PL184520B1 - Sposób wytwarzania kwasu inozynowego lub guanylowego stransformowany mikroorganizm zrekombinowany DNA białko oraz gen - Google Patents
Sposób wytwarzania kwasu inozynowego lub guanylowego stransformowany mikroorganizm zrekombinowany DNA białko oraz genInfo
- Publication number
- PL184520B1 PL184520B1 PL96322580A PL32258096A PL184520B1 PL 184520 B1 PL184520 B1 PL 184520B1 PL 96322580 A PL96322580 A PL 96322580A PL 32258096 A PL32258096 A PL 32258096A PL 184520 B1 PL184520 B1 PL 184520B1
- Authority
- PL
- Poland
- Prior art keywords
- inosine
- protein
- gene
- guanosine
- sequence
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 82
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 title description 23
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 title description 23
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 title description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 189
- 229940029575 guanosine Drugs 0.000 claims abstract description 147
- 108091000080 Phosphotransferase Proteins 0.000 claims abstract description 111
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 99
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 93
- 102000020233 phosphotransferase Human genes 0.000 claims abstract description 81
- NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N Guanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O NYHBQMYGNKIUIF-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims abstract description 79
- UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N Inosine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]1N1C2=NC=NC(O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 53
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims abstract description 53
- 229930010555 Inosine Natural products 0.000 claims abstract description 52
- 229960003786 inosine Drugs 0.000 claims abstract description 52
- MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N Crotonoside Natural products C1=NC2=C(N)NC(=O)N=C2N1[C@H]1O[C@@H](CO)[C@H](O)[C@@H]1O MIKUYHXYGGJMLM-GIMIYPNGSA-N 0.000 claims abstract description 39
- NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N D-guanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(CO)C(O)C1O NYHBQMYGNKIUIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 39
- GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N IMP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-KQYNXXCUSA-N 0.000 claims abstract description 37
- GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N Inosinic acid Natural products OC1C(O)C(COP(O)(O)=O)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 GRSZFWQUAKGDAV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 35
- 235000013902 inosinic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 35
- RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N guanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O RQFCJASXJCIDSX-UUOKFMHZSA-N 0.000 claims abstract description 25
- RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 14C-Guanosin-5'-monophosphat Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O RQFCJASXJCIDSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 24
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims abstract description 24
- 235000013928 guanylic acid Nutrition 0.000 claims abstract description 24
- 239000002243 precursor Substances 0.000 claims abstract description 14
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 57
- 241000131747 Exiguobacterium acetylicum Species 0.000 claims description 50
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 49
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 37
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 37
- 241000186145 Corynebacterium ammoniagenes Species 0.000 claims description 30
- 241000186216 Corynebacterium Species 0.000 claims description 17
- 241001468127 Exiguobacterium aurantiacum Species 0.000 claims description 14
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 12
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 11
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 10
- 241000222120 Candida <Saccharomycetales> Species 0.000 claims description 6
- 241000588722 Escherichia Species 0.000 claims description 6
- 238000002955 isolation Methods 0.000 claims description 4
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 230000004952 protein activity Effects 0.000 claims 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 claims 1
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 abstract description 97
- ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N Adenosine triphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O ZKHQWZAMYRWXGA-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract description 65
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J ATP(4-) Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-J 0.000 abstract description 3
- 239000004278 EU approved seasoning Substances 0.000 abstract 1
- 235000011194 food seasoning agent Nutrition 0.000 abstract 1
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 114
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 79
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 72
- ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N Adenosine triphosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O ZKHQWZAMYRWXGA-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 62
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 59
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 59
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 56
- TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L Magnesium chloride Chemical compound [Mg+2].[Cl-].[Cl-] TWRXJAOTZQYOKJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 51
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 44
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 41
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 41
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 41
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 38
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 35
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 30
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 29
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 28
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 28
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 27
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 25
- 229910001629 magnesium chloride Inorganic materials 0.000 description 25
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 24
- 235000013351 cheese Nutrition 0.000 description 23
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 23
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 19
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 19
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 description 19
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 description 19
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 18
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 18
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 18
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 17
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 16
- -1 iron ion Chemical class 0.000 description 15
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 15
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 15
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 14
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 13
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 13
- 239000000047 product Substances 0.000 description 13
- 239000001226 triphosphate Substances 0.000 description 13
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 12
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 12
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 12
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 12
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 12
- 150000003833 nucleoside derivatives Chemical class 0.000 description 12
- 235000011178 triphosphate Nutrition 0.000 description 12
- 229930024421 Adenine Natural products 0.000 description 11
- GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N Adenine Chemical compound NC1=NC=NC2=C1N=CN2 GFFGJBXGBJISGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 11
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 11
- 229960000643 adenine Drugs 0.000 description 11
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 11
- 229910021645 metal ion Inorganic materials 0.000 description 11
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 11
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 11
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 10
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 9
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 9
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 9
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 9
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010036383 guanosine kinase Proteins 0.000 description 9
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 9
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 9
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 8
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 8
- 210000004897 n-terminal region Anatomy 0.000 description 8
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 8
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 8
- 210000000349 chromosome Anatomy 0.000 description 7
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 7
- 238000004520 electroporation Methods 0.000 description 7
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 7
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 7
- 125000002467 phosphate group Chemical group [H]OP(=O)(O[H])O[*] 0.000 description 7
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 7
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 7
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 7
- UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N triphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O UNXRWKVEANCORM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 241000186226 Corynebacterium glutamicum Species 0.000 description 6
- XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N Guanosine-5'-triphosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XKMLYUALXHKNFT-UUOKFMHZSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 6
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 6
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 6
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 5
- 241001468125 Exiguobacterium Species 0.000 description 5
- IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N Inositol-hexakisphosphate Chemical compound OP(O)(=O)O[C@H]1[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@H](OP(O)(O)=O)[C@@H]1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-GPIVLXJGSA-N 0.000 description 5
- 241000186035 Kurthia zopfii Species 0.000 description 5
- IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N Phytic acid Natural products OP(O)(=O)OC1C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C(OP(O)(O)=O)C1OP(O)(O)=O IMQLKJBTEOYOSI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 5
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 5
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 5
- 235000013877 carbamide Nutrition 0.000 description 5
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 5
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 5
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N iron Substances [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 5
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 5
- 235000002949 phytic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000000467 phytic acid Substances 0.000 description 5
- 229940068041 phytic acid Drugs 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 210000001938 protoplast Anatomy 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 5
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 5
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 4
- 241001468180 Kurthia gibsonii Species 0.000 description 4
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 4
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 4
- RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N TTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 RZCIEJXAILMSQK-JXOAFFINSA-N 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 4
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 4
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 239000000428 dust Substances 0.000 description 4
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 4
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 4
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 4
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 4
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 4
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 4
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 4
- 235000013379 molasses Nutrition 0.000 description 4
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 4
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 4
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 4
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 235000000346 sugar Nutrition 0.000 description 4
- 150000008163 sugars Chemical class 0.000 description 4
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 3
- ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 7553-56-2 Chemical compound [I] ZCYVEMRRCGMTRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 3
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 3
- 244000063299 Bacillus subtilis Species 0.000 description 3
- 235000014469 Bacillus subtilis Nutrition 0.000 description 3
- JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N Cu2+ Chemical compound [Cu+2] JPVYNHNXODAKFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 3
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 3
- 108020003215 DNA Probes Proteins 0.000 description 3
- 239000003298 DNA probe Substances 0.000 description 3
- 241000186809 Kurthia Species 0.000 description 3
- JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N Magnesium ion Chemical compound [Mg+2] JLVVSXFLKOJNIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N Manganese(2+) Chemical compound [Mn+2] WAEMQWOKJMHJLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- QMMRHASQEVCJGR-UBHSHLNASA-N Phe-Ala-Pro Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(O)=O)C1=CC=CC=C1 QMMRHASQEVCJGR-UBHSHLNASA-N 0.000 description 3
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 3
- 235000014680 Saccharomyces cerevisiae Nutrition 0.000 description 3
- 241000191940 Staphylococcus Species 0.000 description 3
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 3
- WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N cadmium(2+) Chemical compound [Cd+2] WLZRMCYVCSSEQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 description 3
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 description 3
- 229910001429 cobalt ion Inorganic materials 0.000 description 3
- XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N cobalt(2+) Chemical compound [Co+2] XLJKHNWPARRRJB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229910001431 copper ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000002515 guano Substances 0.000 description 3
- 239000011630 iodine Substances 0.000 description 3
- 229910052740 iodine Inorganic materials 0.000 description 3
- 229910001425 magnesium ion Inorganic materials 0.000 description 3
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 235000011007 phosphoric acid Nutrition 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 229960000344 thiamine hydrochloride Drugs 0.000 description 3
- 235000019190 thiamine hydrochloride Nutrition 0.000 description 3
- 239000011747 thiamine hydrochloride Substances 0.000 description 3
- YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 2'-deoxyguanosine Natural products C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1C1CC(O)C(CO)O1 YKBGVTZYEHREMT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- OUSWRMGBDBDOAY-NKTUVHCLSA-N 2-[(2s,3s,4r,5r)-5-(2-amino-6-oxo-3h-purin-9-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]-2-hydroxyacetic acid Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](C(O)C(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O OUSWRMGBDBDOAY-NKTUVHCLSA-N 0.000 description 2
- AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- NVCIXQYNWYTLDO-IHRRRGAJSA-N Arg-His-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N NVCIXQYNWYTLDO-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N Asn-Glu Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O IIFDPDVJAHQFSR-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 2
- VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N Asp-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N VPPXTHJNTYDNFJ-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 239000008001 CAPS buffer Substances 0.000 description 2
- 101100228200 Caenorhabditis elegans gly-5 gene Proteins 0.000 description 2
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 2
- QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N Disodium Chemical compound [Na][Na] QXNVGIXVLWOKEQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001131785 Escherichia coli HB101 Species 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CVPXINNKRTZBMO-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Asn Chemical compound C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)CN=C(N)N CVPXINNKRTZBMO-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N Gly-Phe-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CC=CC=C1)NC(=O)CN)O WNZOCXUOGVYYBJ-CDMKHQONSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N Ile-Gly-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O PDTMWFVVNZYWTR-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- 108010001139 Inosine kinase Proteins 0.000 description 2
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- VWPJQIHBBOJWDN-DCAQKATOSA-N Lys-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O VWPJQIHBBOJWDN-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N N-L-alpha-glutamyl-L-leucine Natural products CC(C)CC(C(O)=O)NC(=O)C(N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010021757 Polynucleotide 5'-Hydroxyl-Kinase Proteins 0.000 description 2
- 102000008422 Polynucleotide 5'-hydroxyl-kinase Human genes 0.000 description 2
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 description 2
- 102000001253 Protein Kinase Human genes 0.000 description 2
- 241000235070 Saccharomyces Species 0.000 description 2
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 2
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 2
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 2
- 108010006785 Taq Polymerase Proteins 0.000 description 2
- SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N Thr-Gly-Ala Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O SLUWOCTZVGMURC-BFHQHQDPSA-N 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- CXPJPTFWKXNDKV-NUTKFTJISA-N Trp-Leu-Ala Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)=CNC2=C1 CXPJPTFWKXNDKV-NUTKFTJISA-N 0.000 description 2
- LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N Val-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N LYERIXUFCYVFFX-GVXVVHGQSA-N 0.000 description 2
- UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N Val-Leu-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O UMPVMAYCLYMYGA-ONGXEEELSA-N 0.000 description 2
- MJOUSKQHAIARKI-JYJNAYRXSA-N Val-Phe-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 MJOUSKQHAIARKI-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 2
- GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N Val-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O GVRKWABULJAONN-VQVTYTSYSA-N 0.000 description 2
- 235000010724 Wisteria floribunda Nutrition 0.000 description 2
- PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N Zinc dication Chemical compound [Zn+2] PTFCDOFLOPIGGS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 description 2
- LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N acetyl dihydrogen phosphate Chemical compound CC(=O)OP(O)(O)=O LIPOUNRJVLNBCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 108010047495 alanylglycine Proteins 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N ammonia Natural products N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001166 ammonium sulphate Substances 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 2
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 2
- YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L cadmium dichloride Chemical compound Cl[Cd]Cl YKYOUMDCQGMQQO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 2
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 2
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 2
- 239000000287 crude extract Substances 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N desoxyinosine Natural products C1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 VGONTNSXDCQUGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108010064235 lysylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 2
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 2
- 150000007522 mineralic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- 150000008300 phosphoramidites Chemical class 0.000 description 2
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 description 2
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 238000002731 protein assay Methods 0.000 description 2
- 108060006633 protein kinase Proteins 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010703 silicon Substances 0.000 description 2
- 239000002002 slurry Substances 0.000 description 2
- BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M sodium acetic acid acetate Chemical compound [Na+].CC(O)=O.CC([O-])=O BHZOKUMUHVTPBX-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M sodium;2-aminoacetic acid;hydroxide Chemical compound O.[Na+].NCC([O-])=O CIJQGPVMMRXSQW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N tris acetate Chemical compound CC(O)=O.OCC(N)(CO)CO PIEPQKCYPFFYMG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 2'-deoxyguanosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=2NC(N)=NC(=O)C=2N=CN1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(O)=O)O1 LTFMZDNNPPEQNG-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- SADPCIINLASURY-UHFFFAOYSA-N 2-morpholin-4-ylethanesulfonic acid;sodium Chemical compound [Na].OS(=O)(=O)CCN1CCOCC1 SADPCIINLASURY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SZPCMDISHYFOHA-UHFFFAOYSA-N 3-amino-2-methylpropan-1-ol;hydrochloride Chemical compound Cl.NCC(C)CO SZPCMDISHYFOHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 4-Nitrophenyl Phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 XZKIHKMTEMTJQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 5'-adenylphosphoric acid Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O XTWYTFMLZFPYCI-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N Adenosine diphosphate Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(=O)OP(O)(O)=O)C(O)C1O XTWYTFMLZFPYCI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N Ala-Glu-Val Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O OMMDTNGURYRDAC-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N Ala-Leu-Arg Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N YHKANGMVQWRMAP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N Ala-Lys-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](NC(=O)[C@@H](N)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N Ala-Lys-Lys Natural products NCCCCC(NC(=O)C(N)C)C(=O)NC(CCCCN)C(O)=O VCSABYLVNWQYQE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N Ala-Phe Chemical compound C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 OMNVYXHOSHNURL-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 1
- ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N Ala-Val-Tyr Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O ZDILXFDENZVOTL-BPNCWPANSA-N 0.000 description 1
- 102100038910 Alpha-enolase Human genes 0.000 description 1
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O Ammonium Chemical compound [NH4+] QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 1
- VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N Ammonium hydroxide Chemical compound [NH4+].[OH-] VHUUQVKOLVNVRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N Arg-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O PNQWAUXQDBIJDY-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N Asn-Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)NCC(O)=O PCKRJVZAQZWNKM-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N Asn-Gly Chemical compound NC(=O)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O KLKHFFMNGWULBN-VKHMYHEASA-N 0.000 description 1
- PNHQRQTVBRDIEF-CIUDSAMLSA-N Asn-Leu-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N PNHQRQTVBRDIEF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N Asn-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O QJMCHPGWFZZRID-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N Asn-Thr-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O HCZQKHSRYHCPSD-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 1
- DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N Asp-Ala Chemical compound OC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O DVUFTQLHHHJEMK-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 1
- GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N Asp-Gln Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O GSMPSRPMQQDRIB-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N Asp-Glu Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O CKAJHWFHHFSCDT-WHFBIAKZSA-N 0.000 description 1
- HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N Asp-His Chemical compound OC(=O)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CNC=N1 HSPSXROIMXIJQW-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- ILQCHXURSRRIRY-YUMQZZPRSA-N Asp-His-Gly Chemical compound C1=C(NC=N1)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N ILQCHXURSRRIRY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YFSLJHLQOALGSY-ZPFDUUQYSA-N Asp-Ile-Lys Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)N YFSLJHLQOALGSY-ZPFDUUQYSA-N 0.000 description 1
- PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N Asp-Leu-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O PAYPSKIBMDHZPI-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- XLILXFRAKOYEJX-GUBZILKMSA-N Asp-Leu-Gln Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(O)=O XLILXFRAKOYEJX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- 101000755953 Bacillus subtilis (strain 168) Ribosome maturation factor RimP Proteins 0.000 description 1
- BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N Butylate Chemical compound CCSC(=O)N(CC(C)C)CC(C)C BMTAFVWTTFSTOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101100441252 Caenorhabditis elegans csp-2 gene Proteins 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002134 Carboxymethyl cellulose Polymers 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000614261 Citrus hongheensis Species 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q(11) Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1OC(COP(O)(O)=O)C(O)C1O UDMBCSSLTHHNCD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910021592 Copper(II) chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102100033195 DNA ligase 4 Human genes 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710181040 Endonuclease 5 Proteins 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 241001522878 Escherichia coli B Species 0.000 description 1
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 description 1
- 102100039555 Galectin-7 Human genes 0.000 description 1
- GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N Gallium Chemical compound [Ga] GYHNNYVSQQEPJS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N Glu-Glu-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CGOHAEBMDSEKFB-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N Glu-His Chemical compound OC(=O)CC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CN=CN1 HKTRDWYCAUTRRL-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N Glu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O YBAFDPFAUTYYRW-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N Glu-Leu-Gly Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O ATVYZJGOZLVXDK-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N Glu-Leu-Pro Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N UGSVSNXPJJDJKL-SDDRHHMPSA-N 0.000 description 1
- NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N Glu-Leu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O NJCALAAIGREHDR-WDCWCFNPSA-N 0.000 description 1
- BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N Glu-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O BBBXWRGITSUJPB-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N Glu-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O JSIQVRIXMINMTA-ZDLURKLDSA-N 0.000 description 1
- 108010021582 Glucokinase Proteins 0.000 description 1
- JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N Gly-Arg Chemical compound NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N JLXVRFDTDUGQEE-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N Gly-His Chemical compound [NH3+]CC(=O)N[C@H](C([O-])=O)CC1=CN=CN1 YIWFXZNIBQBFHR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N His-Asp Chemical compound OC(=O)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CC1=CNC=N1 MDCTVRUPVLZSPG-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N His-Leu-Cys Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC1=CN=CN1)N LJUIEESLIAZSFR-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N His-Val-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O KFQDSSNYWKZFOO-LSJOCFKGSA-N 0.000 description 1
- 101000882335 Homo sapiens Alpha-enolase Proteins 0.000 description 1
- 101000927810 Homo sapiens DNA ligase 4 Proteins 0.000 description 1
- 101000608772 Homo sapiens Galectin-7 Proteins 0.000 description 1
- 101001046426 Homo sapiens cGMP-dependent protein kinase 1 Proteins 0.000 description 1
- HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N ITP Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O[C@H]1N1C(N=CNC2=O)=C2N=C1 HAEJPQIATWHALX-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N Ile-Ala-Val Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)N MKWSZEHGHSLNPF-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 1
- 239000005569 Iron sulphate Substances 0.000 description 1
- QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N L-Prolyl-L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 QLROSWPKSBORFJ-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N L-arginyl-L-glutamic acid Chemical compound NC(=N)NCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O HFKJBCPRWWGPEY-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N L-leucyl-L-arginine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N Leu-Arg Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCN=C(N)N SENJXOPIZNYLHU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N Leu-Arg-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O UCOCBWDBHCUPQP-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N Leu-Asn-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O TWQIYNGNYNJUFM-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 1
- BPANDPNDMJHFEV-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O BPANDPNDMJHFEV-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 1
- ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N Leu-Asp-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ILJREDZFPHTUIE-GUBZILKMSA-N 0.000 description 1
- ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N Leu-Asp-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)NCC(O)=O ULXYQAJWJGLCNR-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O NFNVDJGXRFEYTK-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N Leu-Gly Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O LESXFEZIFXFIQR-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N Leu-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O OXRLYTYUXAQTHP-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- KVOFSTUWVSQMDK-KKUMJFAQSA-N Leu-His-Lys Chemical compound NCCCC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@@H](N)CC(C)C)CC1=CN=CN1 KVOFSTUWVSQMDK-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N Leu-Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O BGZCJDGBBUUBHA-KKUMJFAQSA-N 0.000 description 1
- KLSUAWUZBMAZCL-RHYQMDGZSA-N Leu-Thr-Pro Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1CCC[C@H]1C(O)=O KLSUAWUZBMAZCL-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N Lithium Chemical compound [Li] WHXSMMKQMYFTQS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N Lys-Gly Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)NCC(O)=O HGNRJCINZYHNOU-LURJTMIESA-N 0.000 description 1
- ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N Lys-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN ATIPDCIQTUXABX-UWVGGRQHSA-N 0.000 description 1
- QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N Lys-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN QQPSCXKFDSORFT-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 1
- IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N Lys-Val-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N IKXQOBUBZSOWDY-AVGNSLFASA-N 0.000 description 1
- 229910021380 Manganese Chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L Manganese chloride Chemical compound Cl[Mn]Cl GLFNIEUTAYBVOC-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- DRXODWRPPUFIAY-DCAQKATOSA-N Met-Asn-Lys Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCCCN DRXODWRPPUFIAY-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- UZVKFARGHHMQGX-IUCAKERBSA-N Met-Gly-Met Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCSC UZVKFARGHHMQGX-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 101800000135 N-terminal protein Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 1
- 101800001452 P1 proteinase Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 244000179684 Passiflora quadrangularis Species 0.000 description 1
- 235000011266 Passiflora quadrangularis Nutrition 0.000 description 1
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 1
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 1
- CYZBFPYMSJGBRL-DRZSPHRISA-N Phe-Ala-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O CYZBFPYMSJGBRL-DRZSPHRISA-N 0.000 description 1
- HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N Phe-Gly-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 HNFUGJUZJRYUHN-JSGCOSHPSA-N 0.000 description 1
- GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N Phe-Phe Chemical compound C([C@H]([NH3+])C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C([O-])=O)C1=CC=CC=C1 GKZIWHRNKRBEOH-HOTGVXAUSA-N 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N Phosphorus Chemical compound [P] OAICVXFJPJFONN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N Pro-Leu-Thr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O VTFXTWDFPTWNJY-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N Pro-Phe Chemical compound C([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H]1NCCC1)C1=CC=CC=C1 IWIANZLCJVYEFX-RYUDHWBXSA-N 0.000 description 1
- PKHDJFHFMGQMPS-RCWTZXSCSA-N Pro-Thr-Arg Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O PKHDJFHFMGQMPS-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- 108010009736 Protein Hydrolysates Proteins 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 244000172730 Rubus fruticosus Species 0.000 description 1
- 241000702208 Shigella phage SfX Species 0.000 description 1
- 108010073771 Soybean Proteins Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N Thiamine Natural products CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N JZRWCGZRTZMZEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YLXAMFZYJTZXFH-OLHMAJIHSA-N Thr-Asn-Asp Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O YLXAMFZYJTZXFH-OLHMAJIHSA-N 0.000 description 1
- DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N Thr-Lys-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@@H](N)[C@@H](C)O)C(O)=O DXPURPNJDFCKKO-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 1
- IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N Thr-Phe Chemical compound C[C@@H](O)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 IQHUITKNHOKGFC-MIMYLULJSA-N 0.000 description 1
- NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N Thr-Ser-Ile Chemical compound [H]N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O NQQMWWVVGIXUOX-SVSWQMSJSA-N 0.000 description 1
- CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N Tyr-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O CNLKDWSAORJEMW-KWQFWETISA-N 0.000 description 1
- IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N Val-Ala-Gln Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N IZFVRRYRMQFVGX-NRPADANISA-N 0.000 description 1
- ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N Val-Ala-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(O)=O ASQFIHTXXMFENG-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- IVXJODPZRWHCCR-JYJNAYRXSA-N Val-Arg-Phe Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)O)N IVXJODPZRWHCCR-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N Val-Asp-Ala Chemical compound C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)N ISERLACIZUGCDX-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 1
- HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N Val-Asp-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N HZYOWMGWKKRMBZ-BYULHYEWSA-N 0.000 description 1
- FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N Val-Cys-Gly Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)NCC(O)=O FPCIBLUVDNXPJO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 1
- GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N Val-Glu-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N GBESYURLQOYWLU-LAEOZQHASA-N 0.000 description 1
- KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N Val-Gly-Thr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O KZKMBGXCNLPYKD-YEPSODPASA-N 0.000 description 1
- OJOMXGVLFKYDKP-QXEWZRGKSA-N Val-Met-Asp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N OJOMXGVLFKYDKP-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 1
- MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N Val-Pro-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1C(=O)[C@H](C(C)C)N)O MIKHIIQMRFYVOR-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- UJMCYJKPDFQLHX-XGEHTFHBSA-N Val-Ser-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O UJMCYJKPDFQLHX-XGEHTFHBSA-N 0.000 description 1
- ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N Val-Tyr-Val Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 ZNGPROMGGGFOAA-JYJNAYRXSA-N 0.000 description 1
- JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N Val-Val-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@H](C(C)C)N)O JVGDAEKKZKKZFO-RCWTZXSCSA-N 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000319304 [Brevibacterium] flavum Species 0.000 description 1
- 241000192370 [Candida] psychrophila Species 0.000 description 1
- 241000222295 [Candida] zeylanoides Species 0.000 description 1
- SLIUELDPAPMQIB-IDIVVRGQSA-N [Na].[Na].[C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(=O)(O)O)O1)N1C=NC=2C(O)=NC=NC12 Chemical compound [Na].[Na].[C@@H]1([C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(=O)(O)O)O1)N1C=NC=2C(O)=NC=NC12 SLIUELDPAPMQIB-IDIVVRGQSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 description 1
- UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N adenosine 5'-monophosphate Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(O)=O)[C@@H](O)[C@H]1O UDMBCSSLTHHNCD-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 1
- 229950006790 adenosine phosphate Drugs 0.000 description 1
- 230000001464 adherent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 108010041407 alanylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010005233 alanylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010011559 alanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000003863 ammonium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000002280 amphoteric surfactant Substances 0.000 description 1
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003945 anionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 1
- 108010052670 arginyl-glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010038633 aspartylglutamate Proteins 0.000 description 1
- 229910001626 barium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L barium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ba+2] WDIHJSXYQDMJHN-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000021029 blackberry Nutrition 0.000 description 1
- 238000009395 breeding Methods 0.000 description 1
- 230000001488 breeding effect Effects 0.000 description 1
- 102100022422 cGMP-dependent protein kinase 1 Human genes 0.000 description 1
- FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L calcium;3-[[(2s)-2,4-dihydroxy-3,3-dimethylbutanoyl]amino]propanoate Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-CTWWJBIBSA-L 0.000 description 1
- FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N carbamoyl phosphate Chemical compound NC(=O)OP(O)(O)=O FFQKYPRQEYGKAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000001768 carboxy methyl cellulose Substances 0.000 description 1
- 235000010948 carboxy methyl cellulose Nutrition 0.000 description 1
- 239000008112 carboxymethyl-cellulose Substances 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 1
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M chloromercury Chemical compound [Hg]Cl RCTYPNKXASFOBE-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L copper(II) chloride Chemical compound Cl[Cu]Cl ORTQZVOHEJQUHG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 1
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 1
- 108010016616 cysteinylglycine Proteins 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 230000030609 dephosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006209 dephosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical class CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N diphosphoric acid Chemical compound OP(O)(=O)OP(O)(O)=O XPPKVPWEQAFLFU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000013890 disodium inosinate Nutrition 0.000 description 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 150000004665 fatty acids Chemical class 0.000 description 1
- VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N festuclavine Chemical compound C1=CC([C@H]2C[C@H](CN(C)[C@@H]2C2)C)=C3C2=CNC3=C1 VLMZMRDOMOGGFA-WDBKCZKBSA-N 0.000 description 1
- 238000007667 floating Methods 0.000 description 1
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000012215 gene cloning Methods 0.000 description 1
- 238000012252 genetic analysis Methods 0.000 description 1
- 108010080575 glutamyl-aspartyl-alanine Proteins 0.000 description 1
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 1
- VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N glycyl-DL-alpha-alanine Natural products OC(=O)C(C)NC(=O)CN VPZXBVLAVMBEQI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N glycylglycine Chemical compound [NH3+]CC(=O)NCC([O-])=O YMAWOPBAYDPSLA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010020688 glycylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 210000001822 immobilized cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000002372 labelling Methods 0.000 description 1
- 108010000761 leucylarginine Proteins 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 229910052744 lithium Inorganic materials 0.000 description 1
- 101150035025 lysC gene Proteins 0.000 description 1
- 108010003700 lysyl aspartic acid Proteins 0.000 description 1
- 108010017391 lysylvaline Proteins 0.000 description 1
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 1
- 150000002696 manganese Chemical class 0.000 description 1
- 239000011565 manganese chloride Substances 0.000 description 1
- 235000002867 manganese chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- BQPIGGFYSBELGY-UHFFFAOYSA-N mercury(2+) Chemical compound [Hg+2] BQPIGGFYSBELGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 108091005573 modified proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000035118 modified proteins Human genes 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 229940066779 peptones Drugs 0.000 description 1
- CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N phenyl phosphate Chemical compound OP(O)(=O)OC1=CC=CC=C1 CMPQUABWPXYYSH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010073025 phenylalanylphenylalanine Proteins 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 239000011574 phosphorus Substances 0.000 description 1
- 229910052698 phosphorus Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000002743 phosphorus functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000000865 phosphorylative effect Effects 0.000 description 1
- 229920001983 poloxamer Polymers 0.000 description 1
- 229920000137 polyphosphoric acid Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 108010070643 prolylglutamic acid Proteins 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 239000003531 protein hydrolysate Substances 0.000 description 1
- 229940005657 pyrophosphoric acid Drugs 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000001172 regenerating effect Effects 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 1
- 102220277134 rs776745497 Human genes 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- ZEDAGFBWUVYFQU-UHFFFAOYSA-M sodium;3-morpholin-4-ylpropane-1-sulfonate;hydrate Chemical compound [OH-].[Na+].OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 ZEDAGFBWUVYFQU-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 229940001941 soy protein Drugs 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 230000001629 suppression Effects 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009897 systematic effect Effects 0.000 description 1
- 235000019157 thiamine Nutrition 0.000 description 1
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 description 1
- 239000011721 thiamine Substances 0.000 description 1
- KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N thiamine Chemical compound CC1=C(CCO)SCN1CC1=CN=C(C)N=C1N KYMBYSLLVAOCFI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 150000003672 ureas Chemical class 0.000 description 1
- 108010073969 valyllysine Proteins 0.000 description 1
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 1
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 1
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 1
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 1
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 1
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
- C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
- C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
- C12P19/28—N-glycosides
- C12P19/30—Nucleotides
- C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
12R 1/19 Sposób wytwarzania kwasu 5’-inozynowego lub 5’-guanylowego, stransformowany mikroorganizm, zrekombinowany DNA, bialko oraz gen PL PL PL
Description
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'guanylowego, stransformowany mikroorganizm, zrekombinowany DNA, białko oraz gen.
W celu produkcji kwasu 5'-inozynowego przy użyciu mikroorganizmów fosforylujących inozynę dotychczas opracowano sposób stosujący fosforan p-nitrofenylu (japońska publikacja patentowa nr 29,858/1964), sposób stosujący nieorganiczne kwasy fosforowe (japońska publikacja patentowa nr 1,186/1967 i 44,350/1974), sposób z zastosowaniem fosforanu acetylu (japońskie wyłożone zgłoszenie patentowe nr 82,098/1981) i sposób z zastosowaniem ATP (japońskie wyłożone zgłoszenie patentowe nr 230,094/1988). Jednak akumulacja kwasu 5'inozynowego produkowanego tymi sposobami nie była zadawalająca. Dla ulepszenia metod fosforylowania inozyny za pomocą ATP opracowano metodę (WO 91/08286), która obejmuje otrzymywanie genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową z Escherichia coli, przygotowanie szczepu E.coli mającego zwiększoną aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej techniką rekombinacji DNA i fosforylowania inozyny lub guanozyny przy użyciu tego szczepu w celu wytworzenia kwasu 5'-inozynowego lub 5'-guanylowego. Jednak, sposób ten wymaga, aby mikroorganizm do regenerowania ATP do zużycia podczas reakcji był oddzielnie hodowany i żeby jego komórki dodawane były do roztworu. Tak więc, potrzebny był bardziej wydajny sposób otrzymywania kwasu 5'-inozynowego lub 5'-guanylowego.
Ponadto wiadomo jedynie, że gen kinazy inozynowo-guanozynowej obecny jest w niektórych mikroorganizmach takich jak E. coli [J.Gen.Microbiol., 135, 1263-1273 (1989)].
Celem wynalazku było opracowanie bardziej wydajnego sposobu wytwarzania kwasu 5'-inozynowego i/lub 5'-guanylowego. Okazało się, że kwas 5'-inozynowy i/lub 5'-guanylowy może być z łatwością wytwarzany z dużą wydajnością przez wprowadzenie genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową do mikroorganizmu mającego dostateczną zdolność regenerowania zużywanego ATP w trakcie reakcji. Znaleziono również nową kinazę inozynowoguanozynową mającą sekwencję aminokwasową różną od kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzącej z E.coli.
Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'guanylowego, charakteryzujący się tym, że kontaktuje się stransformowany mikroorganizm mający zdolność reprodukowania ATP, posiadający gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, z inozyną, guanozynąlub ich prekursorem, źródłem energii i donorem fosforanu, a następnie wydziela się kwas 5'-inozynowy lub kwas 5'-guanylowy.
Korzystnie, stosuje się mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Saccaromyces, Staphylococcus lub Candida, a najkorzystniej - Corynebacterium ammoniagenes.
W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się mikroorganizm, który jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen z Exiguobacterium acetylicum lub Escherichia coli. Gen ten ma sekwencję aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów może być usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest stransformowany mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Sacharomyces, Staphylococcus lub Candida mający zdolność reprodukowania ATP posiadający gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
Część aminokwasów w tych sekwencjach może być usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
Korzystnie, mikroorganizm ten należy do Corynebacterium ammoniagenes.
184 520
Korzystnie, gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej ma sekwencję nukleotydową nr 1 lub 14 w liście sekwencji.
Korzystnie, gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej ma sekwencję nukleotydową nr 10 w liście sekwencji.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej .
Część aminokwasów w białku kodowanym przez zrekombinowany DNA według wynalazku może być usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowaniu jego aktywności.
Korzystnie, zrekombinowany DNA według wynalazku obejmuje gen o sekwencji nukleotydów nr 1 lub 14 w liście sekwencji.
Korzystnie, zrekombinowany DNA według wynalazku obejmuje gen o sekwencji nukleotydów nr 10 w liście sekwencji.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
Część aminokwasów w białku według wynalazku może być usunięta, zastąpiona lub dodana przy zachowaniu jego aktywności.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji.
Korzystnie, gen według wynalazku pochodzi z Exiguobacterium acetylicum i ma sekwencję nukleotydów nr lw liście sekwencji lub pochodzi z Exiguobacterium aurantiacum i ma sekwencję nukleotydów nr 14 w liście sekwencji.
Gen według wynalazku może też mieć sekwencję nukleotydów nr 10 w liście sekwencji i pochodzić z Escherichia coli.
Obecny wynalazek obejmuje sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'guanylowego do stosowania w sezonowaniu lub podobnych z inozyny lub guanozyny lub ich prekursorów z łatwością i z dużą wydajnością. Bardziej szczegółowo wynalazek obejmuje sposób, w którym gen kodujący białko, który ma działanie przekształcające inozynę i/lub guanozynę do kwasu 5'-inozynowego i/lub kwasu 5'-guanylowego wprowadza się do mikroorganizmu mającego zdolność regenerowania ATP zużywanego podczas reakcji, na skutek czego kwas 5'-inozynowy i/lub kwas 5'-guanylowy z łatwością otrzymuje się sprawnie z dużą wydajnością jedynie w obecności mikroorganizmu mającego wprowadzony w siebie gen, bez oddzielnego hodowania innego mikroorganizmu do regenerowania ATP zużywanego podczas reakcji, w celu dodawania go do roztworu reakcyjnego.
Dalej, obecny wynalazek obejmuje nowe białko, które otrzymuje się z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum, które ma działanie przekształcające inozynę i guanozynę do kwasu 5'-inozynowego i 5'-guanylowego, odpowiednio, gen kodujący to białko, rekombinacyjne DNA zawierający ten gen, mikroorganizm, który jest przekształcony wymienionym rekombinacyjnym DNA, sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego i/lub 5'guany-lowego przy użyciu tego mikroorganizmu.
Białko według wynalazku jest nowe, ponieważ sekwencja aminokwasowa białka według wynalazku jest całkowicie różna od znanego białka mającego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej. Kinaza inozynowo-guanozynowa pochodząca od E. coli jest już znana. Obecni wynalazcy odkryli, że białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej jest również produkowane w mikroorganizmach należących do rodzaju Exiguobac.terium, który nie był dotychczas znany jako posiadający aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej i z powodzeniem wyodrębnili to białko i klonowali gen kodujący to białko. Białko to różni się od znanych białek pod względem sekwencji aminokwasowej.
Po raz pierwszy zostało stwierdzone przez obecnych wynalazców, że białko mające sekwencję aminokwasową całkowicie różną od sekwencji znanego białka o aktywności inozynowo-guanozynowej ma taką aktywność inozyno wO-guanozynowajak znane białko.
Białko otrzymane z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej ma następujące właściwości:
184 520
1. Działanie
Enzym przenosi grupę fosforanową do nukleozydu w obecności donora fosforanu i formuje 5'-monofosforan nukleozydu.
2. Specyficzność substratu
Grupa fosforanowa w pozycji γ trifosforanu nukleozydu jest przeniesiona do innego nukleozydu
3. Optymalne pH pH 7,7 - 9,9.
4. Stabilność pH pH 6,7-12,1.
5. Optymalna temperatura
- 50°C.
6. Zapotrzebowanie na metal
Jon magnezu, jon manganu, jon kobaltu i jon żelaza
7. Wpływ jonów metalu
Aktywność enzymu jest silnie hamowana przez jon miedzi i jon rtęci, oraz jest również hamowana przez jon cynku i jon kadmu.
8. Wartość Km
Wartość Km wynosi 0,03 mM dla guanozyny, 1 mM dla inozyny i 1,6 mM dla ATP gdy jako substrat stosowano guanozynę.
9. Ciężar molowy
Enzym ma ciężar cząsteczkowy około 36 kilodaltonów według pomiaru za pomocą elektroforezy na żelu SDS-poliakryloamid.
W opisie aktywność fosforylowania inozyny i guanozyny za pomocą ATP i tworzenia kwasu 5'-inozynowego i 5'-guanylowego, odpowiednio, określana jest jako „aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej”. Białko posiadające tę aktywność oznaczane jest jako „kinaza inozynowo-guanozynowa”. Mikroorganizm mający wystarczającą zdolność regenerowania zużywanego ATP podczas reakcji oznaczany jest jako „szczep produkujący ATP”.
Wynalazek zostanie opisany poniżej bardziej szczegółowo.
Kinaza inozynowo-guanozynowa według wynalazku stanowi enzym, który katalizuje reakcję fosforylowania inozyny i guanozyny za pomocą ATP lub podobnych i tworzenia odpowiednio kwasu 5'-inozynozynowego i kwasu 5'-guanylowego. Pochodzenie enzymu nie jest szczególnie ograniczone, ale korzystna jest kinaza inozynowo-guanozynowa pochodząca z mikroorganizmu. Obejmuje ona nie tylko nowy enzym otrzymany z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum lub podobnego, ale również znaną kinazę inozynowoguanozynową otrzymaną z E.coli.
Nowe białko, które może być otrzymane z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum lub podobnego i które ma aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, może być otrzymane przez hodowanie mikroorganizmu, rozerwanie otrzymanych komórek w celu sporządzenia surowego ekstraktu enzymu i przez oczyszczenie enzymu z surowego ekstraktu enzymu. Jako przykład takiego mikroorganizmu można wymienić Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.
Taksonomicznie Exiguobacterium acetylicum nazwane zostało Brevibacterium acetylicum [Bergey's Manuał of Systematic Bacteriology, str. 1301-1313 (1986)]. Jednakże, w wyniku analizy genetycznej proponuje się, aby Brevibacterium acetylicum zostało przeniesione do rodzaju Exiguobacterium jako Exiguobacterium acetylicum [Int.J.Syst.Bacteriol., 44, 74-82 (1994)].
Kinaza inozynowo-guanozynowa może być oczyszczana każdą metodą, która nie wpływa niekorzystnie na aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej. Oczyszczanie na ogół przeprowadza się za pomocą cieczowej chromatografii kolumnowej. W szczególności można stosować kombinację jonowymiennej chromatografii kolumnowej stosując gradient stężenia chlorku potasu, hydrofobowej chromatografii kolumnowej stosując gradient stężenia siarczanu amonu 1 absorpcyjnej chromatografii kolumnowej stosując gradient stężenia buforu fosforanowego.
184 520
Enzym według wynalazku, który może być otrzymany z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum, i który ma aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, ma następujące własności.
1. Działanie
Enzym przenosi grupę fosforanową do nukleozydu w obecności donora fosforanu i tworzy 5'-monofosforan nukleozydu.
Donor fosforanu jest trifosforanem nukleozydu. Przykładami trifosforanu nukleozydu są ATP, trifosforan 2'-dezoksyadenozyny, trifosforan guanozyny, 2'-trifosforan dezoksyguanozyny i trifosforan tymidyny.
Przykładami nukleozydu, do którego przenoszona jest grupa fosforanowa są inozyna, guanozyna i 2'-dezoksyguanozyna.
5'-monofosforan nukleozydu obejmuje estry 5'-monofosforanu wyżej wymienionych nukleozydów i 5'-inozynian, 5'-guanylan, 2'-dezoksy-5'-guanylan itd..
2. Specyficzność substratu
Grupa fosforanowa w pozycji trifosforanu nukleozydu jest przenoszona do innego nukleozydu.
Przykłady trifosforanu nukleozydu obejmują ATP, trifosforan 2'-dezoksyadenozyny, trifosforan guanozyny, trifosforan 2'-dezoksyguanozyny i trifosforan tymidyny.
Przykładami innego nukleozydu, do którego przenoszona jest grupa fosforanowa są inozyna, guanozyna i 2'-dezoksyguanozyna.
3. Optymalne pH
Optymalne pH wynosi pomiędzy 7,7 i 9,9.
4. Stabilność w pH
Aktywność jest ustabilizowana w pH w zakresie pomiędzy 6,7 i 12,1.
5. Optymalna temperatura
Optymalna temperatura jest pomiędzy 30 a 50°C.
6. Trwałość temperaturowa
Enzym jest nieaktywny w temperaturze 40°C i wyższej.
7. Zapotrzebowanie na metale
Dla postępu reakcji wymagane są jony metali. Reakcja zachodzi w obecności jonu magnezowego, jonu manganowego, jonu kobaltowego lub jonu żelaza.
8. Wpływ jonów metali
Aktywność enzymu jest silnie inhibitowana jonami miedzi i jonami rtęci, a także jonami cynku i jonami kadmu.
9. Wartość Km
Wartość Km wynosi 0,03 mM dla guanozyny, 1 mM dla inozyny i 1,6 mM dla ATP gdy substratem jest guanozyna.
10. Ciężar molowy
Enzym ma ciężar cząsteczkowy około 36 kilodaltonów według pomiaru za pomocą elektroforezy na żelu SDS-poliakryloamidowym.
Fragment DNA zawierający gen strukturalny kodujący białko posiadające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej można uzyskać znaną metodą przy użyciu oczyszczonego białka. Przykłady znanych metod obejmują sposób, w którym przygotowuje się przeciwciała skierowane przeciw wymienionemu białku i przy ich pomocy przeszukuje się ekspresyjną bibliotekę genów chromosomalnych, oraz sposób, w którym analizuje się sekwencję aminokwasową wymienionego białka. Jako sekwencję aminokwasową, rozumie się wewnętrzną sekwencję aminokwasową wyznaczoną z polipeptydu uzyskanego przez trawienie białka odpowiednią proteinazą, w połączeniu z N-końcową sekwencją aminokwasową białka. Przykłady sondy obejmują oligonukleotydy syntetyzowane w oparciu o N-końcową sekwencję aminokwasową lub wewnętrzną sekwencję aminokwasową białka, sondy uzyskane przez amplifikację regionu odpowiadającego N-końcowej sekwencji aminokwasowej lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) przy użyciu oligonukleotydów syntetyzowanych na bazie sekwencji, oraz sond uzyskanych przez amplifikację części białka od regionu N-końcowego do wewnętrznej sekwencji aminokwasowej
184 520
Ί przy użyciu oligonukleotydów syntetyzowanych na bazie N-końcowej sekwencji aminokwasowej i wewnętrznej sekwencji aminokwasowej jako primerów. Ponadto, istnieje metoda, w której chromosom liguje się z dwuniciowym oligonukleotydem nazywanym „kasetą”, a żądany fragment uzyskiwany jest przez PCR przy użyciu primera z oligonukleotydu utworzonego według N-terminalnej sekwencji aminokwasowej i primera utworzonego według sekwencji DNA kasetki.
Dokładniej, gen kodujący białko posiadające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej Exiguobacterium acetylicum może być uzyskany przez zwielokrotnienie fragmentu DNA odpowiadającego N-końcowemu regionowi przy użyciu PCR, syntetyzując primer oparty na fragmencie DNA, i zwielokrotniając fragment przy użyciu PCR z kasetą.
Określona sekwencja 28 aminokwasów końca N białka uzyskanego z Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 reprezentowana jest przez SEQ ID NO: 3 w Wykazie Sekwencji. Aminokwas 18 nie został zidentyfikowany.
Sądząc po N-końcowej sekwencji aminokwasowej, białko Exiguobacterium acetylicum jest raczej różne od znanej kinazy inozynowo-guanozynowej otrzymywanej z E.coli jak to opisano w WO 91/08286.
W celu uzyskania żądanego genu, DNA kodujące N-terminalną część białka mającego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej jest specyficznie zwielokrotniony przez PCR przy użyciu primera syntetyzowanego na bazie wyżej wspomnianej N-terminalnej sekwencji aminokwasowej i przy użyciu chromosomu mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum jako matrycy, i klonowany.
Zwykle używany jest primer, w którym skład zasad jest dowolny, zawartość G+C wynosi w przybliżeniu 50%, i nie powstaje żadna specyficzna struktura drugorzędowa, łańcuchy nie są komplementarne w stosunku do siebie, a długość wynosi od 16 do 30 zasad. Sekwencje primerów ulokowane są na obu końcach sekwencji nukleotydowej odpowiadającej N-końcowemu regionowi białka i pokazane są w SEQ ID No: 4 i 5 w Wykazie Sekwencji.
W SEQ ID No: 4, szósty nukleotyd jest mieszaniną T i C, dziewiąty nukleotyd jest mieszaniną A i G, dwunasty nukleotyd jest mieszaniną T, C i A, piętnasty nukleotyd jest mieszaniną T, C, A i G. Oraz w SEQ ID No:5, nukleotydy trzeci i dwunasty są mieszaniną T i C, szósty nukleotyd jest mieszaniną T, C, A, i G, dziewiąty nukleotyd i piętnasty są mieszaniną A i G.
Następnie, chromosom mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum jest przecinany odpowiednią endonukłeazą restrykcyjną. Fragment restrykcyjny liguje z kasetą tworząc matrycę. Fragment DNA zawierający część strukturalnego genu lub górny region białka mającego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej jest specyficznie amplifikowany techniką PCR przy użyciu wspomnianej matrycy i primera syntetyzowanego według sekwencji nukleotydowej odpowiadającej N-końcowej sekwencji aminokwasowej i primera syntetyzowanego według kasetki, i jest następnie klonowany. Można w tym celu wykorzystać primer, spełniający wyżej wymienione warunki, przedstawiony w SEQ ID NO: 6 i 7 w Wykazie Sekwencji.
Wektor który ma zdolność autonomicznego replikowania się w E.coli używany jako gospodarz można zastosować jako wektor użyteczny do klonowania genu. Przykłady wektora obejmują: pUC19, pHSG298, pHSG398 ipBR.322. Dowolny szczep odpowiedni do replikowania wektora może być użyty jako szczep gospodarza przyjmujący powstały rekombinowany DNA. Przykłady szczepów gospodarza obejmują szczepy E. coli takie jak HB101, JM109 i DH5.
Sekwencja nukleotydową genu kinazy inozynowo-guanozynowej obecnego we fragmencie DNA wstawionym do DNA wektora i sekwencja aminokwasowa białka kodowanego przez ten gen może być określona przez zanalizowanie sekwencji nukleotydowej tego fragmentu DNA. Sekwencja nukleotydową i sekwencja aminokwasowa kinazy inozynowoguanozynowej Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 są reprezentowane odpowiednio przez SEQ ED NO: li 2 w Wykazie Sekwencji.
Białko obecnego wynalazku zawiera około 303 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa wynosi w przybliżeniu 32,5 kilodaltonów.
184 520
Białko obecnego wynalazku zawiera nie tylko białko reprezentowane przez SEQ ID NO: 2 w Wykazie Sekwencji ale także białka otrzymywane z innych szczepów należących do Exiguobacterium acetylicum i innych naturalnych mutantów które mają aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
Ponadto, jasnym jest dla znawców dziedziny, że białka w których część sekwencji aminokwasowej jest zastępowana lub usuwana, białka, w których aminokwasy są dodawane oraz częściowo zmodyfikowane białka mogą być stosowane dopóki białka te posiadają aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
Zamiast genu pochodzącego z Exigubacterium acetylicum można zastosować gen, który posiada zdolność hybrydyzowania wymienionego genu, o ile nadal koduje kinazę inozynowoguanozynową.
Gen, posiadający zdolność hybrydyzowania genu derywowanego z Exiguobacterium acetylicum może być uzyskany z następujących szczepów.
Exiguobacterium auratiacum ATCC 35652
Kurthia gibsonii ATCC 43195
Kurthia zopfii JCM 6101
Gen taki jak wspomniany wyżej może być uzyskany znaną metodą przy zastosowaniu zasady hybrydyzacji - homologii. W szczególności, można zastosować następujący sposób.
Najpierw, chromosomowy DNA dowolnego z wyżej wymienionych mikroorganizmów przecina się odpowiednią endonukleazą restrykcyjną, a rozszczepione fragmenty poddaje elektroforezie na żelu agarozowym. Rozszczepione fragmenty nakrapia się na odpowiedni filtr do transferu. Homologiczne fragmenty są wykrywane przez hybrydyzację Southema przy zastosowaniu genu kinazy inozynowo-guanozynowej derywowanego z Exiguobacterium acetylicum jako sonda do określenia wielkości fragmentów.
Spośród fragmentów uzyskanych po trawieniu endonukleazą restrykcyjną, fragmenty posiadające odpowiednią wielkość oczyszcza się. Oczyszczanie jest zwykle przeprowadzone przez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy lub odzyskiwanie z żelu agarozowego za pomocą sproszkowanego szkła glass powder. Oczyszczone fragmenty ligowane są z odpowiednim wektorem, a szczep E.coli transformuje się tak uzyskanym rekombinacyjnym wektorem. Klon zawierający określony fragment posiadający gen kinazy inozynowoguanozynowej może zostać wyselekcjonowany spośród powstałych transformantów przy zastosowaniu metody hybrydyzacji kolonii.
W obecnym wynalazku, zamiast wyżej wspomnianego genu kodującego nową kinazę inozynowo-guanozynową można zastosować gen kodujący znaną kinazę inozynowoguanozynową.
Jako znany gen kinazy inozynowo-guanozynowej można zastosować gen uzyskany z E.coli (J. Gen. Microbiol., 135, 1263-1273 (1989); J. Bacteriol. 177, 2236 - 2240 (1995)), i można go otrzymać na przykład z E.coli ATCC 27325.
Znany gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową można otrzymać znaną metodą. Gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową, który może być zastosowany w obecnym wynalazku, można także uzyskać z chromosomowego DNA E.coli ATCC 27325 wykorzystując następujący sposób.
Najpierw syntetyzuje się primery według sekwencji genu kinazy inozynowoguanozynowej pochodzącej z E.coli jak pokazano w SEQ ID No: 10 w Wykazie Sekwencji (WO 91/08286). Zwykle używa się primerów, w których skład zasad jest dowolny, zawartość G+C wynosi około 50%, nie tworzy się żadna specyficzna struktura drugorzędowa, łańcuchy nie są komplementarne w stosunku do siebie, a długość wynosi od 15 do 30 zasad. Sekwencje primerów lokują się na obu końcach strukturalnego genu kinazy inozynowoguanozynowej jak to jest pokazane w SEQ ID Nos. 11 i 12.
Następnie, strukturalny gen kinazy inozynowo-guanozynowej amplifikowany jest z chrosomalnego DNA E.coli przez PCR przy użyciu tych primerów i klonowany. Stosuje się wektor derywowany z E.coli, taki jak pUCl9 i pBR322. Dowolny szczep przyjmujący odpowiedni do replikacji wektora można zastosować dla powstałego rekombinacyjnego DNa. Przykłady tego przyjmującego szczepu obejmują szczepy E.coli takie jak HB101, JM109
184 520
DH5. W ten sposób uzyskuje się rekombinacyjny wektor, posiadający wstawienie fragmentu DNA zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej E.coli.
Gen, który jest homologiczny do wyżej wspomnianego genu derywowanego z E.coli 1 jest zdolny do hybrydyzacji genu może zostać użyty, jak w Exiguobacterium acetylicum, o ile taki gtn kgdnje kinazę ina/ynowo-guaoozynowy.
Tak uzoseano' fragment DNA zawierający gen kodujący białko posiadające aktywność Μοα20 1no/ynowo-guano/onowej wprowadza się do komórki gospodarza, która może regenerować ATP po jego ponownej rekombinacji z innym odpowiednim wektorem lub wprowadzeniu miejsca początku replikacji.
Mikroorganizm posiadający wystarczającą zdolność regenerowania zużytego w reakcji ATP z prekursora ATP (zdolność wytwarzania ATP) używany jest jako komórka gospodarza.
W obecnym wynalazku, mikroorganizm posiadający zdolność produkowania ATP może być dowolnym mikroorganizmem posiadającym zdolność regenerowania zużytego ATP w reakcji przekształcania inozyny i/lub guanozyny w kwas 5'-ioozynowy i/lub 5'-guanylowy z prekursora ATP w układzie reakcji poprzez który reakcja może zajść. Przykłady tego mikroorganizmy obejmują mikroorganizmy należące do rodzaju Corynebacterium,
Escherichia, Staphylococcus, Saccharomyces lub Candida. Mikroorganizmy oaldżące do Corynebacterium ammoniagenes, które mają wysoką zdolność produkowania ATP są szczególnie korzystne.
Przypadkowo, Corynebacterium ammoniagenes został sklasyfikowany wcześniej jako Brevibacterium ammoniagenes.
Konkretne przykłady mikroorganizmów posiadających zdolność wytwarzania ATP, użyte w obecnym wyoalaz.ku, są to szczepy pokazane poniżej oraz derywowane z oich mutanty.
Corynebacterium ammoniagenes (poprzednia nazwa: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 6872
Corynebacterium ammoniagenes (poprzednia oazwa: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 21295
Corynebacterium ammoniagenes (ppprzednia nazwa: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 21477
Corynebacterium glutamicum ATCC 13020
Corynebacterium glutamicum (poprzednia nazwa: Brevibacterium flavum)
ATCC 14067
Corynebacterium glutamicum (poprzednia nazwa: Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869
Escherichia coli B (ATCC 11303)
Ssaccharomyces cerevisiae ATCC 20018
Staphylococcus aureus ATCC 4012
Candida zeylanoides ATCC 20356
Candida psychropila (poprzednia nazwa: Torulopsis psychrophila)
ATCC 22163
Ponadto, korzystne są mikroorganizmy posiadające zdolność wytwarzania ATP w Których aktywność degradująca inozyny 1/lub guanozyny jest słaba lub jej brak. Następujące mikroorganizmy wybrane są spośród wyżej wspomnianych mikroorganizmów.
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21295
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477
Jako mieroorgaoi/mo wytwarzające ATP w obecnym wynalazku mogą także być użyte szczepy posiadające zdolność wytwarzania inozyny lub guanozyny z prekursora inozyny lub gua-ozyny jako dodatek do zdolności wytwarzania ATP. W tym przypadku, kwas 5'ii-ozyoowy lub kwas 5'-guanylowy może być wytworzony z prekursora inozyny lub guanozyoy zamiast inozyny lub guanozyny. Przykłady tego prekursora obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, melasa, hydrolizat skrobi, kwasy organiczne takie jak kwas octowy, i alkohole takie jak glicerol 1 etanol.
184 520
Szczepy wytwarzające ATP, posiadające zdolność wytwarzania inozyny lub guanozyny obejmują:
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21478
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21480
Wektor, do którego jest Integrowany gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową nie jest szczególnie ograniczony, jeśli może być replikowany w szczepach wytwarzających ATP, które są szczepami przyjmującymi. Na przykład, gdy bakterie należące do rodzaju Corynebacterium są stosowane jako szczepy wytwarzające ATP, wymienia się plazmidy które mogą być autonomicznie replikowane w tych bakteriach. Konkretne ich przykłady obejmują pAM330 (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 67,699/1983), pHMl5l9 (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 77,895/1983), pAJ655, pAJ6l1, pAJ1844 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 192,900/1983), pCGl, (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 13-4,500/1982), pCG2 (Japońskie Wyłożeniowe - Zgłoszenie Patentowe Nr 35,197/1983), pCG4, pCGll (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 183,799/1982), pGAl [Gen, 1θ7,69 (1991)], pHK4, i pHC4 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 7,491/1993). Gdy Escherichia coli używana jest jako szczep wytwarzający ATP, można zastosować na przykład plazmid ColEl, plazmid P15A, plazmid czynnika R, plazmid czynnika F, oraz plazmid fagowy. Konkretne ich przykłady obejmują pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pACYC184 [J. Bacteriol, 134, 1141 (1978)], ipSCIOl [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 70, 3240, (1973) ]. Gdy Saccharomyces cerevisiae użyty jest jako szczep wytwarzający ATP, można zastosować plazmid YEp, plazmid YCp, plazmid Yrp oraz Ylp. Konkretne ich przykłady obejmują Yep24, Yrp7 1 Ycp5o. Gdy Staphylococcus aureus używany jest jako szczep wytwarzający ATP, może zostać użyty pRIT5 [EMBO J, 4, 1075 (1985)].
W celu ekspresji genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową przy wysokiej częstotliwości, korzystnym jest aby sekwencja promotora i sekwencja SD były ulokowane powyżej genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową. Metoda wprowadzania tych sekwencji nie jest szczególnie ograniczona. Sekwencja promotora i sekwencja SD mogą być wprowadzone za pomocą metody, w której wyżej wspomniany gen jest wprowadzany poniżej tych sekwencji przy użyciu wektora posiadającego te sekwencje, lub metody w której te sekwencje są syntezowane i wprowadzane powyżej powyższego genu. Sekwencja promotora i sekwencja SD nie są szczególnie ograniczone. Kiedy bakterie z rodzaju Corynebacterium użyte są jako szczepy wytwarzające ATP, można wymienić promotory tac, lac, Itrp derywowane z E.coli, promotor trp derywowany z bakterii rodzaju Corynebacterium [Gene, 53, 191 (1987)], promotor fda [Mol. Mocrobiol., 3, 1625 (1989)], promotor ppc [Gene, 77, 237 (1989)], promotor lysC (Mol. Microbiol., 6, 317 (1992)] 1 promotory cspl i csp2 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe 502, 548/1994). Kiedy jako szczep wytwarzający ATP stosuje się Escherichia coli można wymienić promotory tac, lać, i trp derywowane z E.coli, i promotor PL faga X Kiedy jako szczep wytwarzający ATP użyte jest Saccharomyces cerevisiae, można wymienić promotory ADH1, ENO1, PKG1, GAP-DH, GALI, GALIO, GAL7, PH05 i MFa 1. Kiedy jako szczep wytwarzający ATP jest użyty Staphylococcus aureus, można wymienić promotor spa [J. Bacteriol., 159, 713 (1984)].
Sposób wprowadzania do mikroorganizmu wytwarzającego ATP rekomblnowanego DNA zawierającego gen kodujący białko posiadające aktywność przekształcania Inozyny 1/lub guanozyny w kwas 5'-inozynowy I/lub kwas 5'-guanylowy nie jest szczególnie ograniczony. Wprowadzenie to może być wykonane za pomocą zwykłej metody. Na przykład, kiedy bakterie rodzaju Corynebacterium stosowane są jako szczep wytwarzający ATP, szczególnie skuteczna jest metoda protoplasty (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 183, 799/1982) 1 elektroporacji (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 207, 791/1990). Kiedy jako szczep wytwarzający ATP użyta jest Escherichia coli, można zastosować metodę chlorku wapnia [J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], metodę Hanahana [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)], metodę SEM (Gen , 96, 23 (1990)}, metodę Chung i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2172 (1989)], 1 elektroporacji [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988). Istnieje me184 520 toda, w której DNA wprowadzane jest przez przygotowanie komórek kompetentnych z komórek na etapie rozwoju jak podano w odniesieniu do Bacillus subtilis [Gene, 1, - 153 (1977)]. Alternatywnie, można zastosować metodę w której komórki przyjmującego szczepu DNA są formowane w protoplasty lub sferoplasty, które łatwo wchłaniaj ą rekombinowany DNA, i rekombinowany DNA wprowadza Bacillus subtilis się do tego szczepu przyjmującego DNA, jak podano w odniesieniu do, promieniowców, i drożdży [Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979), Naturę, 274, 398 (1978), i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]. Kiedy Saccharomyces cerevisiae użyta jest jako szczep wytwarzający ATP, rekombinowany DNA można wprowadzić za pomocą metody sferoplastu {Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75, 1929 (1978)], metody octanu litu [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], lub elektroporacji [Methods in Enzymology, l94, 182 (1991)]. Kiedy jako szczep wytwarzający ATP zastosowano Staphylococcus aureus, wprowadzenie rekombinantu DNA może się odbyć za pomocą metody protoplasty. [Plasmid, 5, 292 (1981)].
W metodzie protoplasty, wysoką wydajność można otrzymać wymienionym sposobem, który jest stosowany w Bacillus subtilis. Jednak, jak ujawniono w japońskim wyłożonym zgłoszeniu patentowym nr 183,799/1982, można również wykorzystać sposób, w którym DNA wprowadza się do protoplastów komórek bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium będących w kontakcie bądź z glikolem polietylenowym bądź z alkoholem poliwinylowym i jonami dwuwartościowego metalu. Pobór DNa można wzmóc przez dodanie karboksymetylocelulozy, dekstranu, Ficolu lub Pluronic (produkcji Serva Co.) lub podobnych, zamiast glikolu polietylenowego lub alkoholu poliwinylowego.
Rekombinowany DNA może być wprowadzony do szczepu biorcy metodą elektroporacji (nawiązanie do japońskiego wyłożonego opisu patentowego nr 207,791/1990). Metoda transformacji stosowana w przykładach jest elektroporacją.
Ponadto, gen kinazy inozynowo-guanozynowej może być zintegrowany z chromosomalnym DNA mikroorganizmu produkującego ATP.
Sposób integrowania tego genu do chromosomalnego DNA nie jest szczególnie ograniczony. Na przykład, wrażliwy na temperaturę początek replikacji pochodzący z bakterii rodzaju Corynebacterium, gen kinazy inozynowo-guanozynowej i marker, dający oporność na antYbiotyk taki jak chloramfenikol, wprowadza się do wektora plazmidu tworząc rekombinantowy DNA. Bakterię rodzaju Corynebacterium transformuje się tym rekombinantowym DNA. Transformant hoduje się w środowisku zawierającym antybiotyk w temperaturze, w której nie funkcjonuje początek replikacji wrażliwej na temperaturę, do utworzenia szczepu transformanta, w którym rekombinowane DNA zostało zintegrowane z chromosomalnym DNA [J.Bacteriol., 162, 1196 (1985), i japońskie wyłożone zgłoszenie patentowe nr 7,49l/1993]. Może być również stosowana metoda stosująca ruchomy element genetyczny pochodzący od bakterii rodzaju Corynebacterium [Mobile Genetic Elements, Academic Press, New York (1983) i WO 93/18151].
Kinaza inozynowo-guanozynowa może być wytwarzana na wysokim poziomie przez hodowanie tak otrzymanego transformanta według wynalazku, do którego wprowadzono rekombinowany DNA zawierający gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowoguanozynowej, w zwykłym środowisku hodowlanym zawierającym źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne i ewentualnie ślady organicznych pożywek.
Przykłady źródła węgla obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, melasy i hydrolizaty skrobiowe; kwasy organiczne takie jak kwas octowy i kwas cytrynowy; oraz alkohole takie jak etanol. Przykłady źródła azotu obejmują moczniki, sole amonowe, amoniak wodny i gaz amoniakalny. Przykłady soli nieorganicznych obejmują fosforany oraz sole potasu, magnezu, żelaza i manganu. Przykłady śladowych pożywek organicznych obejmują aminokwasy, witaminy, kwasy tłuszczowe i kwasy nukleinowe jak również peptony, ekstrakt drożdżowy i hydrolizat białka soi zawierające którekolwiek z wyżej wymienionych.
Hodowla jest przeprowadzona aerobowo w temperaturze od 25 do 37°C przez 10 do 40 godzin, podczas których utrzymywana jest wartość pH pomiędzy 5 i 9.
Po zakończeniu hodowli, mierzona jest aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej akumulowanej w hodowli celem określenia miana. Aktywność można zmierzyć metodą opisaną
184 520 w Molec. Gen. Genet. 143, 85-91 (1975) przy pomocy substancji uzyskanej przez rozdzielenie komórek otrzymanych z hodowli przez odwirowanie lub podobną metodą, działając ultradźwiękami lub prasą francuską, odwirowując rozdzielone komórki by usunąć pozostałości komórkowe oraz usuwając substancje niskocząsteczkowe poprzez filtrację żelową.
Hodowla mikroorganizmu zawierającego gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową i mającego zdolność biologicznego syntezowania ATP z prekursora ATP, komórki oddzielone z tej hodowli, lub poddany określonemu działaniu produkt tych komórek jest kontaktowany z inozyną lub guanozyną lub ich prekursorem w obecności donora energii i donora grupy fosforanowej, tworząc w roztworze reakcyjnym kwas 5'-inozynowy lub 5'-guanylowy. Komórki mogą być wydzielone z hodowli poprzez odwirowanie lub metody podobne. Poddany określonemu działaniu produkt komórek obejmuje komórki traktowane acetonem, unieruchomione komórki, rozerwane komórki, itd.
Materiały, których zastosowanie jest korzystne według wynalazku zostały wymienione poniżej.
Przykłady prekursora inozyny lub guanozyny obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, melasy, hydrolizaty skrobiowe etc.; kwasy organiczne takie jak kwas octowy itd.; oraz alkohole takie jak glicerol, etanol, itd.
Przykłady donora energii obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, hydrolizaty skrobiowe, melasy itd.; kwasy organiczne takie jak kwas octowy, kwas cytrynowy itd.; oraz alkohole takie jak etanol, itd.
Przykłady donora grupy fosforowej obejmują kwasy nieorganiczne takie jak kwas ortofosforowy, kwas pirofosforowy, kwas polifosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas polimetafosforowy, kwas heksametafosforowy itd., sole tych kwasów nieorganicznych; oraz organiczne kwasy fosforowe takie jak fosforan fenylu, fosforan acetylu, fosforan karbamoilu itd.
Wydajność reakcji można poprawić przez dodanie do roztworu reakcyjnego prekursora ATP, środka powierzchniowo czynnego, jonu metalu itd.
Przykłady prekursora ATP obejmują difosforan adenozyny, kwas adenylowy, adenozynę, adeninę, sól adeniny z kwasem mineralnym, hydrolizat kwasu rybonukleinowego itd.
Środkami powierzchniowo czynnymi mogą być kationowe, anionowe i amfoteryczne środki powierzchniowo czynne o ile wzmagają fosforylowanie inozyny lub guanozyny. Przykłady jonów metali obejmują jon magnezowy, jon manganowy, itd.
W zwykłej fosforylacji przy użyciu kinazy inozynowo-guanozynowej i szczepu wytwarzającego ATP, rozpuszczalnik organiczny jest zwykle dodawany do systemu reakcyjnego (japońskie wyłożonego zgłoszenia patentowego nr 230,094/1988 i WO 9l/08286). Tymczasem, w obecnym wynalazku, reakcja postępuje wydajnie nawet gdy rozpuszczalnik organiczny jest ominięty w systemie reakcyjnym.
Reakcja jest prowadzona jest aerobowo w temperaturze od 25 do 37 °C przez okres od 10 do 30 godzin podczas których utrzymywana jest wartość pH pomiędzy 6 a 8.
Po zakończeniu reakcji, kwas 5'-inozynowy lub kwas 5'-guanylowy akumulowany w roztworze reakcyjnym można zebrać stosując żywicę jonowymienną, krystalizację lub podobne.
Najbardziej korzystny przykład wykonania. Obecny wynalazek bardziej szczegółowo zostanie opisany poprzez nawiązanie do następujących przykładów. Jakkolwiek, obecny wynalazek nie ogranicza się do tych przykładów.
Przykład 1 (Konstrukcja plazmidu dla ekspresji genu kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzącego E. coli i wprowadzanie go do Corynebacterium ammoniagenes) (1) Amplifikacja genu kinazy inozynowo-guanozynowej przez PCR oraz jego klonowanie
Oligonukleotydy posiadające 5'- i 3'-końcowe sekwencje genu kinazy inozynowoguanozynowej pochodzącego od E. coli oraz miejsca rozszczepienia odpowiednio endonukleazy restrykcyjnej Pstl i HindIII, jak pokazano w SEQ ID NO:11 i 12 , zostały zsyntezowane za pomocą metody fosforoamidynowej (Phosphoramidite) stosując syntezator DNA (Model 394, produkowany przez Applied Biosystem Co.).
184 520
0,25 mg tych oligonukleotydów jako primery, 0,1 mg chromosomowego DNA z E. coli W3110 (ATCC 27325) wytworzonego metodą według Saito i Miura [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)] jako matryca oraz 2,5 jednostek polimerazy taq DNA (wytwarzanej przez Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml 10 mM buforu chlorowodorku Ntris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetanu (oznaczanego tu jako Tris (pH 8,3) zawierającego 200 mM dATP, 200 mM dCTP, 200 mM dGTP, 200 mM dTTP, 50 mM chlorku potasowego,
1,5 mM chlorku magnezowego oraz 0,0001°% żelatyny. Przeprowadzono PCR, w którym trój temperaturowe cykle, mianowicie w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w temperaturze 55°C przez 30 sekund i w temperaturze 72°C przez 30 sekund, powtarzano 25 razy. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na żelu agarozowym, i oczekiwany fragment DNA wydzielono stosując pył szklany (wytwarzany przez Takara Shuzo Co.). Około 2 mg tego fragmentu DNA, 20 jednostek endonukleazy Pstl oraz 20 jednostek HindIII wymieszano z 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, lOO mM chlorku sodowego oraz 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Roztwór ten ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu w zwykły sposób.
Jeden mikrogram plazmidu pHSG298 (wyprodukowanego przez Takara Shuzo Co.) DNA, 20 jednostek restrykcyjnej endonukleazy Pstl oraz 20 jednostek restrykcyjnej endonukleazy HindIII wymieszano z 50 mM Tris-chlorowodorowego buforu (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego oraz 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po zakończeniu inkubacji mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu w zwykły sposób otrzymując plazmid pHSG298 trawiony Pstl i HindIII. 0,1 mg tego pHSG298 trawionego Pstl i HindIII, 0,5 mg amplifikowanego PCR fragmentu trawionego Pstl i HindIII oraz 1 jednostkę ligazy T4 DNA dodano do 66 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu oraz 10 mM ATP, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin ligując DNA. Następnie, E. coli JM 109 ( Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA w tradycyjny sposób, po czym wysiano na płytce z pożywką L-agarową zwierającą lOO mg/ml kanamycyny uzyskując transformanty.
Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy metodą alkalicznej lizy opisanej w Molecular Cloning 2nd etition, według J. Sambrook, E. F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbour, laboratory Press, str. 1,25 (1989), po czym poddano je elekrtroforezie na żelu agarozowym w zwykły sposób. Wydzielono rekombinowany plazmid, w którym do plazmidu pHSG298 wstawiono gen kinazy inozynowo-guanozynowej. Plazmid ten oznaczono „pIKG-1”.
(2) Wstawienie promotora trp E. coli
Zsyntetyzowano oligonukleotyd posiadający miejsca trawienia restrykcyjną endonukleazą BamHI oraz Pstl przy końcach 5'- oraz 3'-, odpowiednio, jak pokazano w SEQ ID NO: 13, oraz oligonukleotyd posiadający sekwencję komplementarną. Te oligonukleotydy w ilościach 1 mg każdy zmieszano, potraktowano temperaturą 100°C przez 5 minut, po czym stopniowo ochłodzono w celu umożliwienia hybrydyzacji. Roztwór oligonukleotydów oraz 20 Jednostek BamHI zmieszano z 20 mM buforu Tris-HCl (pH 8,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego oraz 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 30 °C przez 2 godziny. Otrzymany roztwór ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu. Następnie tak otrzymany osad strawiono Pstl w taki sam sposób Jak w punkcie (1), roztwór ten ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu otrzymując fragment DNA zawierający promotor trp E. coli oraz trawiony przez BamHI i Pstl.
Jeden mikrogram rekombinowanego plazmidu plGK-1 zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej uzyskany według punktu (1) w podobny sposób trawiono BamHI i Pstl. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu w zwykły sposób uzyskując plazmid trawiony BamHI i Pstl, po czym dodano 1 jednostkę ligazy T4 DNA (Takara Shuzo Co.) do 66 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu oraz 10 mM ATP, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin ligując DNA. Następnie, E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.)
184 520 transformowano tą mieszaniną DNA, po czym zaszczepiono go na L-agarowej płytce z pożywką zwierającą 100 mg/ml kanamycyny uzyskując transformanty.
Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy metodą lizy alkalicznej, po czym poddano je elektroforezie na żelu agarozowym standardowymi metodami wydzielając rekombinowany plazmid, w którym do plazmidu pIGK-1 wstawiono promotor trp E. coli. Plazmid ten oznaczono pIKG-2.
(3) Wstawienie początku replikacji pochodzącego od Corynebacterium
Jeden mikrogram rekombinowanego plazmidu pIGK-2 zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej oraz promotor trp otrzymany w (2) trawiono BamHI w taki sam sposób jak w punkcie (2), po czym ekstrahowano fenolem i ekstrakt ten wytrącono etanolem.
W celu zapobieżenia ponownemu wiązaniu, plazmid pIGK-2 trawiony BamHI poddano defosforylacji fragmentu DNa za pomocą zabiegu stosującego bakteryjną alkaliczną fosfatazę według metody opisanej w Molecular Cloning 2nd Edition, według J. Sambrook, E. F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbour, Laboratory Press, str. 1,60 (1989).
Tymczasem, 1 ug plazmidu pHC4 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe nr 7,491/1993) uzyskanego poprzez wstawienie regionu początku replikacji uzyskanego z Corynebacterium glutamicum do pHSG399 (Takara Shuzo Co.) oraz 10 jednostek restrykcyjnej endonukleazy Kpnl dodano do 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego i 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono za pomocą etanolu. Końce pHC4 trawione za pomocą Kphl stępiono według instrukcji stosując zestaw DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co.). Fosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo Co.) sprzężono z tym plazmidem stosując polinukleotydową ligazę T4 uzyskując fragment DNA mający miejsce trawienia BamHI po obu stronach regionu zawierającego plazmidowy początek replikacji pochodzący z Corynebacterium glutamicum. Ten fragment DNA oraz 20 jednostek BamHI zmieszano w takim samym buforem jaki stosowano w (2), po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono za pomocą etanolu.
0,1 (ig otrzymanego powyżej plazmidu pIGK-2 trawiono BamHI, 0,2 (ig fragmentu DNA uzyskanego z plazmidu pHC4 trawionego BamHI oraz 1 jednostkę ligazy T4 DNA (wytwarzanej przez Takara Shuzo Co.) wymieszano w takim samym buforze jaki stosowano w (1). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin ligując DNA. Następnie, E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA i wysiano na Lagarowej płytce na pożywce zwierającej 100 mg/ml kanamycyny uzyskując transformanty.
Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy metodą lizy alkalicznej, po czym poddano je elektroforezie na żelu agarozowym w zwykły sposób wydzielając rekombinowany plazmid, w którym do plazmidu pIGK-2 wstawiono fragment DNA, autonomicznie zdolny do replikacji w Corynebacterium. Plazmid ten oznaczono pIKG-3.
E. coli AJ 12617 zawierający plazmid pCH4 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of the Agency of Industial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japonia, w dniu 24 kwietnia 1991 r. pod numerem depozytu FERM P-12215. Został on przekazany do depozytu na podstawie Traktatu Budapesztańskiegio w dniu 26 sierpnia 1991 r., i został oznaczony numerem depozytu FERM BP-3532.
(4) Wprowadzenie pIGK-3 do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477
0,1 pg pIGK-3 uzyskanego w (3) wprowadzono do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477 zwykłą metodą transformacji stosując elektroporację (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe nr 207,791/1990). Komórki wysiano na L-agarowej płytce na pożywce zwierającej 10% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 0,5% chlorku sodowego, 0,5% glukozy oraz 50 mg/ml kanamycyny uzyskując transformant ATCC 21477/pIGK-3.
(5) Pomiar aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej tego transformanta
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 otrzymanym w punkcie (4) zaszczepiono 50 ml pożywki (pH 7,2) zwierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4% dwuwodorowego fosforanu potasowego, 0,1% siarczanu magnezowego,
184 520
0,5% siarczanu amonowego, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelaza, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr chlorowodorku tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapniowego, 30 mg biotyny, 0,05 % adeniny oraz 50 mg/litr kanamycyny, po czym hodowano w temperaturze 32°C przez 24 godziny. Kulturę odwirowano w zwykły sposób w celu zebrania komórek.
Etap zawieszania komórek w 0,9% roztworze chlorku sodowego i wirowanie tej zawiesiny powtarzano dwukrotnie w celu przemycia komórek. Otrzymane komórki zawieszono w 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,9) zawierającego 20% glicerolu, 100 mM chlorku potasowego, oraz 5 mM 2-merkaptoetanolu, po czym zawiesinę poddano działaniu ultradźwięków przy 150 W przez 20 minut stosując urządzenie wyprodukowane przez Kubota K. K. Tak potraktowaną zawiesinę wirowano przy 15000 rpm (obrotów na minutę) przez 30 minut uzyskując supematant. Supematant ten poddano chromatografii kolumnowej stosując kolumnę Sephadex G-15 (produkowaną przez Pharmacia Co.) w celu usunięcia substancji niskocząsteczkowych, a otrzymany roztwór stosowano jako surowy roztwór enzymu.
Aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej z otrzymanego surowego roztworu enzymu mierzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 100 mM Tris. 10 mM chlorku magnezowego, 1 mM ATP, 250 mM chlorku potasowego oraz 0,2 mM [844C]-inozyny. Roztwór surowego enzymu dodano do mieszaniny reakcyjnej i inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 minut. Część mieszaniny reakcyjnej nałożono jako plamki na płytkę z żelem silikonowym (wytwarzaną przez Merck Co.) w celu zakończenia reakcji, i rozwijano w eluencie zawierającym n-butanol, etanol i wodę w stosunku objętościowym 2:1:1. Plamkę kwasu 5'-inozynowego wykryto i oznaczono za pomocą zestawu Bio-Image Analyzer (Fuji Photo Film Co.). Stężenie białka w surowym roztworze enzymu określono przy pomocy zestawu do oznaczania białka (Bio-Rad Co.) stosując albuminę z osocza wołowego jako standard, po czym wyliczono specyficzną aktywność enzymu. Jako kontrolę mierzono specyficzną aktywność ATCC 21477/pHK4, tansformanta plazmidem pHK4. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 przejawiało wysoki poziom aktywności, podczas gdy aktywności ATCC 21477/pHK4 nie wykryto. Na podstawie tych wyników wykazano, że wprowadzony gen pochodzący od E. coli wykazywał aktywność kinazy inozynowoguanozynowej w Corynebacterium ammoniagenes.
Plazmid pHK4 posiada strukturę, w której promotor trp oraz gen kinazy inozynowoguanozynowej są usunięte z pIGK-3 i został on użyty jako kontrola.
Szczep niosący pHK4 w E. coli HB101 oznaczono jako AJ 13136 i zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of the Agency of Industial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japonia, w dniu 1 sierpnia, 1995 na podstawie Traktatu Budapesztańskiego z dostępem pod nr. FERM BP-5186.
Tabela 1
Szczep | Działanie specyficzne (nmol/min/mg białka) |
ATCC 21477/pHK4 | nie stwierdzono |
ATCC 21477/pIGK-3 | 186,6 |
Przykład 2 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny stosując szczep zawierający gen kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący od E. coli)
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 zaszczepiono do 450 ml pożywki (pH 7,2) zwierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4% dwuwodorowego fosforanu potasowego, 0,1% siarczanu magnezowego, 0,5% siarczanu amonowego, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelaza, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr chlorowodorku tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapniowego, 30 pg/litr biotyny,
184 520
0,05 % adeniny oraz 50 mg/litr kanamycyny, po czym hodowano w temperaturze 32 °C przez 24 godziny. Kulturę wirowano przy 7000 rpm przez 10 minut uzyskując 20 g mokrych komórek w postaci osadu.
Tak otrzymane komórki zawieszono w ilości 200 g/litr w 20 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 50 g/litr inozyny, 20 g/litr dwuwodorowego fosforanu potasowego, 30 g/lltr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezowego, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 oraz 1 g/litr adeniny. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 32°C mieszając. Wartość pH doprowadzano do 7,2 stosując 4 N wodorotlenek sodowy oraz do mieszaniny reakcyjnej dodano zwiększoną ilość dwuwodorowego fosforanu potasowego. Reakcję prowadzono stosując jako kontrolę ATCC 21477/pHK4. Po 30 godzinach reakcji określono ilość kwasu 5'-inozynowego w roztworze reakcyjnym za pomocą wysoko-wydajnej chromatografii cieczowej. Wyniki pokazano w tabeli 2. Ilość nagromadzonego kwasu 5'-inozynowego wskazano jako ilość 7,5-hydratu 5'-inozynianu dwusodowego. Na podstawie tych wyników wykazano, że inozyna została przekształcona w kwas 5'-inozynowy przez ATCC 21477/pIGK-3 zawierający gen kinazy inozynowoguanozynowej pochodzący od E. coli.
Tabela 2
Szczep | Ilość kwasu 5'-1nozynowego |
zgromadzona w hodowli | |
ATCC 21477/pHK4 | nie wykryto |
ATCC 21477/pIGK-3 | 72,9 |
Przykład 3 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kinazy Inozynowo-guanozynowej pochodzący od E. coli)
Komórki uzyskane w przykładzie 2 zawieszono w ilości 200 g/litr w 50 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 60 g/lltr inozyny, 20 g/litr dwuwodorowego fosforanu potasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezowego, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 oraz 1 g/litr adeniny. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 32°C mieszając natleniające. Wartość pH doprowadzono do 7,2 stosując 4 N wodorotlenek sodowy podczas jednoczesnego monitorowania reakcji za pomocą pHmetru, oraz dodano do mieszaniny reakcyjnej zwiększoną ilość dwuwodorowego fosforanu potasowego. Po 22 godzinach reakcji, ilość nagromadzonego kwasu 5'-inozynowego wynosiła 113,8 g/litr, a jego molowa wydajność w oparciu o dodaną inozynę wynosiła około 100%.
Przykład 4 (Wytwarzanie kwasu 5'-guanozynowego z guanozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący od E. coli)
Reakcję prowadzono w taki sam sposób jak w przykładzie 2, oprócz tego, że zamiast inozyny w roztworze reakcyjnym zastosowano 1 g/litr guanozyny. Po 30 godzinach reakcji, określono Ilość kwasu 5'-guanozynowego w mieszaninie reakcyjnej za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej. W wyniku otrzymano 0,05 g/litr kwasu 5'-guanozynowego, co wyliczono w przeliczeniu na 7,5-hydrat 5'-guanozyn1anu dwusodowego w mieszaninie reakcyjnej przy użyciu ATCC 21477/plGK-3.
Przykład 5 (Oczyszczanie białka o aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej z Exiguobacterium acetylicum oraz jego właściwości) (1) Wytwarzanie komórek 1 surowego ekstraktu enzymu
Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 zaszczepiono 100 ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% pollpeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego (Bacto Yeast Extract), 0,5% glukozy 1 0,5% chlorku sodowego, po czym hodowano w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Tą kulturą zaszczepiono 2 litry wyżej wymienionej pożywki, 1 Inkubowano w temperaturze 30°C
184 520 przez 8 godzin. Tak otrzymaną kulturę wirowano przy 7000 rpm przez 10 minut, osad przemyto dwukrotnie za pomocą 0,9% chlorku sodowego uzyskując lO g mokrych komórek. Komórki zawieszono w 10 ml lOO mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 100 mM chlorku wapniowego 1 1 mM ditiotreitolu (bufor A), i ucierano w młynku (Biospeck Co.) używając szklanych kul o średnicy 0,1 mm. Zawiesinę wirowano przy 15000 rpm przez 10 minut, 1 supematant dializowano wobec wyżej wymienionego buforu uzyskując około 20 ml surowego ekstraktu enzymowego.
Aktywność Kinazy inozynowo-guanozynowej surowego Ekstraktu enzymu mierzono za pomocą następującej metody. Pięć mikrolitrów surowego ekstraktu eozomu dodano do 50 pil lOO mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 5 mM chlorku magnezowego, 5 mM ATP, 100 mM chlorku potasowego oraz 0,2 mM [8‘14C]-ino/yny. Tą miesza-i-ę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 minut. Dwa mikrolitry mieszaniny reakcyjnej nałożono w postaci plamek na płytkę z żelem silikonowym (wytwarzaną przez Merck Co.) w celu zakończenia reakcji, i rozwijano za pomocą eluenta zawierającego n-butanol, etanol i wodę w stosunku objętościowym wynoszącym 2:1:1. Plamkę kwasu 5'-inozynowego wykryto i ilość kwasu 5'-inozynowdgo oznaczono za pomocą Analizatora Bio-Image (Fuji Photo Film Co.). Stężenie białka w surowym roztworze enzymu określono za pomocą próby białkowej (produkowanej przez Bio-Rad Co.) stosując jako standard albuminę z osocza bydlęcego, po czym wyliczono aktywność specyficzną enzymu. Aktywność kinazy inozonowo-guano/ynowej surowego ekstraktu enzymu wynosiła 0,45 nmol/min/mg białka.
(2) Oczyszczanie białka o aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej
Surowy ekstrakt uzyskany w (1) naniesiono na kolumnę DAEA-Toypearl (produkowaną przez Tosoh Co.) zrównoważoną buforem A. Białko o aktywności kinazy inozynowoguanozynowej, po przemyciu go buforem A, wymyto za pomocą buforu A zawierającego 200 mM chlorku potasowego. Do 25 ml tak uzyskanej frakcji aktywnej, dodano siarczanu amonowego do 30% nasycenia. Następnie mieszaninę mieszano w temperaturze' 4°C przez 30 minut, osad usunięto na drodze wirowania. Powstały supematant podano na kolumnę Butylo-Toypearl (Tosoh Co.), zrównoważoną buforem A zawierającym 3θ% siarczanu amonowego. Białko o aktywności kinazy i-ozonowo-gua-ozonowej, po przemyciu wyżej wymienionym buforem, wymyto za pomocą liniowego gradientu stężenia 200 ml buforu A zawierającego od 30% do 15% siarczanu amonowego. Około 15 ml otrzymanej frakcji aktywnej dializowano wobec 2 litrów 25 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 50 mM chlorku potasowego, i mM ditiotreitolu oraz 20 % glicerolu (bufor B).
Roztwór wirowano przy 15000 rpm przez 10 minut, i otrzymany supematant podano -a Kolumnę Mono Q FPLC HR5/5 (Pharmacia Co.) zrównoważoną buforem B zawierającym 100 mM chlorku potasowego. Białko mające działanie kinazy inozynowo-guanozynowej, po przemyciu go buforem B, wymyto za pomocą li-iowdgo gradientu stężenia siarczanu amonowego od 100 mM do 500 mM. Tak otrzymaną frakcję aktywną dializowano wobec 2 litrów 10 buforu fosforanu potasowego (pH 7,4) zawierającego 1 mM ditiotreitolu oraz 20% glicerolu (bufor C), i -anlesiono na kolumnę hydroksyloapatytową TSK-GEL HA-1000 (Tosoh Co.) zrównoważoną wyżej wymienionym buforem. Białko o aktywności kinazy Inozynowogiianozo-owej po przemyciu wyżej wymienionym buforem, wymyto za pomocą liniowego gradientu stężenia 30 ml buforu C zawierającego od 10 mM do 5θ0 mM fosforanu potasowego.
Około 6 ml tak otrzymanej frakcji aktywnej szybko podano na kolumnę hydroksyloapatytową 1 białko o aktywności einazy 1-ozynowo-guanozynowej wymyto za pomocą liniowego gradleotu stężd-la 30 ml buforu C zawierającego od 10 mM do 200 mM fosforanu potasowego. Dwa mililltry frakcji o wysokiej aktyw-ości spośród tak otrzymanych frakcji aktywnych podano oa żelową kolumnę filtracyjną Hiload Supdrdex 200 pg 16/60 (Pharmacia Co.) zrównoważoną za pomocą 25 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 1 mM ditlotreltolu, 20% glicerolu i lOO mM chlorku potasowego, po czym wymyto za pomocą wyżej wymld-lo-dgo buforu. Pięć mikrolitrow z 22 ml tej frakcji o wysokiej aktywności poddano dlektrofordzld -a żelu SDS pollakryloamldowym. W wyniku, otrzymano białko o masie cząsteczkowej wynoszącej około 36 Kllodaltooów, które wykryto za pomocą barwienia srebrem (Nacalai Tdsąue Co.). Białko o aktywności Kinazy I-ozy-owo-guanozy-owej pochodzącej
184 520 od Exiguobacterium acetylicum oczyszczono, po czym za pomocą elektroforezy na żelu SDSpoliakryloamidowym oznaczono jego masę cząsteczkową wynoszącą 36 kilodaltonów.
(3) Właściwości kinazy inozynnwo-nuanozynnwej pochodoącej od ExiguoXacterium acetylicum
Oczyszczoną kinazę inezynpwo-guanezznewą dodane do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 5 mM chlorku magnezowego, 5 mM ATP, 100 mM chlorku potasowego, 0,16 mM guanozyny oraz 0,04 mM [8'14c]-guanozyny. Pięć mikrolitrow z tej mieszaniny reakcyjnej zastosowano jako związek podstawowy i reakcje prowadzono w temperaturze 30°C przez 10 minut. Enzym ten miał następujące właściwości:
1. Działanie
Enzym przenosi grupę fosforową do nukleozydu wybranego z grupy zawierającej guanozynę, inozynę oraz 2'-deeksyguanezynę stosując donor fosforanowy jako trójfesfernn nukleozydu wybrany z grupy zawierającej ATP, trójfosforan 2'-deoksyadenozyny, trójfosforan guanozyny, trójfosforan 2'-deoksyguanozzny oraz trójfosforan tymidyny, oraz tworzy on 5'-monofosforan nukleozydu wybranego z grupy zawierającej 5'-guanozynian, 5'-inozynian oraz 2'-deoksz-5'-gunnozynian, odpowiednio.
2. Specyficzność substratowa
Reakcję prowadzono stosując 0,5 mM każdego z nukleozydów zamiast guanozyny oraz [y-32P]-ATP zamiast ATP. Mierzono tak utworzony 5'-fosforan nukleozydu. Wyniki pokazano w tabeli 3. Guanozynę, inozynę oraz 2'-deokszguanozynę stosowano jako receptory fosforanu.
Tabela 3
Nukleozyg (0,5 mM) | Aktywność względna (%) |
Gunnozynn | 100 |
2' -De oksygunnozynn | 4 |
Inozyna | 5 |
Ksnntozynn | 0 |
Adenozyna | 0 |
2'-geoksyngenozznn | 0 |
Reakcję prowadzono stosując 5 mM każdego z trój fosforanów nukleozydów zamiast ATP, oraz badano możliwe donory fosforanowe. Wyniki zestawiono w tabeli 4.
Oprócz ATP, jako donory fosforanowe stosowano trójfosforan 2'-deoksyadenozznz, trójfosforan guanozyny, trójfosforan 2'-deoksyguanozyny oraz trójfosforan tymidyny.
Tabela 4
Trójfosforan nukleozydu (5 mM) | Aktywność względna (%) |
Trójfosforan adenozyny | 100 |
Trójfosforan 2'-gezoksygenozznz | 71 |
Trójfosforan guanozyny | 59 |
Trójfosforan 2'-dezpkszgunnezynz | 61 |
Trójfosforan ąjtygyny | 6 |
Trójfosforan urjgjnz | 4 |
Trójfosforan tymidyny | 35 |
Nie dodano | 0 |
184 520
3. Optymalne pH
Przeprowadzono reakcję zmiany buforu na 100 mM buforu octan sodowy - kwas octowy (pH 4,2-5,6), buforu kwasu 2-morfoetanosulfonowego (zwanego dalej MES) - wodorotlenku sodowego (pH 5,4-6,3), buforu kwasu 3-morfopropanosulfonowego (MOPS) - wodorotlenek sodowy (pH 6,3-7,2), buforu Tris-HCl (pH 7,2-8,8), buforu kwasu cykloheksyloaminopropanosulfonowego (zwanego dalej CAPS) - wodorotlenku sodowego (pH 8,8-10,4) lub buforu glicyna-wodorotlenek sodu (pH 10,3-11,0). Optymalne pH wynosiło pomiędzy 7,7 a 9,9.
4. Stabilność wpH
Enzym traktowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut 250 mM buforem octan sodu - kwas octowy (pH 1,5-5,6), buforem MES- wodorotlenek sodu (pH 5,4-6,4), buforem MOPS- wodorotlenku sodowego (pH 6,3-7,3), buforem Tris-HCI (pH 7,2-8,8), buforem CAPS- wodorotlenek sodu (pH 8,9-10,4) lub buforem glicyna-wodorotlenek sodu (pH 10,513,3), każdy zawierający 2,5 mg/ml albuminy osocza bydlęcego, 25 mM chlorku potasowego, 0,25 mM ditiotreitolu i 5% glicerolu. Następnie zmierzono aktywność enzymu. W rezultacie aktywność enzymu była stabilna w zakresie pH pomiędzy 6,7 a 12,1.
5. Optymalna temperatura
Reakcję przeprowadzono w przedziale temperatury pomiędzy 16°C a 60°C. W rezultacie optymalna temperatura wynosiła pomiędzy 30°C a 50°C.
6. Stabilność temperaturowa
Enzym potraktowano 12,5 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 5 mg/ml albuminy osocza bydlęcego, 50 mM chlorku potasowego, 0,5 mM ditiotreitolu i 10% glicerolu w 4 do 60°C przez 30 minut i zmierzono szczątkową aktywność enzymu. Została utrzymana aktywność 50% lub więcej po traktowaniu w 25°C lub w niższej temperaturze a enzym został inaktywowany przy 40°C lub w wyższej temperaturze.
7. Zapotrzebowanie na jony metalu
Reakcję przeprowadzono zmieniając chlorek magnezowy na różne jony metalu w roztworze reAkcji. Rezultaty są pokazane w tabeli 5. Odkryto, że jony metalu były wymagane dla aktywności, i że spośród innych jonów niż magnezowe reakcja przebiegała z jonami manganowymi, jonami kobaltowymi i jonami żelaza.
T a b e 1 a 5
Sole metali (5 mM) | Aktywność względna (%) |
Nie dodane | 1 |
MgCl2 · 6H2O | 100 |
MnCl2 · 4H2O | 55 |
ZnCl2 | 1 |
N1CI2 · 6H2O | 1 |
CaCl2 · 2H2O | 1 |
C0CI2 · 6H2O | 36 |
MgSO2 · 7H2O | 107 |
FeSO2 · 7H2O | 24 |
8. Wpływ jonów metali
Względna aktywność enzymu w obecności 1mM różnych jonów metali w mieszaninie reakcyjnej jest przedstawiona w tabeli 6. Enzym ten był silnie hamowany przez jony miedzi i jony rtęci, jak również był silnie hamowany przez jony cynku i jony kadmu.
184 520
Tabela 6
Sole metali (1 mM) | Względna lepkość (%) |
Nie dodane | 100 |
MNCl2 · 4H2O | 81 |
ZnCl2 | 58 |
NiCl, · 6H2O | 113 |
CaCl2 · 2H2O | 71 |
CoCl2 · 6H2O | 103 |
BaCl2 | 106 |
CuCl2 · 2H,O | 25 |
CdCl2 | 43 |
HgCl2 | 22 |
MgSO„ · 7H2O | 110 |
FeSO4 · 7H2O | 95 |
9. Wartości Km
Wartości Km enzymu zmierzone poprzez zmianę stężenia substratu kompozycji reakcyjnej wynosiły 0,03 mM dla guanozyny, 1 mM dla inozyny i 1,6 mM dla ATP gdy guanozyna była używana jako substrat.
10. Masa molekularna
Enzym posiada masę molekularną wynoszącą około 36 kilodaltonów jak zmierzono przy pomocy elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym.
Przykład 6 (Izolacja genu z chromosomu Exiguobacterium acetylicum) (1) Ustalenie N-końcowej sekwencji aminokwasowej
Około 2 ml aktywnej frakcji uzyskanej w przykładzie 5 (2) zatężono do około 0,2 ml przez wirowanie przy 6 OOO rpm przez 3 godziny stosując Centricon-10 (Amicon Co.). Białko nakropiono na filtr przez wirowanie stosując Prospin (Applied Biosystem Co.). Filtr umyto trzy razy 20% metanolem, a następnie osuszono. N-końcową sekwencję aminokwasową białka określono przy użyciu sekwensera białek 476A (Applied Biosystem Co.). Ustalona sekwencja aminokwasowa jest reprezentowana przez SeQ ID Nr 3 w Liście Sekwencji. W tej Liście Sekwencji Xaa przedstawia niezidentyfikowany aminokwas. Określono dwadzieścia osiem aminokwasów N-końca włączając jeden niezidentyfikowany aminokwas.
(2) Przygotowanie chromosomalnego DNA Exiguobacterium acetylicum i amplifikacja N-końcowego regionu
Trzy gramy mokrych komórek Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 otrzymano z 500 ml kultury w ten sam sposób jak w przykładzie 5 (1). Chromosomalne DNA wyekstrahowano z komórek metodą Saito i Mlura [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)].
Zgodnie z oznaczoną w (1) N-końcową sekwencją aminokwasową zsyntetyzowano oligonukleotydy. W oparciu o sekwencje nukleotydów zastosowano mieszaniny oligonukleotydów pokazanych w SEQ ID Nr 4 i 5 w związku z degeneracjąkodonów.
0,25 pmoli oligonukleotydów jako primery, 0,1 pg chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum jako matryca i 2,5 jednostek polimerazy taq DNA (wyprodukowanej przez Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml 10 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3) zawierającego 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, 50 mM chlorek potasowy,
1,5 mM chlorek magnezowy i 0,0001% żelatyny. Przeprowadzono PCR, w którym trójtemperaturowe cykle, tj. przy 94°C 30 sekund, przy 55°C 30 sekund i przy 72°C 1 minutę powtarzano 30 razy. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na żelu agarozowego, 1 amplifikowany fragment DNA o długości około 80 zasad oddzielono stosując szklany pył (Takara Shuzo Co.). Około 0,2 pg tego fragmentu DNA dodano do 50 ul 50mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 2 jednostki fragmentu Klenow'a, 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, 1 mM 2-merkaptoetanol 1 7 mM chlorek magnezowy. Mieszaninę poddano reakcji stępiania końców przy 37°C przez 30 minut. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano
184 520 fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem. Tak wytrącony fragment DNA mający stępione końce został rozpuszczony w 5θ mM buforze Tris-HCl (pH 7,6) zawierającym 10 jednostek kinazy T4 polinukleotydowej, 10 mM chlorku magnezowego, 5 mM ditiotreitolu, 0,1 mM spermidyny i 0,1 mM EDTA, i został poddany reakcji fosforylacji końców w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem. Produkt PCR posiadający fosforylowane stępione końce odzyskano w postaci precypitatu.
Jeden mikrogram wektora plazmidowego pUC18 (Takara Shuzo Co.) i 2θ jednostek endonukleazy restrykcyjnej Smal zmieszano z 33 mM Tris- bufor octanowy (pH 7,9) zawierający 10 mM octan magnezowy, 66 mM octan potasu, 0,5 mM ditiotreitol 1 0,01% albuminy z bydlęcego osocza i mieszaninę inkubowano w 30°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ten wyekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób. Następnie, w celu uniknięcia ponownego związania fragmentu DNA pochodzącego z wektora plazmidu, fragment DNA został defosforylowany. Uzyskany fragment wyekstrahowano fenolem 1 wytrącono etanolem w tradycyjny sposób.
0,1 pg tego pUC18 trawionego Smal, 0,1 ug produktu PCR mającego fosforylowane stępione końce i 1 jednostka T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.) dodano do 20 ml 66 mM bufora Trls-HCI (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu i 10 mM ATP. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin w celu ligacji DNA. Następnie E. coli JM09 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA w tradycyjny sposób 1 wstrzyknięto do medium L-agarowego zawierającego 100 mg/ml ampicyliny w celu uzyskania transformantów.
Plazmidy wyekstrahowano z transformantów metodą lizy alkalicznej.
Plazmidy zawierały fragment DNA o około 80 zasadach uzyskany z chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953. Sekwencja nukleotydową fragmentu DNA została określona przy użyciu tego plazmidowego DNA. Określenie tej sekwencji nukleotydowej zostało przeprowadzone zgodnie z metodą Sangera [J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)] przy użyciu Tag Dyedeoxy Terminator Cycle Seguencing Kit (Perkin Elmer Co.). W ten sposób określono sekwencję nukleotydową 83 zasad DNA odpowiadających N-końcowemu regionowi białka kinazy inozynowo-guanozynowej Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.
(3) Izolaclz fragmenjg DNA zawierającego gen kodujkcy kinazę inozynowoguanozynową Exiguobacterium acetylicum
Dziesięć mikrogramów chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 otrzymanego w (2) dodano do 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającogn 40 jednostek EcoRI, 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego i 1 mM ditiotreitolu, i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godzino. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób w celu uzyskania chromosomOwego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 trawionego EcoRI. Jeden mikroeram tego DNA strawionego EcoRI, 0,05 pg kasety EcoRI (Takara Shuzo Co.) i 10 jednostek ligazy T4 DNA dodano do 66 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu 1 10 mM ATP. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin w celu ligacji DNA. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i ekstrakt został wytrącony etanolem w celu uzyskania chromosomowego DNA trawionego Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligowaoego z kasetg EroRI.
Ol1knnuklootydy Sl 1 S2 mające sekwencje nukleotydowe pokazane w SEQ ID Nr 6 i 7 zostały zsyoitetyzowgne zgodnie z sekwencją określoną w (2).
0,2 Mmoli olieonuklootodu Sl i 0,2 umoll kasety primera Cl (wyprodukowanej przez Takara Shuzo Co.) jako primery, 0,2 mg trawionego chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligowaneeo z kasetą EcoRI jako matryca i 2,5 jednostek pollmerazy Tgq DNA (Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml lOmM buforu Tris-HCl (pH 8,3) zawiergjąreen 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, 50 mM chlorku potasowego, 1,5 mM chlorku magnezowego i Ο,θ0θ1% żelatyno. Przeprowadzono PCR, w którym trój temperaturowe rykle, mianowicie przy temperaturze 94°C przez 30 sekund, przy 55°C przez 2 minuty 1 przy 72°C przez 3 minuty, powtórzono 25 razy. PCR przeprowadzono z zAchowAniem wyżej wspomnianych warunków przy użyciu 1 pl mieszanino reakcyjnej jako
184 520 matrycy, i 0,2 pmoli oligonukleotydu S2 i 0,2 pmoli kasety primera C2 (Takara Shuzo Co.) jako primerów. Część mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie na żelu agarozowym. W rezultacie, amplifikowano spacyficznie fragment około 1000 par zasad. Otrzymano fragment DNA rozciągający się od N-końcowego regionu białka do miejsca trawienia EcoRI poniżej genu, w kierunku 5'.
Ten fragment DNA odzyskano przy użyciu pyłu szklanego (wyprodukowanego przez Takara Shuzo Co.). Około 0,2 pg tego fragmentu DNA poddano reakcji stępienia końców w temperaturze 37°C przez 30 minut przy użyciu fragmentu Klenow'a. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i ekstrakt wytrącono etanolem. Odzyskany fragment DNA jako strąt poddano reakcji fosforylacji zakończeń w temperaturze 37°C przez 1 godzinę przy użyciu T4 kinazy polinukleotydowej. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i ekstrakt wytrącono etanolem. Produkt PCR mający fosforylowane stępione końce odzyskano jako strąt.
Jeden mikrogram wektora plazmidu pUC18 (Takara Shuzo Co.) potraktowano restrykcyjną endonukleazą Smal w temperaturze 30°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ten ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób. Następnie fragment DNA defosforylowano przez obróbkę bakteryjną alkaliczną fosfatazą ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem.
0,1 pg tego pUC18 trawionego z SmaI. 0,1 pg produktu PCR mającego fosforylowane stępione zakończenia i 1 jednostkę T4 ligazy DNA (Takara Shuzu Co.) poddano reakcji w temperaturze 16°C przez 8 godzin w celu ligowania DNA. Następnie E. coli JM09 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA i zaszczepiono płytki z pożywką L-agarową zawierającą 100 mg/ml ampicyliny w celu uzyskania transformantów.
Plazmidy ekstrahowano z wcześniej otrzymanych transformantów metodą lizy alkalicznej i oddzielono plazmid zawierający fragment amplifikowanego PCR. Ten plazmid oznaczono pCS2.
Zsyntetyzowano oligonukleotydy komplementarne dooligonukleotydów SI i S2 i oznaczono odpowiednio S4 i S3. Przeprowadzono amplifikację przez PCR w takich samych warunkach jak wspomniane wyżej przy użyciu oligonukleotydów S3 i kasety primera C1 (Takara Shuzo Co.) jako primerów i produktu trawienia chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 zligowanego z kasetą EcoRI jako matrycą. Przeprowadzono PCR przy użyciu uprzednio uzyskanej mieszaniny jako matrycy i oligonukleotydów S4 oraz kasety primera C2 (Takara Shuzo Co.) jako primerów. Amplifikowano fragment DNA o około 2300 par zasad rozciągających się od N-końcowego regionu białka do miejsca trawienia EcoRI powyżej genu.
Około 0,2 pg tego fragmentu DNA poddano reakcji stępiania w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy użyciu fragmentu Klenow'a. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono etanolem. Odzyskany jako strąt fragment DNA wymieszano z 50 pl 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 jednostek endonukleazy restrykcyjnej KpnI, 10 mM chlorku magnezowego i 1 mM ditiotreitolu. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ten ekstrahowano fenolem, ą ekstrakt wytrącono etanolem.
Jeden mikrogram wektora plazmidowego pUC18 (Takara Shuzo Co.), 5 jednostek endonukleazy restrykcyjnej KpnI i 5 jednostek endonukleazy restrykcyjnej HincII zmieszano z 50 ml 33 mM buforu Tris- octanowego (pH 7,9) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 50 mM chlorku sodowego i 1 mM ditiotreitolu. Mieszaninę inkubowąno w temperaturze 37°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ektsrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono etanolem.
0,1 pg tego pUC18 strawionego KpnI i HincII, około 0,1 pg produktu PCR poddanego reakcji stępiania i trawionego KpnI poddano działaniu T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.) w 16°C przez 8 godzin w celu ligacji DNA. Następnie E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA i zaszczepiono na płytkę L-ągarową zawierającą 100 mg/ml ampicyliny w celu uzyskania transformantów'.
184 520
Plazmidy ekstrahowano z tak uzyskanych transformantów metodą lizy alkalicznej. Wyselekcjonowano plazmid zawierający fragment DNA o około 600 par zasad rozciągający się od N-końcowego regionu do miejsca trawienia KpnI powyżej genu. Ten plazmid oznaczono pKS4.
(4) Określenre sekwencji nukleotydowej genu kinazy ino;ynowo-guanozynowej Exig,uobacterium acetylicum
Określnon sekwencje nunSentydowo plazmidów pCS2 i pKS4 uzyskano w (3). Sekwencja ounientydowa otwartej ramki odczytu od tej pory będąca założeniem jest reprezentowana przez SEQ ID Nr lw Liście Sekwoocji. Sekwencja aminokwasów produktu przewidywana oa podstawie tej sekwencji ouklentydnwoj jest reprezentowana przez SEQ DD Nr 2 w Liście Senwnocji. Zatem gen kodujący białko mające sokwe-cię aminokwasów reprezentowaną przez SEQ ID Nr 2 w Liście Sekwencji jest geoem ki-azy ionzyonwo-guanozynowej Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.
Sekwencja ouklentydowa i sekwencja amiookwasowa zostały porów-aue zo zoaoymi sekwencjami biorąc pod uwagę homolngię. Zanalizowanymi bazami danych były EMBL i SWISS-PROT. W rezultacie odkryto, że DNA reprezentowano przez SEQ Id Nr 1 w Liście Sekwencji i białko kodowane przez to DNA są nowością i że sekwencja uunleotydnwa jest moiej hnmnlogikzua niż sekwencja kodująca kinazę inozynnwo-guanozynową E. coli, która jest jedo-ą zoaoą jako geo kodujący kinazę ioozonnwn-guanozynową i jest dość od nich odmieuua.
Białko kodowane przez ten go- składa się z 303 aminokwasów i jego waga molekularna obliczona z sekwencji aminokwasowej wynosiła 32,5 nilodaltnoów.
Przykład7 (Konstruowanie plazmidu do ekspresji kinazy innzynowo-guannzokowej’ uzyskanej z Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 i wprowadzeoie go do Corynebacterium ammoniagenes) (1) Amplifikacja gonu kinazy innzynnwo-guaonzonowej przez PCR i klonowanie
Zseutetyznwaoo nlikonunlootydy odpowiadająco 5'- i 3'- końcowym sekwencjom geou kinazy iugzyoown-guaonzoknweu Exiguobacterium acetylicum i miejscom trawienia ondnoukleazami restrykcyjnymi PstS i SphL odpowiednio, jak pokazano w sEq ID Nr 8 i 9.
0,25 Mmoli tych oligoounlentodów lako primery, 0,1 pg chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 otrzoma-ego w przykładzie 6 (2) jako matryca i 2,5 jednostek pnlimorazo taq DNA (Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml lO mM buforu TrisHCl (pH 8,3) zawierającego 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM GTP, 200 pM dTTP, 50 mM chlorku potasowego, 1,5 mM chlorku magnezowego i 0,0001% żelatyny. Przeprowadznon PCR, w którym trój temperaturowe Cykle, mia-owicie przy 94 °C przoz 30 sekuod, przy 55°C przez 30 sekuod i 72°C przoz 30 sokuod, powtórzono 25 razy. Mieszanioę reakcyjną podda-o elektroforezie -a żelu agarozowym i wybrany fragmoot DNA odzyskano przy użyciu pyłu szkla-ego (Takara Shuzo Co.). Około 2 fig togo fragmeotu DNA,10 jed-ostek nudoounleazy restrykcyjnoU Pstl i 10 Uednostnn endonukleazo restrykcyjnoU SphI zmiesza-o z 50 ml 5θ mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku makoezowegn, 100 mM chlorku potasowego i 1 mM ditiotroitolu. Mieszaoioę inkubnwano w 37 °C przoz 2 godzioy w colu uzyskania produktu trawienia. Produkt ton ekstrahowa-o fe-olem, a ekstrakt wytrąco-o etaoolem.
Jedeo mikrogram plazmidu pHSG298 (Takara Shuzo Co.), 20 jod-ostek endonuklnazo restrykcyjnej Pstl i 20 jod-ostek eodnnukleazy restrykcyjnoj SphI zmieszano z 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku potasowego i 1 mM ditintroitnlu. Mieszaoinę ionubnwann w temperaturze 37 °C przoz 2 godziuy. Miesza-i-ę reakcyjną ekstrahowano fe-olem i wytrącnon etanolem tradycyjną metodą w celu uzyskania plazmidu pHSG298 strawinoekO Pstl i SphI. 0,1 pg tego plazmidu pHSG298 strawinoegn Pstl i SphI, 0,5 pg amplifikowaoogo PCR fragmentu strawinungn Pstl i SphI i 1 jod-ostkę T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.) dodaoo do 66 mM buforu TrisHCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magooznwegn, 10 mM ditintreitnlu i .10 mM ATP. Mieszaki-ę ionubnwaun w temperaturze 16°C przez 8 godzi- w celu ligacji DNA.
184 520
Następnie E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) stransformowano tą mieszaniną DNA w tradycyjny sposób i wstrzyknięto na płytkę z pożywką L-agarową zawierającą 100 mg/ml kanamycyny, w celu uzyskania transformantów.
Plazmidy ekstrahowano z tak otrzymanych transformantów metodą lizy alkalicznej i poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Wyselekcjonowano rekombinowany plazmid, w którym gen kinazy inozynowo-guanozynowej otrzymanej z Exiguobacterium acetylicum wprowadzono do wektora plazmidowego pHSG298. Ten plazmid oznaczono pBA-1.
(2) Wprowadzanie promotora trp E. coli
Przygotowano, w ten sam sposób jak w przykładzie 1 (2), fragment DNA zawierający promotor trp E. coli strawiony BamHI i Pstl.
Jeden mikrogram rekombinowanego plazmidu pBA-1 mającego wprowadzony fragment DNA zawierający gen kinazy inozynowo-guanozynowej otrzymany w (1) strawiono BamHI i Pstl. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób w celu uzyskania plazmidu strawionego BamHI i Pstl. 0,1 mg tego plazmidu strawionego BamHI i Pstl ligowano z fragmentem DNA zawierającym promotor trp E. coli strawiony BamHI i Pstl przy użyciu 1 jednostki T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.). Następnie E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) stransformowano tą mieszaniną DNA i wstrzyknięto na L-agarową płytkę z pożywką zawierającą 100 mg/ml kanamycyny, uzyskując transformanty.
Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy i poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Wydzielono rekombinowany plazmid w którym promotor trp E. coli został wstawiony do plazmidu pBA-1. Plazmid ten oznaczono pBA-2.
E. coli AJ13094 zawierające plazmid pBA-2 został zdeponowany w National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken 3-5, Japonia dnia 27 kwietnia 1995r. zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, pod numerem dostępu FERM BP-5089.
(3) Wstawienie początku replikacji otrzymanego z bakterii rodzaju Corynebacterium.
W ten sam sposób jak w (2), trawiono BamHI 1 pg rekombinowanego plazmidu pBA-2 zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej i promotor trp otrzymany w (2). Produkt trawienia ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono etanolem. Strąt trawiono KpnI w ten sam sposób jak w przykładzie 6 (2), i produkt trawienia ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono przy pomocy etanolu. Tak otrzymany plazmid pBA-2 strawiony BamHI i KpnI został poddany defosforylacji fragmentu DNA przez potraktowanie bakteryjną fosfatazą. Otrzymaną substancję ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu.
Tymczasem, 1 fig plazmidu pHC4 (japoński wyłożeniowy opis patentowy 7,491/1993) podobnie trawiono BamHl i KpnI. Produkt trawienia ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono za pomocą etanolu. 0,1 fig wyżej otrzymanego plazmidu pBA-2 strawionego BamHI i KpnI ligowano z 0,2 fig fragmentu DNA z plazmidu pHC4 strawionego przy pomocy BamHI i KpnI przy użyciu T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.). Następnie, E. coli JM 109 (Takara Shuzo Co.) stransformowano mieszaniną DNA i wysiano na płytkę z pożywką L-agarową zawierającą 100 mg/ml kanamycyiny, uzyskując transformanty.
Z tak otrzymanych transformantów plazmidy ekstrahowano metodą lizy alkalicznej i poddano je elektroforezie na żelu agarozowym. Wydzielono w ten sposób rekombinowany plazmid ze wstawionym początkiem replikacji pochodzącym z bakterii rodzaju Corynebacterium do plazmidu pBA-2. Plazmid ten oznaczono pBA-3.
(4) Wprowadzenie pBA-3 do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477
0,1 pg pBA-3 otrzymanego w (3) wprowadzono do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477 przy pomocy zwykłej metody elektroporacji (japoński wyłożeniowy opis patentowy nr 207,791/1990). Stransformowanymi komórkami zaszczepiono pożywkę agarową zawierającą 1°% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 0,5% chlorku sodu, 0,5% glukozy i 50 mg/ml kanamycyny w celu uzyskania transformantu ATCC 21477/pBA-3.
(5) Pomiar aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej rekombinacyjnego szczepu.
Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pBA-3 uzyskanym w (4) zaszczepiono ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4% fosforanu dwuwodoro-potasowego, 0,1% siarczanu magnezu, 0,5% siarczanu
184 520 amonu, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelazawego, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr Chlorowodorku tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapnia, 30 pg/litr biotyny, 0,05% adeniny i 50 mg/litr kanamycyny i Hodowano w temperaturze 32°C przez 24 godziny. Hodowlę żwirowano w zwykły sposób w Celu zebrania komórek.
Etap zawieszenia komórek w 0,9% roztworze wodnym chlorku sodu i odwirowania zawiesiny powtórzono dwukrotnie w celu przemycia komórek. Otrzymane komórki zawieszono w 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,9) zawierającego 20% glicerolu i lOOmM Chlorku potasu, n zawiesinę rozbijano ultra Dźwiękami 150 W przez 20 minut i następnie odwirowano przy 15,000 rpm ppzee 30 minnt w cClu (trzymania suppmataniu. Su^manam unniesicmn nn Pch lumnę UsdCadex G-15 (Pharmacia Co.) w celu usunięcia substancji niskoąząsteczkowyąh i otrzymany roztwór stosowano jako surowy roztwór enzymu.
Aktywność kinazy inozynpwp-guanpzznowsj surowego roztworu enzymu określono mstodą opisaną w przykładzie 5 (1). Jako kontrolę użyto ATCC 21477/pHK4, uzyskany poprzez transformację plazmidem pHK4. Wyniki przedstawiono w tabeli 7. ATCC 21477/pBA3 wykazywał wysoki stopień aktywności, podczas gdy nie zaobserwowano żadnej aktywności w ATCC21477/pHK4. Na podstawie tych wyników wykazano, iż wprowadzony gen uzyskany z Exiguebacterium acetylicum wykazał aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej w Corynebacterium ammoniagenes.
Plazmid pHK4 zastosowano jako kontrolę ponieważ posiada on strukturę, w której regiony trp promotora i genp kinazy inozynowo-guanozznowej zostały usunięte z pBA-3.
Szczep niosący pHK4 w E. coli HB101 oznaczono jako AJ 13136 i zdeponowano w National Institute of Βί^ά^^ and Human Tsąhnplogy, Agency of Industrial Science and Teąhnelogy, 1-3, Higashi 1 CCome, Tspkuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japonia dnia 1 sierpnia 1995 r. zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, pod numerem dostępu FERM BP-5186.
Tabela 7
Szczep | Aktywność specyficzna (nmol/min/mg białka) |
ARCC 21477/pHK4 | nie wykryto |
ATCC 21477/pBA-3 | 50,4 |
Przykład 8 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozznowego z inozyny przy pomocy komórek zawierających gen kinazy inoeznowρ-guanoeznpweJ Exiguobacterium acetyllcum).
Cerynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pBA-3 zaszczepiono do 450 ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4 fosforanu dwpwρdpro-dPtaspwegp, 0,1% siarczanu magnezu, 0,5% siarczanu amonu, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelazawego, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr ąClorowegorkt tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapnia, 30 mg/litr biotyny, 0,05% adeniny i 50 mg/litr kanamycyny i Hodowano w temperaturze 32°C przez 24 godziny. Hodowlę odwirowano przy 7,000 rpm drzsz 10 minut uzyskując 20 g mokrych komórek w postaci osadu.
Tak otrzymane komórki zawieszono w ilościach 200g/litr w 20 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 50 g/litr inozyny, 20 g/litr fosforanu dwuwodoropotasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezu, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 i 1 g/litr adeniny. Zawiesinę tą inkubowano w temperaturze 32 °C z mieszaniem. Wartość pH Dostosowano do 7,2 4 N wodorotlenkiem sodu, a Do mieszaniny reakcyjnej dodano zmniejszoną ilość fosforanu dwpwoderodotasewsgo. Jako kontrolę przeprowadzono reakcję stosując ATCC 21477/pHK4. Po 30 godzinach reakcji, ilość kwasu 5'-inozznowego w roztworze reakcyjnym określono poprzez wysekowzdatną Chromatografię Cieczową.
184 520
Wyniki przedstawiono w tabeli 8. Ilość akumulowanego kwasu 5'-inozynowego wykazano poprzez ilość 7,5 hydratu 5'-ioozynianu disodowego. Na podstawie wyników zaobserwowano konwersję inozyny do kwasu 5'-ino/ynowego w ATCC 21477/pBA-3, wykazującego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
Tabela 8
Szczep | Ilość akumulowa-dgo kwasu 5'-ino/ynowego (g/litr) |
ATCC 21477/pHK4 | nie wykryto |
ATCC 21477/pBA-3 | 69,8 |
Przykład9 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z Inozy-y przy użyciu komórek zawierających gen kinazy Inozynowo-guanozynowdj Exiguobacterium acetylicum).
Komórki uzyskane w przykładzie 8 zawieszo-o w ilościach 200 g/lltr w 50 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 60 g/lltr i-ozyny, 20 g/litr fosforanu dwuwodoropotasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezu, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 1 g/litr Nymeen S-215 i 1 g/litr adeniny. Zawiesinę tę inkubowano w temperaturze 32 °C z mieszaniem natleniającym. Wartość pH doprowadzono do 7,2 4 N wodorotlenkiem sodu monitorując z zastosowaniem pH-metru, i do mieszaniny reakcyjnej dodano obniżoną Ilość dwuwodorowego fosforanu potasowego. Po 30 godzinach reakcji, ilość zebranego kwasu 5'-inozynowdgo wynosiła 111,3 g/litr, i wydajność molowa względem inozyoy wynosiła około 100%.
Przykład 10 (Zamiana guanozyny w kwas 5'-guaoylowego z zastosowaniem komórek zawierających gen kinazy inozyoowo-guanozynowej)
Komórki otrzymane w przykładzie 8 zawieszo-o w ilościach 200 g/litr w 50 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 25 g/litr guanozyny, 20 g/litr dwuwodorowego fosforanu potasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezowego, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 1 1 g/litr adeniny. Zawiesinę inkubowano w 32°C z mieszaniem natleniającym. pH dostosowano do 7,2 za pomocą 4 N wodorotlenku sodowego używając pH-metru. Po 8 godzinach tej reakcji, ilość zebranego kwasu 5'guanylowdgo wynosiła 7,3 g/litr, i wydajność molowa względem dodanej guanozyny wynosiła około 14%.
Przykład 11 (Wykrywanie aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej w Exiguobacterium aurantiacan, Kurthia gisoni i Kurthia zopfii}
Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652 /as/czepiono 50 ml pożywki (pH 9,7) zawierającej 1% pollpeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego bacto, 0,5% glukozy, 0,5% chlorku sodowego, 1 1% węglanu sodowego.
Każdym z Kurthia gibsonii ATCC 43195 i Kurthia zopfii ATCC 33403 zaszczepiono po 50 ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego bacto, 0,5% glukozy i 0,5% chlorku sodowego. Hodowle prowadzono w 30°C przez 4 godziny. Każdą z hodowli odwirowano przy 7,000 rpm przez lO minut, i strąt przemyto dwa razy 0,9% chlorkiem sodu otrzymując mokre Komórki. Komórki zawieszono w 3 ml buforu A i rozrywano ultradźwiękami. Zawiesinę wirowano przy 15,000 rpm przez 30 minut, i unoszący się -a powierzchni supernatant odsolooo używając kolumny Sephadex G-25 (Pharmacia Co.), otrzymując około 3,5 ml surowego ekstraktu enzymatycznego. Pięć mikrolitrów surowego ekstraktu enzymatycznego dodano do 50 pl 100 mM buforu Tris-HCl , (pH 7,5) zawierającego 5 mM chlorku magnezowego, 5 mM ATP, 100 mM chlorku potasu, 0,06 mM guano/yno 1 0,04 mM (8-14C) -guanozy-y. Mleszaoioę i-kubowano w 30°C przez 10 minut. Określono ilość wytworzo-ego Kwasu 5'-guanylowego 1 zmlerzo-o specyficzną aktywność kinazy
184 520 inozynowo-guanozyoowej. Wyniki pokazano w tabeli 9. Aktywność kinazy inozynowoguaoozooowoj zaobserwowano wo wszystkich szczepach.
Tabela 9
Szczep | Działanie specyficzne (ornol/mlo/mg białka) |
Ex1guobgctonum gurgotlgcum | 46,3 |
Kurthia gibsonii | 6,64 |
Kurthia zopfii | 1,19 |
Przykład 12 (Detekcja fragmentów mających homologię do genu kinazy inozynowo-guanozynowej z Exiguobacterium acetylicum w chromosomach Exiguobacterium aurantiacum, Kurthia gisonii i Kurthia zopfii)
Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652, Kurthia gibsonii ATCC 3195 i Kurthia zopfii ATCC 33403 hodowano w 30°C przez 16 godzin tak samo jak w przykładzie 11. Chromosomgloo DNA otrzymano z odpowiednich hodowli sposobem jak w przykładzie 5 (2). Dziesięć mikrogramów z każdego chrnmosomalnego DNA i 100 jednostek z endonuklegzy restrykcyjnej EcnRI wymieszano z 50 mM buforu Tris-HCl, (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego i 1 mM ditiotreitolu, i inkubowano w 37°C przez 14 godzin. Następnie, mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem zwykłym sposobem. Otrzymany tak chromosomalny DNA strawiony przez EcoRI poddano elektroforezie na 0,8 % żelu aearozowym i przeniesiono na błonę nylonową (DuPont Co.) z żelu ggrozowoko metodą transferu alkalicznego opisanego w Molocular Clnnink 2 edycja, J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbnur Laboratory Press, str. 9,31(1989). Błonę poddano hybrydyzacji w temperaturze 42°C przez 14 godzin w obecności 20% formamidu używając jako sondy fragmentu zawierającego gen kinazy ioozonowo-guanozooowej pochodzący od Exiguobacterium aurantiacum.
Przykład 13 (Izolacja homologicznego fragmentu genu kinazy inozonowo-kuanosynowej uzyskiwanego od Exiguobacterium acetylicum z chromosomu z Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652)
Osiemnaście mlkro^amów chromosomglogko DNA z Exiguobacterium auranntiacum ATCC 35652 1 200 jednostek oodonuklegzy restrykcyjnej EcoRI poddano reakcji w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem. Powstałe strawione fragmenty poddano elektroforezie na żelu agrarozowym. Fragmenty wielkości około 4,6 kb wydobyto używając sproszkowanego szkła (wyrobionego przez Takara Shuzo Co.) otrzymując wybrane rozmiary chromosomalnych fragmentów Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652.
Jeden mikrogram wektora plazmidowego pMW218 (Nippon Gene Co.) inkubowano z 20 jednostkami godoouklegzy restrykcyjnej EcoRI w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Roztwór ekstrahowano fenolem, i ekstrakt wytrącono etanolem. Następnie, fragment DNA defoseorolowano poprzez traktowanie alkaliczną fosfatazą. Fragment potraktowany w ten sposób ekstrahowano fenolem, 1 ekstrakt wytrącono etanolem.
0,2 pg tego pMW218 strawionego EcoRI poddano Ι^ΑΟΟΪ z 5 mg chromosomalooch fragmentów Exiguobacterium aurantiacum strawionych EcoRI używając T4 DNA ligazy (Takara Shuzo Co.). Następnie, E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA, 1 wysiano na płytce L-agarowej zawierającej 100 mg/ml kgnamocvno otrzymując około 1000 trgosformgotów.
184 520
Spośród otrzymanych transformantów wyselekcjonowano metodą hybrydyzącji kolonii transformant hybrydyzujący z sondą DNA. Plazmidowy DNA został ekstrahowany z tego transformantą metodą lizy alkalicznej. Ten plazmidowy DNA zawierał fragment DNA około
4,6 kb pochodzący z chromosomu Exiguobacterium aurantiacum.
Przykład 14 (Określenie sekwencji nukleotydowej genu kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzącego z Exiguobacterium aurantiacum)
Plazmid otrzymany w przykładzie 13 przecięto endonukleazami restrykcyjnymi i poddano hybrydyzacji Southema, identyfikując fragment hybrydyzujący z sondą DNA.
W rezultacie, hybrydyzował fragment zbliżony do 2,7 kb, który był przecięty EcoRI i Pstl. Ten fragment DNA poddano ligacji z wektorem plazmidowym pSTV28 (Takara Shuzo Co.) trawionym EcoRI i Pstl, i wprowadzono do E. coli JM109. Spośród otrzymanych transformantów, fragment do hybrydyzącji z sondą DNA klonowano metodą hybrydyzącji kolonii opisaną w Molecular Cloning 2 edycja, J. Sambrook, E. F Fritsh i T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, str. 1,90 (1989). Aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej z komórkowego ekstraktu E.coli niosącego plazmid zawierający powyższy fragment mierzono według metody opisanej w przykładzie 7 (5), i okazało się że jest ona około 300 razy większa szczepu niosącego wektor, który było stosowany jako odnośnik. W ten sposób zostało potwierdzone, że klonowany fragment zawiera gen kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący z Exiguobacterium aurantiacum.
Sekwencję nukleotydową fragmentu przeciętego EcoRI i Pstl oznaczono przy użyciu tak uzyskanego plazmidowego DNA. Przypuszczalna sekwencja nukleotydową ramki odczytu z określonej sekwencji nukleotydowej jest przedstawiona przez SEQ ID NO: 14 w liście sekwencji. Sekwencja aminokwasowa określona na podstawie tej sekwencji nukleotydowej jest przedstawiona przez SEQ ID NO: 15 w liście sekwencji. Obydwie sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa wykazują silną homologię do kinazy inozynowo-guanozynowej uzyskanej z Exiguobacterium acetylicum. Jednak nie ma wątpliwości, że jest to nowy gen. Zatem, gen kodujący białko majacy sekwencję aminokwasowa przedstawioną przez SEQ ID NO: 15 w liście sekwencji jest genem kinazy inozynowo-guanozynowej z Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652.
Jak wyżej wspomniano, otrzymano gen zdolny do hybrydyzacji genu kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący z Exiguobacterium acetylicum, i potwierdzono, że gen ten koduje białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
184 520
Wykaz Sekwencj i (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Ajinomoto Co, Inc (ii) NAZWA WYNÓIA. ZKU : SPOSÓB WYTWARZÓNI A
NUKLEINOWYCH (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 15 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:
KWASÓW
(A) | ADRESAT |
(B) | ULICA: |
(C) | MIASTO: |
(D) | STAN: |
(E) | KRAJ: |
(F) | KOD: |
(2) (v) FORMA ZAPISU KOMPUTEROWEGO:
(A) | TYP NOŚNIKA: | |
(B) | KOMPUTER: | |
(C) | SYSTEM OPERACYJNY: | |
(D) | OPROGRAMOWANIE: | |
(vi) | DANE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA: | |
(A) | NUMER ZGŁOSZENIA: | |
(B) | DATA WPŁYWU: | |
(C) | KLASSYFIKACJA: | |
(vii) | DANE PRAWNIKA/PRZEDSTAWICIELA | |
(A) | NAZWISKO: | |
(B) | NUMER REJESTRACYJNY | |
(ix) | INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE : | |
(A) | TELEFON: | |
(B) | FAX: | |
(C) | TELEX: | |
INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 1: |
(i) SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 909 par zasad
184 520
(B) | TYP: kwas | nukleinowy | |
(C) | ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy | ||
(D) | TOPOLOGIA: | liniowa | |
ii) | TYP | CZĄSTECZKI | : genomowy DNA |
iii) | HIPOTETYCZNY: | nie | |
iv) : | ANTYSENSOWNY: | nie |
(vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
(A) organizm: Exiguobacterium acetylicum (C) SZCZEP: ATCC 953 (ix) CECHY:
(A) NAZWA: sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1..909 (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 1:
ATGAATAAAA | TCGCGGTAAT | CGGAAAAGTA | TTCGTCGACA | TAAAAGGAAC | TTCGTTCGCT | 60 |
CCTTTGCATA | AGGATGCGAA | AAACGTAGGA | GACATCACGT | TTTCAAATGG | AGGAACAGGA | 120 |
CGCAACGTAG | CACAAAATCT | AGCCGTCCTC | GGGAATGAAG | TTCGCTTTAT | CTCGACGGTT | 180 |
ACGAATGATC | AGATTGGCGT | GGGAGTGCTC | GATGAGCTGA | AATCCTACGG | TGCGAATGTG | 240 |
GATCACGTCG | AAATGTTAGA | AGATCATGGA | ATGGGTATGT | GGCTAGCTGT | CATGGATAAC | 300 |
GAGGGTGACT | TGCAAACATC | GATCTCGAAA | CAACCGGATG | CCAAGTTGCT | CGAAGAGGCG | 360 |
attttacgtc | AATCGATCTA | TGCACTCGAT | GGAGTCGATG | CCGTTGCAAT | CGATTTGGAT | 420 |
TTGTCCGTCA | CGGTCTTAGA | ACGTTTGATT | CATTTATGTC | GTAAGATGGA | GTTGCCATTG | 480 |
TTTGGTGTTT | GTGGTCACTT | GAGCGTCATC | GAACGAAATC | GTCATCTGCT | ACAAGGGTTC | 540 |
ACTGGATTCA | TTTGTAGCCG | AGAAGAGGCT | GAAATTCTGT | CTGATCTATC | GATCGTGACG | 600 |
GTCGAAGATG | CGATTCATGT | AGCAAATGAG | CTAGCGAAAA | AGGGCGCTCC | GTTTACGGTC | 660 |
GTGACGATGA | GTGAACTGGG | GGCGGTCTAC | GTTGATCGTC | GTACGGCGAC | ATCAGGTCAC | 720 |
GTCGGAACGA | AAAAAGTGAA | GGTTGTCGAC | TCAACGGGAG | CAGGCGATTC | CTTCTTCTCC | 780 |
GCAGTCTTGT | CCGAATTGAC | ACAGGAAAAG | TCAGCAGAAG | AGGCTTTGAA | GCTTGGTATG | 840 |
AAGGTCGCAG | CAGAAGTCAT | CGCTTCAACA | GAGAATGGAC | TCGTTCCTGA | AATGCTAGAT | 900 |
GCTCTTCAA
909
184 520 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 2:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) | DŁUGOŚĆ: 303 aminokwasów | ||
(B) | TYP: aminokwas | ||
(D) | TOPOLOGIA: | liniowa | |
(ii) | TYP | CZĄSTECZKI: | : białko |
(X) | OPIS | SEKWENCJI: | SEK ID NR 2: |
Met | Asn | Lys | Ile | Ala VaA Ile Hy Lys VaA | PPh | Val Asp | Ile | Lls 15 | Gly | ||||||
5 | 10 | ||||||||||||||
Thr | Ser | Phe | Ala | Pro | Leu | Hhs | Lys | Aip | Ala | Lys | Asn | Val | Gly | Aip | Ile |
20 | 25 | 33 | |||||||||||||
Thr | Phe | Ser | Asn | Gly | Hy | TTh | Gly | Arg | Al si | VaA | Ala | Gln | Asn | Leu | Ala |
35 | 40 | 45 | |||||||||||||
Val | Leu | Gly | Asn | Glu | Val | TAg | Phh | Ile | Ser | TTh | VaA | Thr | Asn | Asp | Gln |
50 | 55 | 66 | |||||||||||||
Ile | Gly | VaA | Gly | VaA | Leu | Asp | Glu | Leu | Lls | Ser | Tyr | Gly | Ala | Asn | Val |
65 | 70 | 755 | 80 | ||||||||||||
Asp | His | VaA | Glu | Met: | Leu | Gib | Asp | His | Gly | Met | Gly | Met | Trp | Leu | Ala |
85 | 90 | 95 | |||||||||||||
Val | Met | Asp | As n | Glu | Hy | Aip | Leu | Gln | Thr | Ser | Ite | Ser | Lls | Gln | Pro |
100 | 105 | 111 | |||||||||||||
Asp | Ala | Lys | Leu | Leu | Glu | Glu | Ala | Ile | Leu | Ag | Gln | Ser | Ile | Tyr | Ala |
115 | 112 | 125 | |||||||||||||
Leu | Asp | Gly | Val | Asp | Ala | VaA | Ala | Ile | Asp | Leu | Asp | Leu | Ser | Val | Thr |
130 | 135 | 144 | |||||||||||||
Val | Leu | Glu | Ag | Leu | Ile | His | Leu | Cys | Ag | Lys | Met | Glu | Leu | Pro | Leu |
145 | 150 | 155 | 160 | ||||||||||||
Phe | Gly | Val | Cys | Gly | Hhs | Leu | Ser | Vae | IiLe | Glu | Arg | Asn | Arg | His | Leu |
165 | 170 | 175 | |||||||||||||
Leu | Gln | Gly | Phe | Thr | Gly | Phe | Ile | Cys | Ser | Arg | Glu | Glu | Ala | Glu | Ile |
180 | 185 | 110 | |||||||||||||
Leu | Ser | Asp | Leu | Ser | Ite | VaA | TTh | Val | Glu | Asp | Ala | Ile | His | Val | Ala |
195 200 205
184 520
Asn | Glu 210 | LeL Ala | Lys | Lys | Gly Alei Pro Phe Tlnr Val | Val | Thr | Mee | Ser | ||||||
221 | 220 | ||||||||||||||
Glu | Leu | Gly | Ala | Val | Tyr | Val | Aip | Arg | Air | Thr | Ali | TTr | Ser | Gly | HHs |
225 | 230 | 235 | 240 | ||||||||||||
Val | Gly | Thr | Lys | Lys | Val | Lys | Val | Val | Aip | Ser | Thr | Gly | Ala | Gly | Asp |
245 | 250 | 255 | |||||||||||||
Ser | Phh | Phe | Ser | Ala | Val | Leu | Ser | Glu | Leu | Thr | Gln | Glu | Lys | Ssi: | Ala |
260 | 255 | 200 | |||||||||||||
Glu | Glu | Ala | Leu | Lys | Leu | Gly | Met | Lys | Val | Ala | Ala | Glu | Val | Ile | Ala |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ser | Thr | Gli | Ain | Hy | Leu | VaA | Pro | Glu | Met | Leu | Asp | Ala | Leu | Gln |
290
295
300 (2) INFORMACJA DLA. SEK . ID. NR 3 :
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI .
CA.) DŁUGOŚĆ: 2 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: iiwiowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 3:
Met Asn Lys Ile Ala Val Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lys Gly 15 10 15
Thr Xaa Phe Ala Pro Leu His Lys Asp Ala Lys Asn 20 25 (2) INFORMACJA DLA SEK . IIK . NR 4:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie
184 520 (iv): ANTYSENSOWNY: nie (X) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 4:
ATGAAYAARA THGCNGT 17 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 5:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA:
(ii) TYP CZĄSTECZKI:
(iii) HIPOTETYCZNY:
(iv) : ANTYSENSOWNY: (x) OPIS SEKWENCJI:
TTYTTNGCRT CYTTRTG 17 liniowa inny kwas nukleinowy, nie nie
SEK ID NR 5:
syntetyczny DNA (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 6:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (X) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 6: TAATCGGAAA AGTATTCGTC GAC 23 syntetyczny DNA (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 7:
(i) CIHARAKTERYSTYiK. SEKWENCCI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy
184 520 (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY : nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 7:
GGAACTTCGT TCGCTCCTTT G 21 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 8:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 8 : GGCTGCAGGA ATGAATAAAA TCGCGGTAAT 30 syntetyczny DNA (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 9:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny-DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 9:
GGGCATGCTG GAAAGACATA ATACGTTTCG 30
184 520 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 10:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 1302 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy
(D) TOPOLOGIA: | liniowa | |
(ii) | TYP CZĄSTECZKI | : genomowy 1 |
(iii) | HIPOTETYCZNY: | nie |
(iv) : | ANTYSENSOOWNY: | nie |
(vi) | ŹRÓDŁO POCHODZENIA: | |
(A) organizm: | Escherichia |
(C) SZCZEP: HM70 (ix) CECHY:
(A) | NAHZWA: sekwencja | koduj ąca | |
(B) | POŁOŻENIE: | 1. . 1302 | |
OPIS | SEKWENCJI: | SEK ID | NR 10 : |
ATGAAATTTC | CCGGTAAACG | TAAATCCAAA | CATTACTTCC | CCGTAAACGC | ACGCGATCCG | 60 |
CTGCTTCAGC | AATTCCAGCC | AGAAAACGAA | ACCAGCGCTG | CCTGGGTAGT | GGGTATCGAT | 120 |
CAAACGCTGG | TCGATATTGA | AGCGAAAGTG | GATGATGAAT | TTATTGAGCG | TTATGGATTA | 180 |
AGCGCCGGGC | ATTCACTGGT | GATTGAGGAT | GATGTAGCCG | AAGCGCTTTA | TCAGGAACTA | 240 |
AAACAGAAAA | ACCTGATTAC | CCATCAGTTT | GCGGGTGGCA | CCATTGGTAA | CACCATGCAC | 300 |
AACTACTCGG | TGCTCGCGGA | CGACCGTTCG | GTGCTGCTGG | GCGTCATGTG | CAGCAATATT | 360 |
GAAATTGGCA | GTTATGCCTA | TCGTTACCTG | TGTAACACTT | CCAGCCGTAC | CGATCTTAAC | 420 |
TATCTACAAG | GCGTGGATGG | CCCGATTGGT | CGTTGCTTTA | CGCTGATTGG | CGAGTCCGGG | 480 |
GAACGTACCT | TTGCTATCAG | TCCAGGCCAC | ATGAACCAGC | TGCGGGCTGA | AAGCATTCCG | 540 |
GAAGATGTGA | TTGCCGGAGC | CTCGGCACTG | GTTCTCACCT | CATATCTGGT | GCGTTGCAAG | 600 |
CCGGGTGAAC | CCATGCCGGA | AGCAACCATG | AAAGCCATTG | AGTACGCGAA | GAAATATAAC | 660 |
GTACCGGTGG | TGCTGACGCT | GGGCACCAAG | TTTGTCATTG | CCGAGAATCC | GCAGTGGTGG | Ί20 |
CAGCAATTCC | TCAAAGATCA | CGTCTCTATC | CTTGCGATGA | AC GAAGATGA | AGCCGAAGCG | Ί80 |
TTGACCGGAG | AAAGCGATCC | GTTGTTGGCA | TCTGACAAGG | CGCTGGACTG | GGTAGATCTG | 840 |
GTGCTGTGCA | CCGCCGGGCC | AATCGGCTTG | TATATGGCGG | GCTTTACCGA | AGACGAAGCG | 900 |
184 520
AAACGTAAAA | CCCAGC.ATCC | GCTGCTGCCG | GGCCCZT.TTTG | CCGAGTTTAG | CAAGAAGGAG | 960 |
TTTAGCCGCG | CCATGCGCCA | CAAGGATTGC | CAGAATTCGG | GTGAAGATGT | GTCTAAGAGT | 1020 |
GCGCCGTACA | TGGGCGGGCC | GGAAAAAATC | ATGAGGAGTT | ATGAAGACGG | GGAGTGAAAA | 1080 |
TTGGCAGCGT | TGCTGCATGA | CATTACCGCC | AAGAGGGTGC | ATCAATGGAG | CAGTGCTAAG:: | 1140 |
TCCAGCAAAC | ATAAATTCAC | CTGGTTAACT | TTTTCATCTA | TTGGAAAGGA | GATATAG.GAG | 1)200 |
GCTAACCGTG | TGAGCTATCA | GGTACTGAAC | CATGATTTAG | GAAACAGATT | 1260 | |
CCGGAGCGTG | AAGACAGCCT | GGAAGAGTCT | TTTTGAAATT | GG | 1)302 |
(2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 11:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCCOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 11:
GGCTGCAGCC ATGAAATTTC CCGGTAAACG 30 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 12:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCCOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny-DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 12:
GGAAGCTTAA CGATCCCAGT AAGACTCTTC 30
184 520 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 13:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 72 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOiWC: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 13:
GGGGATCCTG TTGACAATTA ATCATCGAAC TAGTTAACAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA GGGTCTGCAG CC 72 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 14: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
(A) DŁUGOŚĆ: 924 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy
(D) TOPOLOGIA: | liniowa | |
(ii) | TYP CZĄSTECZKI | : genomowy DNA |
(iii) | HIPOTETYCZNY: | nie |
(iv) : | ACTYSECSOWCY: | nie |
(vi) | ŹRÓDŁO POCHODZENIA: |
(A) organizm: Exiguobacterium aurantiacum (C) SZCZEP: ATCC 35652 (ix) CECHY:
(A) NAHZWA: sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1..654 (x) OPIS SEKWENCJI : SEK ID NR 14 :
ATGAATACGA TTGCAGTAAT CGGCAAAGTG TTTGTCGACA TAAAAGGAAC GTCGTTCGCC 60 CCCATCCATA AAGATGCGAA AAACGTCGGA GATATCGCCT TCTCAAACGG TGGCACCGGA 12 0 CGAAACGTCG CTCAGAACTT AGGTGTCCTC GGTAACGATG TTCGGTTCGT CTCGACCGTG 180 ACGAACGATC AAATCGGAAT CGGTGTCCTC GAAGAACTAC GCAGTTTGAA CGTCAATGTC 2 40 GAACACGTCG ACTTGCTCGA AGACAACGGC ATGGGTATGT GGCTCGCGGT CATGGACAAT 300
184 520
AACGGTGACC | TCCAGACGTC | AATCTCAAAA | CAACCTGACG | AGGCGATGAT | GGAACAATGC | 360 |
ATCCTCCGTC | GCATCGATAC | CGTTTTCGCC | GAGAGCACGG | CTGTCGCCAT | CGACCTCGAC | 420 |
TTATCGGTCA | ACGTCTTAAA | CGAGACGATT | GAATTGTGCC | GTGAGATGAA | ACTCCC^TA | 480 |
TACGGTGTAT | GTGGTCACCT | CTCGGTCATC | GAACGCAACC | GTCACTTGCT | CCAAGGGTTC | 540 |
ACGGGCTTCA | TCTGTAGCCG | CGAAGAAGCC | GAGATTCTCT | CGGATATGTC | CATCGTCACG | 600 |
GTTGACGATG | CCCTTCGCGT | CGCCGAGGTG | CTCGCCATGA | AAGGAGCGCC | GCTCACGATT | 660 |
GTCACGATGA | GCGAGCTCGG | AGCCGTCTAC | GTCGACCTTC | GCACGAACGA | ACAAGGTCAC | 720 |
GTGCCGACGA | CGAAAGTGAA | AGTTGCCGAC | TCCACAGGCG | CCGGGGjATTC | CTTCTTCTCT | 780 |
GCCGTTATTT | CCGAGCTCAT | GAAAGAGCAT | TCGATTGAAG | ATGCACTTCG | TCTCGGCATG | 840 |
CGTGTCGCCG | GGAAAGTCAT | CGGCTCTCAT | GACAACGGAC | TGACGCCTGA | GATGTATGCT | 900 |
TCACTTGAAC | AACCAACACG | TGAC | 924 |
(2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 15:
(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:
i (A) DŁUGOŚĆ: 308 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko
(x) | OPIS SEKWENCJI | : SSE ND NR 01: | |
Met | Asn | Thr Ile Ala Vvl | Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lly Gly |
5 | 10 15 | ||
Thr | Ser | Phe Ala Pro Ile | His Lly 2Ap Ala Lys Asn Vvl dy Aip Ile |
20 | 25 33 | ||
Ala | Phe | Ser Ais Gly Gly | Thr dy Arg Ain Val ALa Gln Ain Leu dy |
35 | 40 45 | ||
Val | Leu | Gly Am Asp Val | Arg Phe Val Ser Thr Val Thr Am Asp Gln |
50 | 55 60 | ||
Ile | Gly | Ile dy Val Leu | Glu du Leu Arg Ser Leu Asn Val Asn Val |
65 | 70 | 75 80 | |
Glu | His | Vvl Aip Leu Leu | Glu Asp Asn dy Met Gly Met: Trp Leu Ala |
85 | 90 95 |
184 520
Val Met Asp Asn Asn Gly Asp Leu Gln Thr Ser Ile Ser Lys | lln | Pro | |||||||||||||
100 | 105 | 111 | |||||||||||||
Asp | Glu | Ha | Met | Met | Glu | Gln | Ccs | Ile | Ltu | 2Ag | Aa: | Ile | AAP | TTh | Vvl |
115 | 110 | 112 | |||||||||||||
Phe | Ala | Glu | Ser | T^r | Aa | Val | Aa | Ile | Asp | Leu | AAP | Llu | Ser | Vvl | Am |
130 | 135 | 140 | |||||||||||||
Val | Leu | Am | Glu | Thr | IlT | Hu | Geu | Cu s | Arg | Gilu | Met | Lys | Leu | ery | Llu |
145 | 150 | 115 | 160 | ||||||||||||
Tyr | Hy | Val | Cys | Gly | HHs | Leu | Ser | Val | Ite | Glu | Arg | Asn | Arg | His | Leu |
165 | 170 | Hii | |||||||||||||
Leu | Gln | Gly | Phe | Thr | Gly | Phe | Ile | Ccs | Str | Arg | Glu | llu | Alei | Glu | Il<i |
180 | 115 | 190 | |||||||||||||
Leu | Ser | Asp | Met | Ser | Ile | Val | TTr | Val | Asp | Asp | Ala | Leu | Arg | Val | Alei |
195 | 200 | 205 | |||||||||||||
Hu | Val | Leu | AA a | Met | Lys | Gly | Aa | Pro | Leu | Thr | Ile | Val | Thr | Met | Ser |
210 | 215 | 225 | |||||||||||||
Hu | Leu | Gly | Ala | Val | Tyr | Val | AAP | Leu | Arg | TTr | Asn | Glu | Gln | Gly | His |
225 | 230 | 225 | 240 | ||||||||||||
Val | Pro | Thr | Thr | Lys | Val | Lys | Val | ALa | Asp | SSr | Thr | Gly | Ala | Gly | Asp |
245 | 250 | 225 | |||||||||||||
Ser | Phe | Phe | Ser | Ala | Val | Ile | Ser | Glu | Leu | Met | Lys | llu | HHs | Ser | Ile |
260 | 226 | 270 | |||||||||||||
Hu | Asp | Ala | Llu | AAg | Leu | Gly | Met | Alg | Val | ALa | Gly | Lys | Val | Ile | Gly |
275 | 280 | 285 | |||||||||||||
Ser | His | Asp | Am | Gil' | Leu | Thr | Pro | Hu | Met | Tyr | Ala | Ser | Leu | Glu | Gln |
290 295 300
Pro Thr Arg Asp 305
184 520
Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Ceną 6,00 zł.
Claims (19)
- Zastrzeżenia patentowe1. Sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'-guanylowego, znamienny tym, że kontaktuje się stransformowany mikroorganizm mający zdolność reprodukowania ATP, posiadający gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, z inozyną, guanozyną lub ich prekursorem, źródłem energii i donorem fosforanu, a następnie wydziela się kwas 5'-inozynowy lub kwas 5'-guanylowy.
- 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Saccaromyces, Skaphylococcus lub Candida.
- 3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm należący do Corynebacterium ammoniagenes.
- 4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm, który jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen z Exiguobacterium acetylicum lub Escherichia coli.
- 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm, który jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
- 6. Stransformowany mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Sacharomyces, Skaphylococcus lub Candida mający zdolność reprodukowania ATP posiadający gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
- 7. Stransformowany mikroorganizm według zastrz. 6, znamienny tym, że jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
- 8. Stransformowany mikroorganizm według zastrz. 7, znamienny tym, że należy do Corynebacterium ammoniagenes.
- 9. Stransformowany mikroorganizm według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynow-O-guanozynowej posiada gen o sekwencji nukleotydowej nr 1 lub 14 w liście sekwencji.
- 10. Stransformowany mikroorganizm mający zdolność reprodukowania ATP posiadający gen o sekwencji nukleotydowej nr 10 w liście sekwencji kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
- 11. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
- 12. Zrekombinowany DNA według zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
- 13. Zrekombinowany DNA według zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje gen o sekwencji nukleotydów nr 1 lub 14 w liście sekwencji.
- 14. Zrekombinowany DNA obejmujący gen o sekwencji nukleotydów nr 10 w liście sekwencji.
- 15. Białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
- 16. Białko według zastrz. l5, znamienne tym, że ma sekwencję aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, zastąpiona lub dodana przy zachowaniu jego aktywności.
- 17. Gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji.184 520
- 18. Gen według zastrz. 17, znamienny tym, że pochodzi z Exiguobacterium acetylicum i ma sekwencję nukleotydów nr 1 w liście sekwencji lub pochodzi z Exiguobacterium aurantiacum i ma sekwencję nukleotydów nr 14 w liście sekwencji.
- 19. Gen o sekwencji nukleotydów nr 10 w liście sekwencji pochodzący z Escherichia coli.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP10288895 | 1995-03-24 | ||
JP17790095 | 1995-06-09 | ||
PCT/JP1996/000761 WO1996030501A1 (fr) | 1995-03-24 | 1996-03-22 | Procede de production d'acides nucleiques |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
PL322580A1 PL322580A1 (en) | 1998-02-02 |
PL184520B1 true PL184520B1 (pl) | 2002-11-29 |
Family
ID=26443578
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
PL96322580A PL184520B1 (pl) | 1995-03-24 | 1996-03-22 | Sposób wytwarzania kwasu inozynowego lub guanylowego stransformowany mikroorganizm zrekombinowany DNA białko oraz gen |
Country Status (12)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6673576B1 (pl) |
EP (1) | EP0816491B1 (pl) |
JP (1) | JP3948027B2 (pl) |
KR (1) | KR100376635B1 (pl) |
CN (1) | CN1130457C (pl) |
BR (1) | BR9607745A (pl) |
CA (1) | CA2216172A1 (pl) |
DE (1) | DE69637616D1 (pl) |
ES (1) | ES2311289T3 (pl) |
HU (1) | HUP9801687A3 (pl) |
PL (1) | PL184520B1 (pl) |
WO (1) | WO1996030501A1 (pl) |
Families Citing this family (13)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR100463983B1 (ko) * | 1998-03-14 | 2005-06-02 | 씨제이 주식회사 | 유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법 |
TWI222464B (en) * | 1999-02-08 | 2004-10-21 | Kyowa Hakko Kogyo Kk | Process for producing purine nucleotides |
KR100397321B1 (ko) * | 2000-12-26 | 2003-09-06 | 씨제이 주식회사 | 5'-이노신산을 고수율로 생산하는 미생물 코리네박테리움암모니아게네스 씨제이아이피009 및 그를 이용한5'-이노신산 생산방법 |
JP4760711B2 (ja) * | 2004-03-31 | 2011-08-31 | 味の素株式会社 | バチルス属又はエシェリヒア属に属する細菌を使用した発酵によるプリンヌクレオシド及びヌクレオチドの製造方法 |
KR100694427B1 (ko) * | 2005-12-02 | 2007-03-12 | 씨제이 주식회사 | 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조 방법 |
BRPI0709635A2 (pt) | 2006-04-24 | 2011-07-19 | Ajinomoto Kk | bactéria pertencendo ao gênero bacillus, e, métodos para produzir uma substáncia derivada de purina, e um nucleotìdeo de purina |
JP5104754B2 (ja) | 2006-04-24 | 2012-12-19 | 味の素株式会社 | プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法 |
JP2010110216A (ja) | 2007-02-20 | 2010-05-20 | Ajinomoto Co Inc | L−アミノ酸または核酸の製造方法 |
JP2011067095A (ja) | 2008-01-10 | 2011-04-07 | Ajinomoto Co Inc | 発酵法による目的物質の製造法 |
EP2264144A4 (en) | 2008-02-25 | 2012-11-07 | Ajinomoto Kk | PROCESS FOR THE PREPARATION OF 5'-GUANYLIC ACID |
US9234226B2 (en) | 2008-10-14 | 2016-01-12 | Wayne M. Barnes | In vitro recombination methods using 5′ exonuclease |
JP6519476B2 (ja) | 2013-10-23 | 2019-05-29 | 味の素株式会社 | 目的物質の製造法 |
KR102284843B1 (ko) * | 2019-10-08 | 2021-08-02 | 씨제이제일제당 주식회사 | 5'-구아닐산이나트륨 7수화물 결정의 제조 방법 |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JPS4944350B1 (pl) * | 1967-06-16 | 1974-11-27 | ||
NL7209936A (pl) | 1972-07-19 | 1974-01-22 | ||
JPS5682098A (en) | 1979-12-06 | 1981-07-04 | Ajinomoto Co Inc | Production of purine nucleoside-5'-monophosphate |
JPH0669386B2 (ja) | 1987-03-18 | 1994-09-07 | 協和醗酵工業株式会社 | 5′−イノシン酸の製造法 |
EP0458971B1 (en) * | 1989-12-05 | 1996-01-03 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Inosine guanosine kinase |
US5756315A (en) * | 1989-12-05 | 1998-05-26 | Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. | Inosine-guanosine kinase |
-
1996
- 1996-03-22 KR KR1019970706658A patent/KR100376635B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1996-03-22 ES ES96906930T patent/ES2311289T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-22 EP EP96906930A patent/EP0816491B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-22 HU HU9801687A patent/HUP9801687A3/hu not_active Application Discontinuation
- 1996-03-22 DE DE69637616T patent/DE69637616D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1996-03-22 CN CN96194140A patent/CN1130457C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-22 BR BR9607745A patent/BR9607745A/pt not_active IP Right Cessation
- 1996-03-22 CA CA002216172A patent/CA2216172A1/en not_active Abandoned
- 1996-03-22 PL PL96322580A patent/PL184520B1/pl not_active IP Right Cessation
- 1996-03-22 JP JP52915796A patent/JP3948027B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-22 US US08/913,816 patent/US6673576B1/en not_active Expired - Fee Related
- 1996-03-22 WO PCT/JP1996/000761 patent/WO1996030501A1/ja active IP Right Grant
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ES2311289T3 (es) | 2009-02-01 |
KR100376635B1 (ko) | 2003-06-12 |
PL322580A1 (en) | 1998-02-02 |
US6673576B1 (en) | 2004-01-06 |
HUP9801687A3 (en) | 2000-06-28 |
JP3948027B2 (ja) | 2007-07-25 |
EP0816491A4 (en) | 2000-11-22 |
BR9607745A (pt) | 1998-06-23 |
CN1130457C (zh) | 2003-12-10 |
KR19980703254A (ko) | 1998-10-15 |
EP0816491A1 (en) | 1998-01-07 |
CA2216172A1 (en) | 1996-10-03 |
EP0816491B1 (en) | 2008-07-30 |
DE69637616D1 (de) | 2008-09-11 |
WO1996030501A1 (fr) | 1996-10-03 |
CN1185174A (zh) | 1998-06-17 |
HUP9801687A2 (hu) | 1998-10-28 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6207435B1 (en) | Method for producing nucleoside-5′-phosphate ester | |
US6010851A (en) | Method for producing nucleoside-5'-phosphate ester | |
PL184520B1 (pl) | Sposób wytwarzania kwasu inozynowego lub guanylowego stransformowany mikroorganizm zrekombinowany DNA białko oraz gen | |
JP2022524680A (ja) | プリンヌクレオチドを生産する微生物及びそれを用いたプリンヌクレオチドの生産方法 | |
JP4663631B2 (ja) | 放線菌由来のampデアミナーゼ及びその利用 | |
KR100957689B1 (ko) | 5'-구아노신 모노포스페이트 생산능이 향상된코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-구아노신모노포스페이트의 생산방법 | |
JP2000295996A (ja) | プリンヌクレオチドの製造法 | |
CN112126666B (zh) | 核苷高产菌及其构建方法与应用 | |
JP3941390B2 (ja) | 変異型酸性フォスファターゼ | |
KR0145418B1 (ko) | 이노신-구아노신 키나아제 | |
JP3117707B2 (ja) | 5´―イノシン酸の製造法 | |
US5874272A (en) | Inosine-guanosine kinase | |
CN114736884A (zh) | 一种胞苷单磷酸激酶突变体及其基因和应用 | |
WO2001002584A1 (fr) | Adn codant une enzyme ii de pts de sucrose | |
US5250425A (en) | Process for producing ascorbic acid-2-phosphate | |
US6841368B1 (en) | Enzymatic production of difructose dianhydride IV from sucrose and relevant enzymes and genes coding for them | |
KR100237091B1 (ko) | 플라빈 뉴클레오타이드의 제조방법 | |
JP4649787B2 (ja) | 5’−グアニル酸の製造法 | |
JPWO2003057895A1 (ja) | 2’−デオキシグアノシンの製造法 | |
JP2999256B2 (ja) | イノシングアノシンキナーゼ | |
JPH05304975A (ja) | フラビンヌクレオチド類の製造法 | |
KR19990074792A (ko) | 유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
LAPS | Decisions on the lapse of the protection rights |
Effective date: 20080322 |