해한다. 반응 혼합물을 페놀로 추출하고 통상의 방법으로 에탄올로 침전시켜 PstI와 BamHI로 분해된 플라스미드를 수득한다. PstI와 BamHI로 분해된 플라스미드 0.1μg을T4 DNA 리가제(다카라스조가부시키가이샤가 생산) 1단위를 사용하여 PstI와 BamHI로 분해된 E. 콜라이 trp 프로모터를 함유하는 DNA 단편과 연결한다. 이어서, E. 콜라이 JM109(다카라스조가부시키가이샤가 생산)를 DNA 혼합물을 사용하여 형질변형시키고 카나마이신 100μg/ml를 함유하는 L-아가 플레이트 배지에 접종한다.
이렇게 수득한 형질변형체로부터 플라스미드를 추출하고 아가로스 겔 전기영동시킨다. 이. 콜라이 trp 프로모터가 플라스미드 pBA-1에 삽입되어 있는 재조합 플라스미드를 선택한다. 당해 플라스미드를 pBA-2이라고 명명한다.
플라스미드를 pBA-2를 함유하는 이. 콜라이 AJ 13094는 승인 번호 FERM BP-5089로 부다페스트 협약하에 1995년 4월 27일자로 통상산업성공업기술원생명공학공업기술 연구소(일본 305 이바라키켄 쓰쿠바시 히가시 1초메 1-3)에 기탁되었다.
(3) 코리네박테리움속의 세균으로부터 기원한 복제 오리진의 삽입
(2)에서와 동일한 방법으로, 이노신-구아노신 키나제 유전자 및 (2)에서 수득한 trp 프로모터를 함유하는 재조합 플라스미드 pBA-2 1μg을 BamHI로 분해한다. 분해물을 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 침전물을 KpnI로 실시예6(2)와 동일한 방법으로 분해하고 분해물을 페놀로 추출하고 추출물을 에탄올로 침전시킨다. 이렇게 수득한 BamHI 및 KpnI로 분해된 플라스미드 pBA-2를 박테리움성 인산염 처리를 통해 DNA 단편을 탈포스포릴화한다. 생성된 물질을 페놀로 추출하고 추출물을 에탄올로 침전시킨다.
한편, 플라스미드 pHC4 1μg을 마찬가지로 BamHI 및 KpnI로 분해한다. 분해물을 페놀로 추출하고 에탄올로 침전시킨다. 수득한 BamHI 및 KpnI로 분해된 플라스미드 pBA-2 0.1μg을 BamHI 및 KpnI로 분해된 플라스미드 pHC4로부터 유도된 DNA 단편 0.2μg과 T4 DNA 라가제(다카라스조가부시키가이샤가 생산)를 사용하여 연결한다. 이어서, 이. 콜라이 JM109(다카라스조가부시키가이샤가 생산)를 DNA 혼합물을 사용하여 형질변형시키고 카나마이신 100μg/ml를 함유하는 L-아가 플레이트 배지에 접종한다.
이렇게 수득한 형질변형체로부터 알칼리 분해로 플라스미드를 추출하고 아가로스 겔 전기영동시킨다. 코리네박테리움 속의 박테리움로부터 유도된 복제 오리진이 플라스미드 pBA-2에 삽입되어 있는 재조합 플라스미드를 선택한다. 당해 플라스미드를 pBA-3이라고 명명한다.
(4) pBA-3의 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477로의 삽입
(3)에서 수득한 pBA-3 0.1μg을 통상의 일렉트로포레이션(일본 공개특허공보 제207,791/1990)으로 코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477에 도입한다. 형질변형된 세포를 1% 펩톤, 1% 효모 추출물, 0.5% 염화나트륨, 0.5% 글루코즈 및 가나마이신 50μg/ml를 함유하는 한천 배지에 접종하여 형질변형체 ATCC 21477/pBA-3을 수득한다.
(5) 재조합 균주의 이노신-구아노신 키아제 활성의 측정
(4)에서 수득된 코이아박테리움 암모니아게네스 ATTC 21477/pBA-3을 폴리펩톤 1%, 효모 추출물 1%, 글루코스 5%, 인산 2수소칼륨 0.4%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 우레아 0.5%, 황산제일철 0.001%, 황산망간 0.001%, 티아민 하이드로클로라이드 0.005g/ℓ, 칼슘 판토테네이트 0.01g/ℓ, 비오틴 30㎍/ℓ, 아데닌 0.05% 및 카나마이신 50㎎/ℓ를 함유하는 배지(pH 7.2) 50㎖ 속에서 항온시키고 32℃에서 24시간 동안 배양한다. 배양물을 통상의 방법으로 원심분리하여 세포를 수거한다.
0.9% 염화나트륨 수용액 속에 세포를 현탁시키고 현탁액을 분리시키는 단계를 2회 반복하여 세포를 세척한다. 생성되는 셀을, 20% 글리세롤 및 100mM 염화칼륨을 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.9) 속에 현탁시키고 현탁액을 20분동안 150W로 초음파처리한 다음 30분동안 15,000rpm의 속도로 원심분리시켜 상청액을 수득한다. 당해 상층액을 세파덱스 G-15 칼럼[제조원: Pharmacia Co.]에 적용시켜 저분자량 물질을 제거하고 생성 용액을 조 효소 용액으로서 사용한다.
조 효소 용액의 이노신-구아노신 키나제 활성을 실시예 5(1)에 기술된 방법으로 측정한다. 이 시점에서 플라스미드 pHK4로 형질전환시킴으로써 수득한 ATTC 21477/pHK4를 대조용으로서 사용한다. 이의 결과가 표 7에 제시되어 있다. ATTC 21477/pBA-3은 높은 수준의 활성을 나타내는 반면 ATTC 21477/pHK4에서는 활성이 관측되지 않는다. 이러한 결과는 엑시구아노박테리움 아세틸리슘으로부터 유도된 도입된 유전자가 코리네박테리움 암모니아게네스 중에서 이노신-구아노신 키나제 활성을 발현시킴을 시사한다.
플라스미드 pHK4는 trp 프로모터 및 이노신-구아노신 키나제 유전자 영역이 pBA-3으로부터 제거되는 구조를 보유하므로 이것이 대조용으로 사용된다.
이. 콜라이 HB101에서의 균주 pHK4는 기탁번호 제AJ 13136호로서 지정되며 이는 부다페스트 조약 제FERM BP-5186호하에서 1995년 8월 1일자로 통상산업성공업기술원생명공학공업기술 연구소[National Institute of Bioscience and Human-Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki ken 305, Japan]에 기탁되었다.
균주 특이적 활성(nmol/분/mg 단백질)
ATCC 21477/pHK4 검출되지 않음
ATCC 21477pBA-3 50.4
실시예 8
엑시구오박테리움 아세틸리쿰의 이노신-구아노신 키나제 유전자를 사용한 이노신으로부터 5'-이노신산의 제조
코리네박테리움 암모니아게네스 ATCC 21477pBA-3을 폴리펩톤 1%, 효모 추출물 1%, 글루코스 5%, 인산 2수소 칼륨 0.4%, 황산마그네슘 0.1%, 황산암모늄 0.5%, 우레아 0.5%, 황산제일철 0.001%, 황산망간 0.001%, 티아민 하이드로클로라이드 0.005g/ℓ, 칼슘 판토테네이트 0.01g/ℓ, 비오틴 30㎍/ℓ, 아데닌 0.05% 및 카나마이신 50㎎/ℓ를 함유하는 배지(pH 7.2) 450㎖ 속에서 배양시키고 이를 32℃에서 24시간 동안 배양한다. 생성되는 배양액을 10분동안 7,000rpm의 속도로 원심분리하여 침전물로서 습윤 세포 20g을 수거한다.
이와같이 수득된 세포를 이노신 50g/ℓ, 인산 2수소 칼륨 20g/ℓ, 글루코스 30g/ℓ, 황산마그네슘 5g/ℓ, 피티산 10g/ℓ(50%의 중량비), 나이민 S-215 4g/ℓ 및 아데닌 1g/ℓ를 함유하는 반응 용액(pH 7.2) 20㎖ 속에서 200g/ℓ의 양으로 현탁시킨다. 현탁액을 32℃에서 교반하면서 항온시킨다. 4N 수산화나트륨을 수회 사용하여 pH를 7.2로 조정하고 감소된 양의 인산 2수소 칼륨을 반응 혼합물에 가한다. 대조용으로서 ATCC 21477/pHK4를 사용하여 반응을 수행한다. 반응이 30분 경과 후에 고성능 액체 크로마토그래피를 통해 반응 용액 중의 5'-이노신산의 용액을 측정한다.
이의 결과가 표 8에 기재되어 있다. 축적된 5'-이노신산의 양은 이나트륨-이노시네이트 7.5-하이드레이트의 양으로 나타내었다. 당해 결과로부터 이노신의 5'-이노신산으로의 전환율은 이노신-구아노신 키나제 활성을 발현하는 ATTC21477/pBA-3으로 측정한다.
균주 축적된 5'-이노신산의 양(g/ℓ)
ATCC 21477/pHK4ATCC 21477/pBA-3 검출되지 않음69.8
실시예 9
엑시구오박테리움 아세틸리쿰의 이노신 구아노신키나제 유전자를 함유하는 세포를 사용한 5'-이노신산의 제조
실시예 8에서 수득한 세포를 이노신 60g/ℓ, 인산 2수소 칼륨 20g/ℓ, 글루코스 30g/ℓ, 황산마그네슘 5g/ℓ, 피티산 10g/ℓ(50%의 중량비), 나이민 S-215 4g/ℓ 및 아데닌 1g/ℓ를 함유하는 반응 용액(pH 7.2) 50㎖ 속에서 200g/ℓ의 양으로 현탁시킨다. 현탁액을 호기적으로 교반하면서 32℃에서 배양한다. pH 메터를 사용하여 모니터링함으로써 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.2로 조정하고 감소된 양의 인산 2수소 칼륨을 반응 혼합물에 가한다. 반응이 30시간 경과한 후 축적된 5'-이노신산의 양은 111.3g/ℓ이고 부가된 이노신을 기준으로 하는 몰 수율은 대략 100%이다.
실시예 10
이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 세포를 사용한 구아노신의 5'-구아닐산으로의 전환
실시예 8에서 수득한 세포를 구아노신 25g/ℓ, 인산 2수소 칼륨 20g/ℓ, 글루코스 30g/ℓ, 황산마그네슘 5g/ℓ, 피티산 10g/ℓ(50%의 중량비), 나이민 S-215 4g/ℓ 및 아데닌 1g/ℓ를 함유하는 반응 용액(pH 7.2) 50㎖ 속에서 200g/ℓ의 양으로 현탁시킨다. 현탁액을 호기적으로 교반하면서 32℃에서 항온시킨다. pH 메터를 사용하여 모니터링함으로써 4N 수산화나트륨을 사용하여 pH를 7.2로 조정하고 감소된 양의 인산 2수소 칼륨을 반응 혼합물에 가한다. 반응이 8시간 경과한 후 축적된 5'-이노신산의 양은 7.3g/ℓ이고 부가된 이노신을 기준으로 하는 몰 수율은 대략 14%이다.
실시예 11
엑시구오박테리움 아우란티아쿰, 쿠르티아 깁소니 및 쿠르티아 조프리에서 이노신-구아노신 키나제의 활성의 검출
폴리펩톤 1%, 박토 효모 추출물 1%, 글루코스 0.5%, 염화나트륨 0.5% 및 탄산나트륨 1%를 함유하는 배지(pH 9.7) 50㎖ 속에서 엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATTC 35651을 배양시킨다. 쿠르티아 깁소니 ATTC 43195 및 쿠르티아 좁피 ATTC33403을 폴리펩톤 1%, 박토 효모 추출물 1%, 글루코스 0.5% 및 염화나트륨 0.5%를 함유하는 배지(pH 7.2) 50㎖ 속에서 항온시킨다. 30℃에서 4시간 동안 배양시킨다. 수득된 각각의 배양액을 7,000rpm의 속도로 10분동안 원심분리시키고, 침전물을 0.9% 염화나트륨으로 2회 세척하여 습윤 셀을 수득한다. 셀을 완충액 3㎖ 속에 현탁시키고 초음파처리에 의해 파열시킨다. 현탁액을 15,000rpm의 속도로 30분동안 원심분리시키고 스파덱스 G-25 칼럼[제조원: Pharmacia Co.]을 사용하여 상층액을 탈염시켜 조악한 효소 추출물을 대략 3.5㎖ 수득한다. 조 효소 추출물 5㎕를 100mM 염화마그네슘, 5mM ATP, 100mM 염화칼륨, 0.06mM 구아노신 및 0.04mM[8-14C]-구아노신을 함유하는 100mM 트리스-하이드로클로라이드 50㎕에 가한다. 혼합물을 30℃에서 10분동안 항온시킨다. 형성된 5'-구아닐산의 양을 측정하고 이노신-구아노신 키나제의 비활성을 측정한다. 이의 결과가 표 9에 기재되어 있다. 이노신-구아노신 키나제 활성이 모든 균주에서 관측되었다.
균주 특수 활성(nmol/분/mg 단백질)
엑시구오박테리아 아우란티아쿰쿠르티아 깁소니쿠르티아 좁피 46.36.641.19
실시예 12
엑시구오박테리움 아우란티아쿰, 구르티아 기브소니이 및 구르티아 조프피이에서 엑시구오박테리움 아세틸리쿰의 이노신-구아노신 키나제 유전자와 상동성을 갖는 단편의 검출)
엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATCC 35652, 쿠르티아 기브소니이 ATCC 3195 및 쿠르티아 조프피이 ATCC 33403을 실시예 11과 동이한 방법으로 30℃에서 16시간 동안 배양한다. 염색체 DNA는 실시예 5(2)와 동일한 방법으로 각각의 배지에서 제조한다. 각각의 염색체 DNA의 ㎍ 및 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 100단위를 10mM 염화마그네슘, 100mM 염화나트륨 및 1mM 디티오트레이톨을 함유하는 50mM 트리스-하이드로클로라이드 완충액(pH 7.5)와 혼합한다. 이어서, 반응 혼합물을 페놀로 추출하고, 추출물을 통상의 방법으로 에탄올로 침전시킨다. 이렇게 수득된, EcoRI에 의해 분해된 염색체 DNA를 0.8% 아가로즈 겔 전기영동시키고, 문헌[참조: Molecular cloning 2nd edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p. 9.31(1989)]에 기술된 알카리 전이 방법에 의해 아가로즈 겔로부터 나일론 막(DuPont Co.사제)으로 전이시킨다. 막을 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 단편을 프로브로서 사용하여 20% 포름아미드의 존재하에 42℃에서 14시간 동안 하이브리드화시킨다. 이 막을 0.2×SSC(0.03M 염화나트륨 및 3mM 나트륨 시트레이트)로 세척하면, 상동성 단편이 모든 균주에서 검출된다. 특히, 강력한 상동성을 나타내는 약 4.6kb의 단편이 엑시구오박테리움 아우란티아쿰의 염색체에서 검출된다.
실시예 13
엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATCC35652의 염색체로부터 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자와 상동성인 단편의 분리
엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATCC 35652의 염색체 DNA 8㎍ 및 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 200단위를 37℃에서 3시간 동안 반응시킨다. 반응 혼합물을 에탄올로 침전시킨다. 생성된 분해 단편을 아가로즈 겔 전기영동시킨다. 유리 분말[참조: Takara Shuzo Co사제]를 사용하여 약 4.6kb의 단편을 회수하여 엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATCC 35652의 크기-선별된 염색체 단편을 수득한다.
플라스미드 벡터 pMW218[참조: Nippon Gene Co.] 1㎍을 제한 엔도뉴클레아제 EcoRI 20단위와 함께 37℃에서 3시간 동안 배양한다. 분해물을 페놀로 추출하고, 추출물을 에탄올로 침전시킨다. 이어서, DNA 단편을 알카리 포스파타제 처리에 의해 탈인산화시킨다. 이렇게 처리된 단편을 페놀로 추출하고, 추출물을 에탄올로 침전시킨다.
EcoRI로 분해시킨 본 pMW218 0.2㎍을 T4 DNA 리가제[참조: Takara Shuzo Co.사제]를 사용하여, EcoRI로 분해시킨 엑시구오박테리움 아우란티아쿰의 염색체 단편 5㎍과 연결시킨다. 이어서, 이. 콜라이 JM109[참조: Takara Shuzo Co.사제]를 상기 DNA 혼합물로 형질전환시키고, 가나마이신 100㎍/ml를 함유하는 L-아가 평판 배지상에 접종하여 약 1,000개의 형질전환체를 수득한다.
수득된 형질전환체중에서, 프로브 DNA와 하이브리드화하는 형질전환체를 콜로니 하이브리드화 방법에 의해 선별한다. 플라스미드 DNA를 알카리 용균 방법에 의해 상기 형질전환체로부터 추출한다. 이 플라스미드 DNA는 엑시구오박테리움 아우란티아쿰의 염색체로부터 유도된 약 4.6kb의 DNA 단편을 함유한다.
실시예 14
엑시구오박테리움 아우란티아쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자의 뉴클레오타이드 서열의 결정
실시예 13에서 수득한 플라스미드를 제한 엔도뉴클레아제로 절단하고, 이어서 써던 하이브리드화시킴으로써 프로브 DNA와 하이브리드화되는 단편을 확인한다. 이 결과, EcoRI 및 PstI으로 절단된 약 2.7kb의 단편이 하이브리드화된 것으로 밝혀졌다. 이 DNA 단편을 EcoRI 및 PstI로 절단시킨 플라스미드 벡터 pSV28[참조: Takara Shuzo Co.사제]과 연결시킨다. 수득된 형질전환체중에서, 프로브 DNA와 하이브리드화되는 단편을 문헌[참조: Molecular Cloning 2nd edition, by J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniatis, Cold Spring Laboratory Press, p. 1.90(1989)]에 기술된 콜로니 하이브리드화 방법에 의해 클로닝시킨다. 상기 단편을 함유하는 플라스미드를 포함하는 이. 콜라이 균주의 세포 유리 추출물의 이노신-구아노신 키나제 활성은 실시예 7(5)에 기술된 방법에 따라 측정하고, 이는 참조로서 사용된 벡터를 포함하는 균주보다 약 300배 높은 것으로 밝혀졌다. 따라서, 클로닝된 단편은 엑시구오박테리움 아우란티아쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제 유전자를 함유하는 것으로 입증된다.
EcoRI 및 PstI으로 절단시킨 단편의 뉴클레오타이드 서열은 이렇게 수득된 플라스미드 DNA를 사용하여 결정한다. 결정된 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되는 개방 판독 프레임의 뉴클레오타이드는 서열 목록의 서열 14에 제시되어 있다. 상기 뉴클레오타이드 서열로부터 추정되는 생성물의 아미노산 서열은 서열 목록의 서열 15에 제시되어 있다. 뉴클레오타이드 서열 및 아미노산 서열 모두는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제와 강력한 상동성을 나타냈다. 그러나, 상기 유전자는 신규한 유전자임에 명백하다. 즉, 서열 목록의 서열 15에 제시된 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자는 엑시구오박테리움 아우란티아쿰 ATCC 35652의 이노신-구아노신 키나제 유전자이다.
상기 언급된 바와 같이, 엑시구오박테리움 아세틸리쿰으로부터 유도된 이노신-구아노신 키나제를 하이브리드화할 수 있는 유전자가 수득되었고, 상기 유전자는 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 것으로 입증되었다.
서 열 리 스 트
(1) 일반 정보:
(i) 출원인 : 아지노모토 가부시키가이샤
(ii) 발명의 명칭 : 핵산의 제조 방법
(iii) 서열 수 : 15
(iv) 거주 주소 :
(A) 주소:
(B) 거리:
(C) 시 :
(D) 주 :
(E) 국가 :
(F) 우편번호:
(v) 컴퓨터 판독형:
(A) 매체 타입:
(B) 컴퓨터:
(C) 운용 시스템:
(D) 소프트웨어:
(vi) 현 출원 데이타:
(A) 출원 번호:
(B) 출원일:
(C) 분류:
(viii) 대리인/위임자 정보:
(A) 명칭:
(B) 등록 번호:
(ix) 통신 정보:
(A) 전화번호:
(B) 팩스 번호:
(C) 텔렉스 번호:
(2) 서열 1에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 909개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 게놈성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 기원:
(A) 유기체: 엑시구오박테리움 아세틸리쿰
(C) 균주: ATCC 953
(ix) 특징
(A) 명칭/키이: CDS
(B) 위치: 1..909
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 2에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 303개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 3에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 28개 아미노산
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 펩타이드
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 4에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 17개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 5에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 17개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 6에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 23개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 7에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 21개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 8에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 9에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 10에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 1302개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 게놈성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 기원:
(A) 유기체: 에스케리키아 콜라이
(C) 균주: HM70
(ix) 특징
(A) 명칭/키이: CDS
(B) 위치: 1..1302
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 11에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 12에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 30개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 13에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 72개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 일본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 기타 핵산..합성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 14에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 924개 염기쌍
(B) 타입: 핵산
(C) 본쇄형: 이본쇄
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 게놈성 DNA
(iii) 가설: 없음
(iv) 안티-센스: 없음
(vi) 기원:
(A) 유기체: 엑시구오박테리움 아우란티아쿰
(C) 균주: ATCC 35652
(ix) 특징
(A) 명칭/키이: CDS
(B) 위치: 1..654
(xi) 서열 기술:
(2) 서열 15에 대한 정보:
(i) 서열 특성:
(A) 길이: 308개 염기쌍
(B) 타입: 아미노산
(D) 위상: 선형
(ii) 분자 형태: 단백질
(xi) 서열 기술:

Claims (17)

  1. 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 ATP를 재생성할 수 있는 미생물에, 이노신 또는 구아노신 또는 이의 전구체, 에너지원 및 포스페이트 공여자와 함께 도입하는 단계, 반응 용액중에 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 축적시키는 단계, 및 이로부터 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산을 수집하는 단계를 포함하는, 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서, ATP를 재생성할 수 있는 미생물이 코리네박테리움(Corynebacterium), 에스케리키아(Escherichia), 사카로마이세스(Saccharomyces), 스타필로코코스(Staphylococcus) 및 칸디다(Candida)로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속에 속하는 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서, ATP를 재생성할 수 있는 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스(Corynebacterium ammoniagenes)에 속하는 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법.
  4. 제1항내지 제3항중의 어느 한항에 있어서, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 엑시구오박테리움 아세틸리쿰(Exiguobacterium acetylicum) 기원의 유전자 또는 이 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자인 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법.
  5. 제1항 내지 제3항중의 어느 한항에 있어서, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 기원의 유전자 또는 이 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자인 5'-이노신산 또는 5'-구아닐산의 제조방법.
  6. 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자를 ATP를 재생성 할 수 있는 미생물내에 도입함으로써 수득된 형질전환체.
  7. 제6항에 있어서, ATP를 재생성할 수 있는 미생물이 코리네박테리움, 에스케리키아, 사카로마이세스, 스타필로코코스 및 칸디다로 이루어진 그룹으로부터 선택된 속에 속하는 형질전환체.
  8. 제6항에 있어서, ATP를 재생성 할 수 있는 미생물이 코리네박테리움 암모니아게네스에 속하는 형질전환체.
  9. 제6항내지 제8항중의 어느 한항에 있어서, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 기원의 유전자 또는 이 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자인 형질전환체.
  10. 제6항 내지 제8항중의 어느 한항에 있어서, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이 기원의 유전자 또는 이 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자인 형질전환체.
  11. 코리네박테리움 암모니아게네스내에서 복제가능하고 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자을 포함하는 재조합 DNA.
  12. 제11항에 있어서, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 엑시구오박테리움 아세틸리쿰 기원의 유전자 또는 이 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자인 재조합 DNA.
  13. 제11항에 있어서, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자가 에스케리키아 콜라이 기원의 유전자 또는 이 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자인 재조합 DNA.
  14. (1) 당해 효소가 포스페이트 그룹을 포스페이트 공여체의 존재하에서 뉴클레오시드에 전이시켜 뉴클레오시드 5'-모노포스페이트를 형성시키는 작용을 갖고,
    (2) 뉴클레오시드 트리포스페이트의 γ-위치의 포스페이트 그룹을 다른 뉴클레오시드로 전이시키는 기질 특이성을 지니며,
    (3) 최적 pH는 7.7 내지 9.9이고,
    (4) pH 안정성 범위는 pH 6.7 내지 12.1이며,
    (5) 최적 온도는 30 내지 50℃이고,
    (6) 요구되는 금속은 마그네슘 이온, 망간 이온, 코발트 이온 또는 철 이온이며,
    (7) 금속 이온의 영향면에서, 효소의 활성이 구리 이온 및 수은 이온에 의헤 강하게 억제되고, 또한 아연 이온 및 카드륨 이온에 의해 억제되고,
    (8) Km 값은, 구아노신이 기질로서 사용될 때, 구아노신의 경우 0.03mM이고, 이노신의 경우 1mM이고, ATP의 경우 1.6mM이며,
    (9) 당해 효소의 분자량이, SDS-폴리아크릴아미드 겔에 의해 측정된 바와 같이, 약 36킬로달톤인 특성을 갖고, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 엑시구오박테리움 아세틸리쿰에 속하는 미생물로 부터 수득될 수 있는 단백질.
  15. 서열2에 도시된 아미노산 서열, 또는 서열2에 도시된 아미노산 서열중의 일부 아미노산이 결실, 치환 또는 첨가된 아미노산 서열을 갖고, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질.
  16. 제14항 또는 제15항의 단백질을 암호화하는 유전자.
  17. 서열1에 도시된 뉴클레오타이드 서열을 갖고, 이노신-구아노신 키나제 활성을 갖는 단백질을 암호화하는 유전자 또는 이 뉴클레오타이드 서열을 갖는 유전자와 하이브리드화할 수 있는 유전자.
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