PL184520B1

PL184520B1 - Sposób wytwarzania kwasu inozynowego lub guanylowego stransformowany mikroorganizm zrekombinowany DNA białko oraz gen

Info

Publication number: PL184520B1
Application number: PL96322580A
Authority: PL
Inventors: Usuda@Yoshihiro; Kawasaki@Hisashi; Shimaoka@Megumi; Utagawa@Takashi
Original assignee: Ajinomoto Kk
Priority date: 1995-03-24
Filing date: 1996-03-22
Publication date: 2002-11-29
Also published as: ES2311289T3; KR100376635B1; EP0816491A1; BR9607745A; CN1130457C; DE69637616D1; JP3948027B2; CA2216172A1; WO1996030501A1; HUP9801687A3; HUP9801687A2; EP0816491B1; PL322580A1; US6673576B1; EP0816491A4; CN1185174A; KR19980703254A

Abstract

12R 1/19 Sposób wytwarzania kwasu 5’-inozynowego lub 5’-guanylowego, stransformowany mikroorganizm, zrekombinowany DNA, bialko oraz gen PL PL PL

Description

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'guanylowego, stransformowany mikroorganizm, zrekombinowany DNA, białko oraz gen.

W celu produkcji kwasu 5'-inozynowego przy użyciu mikroorganizmów fosforylujących inozynę dotychczas opracowano sposób stosujący fosforan p-nitrofenylu (japońska publikacja patentowa nr 29,858/1964), sposób stosujący nieorganiczne kwasy fosforowe (japońska publikacja patentowa nr 1,186/1967 i 44,350/1974), sposób z zastosowaniem fosforanu acetylu (japońskie wyłożone zgłoszenie patentowe nr 82,098/1981) i sposób z zastosowaniem ATP (japońskie wyłożone zgłoszenie patentowe nr 230,094/1988). Jednak akumulacja kwasu 5'inozynowego produkowanego tymi sposobami nie była zadawalająca. Dla ulepszenia metod fosforylowania inozyny za pomocą ATP opracowano metodę (WO 91/08286), która obejmuje otrzymywanie genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową z Escherichia coli, przygotowanie szczepu E.coli mającego zwiększoną aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej techniką rekombinacji DNA i fosforylowania inozyny lub guanozyny przy użyciu tego szczepu w celu wytworzenia kwasu 5'-inozynowego lub 5'-guanylowego. Jednak, sposób ten wymaga, aby mikroorganizm do regenerowania ATP do zużycia podczas reakcji był oddzielnie hodowany i żeby jego komórki dodawane były do roztworu. Tak więc, potrzebny był bardziej wydajny sposób otrzymywania kwasu 5'-inozynowego lub 5'-guanylowego.

Ponadto wiadomo jedynie, że gen kinazy inozynowo-guanozynowej obecny jest w niektórych mikroorganizmach takich jak E. coli [J.Gen.Microbiol., 135, 1263-1273 (1989)].

Celem wynalazku było opracowanie bardziej wydajnego sposobu wytwarzania kwasu 5'-inozynowego i/lub 5'-guanylowego. Okazało się, że kwas 5'-inozynowy i/lub 5'-guanylowy może być z łatwością wytwarzany z dużą wydajnością przez wprowadzenie genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową do mikroorganizmu mającego dostateczną zdolność regenerowania zużywanego ATP w trakcie reakcji. Znaleziono również nową kinazę inozynowoguanozynową mającą sekwencję aminokwasową różną od kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzącej z E.coli.

Przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'guanylowego, charakteryzujący się tym, że kontaktuje się stransformowany mikroorganizm mający zdolność reprodukowania ATP, posiadający gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, z inozyną, guanozynąlub ich prekursorem, źródłem energii i donorem fosforanu, a następnie wydziela się kwas 5'-inozynowy lub kwas 5'-guanylowy.

Korzystnie, stosuje się mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Saccaromyces, Staphylococcus lub Candida, a najkorzystniej - Corynebacterium ammoniagenes.

W sposobie według wynalazku korzystnie stosuje się mikroorganizm, który jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen z Exiguobacterium acetylicum lub Escherichia coli. Gen ten ma sekwencję aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów może być usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest stransformowany mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Sacharomyces, Staphylococcus lub Candida mający zdolność reprodukowania ATP posiadający gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.

Część aminokwasów w tych sekwencjach może być usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.

Korzystnie, mikroorganizm ten należy do Corynebacterium ammoniagenes.

184 520

Korzystnie, gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej ma sekwencję nukleotydową nr 1 lub 14 w liście sekwencji.

Korzystnie, gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej ma sekwencję nukleotydową nr 10 w liście sekwencji.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej .

Część aminokwasów w białku kodowanym przez zrekombinowany DNA według wynalazku może być usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowaniu jego aktywności.

Korzystnie, zrekombinowany DNA według wynalazku obejmuje gen o sekwencji nukleotydów nr 1 lub 14 w liście sekwencji.

Korzystnie, zrekombinowany DNA według wynalazku obejmuje gen o sekwencji nukleotydów nr 10 w liście sekwencji.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.

Część aminokwasów w białku według wynalazku może być usunięta, zastąpiona lub dodana przy zachowaniu jego aktywności.

Kolejnym przedmiotem wynalazku jest gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji.

Korzystnie, gen według wynalazku pochodzi z Exiguobacterium acetylicum i ma sekwencję nukleotydów nr lw liście sekwencji lub pochodzi z Exiguobacterium aurantiacum i ma sekwencję nukleotydów nr 14 w liście sekwencji.

Gen według wynalazku może też mieć sekwencję nukleotydów nr 10 w liście sekwencji i pochodzić z Escherichia coli.

Obecny wynalazek obejmuje sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'guanylowego do stosowania w sezonowaniu lub podobnych z inozyny lub guanozyny lub ich prekursorów z łatwością i z dużą wydajnością. Bardziej szczegółowo wynalazek obejmuje sposób, w którym gen kodujący białko, który ma działanie przekształcające inozynę i/lub guanozynę do kwasu 5'-inozynowego i/lub kwasu 5'-guanylowego wprowadza się do mikroorganizmu mającego zdolność regenerowania ATP zużywanego podczas reakcji, na skutek czego kwas 5'-inozynowy i/lub kwas 5'-guanylowy z łatwością otrzymuje się sprawnie z dużą wydajnością jedynie w obecności mikroorganizmu mającego wprowadzony w siebie gen, bez oddzielnego hodowania innego mikroorganizmu do regenerowania ATP zużywanego podczas reakcji, w celu dodawania go do roztworu reakcyjnego.

Dalej, obecny wynalazek obejmuje nowe białko, które otrzymuje się z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum, które ma działanie przekształcające inozynę i guanozynę do kwasu 5'-inozynowego i 5'-guanylowego, odpowiednio, gen kodujący to białko, rekombinacyjne DNA zawierający ten gen, mikroorganizm, który jest przekształcony wymienionym rekombinacyjnym DNA, sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego i/lub 5'guany-lowego przy użyciu tego mikroorganizmu.

Białko według wynalazku jest nowe, ponieważ sekwencja aminokwasowa białka według wynalazku jest całkowicie różna od znanego białka mającego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej. Kinaza inozynowo-guanozynowa pochodząca od E. coli jest już znana. Obecni wynalazcy odkryli, że białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej jest również produkowane w mikroorganizmach należących do rodzaju Exiguobac.terium, który nie był dotychczas znany jako posiadający aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej i z powodzeniem wyodrębnili to białko i klonowali gen kodujący to białko. Białko to różni się od znanych białek pod względem sekwencji aminokwasowej.

Po raz pierwszy zostało stwierdzone przez obecnych wynalazców, że białko mające sekwencję aminokwasową całkowicie różną od sekwencji znanego białka o aktywności inozynowo-guanozynowej ma taką aktywność inozyno wO-guanozynowajak znane białko.

Białko otrzymane z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej ma następujące właściwości:

184 520

1. Działanie

Enzym przenosi grupę fosforanową do nukleozydu w obecności donora fosforanu i formuje 5'-monofosforan nukleozydu.

2. Specyficzność substratu

Grupa fosforanowa w pozycji γ trifosforanu nukleozydu jest przeniesiona do innego nukleozydu

3. Optymalne pH pH 7,7 - 9,9.

4. Stabilność pH pH 6,7-12,1.

5. Optymalna temperatura

- 50°C.

6. Zapotrzebowanie na metal

Jon magnezu, jon manganu, jon kobaltu i jon żelaza

7. Wpływ jonów metalu

Aktywność enzymu jest silnie hamowana przez jon miedzi i jon rtęci, oraz jest również hamowana przez jon cynku i jon kadmu.

8. Wartość Km

Wartość Km wynosi 0,03 mM dla guanozyny, 1 mM dla inozyny i 1,6 mM dla ATP gdy jako substrat stosowano guanozynę.

9. Ciężar molowy

Enzym ma ciężar cząsteczkowy około 36 kilodaltonów według pomiaru za pomocą elektroforezy na żelu SDS-poliakryloamid.

W opisie aktywność fosforylowania inozyny i guanozyny za pomocą ATP i tworzenia kwasu 5'-inozynowego i 5'-guanylowego, odpowiednio, określana jest jako „aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej”. Białko posiadające tę aktywność oznaczane jest jako „kinaza inozynowo-guanozynowa”. Mikroorganizm mający wystarczającą zdolność regenerowania zużywanego ATP podczas reakcji oznaczany jest jako „szczep produkujący ATP”.

Wynalazek zostanie opisany poniżej bardziej szczegółowo.

Kinaza inozynowo-guanozynowa według wynalazku stanowi enzym, który katalizuje reakcję fosforylowania inozyny i guanozyny za pomocą ATP lub podobnych i tworzenia odpowiednio kwasu 5'-inozynozynowego i kwasu 5'-guanylowego. Pochodzenie enzymu nie jest szczególnie ograniczone, ale korzystna jest kinaza inozynowo-guanozynowa pochodząca z mikroorganizmu. Obejmuje ona nie tylko nowy enzym otrzymany z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum lub podobnego, ale również znaną kinazę inozynowoguanozynową otrzymaną z E.coli.

Nowe białko, które może być otrzymane z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum lub podobnego i które ma aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, może być otrzymane przez hodowanie mikroorganizmu, rozerwanie otrzymanych komórek w celu sporządzenia surowego ekstraktu enzymu i przez oczyszczenie enzymu z surowego ekstraktu enzymu. Jako przykład takiego mikroorganizmu można wymienić Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.

Taksonomicznie Exiguobacterium acetylicum nazwane zostało Brevibacterium acetylicum [Bergey's Manuał of Systematic Bacteriology, str. 1301-1313 (1986)]. Jednakże, w wyniku analizy genetycznej proponuje się, aby Brevibacterium acetylicum zostało przeniesione do rodzaju Exiguobacterium jako Exiguobacterium acetylicum [Int.J.Syst.Bacteriol., 44, 74-82 (1994)].

Kinaza inozynowo-guanozynowa może być oczyszczana każdą metodą, która nie wpływa niekorzystnie na aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej. Oczyszczanie na ogół przeprowadza się za pomocą cieczowej chromatografii kolumnowej. W szczególności można stosować kombinację jonowymiennej chromatografii kolumnowej stosując gradient stężenia chlorku potasu, hydrofobowej chromatografii kolumnowej stosując gradient stężenia siarczanu amonu 1 absorpcyjnej chromatografii kolumnowej stosując gradient stężenia buforu fosforanowego.

184 520

Enzym według wynalazku, który może być otrzymany z mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum, i który ma aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, ma następujące własności.

1. Działanie

Enzym przenosi grupę fosforanową do nukleozydu w obecności donora fosforanu i tworzy 5'-monofosforan nukleozydu.

Donor fosforanu jest trifosforanem nukleozydu. Przykładami trifosforanu nukleozydu są ATP, trifosforan 2'-dezoksyadenozyny, trifosforan guanozyny, 2'-trifosforan dezoksyguanozyny i trifosforan tymidyny.

Przykładami nukleozydu, do którego przenoszona jest grupa fosforanowa są inozyna, guanozyna i 2'-dezoksyguanozyna.

5'-monofosforan nukleozydu obejmuje estry 5'-monofosforanu wyżej wymienionych nukleozydów i 5'-inozynian, 5'-guanylan, 2'-dezoksy-5'-guanylan itd..

2. Specyficzność substratu

Grupa fosforanowa w pozycji trifosforanu nukleozydu jest przenoszona do innego nukleozydu.

Przykłady trifosforanu nukleozydu obejmują ATP, trifosforan 2'-dezoksyadenozyny, trifosforan guanozyny, trifosforan 2'-dezoksyguanozyny i trifosforan tymidyny.

Przykładami innego nukleozydu, do którego przenoszona jest grupa fosforanowa są inozyna, guanozyna i 2'-dezoksyguanozyna.

3. Optymalne pH

Optymalne pH wynosi pomiędzy 7,7 i 9,9.

4. Stabilność w pH

Aktywność jest ustabilizowana w pH w zakresie pomiędzy 6,7 i 12,1.

5. Optymalna temperatura

Optymalna temperatura jest pomiędzy 30 a 50°C.

6. Trwałość temperaturowa

Enzym jest nieaktywny w temperaturze 40°C i wyższej.

7. Zapotrzebowanie na metale

Dla postępu reakcji wymagane są jony metali. Reakcja zachodzi w obecności jonu magnezowego, jonu manganowego, jonu kobaltowego lub jonu żelaza.

8. Wpływ jonów metali

Aktywność enzymu jest silnie inhibitowana jonami miedzi i jonami rtęci, a także jonami cynku i jonami kadmu.

9. Wartość Km

Wartość Km wynosi 0,03 mM dla guanozyny, 1 mM dla inozyny i 1,6 mM dla ATP gdy substratem jest guanozyna.

10. Ciężar molowy

Enzym ma ciężar cząsteczkowy około 36 kilodaltonów według pomiaru za pomocą elektroforezy na żelu SDS-poliakryloamidowym.

Fragment DNA zawierający gen strukturalny kodujący białko posiadające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej można uzyskać znaną metodą przy użyciu oczyszczonego białka. Przykłady znanych metod obejmują sposób, w którym przygotowuje się przeciwciała skierowane przeciw wymienionemu białku i przy ich pomocy przeszukuje się ekspresyjną bibliotekę genów chromosomalnych, oraz sposób, w którym analizuje się sekwencję aminokwasową wymienionego białka. Jako sekwencję aminokwasową, rozumie się wewnętrzną sekwencję aminokwasową wyznaczoną z polipeptydu uzyskanego przez trawienie białka odpowiednią proteinazą, w połączeniu z N-końcową sekwencją aminokwasową białka. Przykłady sondy obejmują oligonukleotydy syntetyzowane w oparciu o N-końcową sekwencję aminokwasową lub wewnętrzną sekwencję aminokwasową białka, sondy uzyskane przez amplifikację regionu odpowiadającego N-końcowej sekwencji aminokwasowej lub wewnętrznej sekwencji aminokwasowej metodą łańcuchowej reakcji polimerazy (PCR) przy użyciu oligonukleotydów syntetyzowanych na bazie sekwencji, oraz sond uzyskanych przez amplifikację części białka od regionu N-końcowego do wewnętrznej sekwencji aminokwasowej

184 520

Ί przy użyciu oligonukleotydów syntetyzowanych na bazie N-końcowej sekwencji aminokwasowej i wewnętrznej sekwencji aminokwasowej jako primerów. Ponadto, istnieje metoda, w której chromosom liguje się z dwuniciowym oligonukleotydem nazywanym „kasetą”, a żądany fragment uzyskiwany jest przez PCR przy użyciu primera z oligonukleotydu utworzonego według N-terminalnej sekwencji aminokwasowej i primera utworzonego według sekwencji DNA kasetki.

Dokładniej, gen kodujący białko posiadające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej Exiguobacterium acetylicum może być uzyskany przez zwielokrotnienie fragmentu DNA odpowiadającego N-końcowemu regionowi przy użyciu PCR, syntetyzując primer oparty na fragmencie DNA, i zwielokrotniając fragment przy użyciu PCR z kasetą.

Określona sekwencja 28 aminokwasów końca N białka uzyskanego z Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 reprezentowana jest przez SEQ ID NO: 3 w Wykazie Sekwencji. Aminokwas 18 nie został zidentyfikowany.

Sądząc po N-końcowej sekwencji aminokwasowej, białko Exiguobacterium acetylicum jest raczej różne od znanej kinazy inozynowo-guanozynowej otrzymywanej z E.coli jak to opisano w WO 91/08286.

W celu uzyskania żądanego genu, DNA kodujące N-terminalną część białka mającego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej jest specyficznie zwielokrotniony przez PCR przy użyciu primera syntetyzowanego na bazie wyżej wspomnianej N-terminalnej sekwencji aminokwasowej i przy użyciu chromosomu mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum jako matrycy, i klonowany.

Zwykle używany jest primer, w którym skład zasad jest dowolny, zawartość G+C wynosi w przybliżeniu 50%, i nie powstaje żadna specyficzna struktura drugorzędowa, łańcuchy nie są komplementarne w stosunku do siebie, a długość wynosi od 16 do 30 zasad. Sekwencje primerów ulokowane są na obu końcach sekwencji nukleotydowej odpowiadającej N-końcowemu regionowi białka i pokazane są w SEQ ID No: 4 i 5 w Wykazie Sekwencji.

W SEQ ID No: 4, szósty nukleotyd jest mieszaniną T i C, dziewiąty nukleotyd jest mieszaniną A i G, dwunasty nukleotyd jest mieszaniną T, C i A, piętnasty nukleotyd jest mieszaniną T, C, A i G. Oraz w SEQ ID No:5, nukleotydy trzeci i dwunasty są mieszaniną T i C, szósty nukleotyd jest mieszaniną T, C, A, i G, dziewiąty nukleotyd i piętnasty są mieszaniną A i G.

Następnie, chromosom mikroorganizmu należącego do Exiguobacterium acetylicum jest przecinany odpowiednią endonukłeazą restrykcyjną. Fragment restrykcyjny liguje z kasetą tworząc matrycę. Fragment DNA zawierający część strukturalnego genu lub górny region białka mającego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej jest specyficznie amplifikowany techniką PCR przy użyciu wspomnianej matrycy i primera syntetyzowanego według sekwencji nukleotydowej odpowiadającej N-końcowej sekwencji aminokwasowej i primera syntetyzowanego według kasetki, i jest następnie klonowany. Można w tym celu wykorzystać primer, spełniający wyżej wymienione warunki, przedstawiony w SEQ ID NO: 6 i 7 w Wykazie Sekwencji.

Wektor który ma zdolność autonomicznego replikowania się w E.coli używany jako gospodarz można zastosować jako wektor użyteczny do klonowania genu. Przykłady wektora obejmują: pUC19, pHSG298, pHSG398 ipBR.322. Dowolny szczep odpowiedni do replikowania wektora może być użyty jako szczep gospodarza przyjmujący powstały rekombinowany DNA. Przykłady szczepów gospodarza obejmują szczepy E. coli takie jak HB101, JM109 i DH5.

Sekwencja nukleotydową genu kinazy inozynowo-guanozynowej obecnego we fragmencie DNA wstawionym do DNA wektora i sekwencja aminokwasowa białka kodowanego przez ten gen może być określona przez zanalizowanie sekwencji nukleotydowej tego fragmentu DNA. Sekwencja nukleotydową i sekwencja aminokwasowa kinazy inozynowoguanozynowej Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 są reprezentowane odpowiednio przez SEQ ED NO: li 2 w Wykazie Sekwencji.

Białko obecnego wynalazku zawiera około 303 aminokwasów, a jego masa cząsteczkowa wynosi w przybliżeniu 32,5 kilodaltonów.

184 520

Białko obecnego wynalazku zawiera nie tylko białko reprezentowane przez SEQ ID NO: 2 w Wykazie Sekwencji ale także białka otrzymywane z innych szczepów należących do Exiguobacterium acetylicum i innych naturalnych mutantów które mają aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.

Ponadto, jasnym jest dla znawców dziedziny, że białka w których część sekwencji aminokwasowej jest zastępowana lub usuwana, białka, w których aminokwasy są dodawane oraz częściowo zmodyfikowane białka mogą być stosowane dopóki białka te posiadają aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.

Zamiast genu pochodzącego z Exigubacterium acetylicum można zastosować gen, który posiada zdolność hybrydyzowania wymienionego genu, o ile nadal koduje kinazę inozynowoguanozynową.

Gen, posiadający zdolność hybrydyzowania genu derywowanego z Exiguobacterium acetylicum może być uzyskany z następujących szczepów.

Exiguobacterium auratiacum ATCC 35652

Kurthia gibsonii ATCC 43195

Kurthia zopfii JCM 6101

Gen taki jak wspomniany wyżej może być uzyskany znaną metodą przy zastosowaniu zasady hybrydyzacji - homologii. W szczególności, można zastosować następujący sposób.

Najpierw, chromosomowy DNA dowolnego z wyżej wymienionych mikroorganizmów przecina się odpowiednią endonukleazą restrykcyjną, a rozszczepione fragmenty poddaje elektroforezie na żelu agarozowym. Rozszczepione fragmenty nakrapia się na odpowiedni filtr do transferu. Homologiczne fragmenty są wykrywane przez hybrydyzację Southema przy zastosowaniu genu kinazy inozynowo-guanozynowej derywowanego z Exiguobacterium acetylicum jako sonda do określenia wielkości fragmentów.

Spośród fragmentów uzyskanych po trawieniu endonukleazą restrykcyjną, fragmenty posiadające odpowiednią wielkość oczyszcza się. Oczyszczanie jest zwykle przeprowadzone przez wirowanie w gradiencie gęstości sacharozy lub odzyskiwanie z żelu agarozowego za pomocą sproszkowanego szkła glass powder. Oczyszczone fragmenty ligowane są z odpowiednim wektorem, a szczep E.coli transformuje się tak uzyskanym rekombinacyjnym wektorem. Klon zawierający określony fragment posiadający gen kinazy inozynowoguanozynowej może zostać wyselekcjonowany spośród powstałych transformantów przy zastosowaniu metody hybrydyzacji kolonii.

W obecnym wynalazku, zamiast wyżej wspomnianego genu kodującego nową kinazę inozynowo-guanozynową można zastosować gen kodujący znaną kinazę inozynowoguanozynową.

Jako znany gen kinazy inozynowo-guanozynowej można zastosować gen uzyskany z E.coli (J. Gen. Microbiol., 135, 1263-1273 (1989); J. Bacteriol. 177, 2236 - 2240 (1995)), i można go otrzymać na przykład z E.coli ATCC 27325.

Znany gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową można otrzymać znaną metodą. Gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową, który może być zastosowany w obecnym wynalazku, można także uzyskać z chromosomowego DNA E.coli ATCC 27325 wykorzystując następujący sposób.

Najpierw syntetyzuje się primery według sekwencji genu kinazy inozynowoguanozynowej pochodzącej z E.coli jak pokazano w SEQ ID No: 10 w Wykazie Sekwencji (WO 91/08286). Zwykle używa się primerów, w których skład zasad jest dowolny, zawartość G+C wynosi około 50%, nie tworzy się żadna specyficzna struktura drugorzędowa, łańcuchy nie są komplementarne w stosunku do siebie, a długość wynosi od 15 do 30 zasad. Sekwencje primerów lokują się na obu końcach strukturalnego genu kinazy inozynowoguanozynowej jak to jest pokazane w SEQ ID Nos. 11 i 12.

Następnie, strukturalny gen kinazy inozynowo-guanozynowej amplifikowany jest z chrosomalnego DNA E.coli przez PCR przy użyciu tych primerów i klonowany. Stosuje się wektor derywowany z E.coli, taki jak pUCl9 i pBR322. Dowolny szczep przyjmujący odpowiedni do replikacji wektora można zastosować dla powstałego rekombinacyjnego DNa. Przykłady tego przyjmującego szczepu obejmują szczepy E.coli takie jak HB101, JM109

184 520

DH5. W ten sposób uzyskuje się rekombinacyjny wektor, posiadający wstawienie fragmentu DNA zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej E.coli.

Gen, który jest homologiczny do wyżej wspomnianego genu derywowanego z E.coli 1 jest zdolny do hybrydyzacji genu może zostać użyty, jak w Exiguobacterium acetylicum, o ile taki gtn kgdnje kinazę ina/ynowo-guaoozynowy.

Tak uzoseano' fragment DNA zawierający gen kodujący białko posiadające aktywność Μοα20 1no/ynowo-guano/onowej wprowadza się do komórki gospodarza, która może regenerować ATP po jego ponownej rekombinacji z innym odpowiednim wektorem lub wprowadzeniu miejsca początku replikacji.

Mikroorganizm posiadający wystarczającą zdolność regenerowania zużytego w reakcji ATP z prekursora ATP (zdolność wytwarzania ATP) używany jest jako komórka gospodarza.

W obecnym wynalazku, mikroorganizm posiadający zdolność produkowania ATP może być dowolnym mikroorganizmem posiadającym zdolność regenerowania zużytego ATP w reakcji przekształcania inozyny i/lub guanozyny w kwas 5'-ioozynowy i/lub 5'-guanylowy z prekursora ATP w układzie reakcji poprzez który reakcja może zajść. Przykłady tego mikroorganizmy obejmują mikroorganizmy należące do rodzaju Corynebacterium,

Escherichia, Staphylococcus, Saccharomyces lub Candida. Mikroorganizmy oaldżące do Corynebacterium ammoniagenes, które mają wysoką zdolność produkowania ATP są szczególnie korzystne.

Przypadkowo, Corynebacterium ammoniagenes został sklasyfikowany wcześniej jako Brevibacterium ammoniagenes.

Konkretne przykłady mikroorganizmów posiadających zdolność wytwarzania ATP, użyte w obecnym wyoalaz.ku, są to szczepy pokazane poniżej oraz derywowane z oich mutanty.

Corynebacterium ammoniagenes (poprzednia nazwa: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 6872

Corynebacterium ammoniagenes (poprzednia oazwa: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 21295

Corynebacterium ammoniagenes (ppprzednia nazwa: Brevibacterium ammoniagenes) ATCC 21477

Corynebacterium glutamicum ATCC 13020

Corynebacterium glutamicum (poprzednia nazwa: Brevibacterium flavum)

ATCC 14067

Corynebacterium glutamicum (poprzednia nazwa: Brevibacterium lactofermentum) ATCC 13869

Escherichia coli B (ATCC 11303)

Ssaccharomyces cerevisiae ATCC 20018

Staphylococcus aureus ATCC 4012

Candida zeylanoides ATCC 20356

Candida psychropila (poprzednia nazwa: Torulopsis psychrophila)

ATCC 22163

Ponadto, korzystne są mikroorganizmy posiadające zdolność wytwarzania ATP w Których aktywność degradująca inozyny 1/lub guanozyny jest słaba lub jej brak. Następujące mikroorganizmy wybrane są spośród wyżej wspomnianych mikroorganizmów.

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21295

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477

Jako mieroorgaoi/mo wytwarzające ATP w obecnym wynalazku mogą także być użyte szczepy posiadające zdolność wytwarzania inozyny lub guanozyny z prekursora inozyny lub gua-ozyny jako dodatek do zdolności wytwarzania ATP. W tym przypadku, kwas 5'ii-ozyoowy lub kwas 5'-guanylowy może być wytworzony z prekursora inozyny lub guanozyoy zamiast inozyny lub guanozyny. Przykłady tego prekursora obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, melasa, hydrolizat skrobi, kwasy organiczne takie jak kwas octowy, i alkohole takie jak glicerol 1 etanol.

184 520

Szczepy wytwarzające ATP, posiadające zdolność wytwarzania inozyny lub guanozyny obejmują:

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21478

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21479

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21480

Wektor, do którego jest Integrowany gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową nie jest szczególnie ograniczony, jeśli może być replikowany w szczepach wytwarzających ATP, które są szczepami przyjmującymi. Na przykład, gdy bakterie należące do rodzaju Corynebacterium są stosowane jako szczepy wytwarzające ATP, wymienia się plazmidy które mogą być autonomicznie replikowane w tych bakteriach. Konkretne ich przykłady obejmują pAM330 (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 67,699/1983), pHMl5l9 (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 77,895/1983), pAJ655, pAJ6l1, pAJ1844 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 192,900/1983), pCGl, (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 13-4,500/1982), pCG2 (Japońskie Wyłożeniowe - Zgłoszenie Patentowe Nr 35,197/1983), pCG4, pCGll (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 183,799/1982), pGAl [Gen, 1θ7,69 (1991)], pHK4, i pHC4 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe Nr 7,491/1993). Gdy Escherichia coli używana jest jako szczep wytwarzający ATP, można zastosować na przykład plazmid ColEl, plazmid P15A, plazmid czynnika R, plazmid czynnika F, oraz plazmid fagowy. Konkretne ich przykłady obejmują pBR322 [Gene, 2, 95 (1977)], pUC19 [Gene, 33, 103 (1985)], pACYC184 [J. Bacteriol, 134, 1141 (1978)], ipSCIOl [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 70, 3240, (1973) ]. Gdy Saccharomyces cerevisiae użyty jest jako szczep wytwarzający ATP, można zastosować plazmid YEp, plazmid YCp, plazmid Yrp oraz Ylp. Konkretne ich przykłady obejmują Yep24, Yrp7 1 Ycp5o. Gdy Staphylococcus aureus używany jest jako szczep wytwarzający ATP, może zostać użyty pRIT5 [EMBO J, 4, 1075 (1985)].

W celu ekspresji genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową przy wysokiej częstotliwości, korzystnym jest aby sekwencja promotora i sekwencja SD były ulokowane powyżej genu kodującego kinazę inozynowo-guanozynową. Metoda wprowadzania tych sekwencji nie jest szczególnie ograniczona. Sekwencja promotora i sekwencja SD mogą być wprowadzone za pomocą metody, w której wyżej wspomniany gen jest wprowadzany poniżej tych sekwencji przy użyciu wektora posiadającego te sekwencje, lub metody w której te sekwencje są syntezowane i wprowadzane powyżej powyższego genu. Sekwencja promotora i sekwencja SD nie są szczególnie ograniczone. Kiedy bakterie z rodzaju Corynebacterium użyte są jako szczepy wytwarzające ATP, można wymienić promotory tac, lac, Itrp derywowane z E.coli, promotor trp derywowany z bakterii rodzaju Corynebacterium [Gene, 53, 191 (1987)], promotor fda [Mol. Mocrobiol., 3, 1625 (1989)], promotor ppc [Gene, 77, 237 (1989)], promotor lysC (Mol. Microbiol., 6, 317 (1992)] 1 promotory cspl i csp2 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe 502, 548/1994). Kiedy jako szczep wytwarzający ATP stosuje się Escherichia coli można wymienić promotory tac, lać, i trp derywowane z E.coli, i promotor P_L faga X Kiedy jako szczep wytwarzający ATP użyte jest Saccharomyces cerevisiae, można wymienić promotory ADH1, ENO1, PKG1, GAP-DH, GALI, GALIO, GAL7, PH05 i MFa 1. Kiedy jako szczep wytwarzający ATP jest użyty Staphylococcus aureus, można wymienić promotor spa [J. Bacteriol., 159, 713 (1984)].

Sposób wprowadzania do mikroorganizmu wytwarzającego ATP rekomblnowanego DNA zawierającego gen kodujący białko posiadające aktywność przekształcania Inozyny 1/lub guanozyny w kwas 5'-inozynowy I/lub kwas 5'-guanylowy nie jest szczególnie ograniczony. Wprowadzenie to może być wykonane za pomocą zwykłej metody. Na przykład, kiedy bakterie rodzaju Corynebacterium stosowane są jako szczep wytwarzający ATP, szczególnie skuteczna jest metoda protoplasty (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 183, 799/1982) 1 elektroporacji (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe Nr 207, 791/1990). Kiedy jako szczep wytwarzający ATP użyta jest Escherichia coli, można zastosować metodę chlorku wapnia [J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)], metodę Hanahana [J. Mol. Biol., 166, 557 (1983)], metodę SEM (Gen , 96, 23 (1990)}, metodę Chung i wsp. [Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 86, 2172 (1989)], 1 elektroporacji [Nucleic Acids Res., 16, 6127 (1988). Istnieje me184 520 toda, w której DNA wprowadzane jest przez przygotowanie komórek kompetentnych z komórek na etapie rozwoju jak podano w odniesieniu do Bacillus subtilis [Gene, 1, - 153 (1977)]. Alternatywnie, można zastosować metodę w której komórki przyjmującego szczepu DNA są formowane w protoplasty lub sferoplasty, które łatwo wchłaniaj ą rekombinowany DNA, i rekombinowany DNA wprowadza Bacillus subtilis się do tego szczepu przyjmującego DNA, jak podano w odniesieniu do, promieniowców, i drożdży [Molec. Gen. Genet., 168, 111 (1979), Naturę, 274, 398 (1978), i Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978)]. Kiedy Saccharomyces cerevisiae użyta jest jako szczep wytwarzający ATP, rekombinowany DNA można wprowadzić za pomocą metody sferoplastu {Proc. Natl. Acad. Sci., U.S.A., 75, 1929 (1978)], metody octanu litu [J. Bacteriol., 153, 163 (1983)], lub elektroporacji [Methods in Enzymology, l94, 182 (1991)]. Kiedy jako szczep wytwarzający ATP zastosowano Staphylococcus aureus, wprowadzenie rekombinantu DNA może się odbyć za pomocą metody protoplasty. [Plasmid, 5, 292 (1981)].

W metodzie protoplasty, wysoką wydajność można otrzymać wymienionym sposobem, który jest stosowany w Bacillus subtilis. Jednak, jak ujawniono w japońskim wyłożonym zgłoszeniu patentowym nr 183,799/1982, można również wykorzystać sposób, w którym DNA wprowadza się do protoplastów komórek bakterii należącej do rodzaju Corynebacterium będących w kontakcie bądź z glikolem polietylenowym bądź z alkoholem poliwinylowym i jonami dwuwartościowego metalu. Pobór DNa można wzmóc przez dodanie karboksymetylocelulozy, dekstranu, Ficolu lub Pluronic (produkcji Serva Co.) lub podobnych, zamiast glikolu polietylenowego lub alkoholu poliwinylowego.

Rekombinowany DNA może być wprowadzony do szczepu biorcy metodą elektroporacji (nawiązanie do japońskiego wyłożonego opisu patentowego nr 207,791/1990). Metoda transformacji stosowana w przykładach jest elektroporacją.

Ponadto, gen kinazy inozynowo-guanozynowej może być zintegrowany z chromosomalnym DNA mikroorganizmu produkującego ATP.

Sposób integrowania tego genu do chromosomalnego DNA nie jest szczególnie ograniczony. Na przykład, wrażliwy na temperaturę początek replikacji pochodzący z bakterii rodzaju Corynebacterium, gen kinazy inozynowo-guanozynowej i marker, dający oporność na antYbiotyk taki jak chloramfenikol, wprowadza się do wektora plazmidu tworząc rekombinantowy DNA. Bakterię rodzaju Corynebacterium transformuje się tym rekombinantowym DNA. Transformant hoduje się w środowisku zawierającym antybiotyk w temperaturze, w której nie funkcjonuje początek replikacji wrażliwej na temperaturę, do utworzenia szczepu transformanta, w którym rekombinowane DNA zostało zintegrowane z chromosomalnym DNA [J.Bacteriol., 162, 1196 (1985), i japońskie wyłożone zgłoszenie patentowe nr 7,49l/1993]. Może być również stosowana metoda stosująca ruchomy element genetyczny pochodzący od bakterii rodzaju Corynebacterium [Mobile Genetic Elements, Academic Press, New York (1983) i WO 93/18151].

Kinaza inozynowo-guanozynowa może być wytwarzana na wysokim poziomie przez hodowanie tak otrzymanego transformanta według wynalazku, do którego wprowadzono rekombinowany DNA zawierający gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowoguanozynowej, w zwykłym środowisku hodowlanym zawierającym źródło węgla, źródło azotu, sole nieorganiczne i ewentualnie ślady organicznych pożywek.

Przykłady źródła węgla obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, melasy i hydrolizaty skrobiowe; kwasy organiczne takie jak kwas octowy i kwas cytrynowy; oraz alkohole takie jak etanol. Przykłady źródła azotu obejmują moczniki, sole amonowe, amoniak wodny i gaz amoniakalny. Przykłady soli nieorganicznych obejmują fosforany oraz sole potasu, magnezu, żelaza i manganu. Przykłady śladowych pożywek organicznych obejmują aminokwasy, witaminy, kwasy tłuszczowe i kwasy nukleinowe jak również peptony, ekstrakt drożdżowy i hydrolizat białka soi zawierające którekolwiek z wyżej wymienionych.

Hodowla jest przeprowadzona aerobowo w temperaturze od 25 do 37°C przez 10 do 40 godzin, podczas których utrzymywana jest wartość pH pomiędzy 5 i 9.

Po zakończeniu hodowli, mierzona jest aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej akumulowanej w hodowli celem określenia miana. Aktywność można zmierzyć metodą opisaną

184 520 w Molec. Gen. Genet. 143, 85-91 (1975) przy pomocy substancji uzyskanej przez rozdzielenie komórek otrzymanych z hodowli przez odwirowanie lub podobną metodą, działając ultradźwiękami lub prasą francuską, odwirowując rozdzielone komórki by usunąć pozostałości komórkowe oraz usuwając substancje niskocząsteczkowe poprzez filtrację żelową.

Hodowla mikroorganizmu zawierającego gen kodujący kinazę inozynowo-guanozynową i mającego zdolność biologicznego syntezowania ATP z prekursora ATP, komórki oddzielone z tej hodowli, lub poddany określonemu działaniu produkt tych komórek jest kontaktowany z inozyną lub guanozyną lub ich prekursorem w obecności donora energii i donora grupy fosforanowej, tworząc w roztworze reakcyjnym kwas 5'-inozynowy lub 5'-guanylowy. Komórki mogą być wydzielone z hodowli poprzez odwirowanie lub metody podobne. Poddany określonemu działaniu produkt komórek obejmuje komórki traktowane acetonem, unieruchomione komórki, rozerwane komórki, itd.

Materiały, których zastosowanie jest korzystne według wynalazku zostały wymienione poniżej.

Przykłady prekursora inozyny lub guanozyny obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, melasy, hydrolizaty skrobiowe etc.; kwasy organiczne takie jak kwas octowy itd.; oraz alkohole takie jak glicerol, etanol, itd.

Przykłady donora energii obejmują cukry takie jak glukoza, sacharoza, hydrolizaty skrobiowe, melasy itd.; kwasy organiczne takie jak kwas octowy, kwas cytrynowy itd.; oraz alkohole takie jak etanol, itd.

Przykłady donora grupy fosforowej obejmują kwasy nieorganiczne takie jak kwas ortofosforowy, kwas pirofosforowy, kwas polifosforowy, kwas tripolifosforowy, kwas polimetafosforowy, kwas heksametafosforowy itd., sole tych kwasów nieorganicznych; oraz organiczne kwasy fosforowe takie jak fosforan fenylu, fosforan acetylu, fosforan karbamoilu itd.

Wydajność reakcji można poprawić przez dodanie do roztworu reakcyjnego prekursora ATP, środka powierzchniowo czynnego, jonu metalu itd.

Przykłady prekursora ATP obejmują difosforan adenozyny, kwas adenylowy, adenozynę, adeninę, sól adeniny z kwasem mineralnym, hydrolizat kwasu rybonukleinowego itd.

Środkami powierzchniowo czynnymi mogą być kationowe, anionowe i amfoteryczne środki powierzchniowo czynne o ile wzmagają fosforylowanie inozyny lub guanozyny. Przykłady jonów metali obejmują jon magnezowy, jon manganowy, itd.

W zwykłej fosforylacji przy użyciu kinazy inozynowo-guanozynowej i szczepu wytwarzającego ATP, rozpuszczalnik organiczny jest zwykle dodawany do systemu reakcyjnego (japońskie wyłożonego zgłoszenia patentowego nr 230,094/1988 i WO 9l/08286). Tymczasem, w obecnym wynalazku, reakcja postępuje wydajnie nawet gdy rozpuszczalnik organiczny jest ominięty w systemie reakcyjnym.

Reakcja jest prowadzona jest aerobowo w temperaturze od 25 do 37 °C przez okres od 10 do 30 godzin podczas których utrzymywana jest wartość pH pomiędzy 6 a 8.

Po zakończeniu reakcji, kwas 5'-inozynowy lub kwas 5'-guanylowy akumulowany w roztworze reakcyjnym można zebrać stosując żywicę jonowymienną, krystalizację lub podobne.

Najbardziej korzystny przykład wykonania. Obecny wynalazek bardziej szczegółowo zostanie opisany poprzez nawiązanie do następujących przykładów. Jakkolwiek, obecny wynalazek nie ogranicza się do tych przykładów.

Przykład 1 (Konstrukcja plazmidu dla ekspresji genu kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzącego E. coli i wprowadzanie go do Corynebacterium ammoniagenes) (1) Amplifikacja genu kinazy inozynowo-guanozynowej przez PCR oraz jego klonowanie

Oligonukleotydy posiadające 5'- i 3'-końcowe sekwencje genu kinazy inozynowoguanozynowej pochodzącego od E. coli oraz miejsca rozszczepienia odpowiednio endonukleazy restrykcyjnej Pstl i HindIII, jak pokazano w SEQ ID NO:11 i 12 , zostały zsyntezowane za pomocą metody fosforoamidynowej (Phosphoramidite) stosując syntezator DNA (Model 394, produkowany przez Applied Biosystem Co.).

184 520

0,25 mg tych oligonukleotydów jako primery, 0,1 mg chromosomowego DNA z E. coli W3110 (ATCC 27325) wytworzonego metodą według Saito i Miura [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)] jako matryca oraz 2,5 jednostek polimerazy taq DNA (wytwarzanej przez Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml 10 mM buforu chlorowodorku Ntris(hydroksymetylo)metylo-2-aminoetanu (oznaczanego tu jako Tris (pH 8,3) zawierającego 200 mM dATP, 200 mM dCTP, 200 mM dGTP, 200 mM dTTP, 50 mM chlorku potasowego,

1,5 mM chlorku magnezowego oraz 0,0001°% żelatyny. Przeprowadzono PCR, w którym trój temperaturowe cykle, mianowicie w temperaturze 94°C przez 30 sekund, w temperaturze 55°C przez 30 sekund i w temperaturze 72°C przez 30 sekund, powtarzano 25 razy. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na żelu agarozowym, i oczekiwany fragment DNA wydzielono stosując pył szklany (wytwarzany przez Takara Shuzo Co.). Około 2 mg tego fragmentu DNA, 20 jednostek endonukleazy Pstl oraz 20 jednostek HindIII wymieszano z 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, lOO mM chlorku sodowego oraz 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Roztwór ten ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu w zwykły sposób.

Jeden mikrogram plazmidu pHSG298 (wyprodukowanego przez Takara Shuzo Co.) DNA, 20 jednostek restrykcyjnej endonukleazy Pstl oraz 20 jednostek restrykcyjnej endonukleazy HindIII wymieszano z 50 mM Tris-chlorowodorowego buforu (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego oraz 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Po zakończeniu inkubacji mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu w zwykły sposób otrzymując plazmid pHSG298 trawiony Pstl i HindIII. 0,1 mg tego pHSG298 trawionego Pstl i HindIII, 0,5 mg amplifikowanego PCR fragmentu trawionego Pstl i HindIII oraz 1 jednostkę ligazy T4 DNA dodano do 66 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu oraz 10 mM ATP, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin ligując DNA. Następnie, E. coli JM 109 ( Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA w tradycyjny sposób, po czym wysiano na płytce z pożywką L-agarową zwierającą lOO mg/ml kanamycyny uzyskując transformanty.

Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy metodą alkalicznej lizy opisanej w Molecular Cloning 2nd etition, według J. Sambrook, E. F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbour, laboratory Press, str. 1,25 (1989), po czym poddano je elekrtroforezie na żelu agarozowym w zwykły sposób. Wydzielono rekombinowany plazmid, w którym do plazmidu pHSG298 wstawiono gen kinazy inozynowo-guanozynowej. Plazmid ten oznaczono „pIKG-1”.

(2) Wstawienie promotora trp E. coli

Zsyntetyzowano oligonukleotyd posiadający miejsca trawienia restrykcyjną endonukleazą BamHI oraz Pstl przy końcach 5'- oraz 3'-, odpowiednio, jak pokazano w SEQ ID NO: 13, oraz oligonukleotyd posiadający sekwencję komplementarną. Te oligonukleotydy w ilościach 1 mg każdy zmieszano, potraktowano temperaturą 100°C przez 5 minut, po czym stopniowo ochłodzono w celu umożliwienia hybrydyzacji. Roztwór oligonukleotydów oraz 20 Jednostek BamHI zmieszano z 20 mM buforu Tris-HCl (pH 8,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego oraz 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 30 °C przez 2 godziny. Otrzymany roztwór ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu. Następnie tak otrzymany osad strawiono Pstl w taki sam sposób Jak w punkcie (1), roztwór ten ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu otrzymując fragment DNA zawierający promotor trp E. coli oraz trawiony przez BamHI i Pstl.

Jeden mikrogram rekombinowanego plazmidu plGK-1 zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej uzyskany według punktu (1) w podobny sposób trawiono BamHI i Pstl. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu w zwykły sposób uzyskując plazmid trawiony BamHI i Pstl, po czym dodano 1 jednostkę ligazy T4 DNA (Takara Shuzo Co.) do 66 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu oraz 10 mM ATP, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin ligując DNA. Następnie, E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.)

184 520 transformowano tą mieszaniną DNA, po czym zaszczepiono go na L-agarowej płytce z pożywką zwierającą 100 mg/ml kanamycyny uzyskując transformanty.

Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy metodą lizy alkalicznej, po czym poddano je elektroforezie na żelu agarozowym standardowymi metodami wydzielając rekombinowany plazmid, w którym do plazmidu pIGK-1 wstawiono promotor trp E. coli. Plazmid ten oznaczono pIKG-2.

(3) Wstawienie początku replikacji pochodzącego od Corynebacterium

Jeden mikrogram rekombinowanego plazmidu pIGK-2 zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej oraz promotor trp otrzymany w (2) trawiono BamHI w taki sam sposób jak w punkcie (2), po czym ekstrahowano fenolem i ekstrakt ten wytrącono etanolem.

W celu zapobieżenia ponownemu wiązaniu, plazmid pIGK-2 trawiony BamHI poddano defosforylacji fragmentu DNa za pomocą zabiegu stosującego bakteryjną alkaliczną fosfatazę według metody opisanej w Molecular Cloning 2nd Edition, według J. Sambrook, E. F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbour, Laboratory Press, str. 1,60 (1989).

Tymczasem, 1 ug plazmidu pHC4 (Japońskie Wyłożeniowe Zgłoszenie Patentowe nr 7,491/1993) uzyskanego poprzez wstawienie regionu początku replikacji uzyskanego z Corynebacterium glutamicum do pHSG399 (Takara Shuzo Co.) oraz 10 jednostek restrykcyjnej endonukleazy Kpnl dodano do 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego i 1 mM ditiotreitolu, po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono za pomocą etanolu. Końce pHC4 trawione za pomocą Kphl stępiono według instrukcji stosując zestaw DNA Blunting Kit (Takara Shuzo Co.). Fosforylowany linker BamHI (Takara Shuzo Co.) sprzężono z tym plazmidem stosując polinukleotydową ligazę T4 uzyskując fragment DNA mający miejsce trawienia BamHI po obu stronach regionu zawierającego plazmidowy początek replikacji pochodzący z Corynebacterium glutamicum. Ten fragment DNA oraz 20 jednostek BamHI zmieszano w takim samym buforem jaki stosowano w (2), po czym mieszaninę inkubowano w temperaturze 30°C przez 2 godziny. Roztwór reakcyjny ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono za pomocą etanolu.

0,1 (ig otrzymanego powyżej plazmidu pIGK-2 trawiono BamHI, 0,2 (ig fragmentu DNA uzyskanego z plazmidu pHC4 trawionego BamHI oraz 1 jednostkę ligazy T4 DNA (wytwarzanej przez Takara Shuzo Co.) wymieszano w takim samym buforze jaki stosowano w (1). Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin ligując DNA. Następnie, E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA i wysiano na Lagarowej płytce na pożywce zwierającej 100 mg/ml kanamycyny uzyskując transformanty.

Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy metodą lizy alkalicznej, po czym poddano je elektroforezie na żelu agarozowym w zwykły sposób wydzielając rekombinowany plazmid, w którym do plazmidu pIGK-2 wstawiono fragment DNA, autonomicznie zdolny do replikacji w Corynebacterium. Plazmid ten oznaczono pIKG-3.

E. coli AJ 12617 zawierający plazmid pCH4 zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of the Agency of Industial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japonia, w dniu 24 kwietnia 1991 r. pod numerem depozytu FERM P-12215. Został on przekazany do depozytu na podstawie Traktatu Budapesztańskiegio w dniu 26 sierpnia 1991 r., i został oznaczony numerem depozytu FERM BP-3532.

(4) Wprowadzenie pIGK-3 do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477

0,1 pg pIGK-3 uzyskanego w (3) wprowadzono do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477 zwykłą metodą transformacji stosując elektroporację (Japońskie Wyłożone Zgłoszenie Patentowe nr 207,791/1990). Komórki wysiano na L-agarowej płytce na pożywce zwierającej 1⁰% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 0,5% chlorku sodowego, 0,5% glukozy oraz 50 mg/ml kanamycyny uzyskując transformant ATCC 21477/pIGK-3.

(5) Pomiar aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej tego transformanta

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 otrzymanym w punkcie (4) zaszczepiono 50 ml pożywki (pH 7,2) zwierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4% dwuwodorowego fosforanu potasowego, 0,1% siarczanu magnezowego,

184 520

0,5% siarczanu amonowego, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelaza, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr chlorowodorku tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapniowego, 30 mg biotyny, 0,05 % adeniny oraz 50 mg/litr kanamycyny, po czym hodowano w temperaturze 32°C przez 24 godziny. Kulturę odwirowano w zwykły sposób w celu zebrania komórek.

Etap zawieszania komórek w 0,9% roztworze chlorku sodowego i wirowanie tej zawiesiny powtarzano dwukrotnie w celu przemycia komórek. Otrzymane komórki zawieszono w 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,9) zawierającego 20% glicerolu, 100 mM chlorku potasowego, oraz 5 mM 2-merkaptoetanolu, po czym zawiesinę poddano działaniu ultradźwięków przy 150 W przez 20 minut stosując urządzenie wyprodukowane przez Kubota K. K. Tak potraktowaną zawiesinę wirowano przy 15000 rpm (obrotów na minutę) przez 30 minut uzyskując supematant. Supematant ten poddano chromatografii kolumnowej stosując kolumnę Sephadex G-15 (produkowaną przez Pharmacia Co.) w celu usunięcia substancji niskocząsteczkowych, a otrzymany roztwór stosowano jako surowy roztwór enzymu.

Aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej z otrzymanego surowego roztworu enzymu mierzono w mieszaninie reakcyjnej zawierającej 100 mM Tris. 10 mM chlorku magnezowego, 1 mM ATP, 250 mM chlorku potasowego oraz 0,2 mM [8⁴⁴C]-inozyny. Roztwór surowego enzymu dodano do mieszaniny reakcyjnej i inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 minut. Część mieszaniny reakcyjnej nałożono jako plamki na płytkę z żelem silikonowym (wytwarzaną przez Merck Co.) w celu zakończenia reakcji, i rozwijano w eluencie zawierającym n-butanol, etanol i wodę w stosunku objętościowym 2:1:1. Plamkę kwasu 5'-inozynowego wykryto i oznaczono za pomocą zestawu Bio-Image Analyzer (Fuji Photo Film Co.). Stężenie białka w surowym roztworze enzymu określono przy pomocy zestawu do oznaczania białka (Bio-Rad Co.) stosując albuminę z osocza wołowego jako standard, po czym wyliczono specyficzną aktywność enzymu. Jako kontrolę mierzono specyficzną aktywność ATCC 21477/pHK4, tansformanta plazmidem pHK4. Wyniki przedstawiono w tabeli 1. Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 przejawiało wysoki poziom aktywności, podczas gdy aktywności ATCC 21477/pHK4 nie wykryto. Na podstawie tych wyników wykazano, że wprowadzony gen pochodzący od E. coli wykazywał aktywność kinazy inozynowoguanozynowej w Corynebacterium ammoniagenes.

Plazmid pHK4 posiada strukturę, w której promotor trp oraz gen kinazy inozynowoguanozynowej są usunięte z pIGK-3 i został on użyty jako kontrola.

Szczep niosący pHK4 w E. coli HB101 oznaczono jako AJ 13136 i zdeponowano w National Institute of Bioscience and Humań Technology of the Agency of Industial Science and Technology, 1-3, Higashi 1-chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japonia, w dniu 1 sierpnia, 1995 na podstawie Traktatu Budapesztańskiego z dostępem pod nr. FERM BP-5186.

Tabela 1

Szczep	Działanie specyficzne (nmol/min/mg białka)
ATCC 21477/pHK4	nie stwierdzono
ATCC 21477/pIGK-3	186,6

Przykład 2 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny stosując szczep zawierający gen kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący od E. coli)

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pIGK-3 zaszczepiono do 450 ml pożywki (pH 7,2) zwierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4% dwuwodorowego fosforanu potasowego, 0,1% siarczanu magnezowego, 0,5% siarczanu amonowego, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelaza, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr chlorowodorku tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapniowego, 30 pg/litr biotyny,

184 520

0,05 % adeniny oraz 50 mg/litr kanamycyny, po czym hodowano w temperaturze 32 °C przez 24 godziny. Kulturę wirowano przy 7000 rpm przez 10 minut uzyskując 20 g mokrych komórek w postaci osadu.

Tak otrzymane komórki zawieszono w ilości 200 g/litr w 20 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 50 g/litr inozyny, 20 g/litr dwuwodorowego fosforanu potasowego, 30 g/lltr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezowego, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 oraz 1 g/litr adeniny. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 32°C mieszając. Wartość pH doprowadzano do 7,2 stosując 4 N wodorotlenek sodowy oraz do mieszaniny reakcyjnej dodano zwiększoną ilość dwuwodorowego fosforanu potasowego. Reakcję prowadzono stosując jako kontrolę ATCC 21477/pHK4. Po 30 godzinach reakcji określono ilość kwasu 5'-inozynowego w roztworze reakcyjnym za pomocą wysoko-wydajnej chromatografii cieczowej. Wyniki pokazano w tabeli 2. Ilość nagromadzonego kwasu 5'-inozynowego wskazano jako ilość 7,5-hydratu 5'-inozynianu dwusodowego. Na podstawie tych wyników wykazano, że inozyna została przekształcona w kwas 5'-inozynowy przez ATCC 21477/pIGK-3 zawierający gen kinazy inozynowoguanozynowej pochodzący od E. coli.

Tabela 2

Szczep	Ilość kwasu 5'-1nozynowego
zgromadzona w hodowli
ATCC 21477/pHK4	nie wykryto
ATCC 21477/pIGK-3	72,9

Przykład 3 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z inozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kinazy Inozynowo-guanozynowej pochodzący od E. coli)

Komórki uzyskane w przykładzie 2 zawieszono w ilości 200 g/litr w 50 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 60 g/lltr inozyny, 20 g/litr dwuwodorowego fosforanu potasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezowego, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 oraz 1 g/litr adeniny. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 32°C mieszając natleniające. Wartość pH doprowadzono do 7,2 stosując 4 N wodorotlenek sodowy podczas jednoczesnego monitorowania reakcji za pomocą pHmetru, oraz dodano do mieszaniny reakcyjnej zwiększoną ilość dwuwodorowego fosforanu potasowego. Po 22 godzinach reakcji, ilość nagromadzonego kwasu 5'-inozynowego wynosiła 113,8 g/litr, a jego molowa wydajność w oparciu o dodaną inozynę wynosiła około 100%.

Przykład 4 (Wytwarzanie kwasu 5'-guanozynowego z guanozyny przy użyciu szczepu zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący od E. coli)

Reakcję prowadzono w taki sam sposób jak w przykładzie 2, oprócz tego, że zamiast inozyny w roztworze reakcyjnym zastosowano 1 g/litr guanozyny. Po 30 godzinach reakcji, określono Ilość kwasu 5'-guanozynowego w mieszaninie reakcyjnej za pomocą wysokowydajnej chromatografii cieczowej. W wyniku otrzymano 0,05 g/litr kwasu 5'-guanozynowego, co wyliczono w przeliczeniu na 7,5-hydrat 5'-guanozyn1anu dwusodowego w mieszaninie reakcyjnej przy użyciu ATCC 21477/plGK-3.

Przykład 5 (Oczyszczanie białka o aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej z Exiguobacterium acetylicum oraz jego właściwości) (1) Wytwarzanie komórek 1 surowego ekstraktu enzymu

Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 zaszczepiono 100 ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% pollpeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego (Bacto Yeast Extract), 0,5% glukozy 1 0,5% chlorku sodowego, po czym hodowano w temperaturze 30 °C przez 24 godziny. Tą kulturą zaszczepiono 2 litry wyżej wymienionej pożywki, 1 Inkubowano w temperaturze 30°C

184 520 przez 8 godzin. Tak otrzymaną kulturę wirowano przy 7000 rpm przez 10 minut, osad przemyto dwukrotnie za pomocą 0,9% chlorku sodowego uzyskując lO g mokrych komórek. Komórki zawieszono w 10 ml lOO mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 100 mM chlorku wapniowego 1 1 mM ditiotreitolu (bufor A), i ucierano w młynku (Biospeck Co.) używając szklanych kul o średnicy 0,1 mm. Zawiesinę wirowano przy 15000 rpm przez 10 minut, 1 supematant dializowano wobec wyżej wymienionego buforu uzyskując około 20 ml surowego ekstraktu enzymowego.

Aktywność Kinazy inozynowo-guanozynowej surowego Ekstraktu enzymu mierzono za pomocą następującej metody. Pięć mikrolitrów surowego ekstraktu eozomu dodano do 50 pil lOO mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 5 mM chlorku magnezowego, 5 mM ATP, 100 mM chlorku potasowego oraz 0,2 mM [8‘¹4C]-ino/yny. Tą miesza-i-ę reakcyjną inkubowano w temperaturze 30°C przez 30 minut. Dwa mikrolitry mieszaniny reakcyjnej nałożono w postaci plamek na płytkę z żelem silikonowym (wytwarzaną przez Merck Co.) w celu zakończenia reakcji, i rozwijano za pomocą eluenta zawierającego n-butanol, etanol i wodę w stosunku objętościowym wynoszącym 2:1:1. Plamkę kwasu 5'-inozynowego wykryto i ilość kwasu 5'-inozynowdgo oznaczono za pomocą Analizatora Bio-Image (Fuji Photo Film Co.). Stężenie białka w surowym roztworze enzymu określono za pomocą próby białkowej (produkowanej przez Bio-Rad Co.) stosując jako standard albuminę z osocza bydlęcego, po czym wyliczono aktywność specyficzną enzymu. Aktywność kinazy inozonowo-guano/ynowej surowego ekstraktu enzymu wynosiła 0,45 nmol/min/mg białka.

(2) Oczyszczanie białka o aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej

Surowy ekstrakt uzyskany w (1) naniesiono na kolumnę DAEA-Toypearl (produkowaną przez Tosoh Co.) zrównoważoną buforem A. Białko o aktywności kinazy inozynowoguanozynowej, po przemyciu go buforem A, wymyto za pomocą buforu A zawierającego 200 mM chlorku potasowego. Do 25 ml tak uzyskanej frakcji aktywnej, dodano siarczanu amonowego do 30% nasycenia. Następnie mieszaninę mieszano w temperaturze' 4°C przez 30 minut, osad usunięto na drodze wirowania. Powstały supematant podano na kolumnę Butylo-Toypearl (Tosoh Co.), zrównoważoną buforem A zawierającym 3θ% siarczanu amonowego. Białko o aktywności kinazy i-ozonowo-gua-ozonowej, po przemyciu wyżej wymienionym buforem, wymyto za pomocą liniowego gradientu stężenia 200 ml buforu A zawierającego od 30% do 15% siarczanu amonowego. Około 15 ml otrzymanej frakcji aktywnej dializowano wobec 2 litrów 25 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 50 mM chlorku potasowego, i mM ditiotreitolu oraz 20 % glicerolu (bufor B).

Roztwór wirowano przy 15000 rpm przez 10 minut, i otrzymany supematant podano -a Kolumnę Mono Q FPLC HR5/5 (Pharmacia Co.) zrównoważoną buforem B zawierającym 100 mM chlorku potasowego. Białko mające działanie kinazy inozynowo-guanozynowej, po przemyciu go buforem B, wymyto za pomocą li-iowdgo gradientu stężenia siarczanu amonowego od 100 mM do 500 mM. Tak otrzymaną frakcję aktywną dializowano wobec 2 litrów 10 buforu fosforanu potasowego (pH 7,4) zawierającego 1 mM ditiotreitolu oraz 20% glicerolu (bufor C), i -anlesiono na kolumnę hydroksyloapatytową TSK-GEL HA-1000 (Tosoh Co.) zrównoważoną wyżej wymienionym buforem. Białko o aktywności kinazy Inozynowogiianozo-owej po przemyciu wyżej wymienionym buforem, wymyto za pomocą liniowego gradientu stężenia 30 ml buforu C zawierającego od 10 mM do 5θ0 mM fosforanu potasowego.

Około 6 ml tak otrzymanej frakcji aktywnej szybko podano na kolumnę hydroksyloapatytową 1 białko o aktywności einazy 1-ozynowo-guanozynowej wymyto za pomocą liniowego gradleotu stężd-la 30 ml buforu C zawierającego od 10 mM do 200 mM fosforanu potasowego. Dwa mililltry frakcji o wysokiej aktyw-ości spośród tak otrzymanych frakcji aktywnych podano oa żelową kolumnę filtracyjną Hiload Supdrdex 200 pg 16/60 (Pharmacia Co.) zrównoważoną za pomocą 25 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 1 mM ditlotreltolu, 20% glicerolu i lOO mM chlorku potasowego, po czym wymyto za pomocą wyżej wymld-lo-dgo buforu. Pięć mikrolitrow z 22 ml tej frakcji o wysokiej aktywności poddano dlektrofordzld -a żelu SDS pollakryloamldowym. W wyniku, otrzymano białko o masie cząsteczkowej wynoszącej około 36 Kllodaltooów, które wykryto za pomocą barwienia srebrem (Nacalai Tdsąue Co.). Białko o aktywności Kinazy I-ozy-owo-guanozy-owej pochodzącej

184 520 od Exiguobacterium acetylicum oczyszczono, po czym za pomocą elektroforezy na żelu SDSpoliakryloamidowym oznaczono jego masę cząsteczkową wynoszącą 36 kilodaltonów.

(3) Właściwości kinazy inozynnwo-nuanozynnwej pochodoącej od ExiguoXacterium acetylicum

Oczyszczoną kinazę inezynpwo-guanezznewą dodane do 100 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 5 mM chlorku magnezowego, 5 mM ATP, 100 mM chlorku potasowego, 0,16 mM guanozyny oraz 0,04 mM [8'¹4c]-guanozyny. Pięć mikrolitrow z tej mieszaniny reakcyjnej zastosowano jako związek podstawowy i reakcje prowadzono w temperaturze 30°C przez 10 minut. Enzym ten miał następujące właściwości:

1. Działanie

Enzym przenosi grupę fosforową do nukleozydu wybranego z grupy zawierającej guanozynę, inozynę oraz 2'-deeksyguanezynę stosując donor fosforanowy jako trójfesfernn nukleozydu wybrany z grupy zawierającej ATP, trójfosforan 2'-deoksyadenozyny, trójfosforan guanozyny, trójfosforan 2'-deoksyguanozzny oraz trójfosforan tymidyny, oraz tworzy on 5'-monofosforan nukleozydu wybranego z grupy zawierającej 5'-guanozynian, 5'-inozynian oraz 2'-deoksz-5'-gunnozynian, odpowiednio.

2. Specyficzność substratowa

Reakcję prowadzono stosując 0,5 mM każdego z nukleozydów zamiast guanozyny oraz [y-³²P]-ATP zamiast ATP. Mierzono tak utworzony 5'-fosforan nukleozydu. Wyniki pokazano w tabeli 3. Guanozynę, inozynę oraz 2'-deokszguanozynę stosowano jako receptory fosforanu.

Tabela 3

Nukleozyg (0,5 mM)	Aktywność względna (%)
Gunnozynn	100
2' -De oksygunnozynn	4
Inozyna	5
Ksnntozynn	0
Adenozyna	0
2'-geoksyngenozznn	0

Reakcję prowadzono stosując 5 mM każdego z trój fosforanów nukleozydów zamiast ATP, oraz badano możliwe donory fosforanowe. Wyniki zestawiono w tabeli 4.

Oprócz ATP, jako donory fosforanowe stosowano trójfosforan 2'-deoksyadenozznz, trójfosforan guanozyny, trójfosforan 2'-deoksyguanozyny oraz trójfosforan tymidyny.

Tabela 4

Trójfosforan nukleozydu (5 mM)	Aktywność względna (%)
Trójfosforan adenozyny	100
Trójfosforan 2'-gezoksygenozznz	71
Trójfosforan guanozyny	59
Trójfosforan 2'-dezpkszgunnezynz	61
Trójfosforan ąjtygyny	6
Trójfosforan urjgjnz	4
Trójfosforan tymidyny	35
Nie dodano	0

184 520

3. Optymalne pH

Przeprowadzono reakcję zmiany buforu na 100 mM buforu octan sodowy - kwas octowy (pH 4,2-5,6), buforu kwasu 2-morfoetanosulfonowego (zwanego dalej MES) - wodorotlenku sodowego (pH 5,4-6,3), buforu kwasu 3-morfopropanosulfonowego (MOPS) - wodorotlenek sodowy (pH 6,3-7,2), buforu Tris-HCl (pH 7,2-8,8), buforu kwasu cykloheksyloaminopropanosulfonowego (zwanego dalej CAPS) - wodorotlenku sodowego (pH 8,8-10,4) lub buforu glicyna-wodorotlenek sodu (pH 10,3-11,0). Optymalne pH wynosiło pomiędzy 7,7 a 9,9.

4. Stabilność wpH

Enzym traktowano w temperaturze pokojowej przez 30 minut 250 mM buforem octan sodu - kwas octowy (pH 1,5-5,6), buforem MES- wodorotlenek sodu (pH 5,4-6,4), buforem MOPS- wodorotlenku sodowego (pH 6,3-7,3), buforem Tris-HCI (pH 7,2-8,8), buforem CAPS- wodorotlenek sodu (pH 8,9-10,4) lub buforem glicyna-wodorotlenek sodu (pH 10,513,3), każdy zawierający 2,5 mg/ml albuminy osocza bydlęcego, 25 mM chlorku potasowego, 0,25 mM ditiotreitolu i 5% glicerolu. Następnie zmierzono aktywność enzymu. W rezultacie aktywność enzymu była stabilna w zakresie pH pomiędzy 6,7 a 12,1.

5. Optymalna temperatura

Reakcję przeprowadzono w przedziale temperatury pomiędzy 16°C a 60°C. W rezultacie optymalna temperatura wynosiła pomiędzy 30°C a 50°C.

6. Stabilność temperaturowa

Enzym potraktowano 12,5 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 5 mg/ml albuminy osocza bydlęcego, 50 mM chlorku potasowego, 0,5 mM ditiotreitolu i 10% glicerolu w 4 do 60°C przez 30 minut i zmierzono szczątkową aktywność enzymu. Została utrzymana aktywność 50% lub więcej po traktowaniu w 25°C lub w niższej temperaturze a enzym został inaktywowany przy 40°C lub w wyższej temperaturze.

7. Zapotrzebowanie na jony metalu

Reakcję przeprowadzono zmieniając chlorek magnezowy na różne jony metalu w roztworze reAkcji. Rezultaty są pokazane w tabeli 5. Odkryto, że jony metalu były wymagane dla aktywności, i że spośród innych jonów niż magnezowe reakcja przebiegała z jonami manganowymi, jonami kobaltowymi i jonami żelaza.

T a b e 1 a 5

Sole metali (5 mM)	Aktywność względna (%)
Nie dodane	1
MgCl2 · 6H2O	100
MnCl2 · 4H2O	55
ZnCl2	1
N1CI2 · 6H2O	1
CaCl2 · 2H₂O	1
C0CI2 · 6H2O	36
MgSO2 · 7H2O	107
FeSO2 · 7H2O	24

8. Wpływ jonów metali

Względna aktywność enzymu w obecności 1mM różnych jonów metali w mieszaninie reakcyjnej jest przedstawiona w tabeli 6. Enzym ten był silnie hamowany przez jony miedzi i jony rtęci, jak również był silnie hamowany przez jony cynku i jony kadmu.

184 520

Tabela 6

Sole metali (1 mM)	Względna lepkość (%)
Nie dodane	100
MNCl₂ · 4H₂O	81
ZnCl₂	58
NiCl, · 6H2O	113
CaCl2 · 2H₂O	71
CoCl₂ · 6H₂O	103
BaCl2	106
CuCl2 · 2H,O	25
CdCl2	43
HgCl₂	22
MgSO„ · 7H₂O	110
FeSO₄ · 7H2O	95

9. Wartości Km

Wartości Km enzymu zmierzone poprzez zmianę stężenia substratu kompozycji reakcyjnej wynosiły 0,03 mM dla guanozyny, 1 mM dla inozyny i 1,6 mM dla ATP gdy guanozyna była używana jako substrat.

10. Masa molekularna

Enzym posiada masę molekularną wynoszącą około 36 kilodaltonów jak zmierzono przy pomocy elektroforezy na żelu SDS-poliakrylamidowym.

Przykład 6 (Izolacja genu z chromosomu Exiguobacterium acetylicum) (1) Ustalenie N-końcowej sekwencji aminokwasowej

Około 2 ml aktywnej frakcji uzyskanej w przykładzie 5 (2) zatężono do około 0,2 ml przez wirowanie przy 6 OOO rpm przez 3 godziny stosując Centricon-10 (Amicon Co.). Białko nakropiono na filtr przez wirowanie stosując Prospin (Applied Biosystem Co.). Filtr umyto trzy razy 20% metanolem, a następnie osuszono. N-końcową sekwencję aminokwasową białka określono przy użyciu sekwensera białek 476A (Applied Biosystem Co.). Ustalona sekwencja aminokwasowa jest reprezentowana przez SeQ ID Nr 3 w Liście Sekwencji. W tej Liście Sekwencji Xaa przedstawia niezidentyfikowany aminokwas. Określono dwadzieścia osiem aminokwasów N-końca włączając jeden niezidentyfikowany aminokwas.

(2) Przygotowanie chromosomalnego DNA Exiguobacterium acetylicum i amplifikacja N-końcowego regionu

Trzy gramy mokrych komórek Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 otrzymano z 500 ml kultury w ten sam sposób jak w przykładzie 5 (1). Chromosomalne DNA wyekstrahowano z komórek metodą Saito i Mlura [Biochem. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)].

Zgodnie z oznaczoną w (1) N-końcową sekwencją aminokwasową zsyntetyzowano oligonukleotydy. W oparciu o sekwencje nukleotydów zastosowano mieszaniny oligonukleotydów pokazanych w SEQ ID Nr 4 i 5 w związku z degeneracjąkodonów.

0,25 pmoli oligonukleotydów jako primery, 0,1 pg chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum jako matryca i 2,5 jednostek polimerazy taq DNA (wyprodukowanej przez Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml 10 mM buforu Tris-HCl (pH 8,3) zawierającego 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, 50 mM chlorek potasowy,

1,5 mM chlorek magnezowy i 0,0001% żelatyny. Przeprowadzono PCR, w którym trójtemperaturowe cykle, tj. przy 94°C 30 sekund, przy 55°C 30 sekund i przy 72°C 1 minutę powtarzano 30 razy. Roztwór reakcyjny poddano elektroforezie na żelu agarozowego, 1 amplifikowany fragment DNA o długości około 80 zasad oddzielono stosując szklany pył (Takara Shuzo Co.). Około 0,2 pg tego fragmentu DNA dodano do 50 ul 50mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 2 jednostki fragmentu Klenow'a, 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, 1 mM 2-merkaptoetanol 1 7 mM chlorek magnezowy. Mieszaninę poddano reakcji stępiania końców przy 37°C przez 30 minut. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano

184 520 fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem. Tak wytrącony fragment DNA mający stępione końce został rozpuszczony w 5θ mM buforze Tris-HCl (pH 7,6) zawierającym 10 jednostek kinazy T4 polinukleotydowej, 10 mM chlorku magnezowego, 5 mM ditiotreitolu, 0,1 mM spermidyny i 0,1 mM EDTA, i został poddany reakcji fosforylacji końców w temperaturze 37°C przez 1 godzinę. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem. Produkt PCR posiadający fosforylowane stępione końce odzyskano w postaci precypitatu.

Jeden mikrogram wektora plazmidowego pUC18 (Takara Shuzo Co.) i 2θ jednostek endonukleazy restrykcyjnej Smal zmieszano z 33 mM Tris- bufor octanowy (pH 7,9) zawierający 10 mM octan magnezowy, 66 mM octan potasu, 0,5 mM ditiotreitol 1 0,01% albuminy z bydlęcego osocza i mieszaninę inkubowano w 30°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ten wyekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób. Następnie, w celu uniknięcia ponownego związania fragmentu DNA pochodzącego z wektora plazmidu, fragment DNA został defosforylowany. Uzyskany fragment wyekstrahowano fenolem 1 wytrącono etanolem w tradycyjny sposób.

0,1 pg tego pUC18 trawionego Smal, 0,1 ug produktu PCR mającego fosforylowane stępione końce i 1 jednostka T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.) dodano do 20 ml 66 mM bufora Trls-HCI (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu i 10 mM ATP. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin w celu ligacji DNA. Następnie E. coli JM09 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA w tradycyjny sposób 1 wstrzyknięto do medium L-agarowego zawierającego 100 mg/ml ampicyliny w celu uzyskania transformantów.

Plazmidy wyekstrahowano z transformantów metodą lizy alkalicznej.

Plazmidy zawierały fragment DNA o około 80 zasadach uzyskany z chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953. Sekwencja nukleotydową fragmentu DNA została określona przy użyciu tego plazmidowego DNA. Określenie tej sekwencji nukleotydowej zostało przeprowadzone zgodnie z metodą Sangera [J. Mol. Biol., 143, 161 (1980)] przy użyciu Tag Dyedeoxy Terminator Cycle Seguencing Kit (Perkin Elmer Co.). W ten sposób określono sekwencję nukleotydową 83 zasad DNA odpowiadających N-końcowemu regionowi białka kinazy inozynowo-guanozynowej Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.

(3) Izolaclz fragmenjg DNA zawierającego gen kodujkcy kinazę inozynowoguanozynową Exiguobacterium acetylicum

Dziesięć mikrogramów chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 otrzymanego w (2) dodano do 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającogn 40 jednostek EcoRI, 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego i 1 mM ditiotreitolu, i mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godzino. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób w celu uzyskania chromosomOwego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 trawionego EcoRI. Jeden mikroeram tego DNA strawionego EcoRI, 0,05 pg kasety EcoRI (Takara Shuzo Co.) i 10 jednostek ligazy T4 DNA dodano do 66 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magnezowego, 10 mM ditiotreitolu 1 10 mM ATP. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 16°C przez 8 godzin w celu ligacji DNA. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i ekstrakt został wytrącony etanolem w celu uzyskania chromosomowego DNA trawionego Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligowaoego z kasetg EroRI.

Ol1knnuklootydy Sl 1 S2 mające sekwencje nukleotydowe pokazane w SEQ ID Nr 6 i 7 zostały zsyoitetyzowgne zgodnie z sekwencją określoną w (2).

0,2 Mmoli olieonuklootodu Sl i 0,2 umoll kasety primera Cl (wyprodukowanej przez Takara Shuzo Co.) jako primery, 0,2 mg trawionego chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 ligowaneeo z kasetą EcoRI jako matryca i 2,5 jednostek pollmerazy Tgq DNA (Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml lOmM buforu Tris-HCl (pH 8,3) zawiergjąreen 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM dGTP, 200 pM dTTP, 50 mM chlorku potasowego, 1,5 mM chlorku magnezowego i Ο,θ0θ1% żelatyno. Przeprowadzono PCR, w którym trój temperaturowe rykle, mianowicie przy temperaturze 94°C przez 30 sekund, przy 55°C przez 2 minuty 1 przy 72°C przez 3 minuty, powtórzono 25 razy. PCR przeprowadzono z zAchowAniem wyżej wspomnianych warunków przy użyciu 1 pl mieszanino reakcyjnej jako

184 520 matrycy, i 0,2 pmoli oligonukleotydu S2 i 0,2 pmoli kasety primera C2 (Takara Shuzo Co.) jako primerów. Część mieszaniny reakcyjnej poddano elektroforezie na żelu agarozowym. W rezultacie, amplifikowano spacyficznie fragment około 1000 par zasad. Otrzymano fragment DNA rozciągający się od N-końcowego regionu białka do miejsca trawienia EcoRI poniżej genu, w kierunku 5'.

Ten fragment DNA odzyskano przy użyciu pyłu szklanego (wyprodukowanego przez Takara Shuzo Co.). Około 0,2 pg tego fragmentu DNA poddano reakcji stępienia końców w temperaturze 37°C przez 30 minut przy użyciu fragmentu Klenow'a. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i ekstrakt wytrącono etanolem. Odzyskany fragment DNA jako strąt poddano reakcji fosforylacji zakończeń w temperaturze 37°C przez 1 godzinę przy użyciu T4 kinazy polinukleotydowej. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i ekstrakt wytrącono etanolem. Produkt PCR mający fosforylowane stępione końce odzyskano jako strąt.

Jeden mikrogram wektora plazmidu pUC18 (Takara Shuzo Co.) potraktowano restrykcyjną endonukleazą Smal w temperaturze 30°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ten ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób. Następnie fragment DNA defosforylowano przez obróbkę bakteryjną alkaliczną fosfatazą ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem.

0,1 pg tego pUC18 trawionego z SmaI. 0,1 pg produktu PCR mającego fosforylowane stępione zakończenia i 1 jednostkę T4 ligazy DNA (Takara Shuzu Co.) poddano reakcji w temperaturze 16°C przez 8 godzin w celu ligowania DNA. Następnie E. coli JM09 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA i zaszczepiono płytki z pożywką L-agarową zawierającą 100 mg/ml ampicyliny w celu uzyskania transformantów.

Plazmidy ekstrahowano z wcześniej otrzymanych transformantów metodą lizy alkalicznej i oddzielono plazmid zawierający fragment amplifikowanego PCR. Ten plazmid oznaczono pCS2.

Zsyntetyzowano oligonukleotydy komplementarne dooligonukleotydów SI i S2 i oznaczono odpowiednio S4 i S3. Przeprowadzono amplifikację przez PCR w takich samych warunkach jak wspomniane wyżej przy użyciu oligonukleotydów S3 i kasety primera C1 (Takara Shuzo Co.) jako primerów i produktu trawienia chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 zligowanego z kasetą EcoRI jako matrycą. Przeprowadzono PCR przy użyciu uprzednio uzyskanej mieszaniny jako matrycy i oligonukleotydów S4 oraz kasety primera C2 (Takara Shuzo Co.) jako primerów. Amplifikowano fragment DNA o około 2300 par zasad rozciągających się od N-końcowego regionu białka do miejsca trawienia EcoRI powyżej genu.

Około 0,2 pg tego fragmentu DNA poddano reakcji stępiania w temperaturze 37 °C przez 30 minut przy użyciu fragmentu Klenow'a. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono etanolem. Odzyskany jako strąt fragment DNA wymieszano z 50 pl 10 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 jednostek endonukleazy restrykcyjnej KpnI, 10 mM chlorku magnezowego i 1 mM ditiotreitolu. Mieszaninę inkubowano w temperaturze 37°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ten ekstrahowano fenolem, ą ekstrakt wytrącono etanolem.

Jeden mikrogram wektora plazmidowego pUC18 (Takara Shuzo Co.), 5 jednostek endonukleazy restrykcyjnej KpnI i 5 jednostek endonukleazy restrykcyjnej HincII zmieszano z 50 ml 33 mM buforu Tris- octanowego (pH 7,9) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 50 mM chlorku sodowego i 1 mM ditiotreitolu. Mieszaninę inkubowąno w temperaturze 37°C przez 2 godziny w celu uzyskania produktu trawienia. Produkt ektsrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono etanolem.

0,1 pg tego pUC18 strawionego KpnI i HincII, około 0,1 pg produktu PCR poddanego reakcji stępiania i trawionego KpnI poddano działaniu T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.) w 16°C przez 8 godzin w celu ligacji DNA. Następnie E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA i zaszczepiono na płytkę L-ągarową zawierającą 100 mg/ml ampicyliny w celu uzyskania transformantów'.

184 520

Plazmidy ekstrahowano z tak uzyskanych transformantów metodą lizy alkalicznej. Wyselekcjonowano plazmid zawierający fragment DNA o około 600 par zasad rozciągający się od N-końcowego regionu do miejsca trawienia KpnI powyżej genu. Ten plazmid oznaczono pKS4.

(4) Określenre sekwencji nukleotydowej genu kinazy ino;ynowo-guanozynowej Exig,uobacterium acetylicum

Określnon sekwencje nunSentydowo plazmidów pCS2 i pKS4 uzyskano w (3). Sekwencja ounientydowa otwartej ramki odczytu od tej pory będąca założeniem jest reprezentowana przez SEQ ID Nr lw Liście Sekwoocji. Sekwencja aminokwasów produktu przewidywana oa podstawie tej sekwencji ouklentydnwoj jest reprezentowana przez SEQ DD Nr 2 w Liście Senwnocji. Zatem gen kodujący białko mające sokwe-cię aminokwasów reprezentowaną przez SEQ ID Nr 2 w Liście Sekwencji jest geoem ki-azy ionzyonwo-guanozynowej Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.

Sekwencja ouklentydowa i sekwencja amiookwasowa zostały porów-aue zo zoaoymi sekwencjami biorąc pod uwagę homolngię. Zanalizowanymi bazami danych były EMBL i SWISS-PROT. W rezultacie odkryto, że DNA reprezentowano przez SEQ Id Nr 1 w Liście Sekwencji i białko kodowane przez to DNA są nowością i że sekwencja uunleotydnwa jest moiej hnmnlogikzua niż sekwencja kodująca kinazę inozynnwo-guanozynową E. coli, która jest jedo-ą zoaoą jako geo kodujący kinazę ioozonnwn-guanozynową i jest dość od nich odmieuua.

Białko kodowane przez ten go- składa się z 303 aminokwasów i jego waga molekularna obliczona z sekwencji aminokwasowej wynosiła 32,5 nilodaltnoów.

Przykład7 (Konstruowanie plazmidu do ekspresji kinazy innzynowo-guannzokowej’ uzyskanej z Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 i wprowadzeoie go do Corynebacterium ammoniagenes) (1) Amplifikacja gonu kinazy innzynnwo-guaonzonowej przez PCR i klonowanie

Zseutetyznwaoo nlikonunlootydy odpowiadająco 5'- i 3'- końcowym sekwencjom geou kinazy iugzyoown-guaonzoknweu Exiguobacterium acetylicum i miejscom trawienia ondnoukleazami restrykcyjnymi PstS i SphL odpowiednio, jak pokazano w sEq ID Nr 8 i 9.

0,25 Mmoli tych oligoounlentodów lako primery, 0,1 pg chromosomowego DNA Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 otrzoma-ego w przykładzie 6 (2) jako matryca i 2,5 jednostek pnlimorazo taq DNA (Takara Shuzo Co.) dodano do 0,1 ml lO mM buforu TrisHCl (pH 8,3) zawierającego 200 pM dATP, 200 pM dCTP, 200 pM GTP, 200 pM dTTP, 50 mM chlorku potasowego, 1,5 mM chlorku magnezowego i 0,0001% żelatyny. Przeprowadznon PCR, w którym trój temperaturowe Cykle, mia-owicie przy 94 °C przoz 30 sekuod, przy 55°C przez 30 sekuod i 72°C przoz 30 sokuod, powtórzono 25 razy. Mieszanioę reakcyjną podda-o elektroforezie -a żelu agarozowym i wybrany fragmoot DNA odzyskano przy użyciu pyłu szkla-ego (Takara Shuzo Co.). Około 2 fig togo fragmeotu DNA,10 jed-ostek nudoounleazy restrykcyjnoU Pstl i 10 Uednostnn endonukleazo restrykcyjnoU SphI zmiesza-o z 50 ml 5θ mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku makoezowegn, 100 mM chlorku potasowego i 1 mM ditiotroitolu. Mieszaoioę inkubnwano w 37 °C przoz 2 godzioy w colu uzyskania produktu trawienia. Produkt ton ekstrahowa-o fe-olem, a ekstrakt wytrąco-o etaoolem.

Jedeo mikrogram plazmidu pHSG298 (Takara Shuzo Co.), 20 jod-ostek endonuklnazo restrykcyjnej Pstl i 20 jod-ostek eodnnukleazy restrykcyjnoj SphI zmieszano z 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku potasowego i 1 mM ditintroitnlu. Mieszaoinę ionubnwann w temperaturze 37 °C przoz 2 godziuy. Miesza-i-ę reakcyjną ekstrahowano fe-olem i wytrącnon etanolem tradycyjną metodą w celu uzyskania plazmidu pHSG298 strawinoekO Pstl i SphI. 0,1 pg tego plazmidu pHSG298 strawinoegn Pstl i SphI, 0,5 pg amplifikowaoogo PCR fragmentu strawinungn Pstl i SphI i 1 jod-ostkę T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.) dodaoo do 66 mM buforu TrisHCl (pH 7,5) zawierającego 6,6 mM chlorku magooznwegn, 10 mM ditintreitnlu i .10 mM ATP. Mieszaki-ę ionubnwaun w temperaturze 16°C przez 8 godzi- w celu ligacji DNA.

184 520

Następnie E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) stransformowano tą mieszaniną DNA w tradycyjny sposób i wstrzyknięto na płytkę z pożywką L-agarową zawierającą 100 mg/ml kanamycyny, w celu uzyskania transformantów.

Plazmidy ekstrahowano z tak otrzymanych transformantów metodą lizy alkalicznej i poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Wyselekcjonowano rekombinowany plazmid, w którym gen kinazy inozynowo-guanozynowej otrzymanej z Exiguobacterium acetylicum wprowadzono do wektora plazmidowego pHSG298. Ten plazmid oznaczono pBA-1.

(2) Wprowadzanie promotora trp E. coli

Przygotowano, w ten sam sposób jak w przykładzie 1 (2), fragment DNA zawierający promotor trp E. coli strawiony BamHI i Pstl.

Jeden mikrogram rekombinowanego plazmidu pBA-1 mającego wprowadzony fragment DNA zawierający gen kinazy inozynowo-guanozynowej otrzymany w (1) strawiono BamHI i Pstl. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem i wytrącono etanolem w tradycyjny sposób w celu uzyskania plazmidu strawionego BamHI i Pstl. 0,1 mg tego plazmidu strawionego BamHI i Pstl ligowano z fragmentem DNA zawierającym promotor trp E. coli strawiony BamHI i Pstl przy użyciu 1 jednostki T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.). Następnie E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) stransformowano tą mieszaniną DNA i wstrzyknięto na L-agarową płytkę z pożywką zawierającą 100 mg/ml kanamycyny, uzyskując transformanty.

Z tak otrzymanych transformantów ekstrahowano plazmidy i poddano elektroforezie na żelu agarozowym. Wydzielono rekombinowany plazmid w którym promotor trp E. coli został wstawiony do plazmidu pBA-1. Plazmid ten oznaczono pBA-2.

E. coli AJ13094 zawierające plazmid pBA-2 został zdeponowany w National Institute of Bioscience and Humań Technology, Agency of Industrial Science and Technology, 1-3, Higashi 1 chome, Tsukubashi, Ibaraki-ken 3-5, Japonia dnia 27 kwietnia 1995r. zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, pod numerem dostępu FERM BP-5089.

(3) Wstawienie początku replikacji otrzymanego z bakterii rodzaju Corynebacterium.

W ten sam sposób jak w (2), trawiono BamHI 1 pg rekombinowanego plazmidu pBA-2 zawierającego gen kinazy inozynowo-guanozynowej i promotor trp otrzymany w (2). Produkt trawienia ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono etanolem. Strąt trawiono KpnI w ten sam sposób jak w przykładzie 6 (2), i produkt trawienia ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono przy pomocy etanolu. Tak otrzymany plazmid pBA-2 strawiony BamHI i KpnI został poddany defosforylacji fragmentu DNA przez potraktowanie bakteryjną fosfatazą. Otrzymaną substancję ekstrahowano fenolem i wytrącono za pomocą etanolu.

Tymczasem, 1 fig plazmidu pHC4 (japoński wyłożeniowy opis patentowy 7,491/1993) podobnie trawiono BamHl i KpnI. Produkt trawienia ekstrahowano fenolem, a ekstrakt wytrącono za pomocą etanolu. 0,1 fig wyżej otrzymanego plazmidu pBA-2 strawionego BamHI i KpnI ligowano z 0,2 fig fragmentu DNA z plazmidu pHC4 strawionego przy pomocy BamHI i KpnI przy użyciu T4 ligazy DNA (Takara Shuzo Co.). Następnie, E. coli JM 109 (Takara Shuzo Co.) stransformowano mieszaniną DNA i wysiano na płytkę z pożywką L-agarową zawierającą 100 mg/ml kanamycyiny, uzyskując transformanty.

Z tak otrzymanych transformantów plazmidy ekstrahowano metodą lizy alkalicznej i poddano je elektroforezie na żelu agarozowym. Wydzielono w ten sposób rekombinowany plazmid ze wstawionym początkiem replikacji pochodzącym z bakterii rodzaju Corynebacterium do plazmidu pBA-2. Plazmid ten oznaczono pBA-3.

(4) Wprowadzenie pBA-3 do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477

0,1 pg pBA-3 otrzymanego w (3) wprowadzono do Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477 przy pomocy zwykłej metody elektroporacji (japoński wyłożeniowy opis patentowy nr 207,791/1990). Stransformowanymi komórkami zaszczepiono pożywkę agarową zawierającą 1°% peptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 0,5% chlorku sodu, 0,5% glukozy i 50 mg/ml kanamycyny w celu uzyskania transformantu ATCC 21477/pBA-3.

(5) Pomiar aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej rekombinacyjnego szczepu.

Corynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pBA-3 uzyskanym w (4) zaszczepiono ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4% fosforanu dwuwodoro-potasowego, 0,1% siarczanu magnezu, 0,5% siarczanu

184 520 amonu, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelazawego, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr Chlorowodorku tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapnia, 30 pg/litr biotyny, 0,05% adeniny i 50 mg/litr kanamycyny i Hodowano w temperaturze 32°C przez 24 godziny. Hodowlę żwirowano w zwykły sposób w Celu zebrania komórek.

Etap zawieszenia komórek w 0,9% roztworze wodnym chlorku sodu i odwirowania zawiesiny powtórzono dwukrotnie w celu przemycia komórek. Otrzymane komórki zawieszono w 50 mM buforu Tris-HCl (pH 7,9) zawierającego 20% glicerolu i lOOmM Chlorku potasu, n zawiesinę rozbijano ultra Dźwiękami 150 W przez 20 minut i następnie odwirowano przy 15,000 rpm ppzee 30 minnt w cClu (trzymania suppmataniu. Su^manam unniesicmn nn Pch lumnę UsdCadex G-15 (Pharmacia Co.) w celu usunięcia substancji niskoąząsteczkowyąh i otrzymany roztwór stosowano jako surowy roztwór enzymu.

Aktywność kinazy inozynpwp-guanpzznowsj surowego roztworu enzymu określono mstodą opisaną w przykładzie 5 (1). Jako kontrolę użyto ATCC 21477/pHK4, uzyskany poprzez transformację plazmidem pHK4. Wyniki przedstawiono w tabeli 7. ATCC 21477/pBA3 wykazywał wysoki stopień aktywności, podczas gdy nie zaobserwowano żadnej aktywności w ATCC21477/pHK4. Na podstawie tych wyników wykazano, iż wprowadzony gen uzyskany z Exiguebacterium acetylicum wykazał aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej w Corynebacterium ammoniagenes.

Plazmid pHK4 zastosowano jako kontrolę ponieważ posiada on strukturę, w której regiony trp promotora i genp kinazy inozynowo-guanozznowej zostały usunięte z pBA-3.

Szczep niosący pHK4 w E. coli HB101 oznaczono jako AJ 13136 i zdeponowano w National Institute of Βί^ά^^ and Human Tsąhnplogy, Agency of Industrial Science and Teąhnelogy, 1-3, Higashi 1 CCome, Tspkuba-shi, Ibaraki-ken 305, Japonia dnia 1 sierpnia 1995 r. zgodnie z Traktatem Budapeszteńskim, pod numerem dostępu FERM BP-5186.

Tabela 7

Szczep	Aktywność specyficzna (nmol/min/mg białka)
ARCC 21477/pHK4	nie wykryto
ATCC 21477/pBA-3	50,4

Przykład 8 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozznowego z inozyny przy pomocy komórek zawierających gen kinazy inoeznowρ-guanoeznpweJ Exiguobacterium acetyllcum).

Cerynebacterium ammoniagenes ATCC 21477/pBA-3 zaszczepiono do 450 ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego, 5% glukozy, 0,4 fosforanu dwpwρdpro-dPtaspwegp, 0,1% siarczanu magnezu, 0,5% siarczanu amonu, 0,5% mocznika, 0,001% siarczanu żelazawego, 0,001% siarczanu manganowego, 0,005 g/litr ąClorowegorkt tiaminy, 0,01 g/litr pantotenianu wapnia, 30 mg/litr biotyny, 0,05% adeniny i 50 mg/litr kanamycyny i Hodowano w temperaturze 32°C przez 24 godziny. Hodowlę odwirowano przy 7,000 rpm drzsz 10 minut uzyskując 20 g mokrych komórek w postaci osadu.

Tak otrzymane komórki zawieszono w ilościach 200g/litr w 20 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 50 g/litr inozyny, 20 g/litr fosforanu dwuwodoropotasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezu, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 i 1 g/litr adeniny. Zawiesinę tą inkubowano w temperaturze 32 °C z mieszaniem. Wartość pH Dostosowano do 7,2 4 N wodorotlenkiem sodu, a Do mieszaniny reakcyjnej dodano zmniejszoną ilość fosforanu dwpwoderodotasewsgo. Jako kontrolę przeprowadzono reakcję stosując ATCC 21477/pHK4. Po 30 godzinach reakcji, ilość kwasu 5'-inozznowego w roztworze reakcyjnym określono poprzez wysekowzdatną Chromatografię Cieczową.

184 520

Wyniki przedstawiono w tabeli 8. Ilość akumulowanego kwasu 5'-inozynowego wykazano poprzez ilość 7,5 hydratu 5'-ioozynianu disodowego. Na podstawie wyników zaobserwowano konwersję inozyny do kwasu 5'-ino/ynowego w ATCC 21477/pBA-3, wykazującego aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.

Tabela 8

Szczep	Ilość akumulowa-dgo kwasu 5'-ino/ynowego (g/litr)
ATCC 21477/pHK4	nie wykryto
ATCC 21477/pBA-3	69,8

Przykład9 (Wytwarzanie kwasu 5'-inozynowego z Inozy-y przy użyciu komórek zawierających gen kinazy Inozynowo-guanozynowdj Exiguobacterium acetylicum).

Komórki uzyskane w przykładzie 8 zawieszo-o w ilościach 200 g/lltr w 50 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 60 g/lltr i-ozyny, 20 g/litr fosforanu dwuwodoropotasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezu, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 1 g/litr Nymeen S-215 i 1 g/litr adeniny. Zawiesinę tę inkubowano w temperaturze 32 °C z mieszaniem natleniającym. Wartość pH doprowadzono do 7,2 4 N wodorotlenkiem sodu monitorując z zastosowaniem pH-metru, i do mieszaniny reakcyjnej dodano obniżoną Ilość dwuwodorowego fosforanu potasowego. Po 30 godzinach reakcji, ilość zebranego kwasu 5'-inozynowdgo wynosiła 111,3 g/litr, i wydajność molowa względem inozyoy wynosiła około 100%.

Przykład 10 (Zamiana guanozyny w kwas 5'-guaoylowego z zastosowaniem komórek zawierających gen kinazy inozyoowo-guanozynowej)

Komórki otrzymane w przykładzie 8 zawieszo-o w ilościach 200 g/litr w 50 ml roztworu reakcyjnego (pH 7,2) zawierającego 25 g/litr guanozyny, 20 g/litr dwuwodorowego fosforanu potasowego, 30 g/litr glukozy, 5 g/litr siarczanu magnezowego, 10 g/litr kwasu fitynowego (stosunek wagowy 50%), 4 g/litr Nymeen S-215 1 1 g/litr adeniny. Zawiesinę inkubowano w 32°C z mieszaniem natleniającym. pH dostosowano do 7,2 za pomocą 4 N wodorotlenku sodowego używając pH-metru. Po 8 godzinach tej reakcji, ilość zebranego kwasu 5'guanylowdgo wynosiła 7,3 g/litr, i wydajność molowa względem dodanej guanozyny wynosiła około 14%.

Przykład 11 (Wykrywanie aktywności kinazy inozynowo-guanozynowej w Exiguobacterium aurantiacan, Kurthia gisoni i Kurthia zopfii}

Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652 /as/czepiono 50 ml pożywki (pH 9,7) zawierającej 1% pollpeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego bacto, 0,5% glukozy, 0,5% chlorku sodowego, 1 1% węglanu sodowego.

Każdym z Kurthia gibsonii ATCC 43195 i Kurthia zopfii ATCC 33403 zaszczepiono po 50 ml pożywki (pH 7,2) zawierającej 1% polipeptonu, 1% ekstraktu drożdżowego bacto, 0,5% glukozy i 0,5% chlorku sodowego. Hodowle prowadzono w 30°C przez 4 godziny. Każdą z hodowli odwirowano przy 7,000 rpm przez lO minut, i strąt przemyto dwa razy 0,9% chlorkiem sodu otrzymując mokre Komórki. Komórki zawieszono w 3 ml buforu A i rozrywano ultradźwiękami. Zawiesinę wirowano przy 15,000 rpm przez 30 minut, i unoszący się -a powierzchni supernatant odsolooo używając kolumny Sephadex G-25 (Pharmacia Co.), otrzymując około 3,5 ml surowego ekstraktu enzymatycznego. Pięć mikrolitrów surowego ekstraktu enzymatycznego dodano do 50 pl 100 mM buforu Tris-HCl , (pH 7,5) zawierającego 5 mM chlorku magnezowego, 5 mM ATP, 100 mM chlorku potasu, 0,06 mM guano/yno 1 0,04 mM (8-¹⁴C) -guanozy-y. Mleszaoioę i-kubowano w 30°C przez 10 minut. Określono ilość wytworzo-ego Kwasu 5'-guanylowego 1 zmlerzo-o specyficzną aktywność kinazy

184 520 inozynowo-guanozyoowej. Wyniki pokazano w tabeli 9. Aktywność kinazy inozynowoguaoozooowoj zaobserwowano wo wszystkich szczepach.

Tabela 9

Szczep	Działanie specyficzne (ornol/mlo/mg białka)
Ex1guobgctonum gurgotlgcum	46,3
Kurthia gibsonii	6,64
Kurthia zopfii	1,19

Przykład 12 (Detekcja fragmentów mających homologię do genu kinazy inozynowo-guanozynowej z Exiguobacterium acetylicum w chromosomach Exiguobacterium aurantiacum, Kurthia gisonii i Kurthia zopfii)

Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652, Kurthia gibsonii ATCC 3195 i Kurthia zopfii ATCC 33403 hodowano w 30°C przez 16 godzin tak samo jak w przykładzie 11. Chromosomgloo DNA otrzymano z odpowiednich hodowli sposobem jak w przykładzie 5 (2). Dziesięć mikrogramów z każdego chrnmosomalnego DNA i 100 jednostek z endonuklegzy restrykcyjnej EcnRI wymieszano z 50 mM buforu Tris-HCl, (pH 7,5) zawierającego 10 mM chlorku magnezowego, 100 mM chlorku sodowego i 1 mM ditiotreitolu, i inkubowano w 37°C przez 14 godzin. Następnie, mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem zwykłym sposobem. Otrzymany tak chromosomalny DNA strawiony przez EcoRI poddano elektroforezie na 0,8 % żelu aearozowym i przeniesiono na błonę nylonową (DuPont Co.) z żelu ggrozowoko metodą transferu alkalicznego opisanego w Molocular Clnnink 2 edycja, J. Sambrook, E.F. Fritsch i T. Maniatis, Cold Spring Harbnur Laboratory Press, str. 9,31(1989). Błonę poddano hybrydyzacji w temperaturze 42°C przez 14 godzin w obecności 20% formamidu używając jako sondy fragmentu zawierającego gen kinazy ioozonowo-guanozooowej pochodzący od Exiguobacterium aurantiacum.

Przykład 13 (Izolacja homologicznego fragmentu genu kinazy inozonowo-kuanosynowej uzyskiwanego od Exiguobacterium acetylicum z chromosomu z Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652)

Osiemnaście mlkro^amów chromosomglogko DNA z Exiguobacterium auranntiacum ATCC 35652 1 200 jednostek oodonuklegzy restrykcyjnej EcoRI poddano reakcji w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Mieszaninę reakcyjną ekstrahowano fenolem 1 ekstrakt wytrącono etanolem. Powstałe strawione fragmenty poddano elektroforezie na żelu agrarozowym. Fragmenty wielkości około 4,6 kb wydobyto używając sproszkowanego szkła (wyrobionego przez Takara Shuzo Co.) otrzymując wybrane rozmiary chromosomalnych fragmentów Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652.

Jeden mikrogram wektora plazmidowego pMW218 (Nippon Gene Co.) inkubowano z 20 jednostkami godoouklegzy restrykcyjnej EcoRI w temperaturze 37°C przez 3 godziny. Roztwór ekstrahowano fenolem, i ekstrakt wytrącono etanolem. Następnie, fragment DNA defoseorolowano poprzez traktowanie alkaliczną fosfatazą. Fragment potraktowany w ten sposób ekstrahowano fenolem, 1 ekstrakt wytrącono etanolem.

0,2 pg tego pMW218 strawionego EcoRI poddano Ι^ΑΟΟΪ z 5 mg chromosomalooch fragmentów Exiguobacterium aurantiacum strawionych EcoRI używając T4 DNA ligazy (Takara Shuzo Co.). Następnie, E. coli JM109 (Takara Shuzo Co.) transformowano tą mieszaniną DNA, 1 wysiano na płytce L-agarowej zawierającej 100 mg/ml kgnamocvno otrzymując około 1000 trgosformgotów.

184 520

Spośród otrzymanych transformantów wyselekcjonowano metodą hybrydyzącji kolonii transformant hybrydyzujący z sondą DNA. Plazmidowy DNA został ekstrahowany z tego transformantą metodą lizy alkalicznej. Ten plazmidowy DNA zawierał fragment DNA około

4,6 kb pochodzący z chromosomu Exiguobacterium aurantiacum.

Przykład 14 (Określenie sekwencji nukleotydowej genu kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzącego z Exiguobacterium aurantiacum)

Plazmid otrzymany w przykładzie 13 przecięto endonukleazami restrykcyjnymi i poddano hybrydyzacji Southema, identyfikując fragment hybrydyzujący z sondą DNA.

W rezultacie, hybrydyzował fragment zbliżony do 2,7 kb, który był przecięty EcoRI i Pstl. Ten fragment DNA poddano ligacji z wektorem plazmidowym pSTV28 (Takara Shuzo Co.) trawionym EcoRI i Pstl, i wprowadzono do E. coli JM109. Spośród otrzymanych transformantów, fragment do hybrydyzącji z sondą DNA klonowano metodą hybrydyzącji kolonii opisaną w Molecular Cloning 2 edycja, J. Sambrook, E. F Fritsh i T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, str. 1,90 (1989). Aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej z komórkowego ekstraktu E.coli niosącego plazmid zawierający powyższy fragment mierzono według metody opisanej w przykładzie 7 (5), i okazało się że jest ona około 300 razy większa szczepu niosącego wektor, który było stosowany jako odnośnik. W ten sposób zostało potwierdzone, że klonowany fragment zawiera gen kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący z Exiguobacterium aurantiacum.

Sekwencję nukleotydową fragmentu przeciętego EcoRI i Pstl oznaczono przy użyciu tak uzyskanego plazmidowego DNA. Przypuszczalna sekwencja nukleotydową ramki odczytu z określonej sekwencji nukleotydowej jest przedstawiona przez SEQ ID NO: 14 w liście sekwencji. Sekwencja aminokwasowa określona na podstawie tej sekwencji nukleotydowej jest przedstawiona przez SEQ ID NO: 15 w liście sekwencji. Obydwie sekwencje nukleotydowa i aminokwasowa wykazują silną homologię do kinazy inozynowo-guanozynowej uzyskanej z Exiguobacterium acetylicum. Jednak nie ma wątpliwości, że jest to nowy gen. Zatem, gen kodujący białko majacy sekwencję aminokwasowa przedstawioną przez SEQ ID NO: 15 w liście sekwencji jest genem kinazy inozynowo-guanozynowej z Exiguobacterium aurantiacum ATCC 35652.

Jak wyżej wspomniano, otrzymano gen zdolny do hybrydyzacji genu kinazy inozynowo-guanozynowej pochodzący z Exiguobacterium acetylicum, i potwierdzono, że gen ten koduje białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.

184 520

Wykaz Sekwencj i (1) INFORMACJE OGÓLNE (i) ZGŁASZAJĄCY: Ajinomoto Co, Inc (ii) NAZWA WYNÓIA. ZKU : SPOSÓB WYTWARZÓNI A

NUKLEINOWYCH (iii) ILOŚĆ SEKWENCJI: 15 (iv) ADRES DO KORESPONDENCJI:

KWASÓW

(A)	ADRESAT
(B)	ULICA:
(C)	MIASTO:
(D)	STAN:
(E)	KRAJ:
(F)	KOD:

(2) (v) FORMA ZAPISU KOMPUTEROWEGO:

	(A)	TYP NOŚNIKA:
	(B)	KOMPUTER:
	(C)	SYSTEM OPERACYJNY:
	(D)	OPROGRAMOWANIE:
(vi)	DANE DOTYCZĄCE ZGŁOSZENIA:
	(A)	NUMER ZGŁOSZENIA:
	(B)	DATA WPŁYWU:
	(C)	KLASSYFIKACJA:
(vii)	DANE PRAWNIKA/PRZEDSTAWICIELA
	(A)	NAZWISKO:
	(B)	NUMER REJESTRACYJNY
(ix)	INFORMACJE TELEKOMUNIKACYJNE :
	(A)	TELEFON:
	(B)	FAX:
	(C)	TELEX:
INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 1:

(i) SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 909 par zasad

184 520

	(B)	TYP: kwas	nukleinowy
	(C)	ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy
	(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
ii)	TYP	CZĄSTECZKI	: genomowy DNA
iii)	HIPOTETYCZNY:	nie
iv) :	ANTYSENSOWNY:	nie

(vi) ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) organizm: Exiguobacterium acetylicum (C) SZCZEP: ATCC 953 (ix) CECHY:

(A) NAZWA: sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1..909 (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 1:

ATGAATAAAA	TCGCGGTAAT	CGGAAAAGTA	TTCGTCGACA	TAAAAGGAAC	TTCGTTCGCT	60
CCTTTGCATA	AGGATGCGAA	AAACGTAGGA	GACATCACGT	TTTCAAATGG	AGGAACAGGA	120
CGCAACGTAG	CACAAAATCT	AGCCGTCCTC	GGGAATGAAG	TTCGCTTTAT	CTCGACGGTT	180
ACGAATGATC	AGATTGGCGT	GGGAGTGCTC	GATGAGCTGA	AATCCTACGG	TGCGAATGTG	240
GATCACGTCG	AAATGTTAGA	AGATCATGGA	ATGGGTATGT	GGCTAGCTGT	CATGGATAAC	300
GAGGGTGACT	TGCAAACATC	GATCTCGAAA	CAACCGGATG	CCAAGTTGCT	CGAAGAGGCG	360
attttacgtc	AATCGATCTA	TGCACTCGAT	GGAGTCGATG	CCGTTGCAAT	CGATTTGGAT	420
TTGTCCGTCA	CGGTCTTAGA	ACGTTTGATT	CATTTATGTC	GTAAGATGGA	GTTGCCATTG	480
TTTGGTGTTT	GTGGTCACTT	GAGCGTCATC	GAACGAAATC	GTCATCTGCT	ACAAGGGTTC	540
ACTGGATTCA	TTTGTAGCCG	AGAAGAGGCT	GAAATTCTGT	CTGATCTATC	GATCGTGACG	600
GTCGAAGATG	CGATTCATGT	AGCAAATGAG	CTAGCGAAAA	AGGGCGCTCC	GTTTACGGTC	660
GTGACGATGA	GTGAACTGGG	GGCGGTCTAC	GTTGATCGTC	GTACGGCGAC	ATCAGGTCAC	720
GTCGGAACGA	AAAAAGTGAA	GGTTGTCGAC	TCAACGGGAG	CAGGCGATTC	CTTCTTCTCC	780
GCAGTCTTGT	CCGAATTGAC	ACAGGAAAAG	TCAGCAGAAG	AGGCTTTGAA	GCTTGGTATG	840
AAGGTCGCAG	CAGAAGTCAT	CGCTTCAACA	GAGAATGGAC	TCGTTCCTGA	AATGCTAGAT	900

GCTCTTCAA

909

184 520 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 2:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

	(A)	DŁUGOŚĆ: 303 aminokwasów
	(B)	TYP: aminokwas
	(D)	TOPOLOGIA:	liniowa
(ii)	TYP	CZĄSTECZKI:	: białko
(X)	OPIS	SEKWENCJI:	SEK ID NR 2:

Met

Asn

Lys

Ile

Ala VaA Ile Hy Lys VaA

PPh

Val Asp

Ile

Lls 15

Gly

5

10

Thr

Ser

Phe

Ala

Pro

Leu

Hhs

Lys

Aip

Ala

Lys

Asn

Val

Gly

Aip

Ile

20

25

33

Thr

Phe

Ser

Asn

Gly

Hy

TTh

Gly

Arg

Al si

VaA

Ala

Gln

Asn

Leu

Ala

35

40

45

Val

Leu

Gly

Asn

Glu

Val

TAg

Phh

Ile

Ser

TTh

VaA

Thr

Asn

Asp

Gln

50

55

66

Ile

Gly

VaA

Gly

VaA

Leu

Asp

Glu

Leu

Lls

Ser

Tyr

Gly

Ala

Asn

Val

65

70

755

80

Asp

His

VaA

Glu

Met:

Leu

Gib

Asp

His

Gly

Met

Gly

Met

Trp

Leu

Ala

85

90

95

Val

Met

Asp

As n

Glu

Hy

Aip

Leu

Gln

Thr

Ser

Ite

Ser

Lls

Gln

Pro

100

105

111

Asp

Ala

Lys

Leu

Glu

Ala

Ile

Leu

Ag

Gln

Ser

Ile

Tyr

Ala

115

112

125

Leu

Asp

Gly

Val

Asp

Ala

VaA

Ala

Ile

Asp

Leu

Asp

Leu

Ser

Val

Thr

130

135

144

Val

Leu

Glu

Ag

Leu

Ile

His

Leu

Cys

Ag

Lys

Met

Glu

Leu

Pro

Leu

145

150

155

160

Phe

Gly

Val

Cys

Gly

Hhs

Leu

Ser

Vae

IiLe

Glu

Arg

Asn

Arg

His

Leu

165

170

175

Leu

Gln

Gly

Phe

Thr

Gly

Phe

Ile

Cys

Ser

Arg

Glu

Ala

Glu

Ile

180

185

110

Leu

Ser

Asp

Leu

Ser

Ite

VaA

TTh

Val

Glu

Asp

Ala

Ile

His

Val

Ala

195 200 205

184 520

Asn

Glu 210

LeL Ala

Lys

Gly Alei Pro Phe Tlnr Val

Val

Thr

Mee

Ser

221

220

Glu

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Val

Aip

Arg

Air

Thr

Ali

TTr

Ser

Gly

HHs

225

230

235

240

Val

Gly

Thr

Lys

Val

Lys

Val

Aip

Ser

Thr

Gly

Ala

Gly

Asp

245

250

255

Ser

Phh

Phe

Ser

Ala

Val

Leu

Ser

Glu

Leu

Thr

Gln

Glu

Lys

Ssi:

Ala

260

255

200

Glu

Ala

Leu

Lys

Leu

Gly

Met

Lys

Val

Ala

Glu

Val

Ile

Ala

275

280

285

Ser

Thr

Gli

Ain

Hy

Leu

VaA

Pro

Glu

Met

Leu

Asp

Ala

Leu

Gln

290

295

300 (2) INFORMACJA DLA. SEK . ID. NR 3 :

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI .

CA.) DŁUGOŚĆ: 2 8 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: iiwiowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: peptyd (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 3:

Met Asn Lys Ile Ala Val Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lys Gly 15 10 15

Thr Xaa Phe Ala Pro Leu His Lys Asp Ala Lys Asn 20 25 (2) INFORMACJA DLA SEK . IIK . NR 4:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie

184 520 (iv): ANTYSENSOWNY: nie (X) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 4:

ATGAAYAARA THGCNGT 17 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 5:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 17 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA:

(ii) TYP CZĄSTECZKI:

(iii) HIPOTETYCZNY:

(iv) : ANTYSENSOWNY: (x) OPIS SEKWENCJI:

TTYTTNGCRT CYTTRTG 17 liniowa inny kwas nukleinowy, nie nie

SEK ID NR 5:

syntetyczny DNA (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 6:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 23 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (X) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 6: TAATCGGAAA AGTATTCGTC GAC 23 syntetyczny DNA (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 7:

(i) CIHARAKTERYSTYiK. SEKWENCCI (A) DŁUGOŚĆ: 21 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy

184 520 (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY : nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 7:

GGAACTTCGT TCGCTCCTTT G 21 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 8:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 8 : GGCTGCAGGA ATGAATAAAA TCGCGGTAAT 30 syntetyczny DNA (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 9:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁANCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny-DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 9:

GGGCATGCTG GAAAGACATA ATACGTTTCG 30

184 520 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 10:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 1302 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy

	(D) TOPOLOGIA:	liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: genomowy 1
(iii)	HIPOTETYCZNY:	nie
(iv) :	ANTYSENSOOWNY:	nie
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:
	(A) organizm:	Escherichia

(C) SZCZEP: HM70 (ix) CECHY:

(A)	NAHZWA: sekwencja	koduj ąca
(B)	POŁOŻENIE:	1. . 1302
OPIS	SEKWENCJI:	SEK ID	NR 10 :

ATGAAATTTC	CCGGTAAACG	TAAATCCAAA	CATTACTTCC	CCGTAAACGC	ACGCGATCCG	60
CTGCTTCAGC	AATTCCAGCC	AGAAAACGAA	ACCAGCGCTG	CCTGGGTAGT	GGGTATCGAT	120
CAAACGCTGG	TCGATATTGA	AGCGAAAGTG	GATGATGAAT	TTATTGAGCG	TTATGGATTA	180
AGCGCCGGGC	ATTCACTGGT	GATTGAGGAT	GATGTAGCCG	AAGCGCTTTA	TCAGGAACTA	240
AAACAGAAAA	ACCTGATTAC	CCATCAGTTT	GCGGGTGGCA	CCATTGGTAA	CACCATGCAC	300
AACTACTCGG	TGCTCGCGGA	CGACCGTTCG	GTGCTGCTGG	GCGTCATGTG	CAGCAATATT	360
GAAATTGGCA	GTTATGCCTA	TCGTTACCTG	TGTAACACTT	CCAGCCGTAC	CGATCTTAAC	420
TATCTACAAG	GCGTGGATGG	CCCGATTGGT	CGTTGCTTTA	CGCTGATTGG	CGAGTCCGGG	480
GAACGTACCT	TTGCTATCAG	TCCAGGCCAC	ATGAACCAGC	TGCGGGCTGA	AAGCATTCCG	540
GAAGATGTGA	TTGCCGGAGC	CTCGGCACTG	GTTCTCACCT	CATATCTGGT	GCGTTGCAAG	600
CCGGGTGAAC	CCATGCCGGA	AGCAACCATG	AAAGCCATTG	AGTACGCGAA	GAAATATAAC	660
GTACCGGTGG	TGCTGACGCT	GGGCACCAAG	TTTGTCATTG	CCGAGAATCC	GCAGTGGTGG	Ί20
CAGCAATTCC	TCAAAGATCA	CGTCTCTATC	CTTGCGATGA	AC GAAGATGA	AGCCGAAGCG	Ί80
TTGACCGGAG	AAAGCGATCC	GTTGTTGGCA	TCTGACAAGG	CGCTGGACTG	GGTAGATCTG	840
GTGCTGTGCA	CCGCCGGGCC	AATCGGCTTG	TATATGGCGG	GCTTTACCGA	AGACGAAGCG	900

184 520

AAACGTAAAA	CCCAGC.ATCC	GCTGCTGCCG	GGCCCZT.TTTG	CCGAGTTTAG	CAAGAAGGAG	960
TTTAGCCGCG	CCATGCGCCA	CAAGGATTGC	CAGAATTCGG	GTGAAGATGT	GTCTAAGAGT	1020
GCGCCGTACA	TGGGCGGGCC	GGAAAAAATC	ATGAGGAGTT	ATGAAGACGG	GGAGTGAAAA	1080
TTGGCAGCGT	TGCTGCATGA	CATTACCGCC	AAGAGGGTGC	ATCAATGGAG	CAGTGCTAAG::	1140
TCCAGCAAAC	ATAAATTCAC	CTGGTTAACT	TTTTCATCTA	TTGGAAAGGA	GATATAG.GAG	1)200
GCTAACCGTG	TGAGCTATCA	GGTACTGAAC	CATGATTTAG		GAAACAGATT	1260
CCGGAGCGTG	AAGACAGCCT	GGAAGAGTCT	TTTTGAAATT	GG		1)302

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 11:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCCOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 11:

GGCTGCAGCC ATGAAATTTC CCGGTAAACG 30 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 12:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 30 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCCOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny-DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOWNY: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 12:

GGAAGCTTAA CGATCCCAGT AAGACTCTTC 30

184 520 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 13:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 72 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: jednoniciowy (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: inny kwas nukleinowy, syntetyczny DNA (iii) HIPOTETYCZNY: nie (iv) : ANTYSENSOiWC: nie (x) OPIS SEKWENCJI: SEK ID NR 13:

GGGGATCCTG TTGACAATTA ATCATCGAAC TAGTTAACAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA GGGTCTGCAG CC 72 (2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 14: (i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

(A) DŁUGOŚĆ: 924 par zasad (B) TYP: kwas nukleinowy (C) ŁAŃCUCHOWOŚĆ: dwuniciowy

	(D) TOPOLOGIA:	liniowa
(ii)	TYP CZĄSTECZKI	: genomowy DNA
(iii)	HIPOTETYCZNY:	nie
(iv) :	ACTYSECSOWCY:	nie
(vi)	ŹRÓDŁO POCHODZENIA:

(A) organizm: Exiguobacterium aurantiacum (C) SZCZEP: ATCC 35652 (ix) CECHY:

(A) NAHZWA: sekwencja kodująca (B) POŁOŻENIE: 1..654 (x) OPIS SEKWENCJI : SEK ID NR 14 :

ATGAATACGA TTGCAGTAAT CGGCAAAGTG TTTGTCGACA TAAAAGGAAC GTCGTTCGCC 60 CCCATCCATA AAGATGCGAA AAACGTCGGA GATATCGCCT TCTCAAACGG TGGCACCGGA 12 0 CGAAACGTCG CTCAGAACTT AGGTGTCCTC GGTAACGATG TTCGGTTCGT CTCGACCGTG 180 ACGAACGATC AAATCGGAAT CGGTGTCCTC GAAGAACTAC GCAGTTTGAA CGTCAATGTC 2 40 GAACACGTCG ACTTGCTCGA AGACAACGGC ATGGGTATGT GGCTCGCGGT CATGGACAAT 300

184 520

AACGGTGACC	TCCAGACGTC	AATCTCAAAA	CAACCTGACG	AGGCGATGAT	GGAACAATGC	360
ATCCTCCGTC	GCATCGATAC	CGTTTTCGCC	GAGAGCACGG	CTGTCGCCAT	CGACCTCGAC	420
TTATCGGTCA	ACGTCTTAAA	CGAGACGATT	GAATTGTGCC	GTGAGATGAA	ACTCCC^TA	480
TACGGTGTAT	GTGGTCACCT	CTCGGTCATC	GAACGCAACC	GTCACTTGCT	CCAAGGGTTC	540
ACGGGCTTCA	TCTGTAGCCG	CGAAGAAGCC	GAGATTCTCT	CGGATATGTC	CATCGTCACG	600
GTTGACGATG	CCCTTCGCGT	CGCCGAGGTG	CTCGCCATGA	AAGGAGCGCC	GCTCACGATT	660
GTCACGATGA	GCGAGCTCGG	AGCCGTCTAC	GTCGACCTTC	GCACGAACGA	ACAAGGTCAC	720
GTGCCGACGA	CGAAAGTGAA	AGTTGCCGAC	TCCACAGGCG	CCGGGGjATTC	CTTCTTCTCT	780
GCCGTTATTT	CCGAGCTCAT	GAAAGAGCAT	TCGATTGAAG	ATGCACTTCG	TCTCGGCATG	840
CGTGTCGCCG	GGAAAGTCAT	CGGCTCTCAT	GACAACGGAC	TGACGCCTGA	GATGTATGCT	900
TCACTTGAAC	AACCAACACG	TGAC				924

(2) INFORMACJA DLA SEK. ID. NR 15:

(i) CHARAKTERYSTYKA SEKWENCJI:

i (A) DŁUGOŚĆ: 308 aminokwasów (B) TYP: aminokwas (D) TOPOLOGIA: liniowa (ii) TYP CZĄSTECZKI: białko

	(x)	OPIS SEKWENCJI	: SSE ND NR 01:
Met	Asn	Thr Ile Ala Vvl	Ile Gly Lys Val Phe Val Asp Ile Lly Gly
		5	10 15
Thr	Ser	Phe Ala Pro Ile	His Lly 2Ap Ala Lys Asn Vvl dy Aip Ile
		20	25 33
Ala	Phe	Ser Ais Gly Gly	Thr dy Arg Ain Val ALa Gln Ain Leu dy
		35	40 45
Val	Leu	Gly Am Asp Val	Arg Phe Val Ser Thr Val Thr Am Asp Gln
	50		55 60
Ile	Gly	Ile dy Val Leu	Glu du Leu Arg Ser Leu Asn Val Asn Val
65		70	75 80
Glu	His	Vvl Aip Leu Leu	Glu Asp Asn dy Met Gly Met: Trp Leu Ala
		85	90 95

184 520

Val Met Asp Asn Asn Gly Asp Leu Gln Thr Ser Ile Ser Lys

lln

Pro

100

105

111

Asp

Glu

Ha

Met

Glu

Gln

Ccs

Ile

Ltu

2Ag

Aa:

Ile

AAP

TTh

Vvl

115

110

112

Phe

Ala

Glu

Ser

T^r

Aa

Val

Aa

Ile

Asp

Leu

AAP

Llu

Ser

Vvl

Am

130

135

140

Val

Leu

Am

Glu

Thr

IlT

Hu

Geu

Cu s

Arg

Gilu

Met

Lys

Leu

ery

Llu

145

150

115

160

Tyr

Hy

Val

Cys

Gly

HHs

Leu

Ser

Val

Ite

Glu

Arg

Asn

Arg

His

Leu

165

170

Hii

Leu

Gln

Gly

Phe

Thr

Gly

Phe

Ile

Ccs

Str

Arg

Glu

llu

Alei

Glu

Il<i

180

115

190

Leu

Ser

Asp

Met

Ser

Ile

Val

TTr

Val

Asp

Ala

Leu

Arg

Val

Alei

195

200

205

Hu

Val

Leu

AA a

Met

Lys

Gly

Aa

Pro

Leu

Thr

Ile

Val

Thr

Met

Ser

210

215

225

Hu

Leu

Gly

Ala

Val

Tyr

Val

AAP

Leu

Arg

TTr

Asn

Glu

Gln

Gly

His

225

230

225

240

Val

Pro

Thr

Lys

Val

Lys

Val

ALa

Asp

SSr

Thr

Gly

Ala

Gly

Asp

245

250

225

Ser

Phe

Ser

Ala

Val

Ile

Ser

Glu

Leu

Met

Lys

llu

HHs

Ser

Ile

260

226

270

Hu

Asp

Ala

Llu

AAg

Leu

Gly

Met

Alg

Val

ALa

Gly

Lys

Val

Ile

Gly

275

280

285

Ser

His

Asp

Am

Gil'

Leu

Thr

Pro

Hu

Met

Tyr

Ala

Ser

Leu

Glu

Gln

290 295 300

Pro Thr Arg Asp 305

184 520

Departament Wydawnictw UP RP. Nakład 70 egz. Ceną 6,00 zł.

Claims

Zastrzeżenia patentowe

1. Sposób wytwarzania kwasu 5'-inozynowego lub 5'-guanylowego, znamienny tym, że kontaktuje się stransformowany mikroorganizm mający zdolność reprodukowania ATP, posiadający gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej, z inozyną, guanozyną lub ich prekursorem, źródłem energii i donorem fosforanu, a następnie wydziela się kwas 5'-inozynowy lub kwas 5'-guanylowy.
2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Saccaromyces, Skaphylococcus lub Candida.
3. Sposób według zastrz. 2, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm należący do Corynebacterium ammoniagenes.
4. Sposób według zastrz. 1 albo 2, albo 3, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm, który jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen z Exiguobacterium acetylicum lub Escherichia coli.
5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że stosuje się mikroorganizm, który jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
6. Stransformowany mikroorganizm należący do rodzaju Corynebacterium, Escherichia, Sacharomyces, Skaphylococcus lub Candida mający zdolność reprodukowania ATP posiadający gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
7. Stransformowany mikroorganizm według zastrz. 6, znamienny tym, że jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej posiada gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
8. Stransformowany mikroorganizm według zastrz. 7, znamienny tym, że należy do Corynebacterium ammoniagenes.
9. Stransformowany mikroorganizm według zastrz. 6 albo 7, albo 8, znamienny tym, że jako gen kodujący białko mające aktywność kinazy inozynow-O-guanozynowej posiada gen o sekwencji nukleotydowej nr 1 lub 14 w liście sekwencji.
10. Stransformowany mikroorganizm mający zdolność reprodukowania ATP posiadający gen o sekwencji nukleotydowej nr 10 w liście sekwencji kodujący białko mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
11. Zrekombinowany DNA obejmujący gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
12. Zrekombinowany DNA według zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, podstawiona lub dodana przy zachowanej aktywności białka.
13. Zrekombinowany DNA według zastrz. 11, znamienny tym, że obejmuje gen o sekwencji nukleotydów nr 1 lub 14 w liście sekwencji.
14. Zrekombinowany DNA obejmujący gen o sekwencji nukleotydów nr 10 w liście sekwencji.
15. Białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji mające aktywność kinazy inozynowo-guanozynowej.
16. Białko według zastrz. l5, znamienne tym, że ma sekwencję aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji, w której część aminokwasów jest usunięta, zastąpiona lub dodana przy zachowaniu jego aktywności.
17. Gen kodujący białko o sekwencji aminokwasów nr 2 lub 15 w liście sekwencji.

184 520
18. Gen według zastrz. 17, znamienny tym, że pochodzi z Exiguobacterium acetylicum i ma sekwencję nukleotydów nr 1 w liście sekwencji lub pochodzi z Exiguobacterium aurantiacum i ma sekwencję nukleotydów nr 14 w liście sekwencji.
19. Gen o sekwencji nukleotydów nr 10 w liście sekwencji pochodzący z Escherichia coli.