WO1996030501A1 - Procede de production d'acides nucleiques - Google Patents

Procede de production d'acides nucleiques Download PDF

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WO1996030501A1
WO1996030501A1 PCT/JP1996/000761 JP9600761W WO9630501A1 WO 1996030501 A1 WO1996030501 A1 WO 1996030501A1 JP 9600761 W JP9600761 W JP 9600761W WO 9630501 A1 WO9630501 A1 WO 9630501A1
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WO
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gene
inosine
guanosine
protein
acid
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PCT/JP1996/000761
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Yoshihiro Usuda
Hisashi Kawasaki
Megumi Shimaoka
Takashi Utagawa
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Ajinomoto Co., Inc.
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/52—Genes encoding for enzymes or proenzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/32—Nucleotides having a condensed ring system containing a six-membered ring having two N-atoms in the same ring, e.g. purine nucleotides, nicotineamide-adenine dinucleotide

Definitions

  • the present invention relates to an adenosine triphosphate (DNA) retaining a DNA encoding a protein having an activity of generating 5′-inosinic acid or 5′-guanylic acid from inosine or guanosine.
  • ATP adenosine triphosphate
  • 5'-inosinic acid or 5'-monoguanylic acid used as a seasoning or the like can be converted from inosine or guanosine or a precursor thereof from inosine or guanosine. It relates to a method of manufacturing.
  • the present invention also relates to a novel protein having inosine-guanosine kinase activity, a gene encoding the same, a recombinant DNA containing the gene, and a microorganism transformed therewith.
  • inosine-guanosine kinase gene is only known to exist in some microorganisms, such as Escherichia coli (J. Gen. Microbiol, 135, 1263-1273 (1989)). Met.
  • the present inventors have been developing a more efficient method for producing 5′-inosinic acid and 5′-guanylic acid, and found that a gene encoding inosine-guanosine kinase could be obtained.
  • 5′-inosinic acid and / or 5′-guanylic acid in a simple and high-volume manner by introducing into a microorganism having sufficient ability to regenerate the ATP consumed by the reaction. It has been found that it can be manufactured.
  • a novel inosine-guanosine kinase having an amino acid sequence different from that of inosine-guanosine kinase obtained from Escherichia coli and E. coli was also found. Disclosure of the invention
  • the present invention relates to a method for preparing 5′-inosinic acid or 5′-guanylic acid, which is used in seasonings and the like, is simple and has a high storage capacity from inosine or guanosine or a precursor thereof. It relates to the method of manufacturing. More specifically, the present invention relates to a microorganism having sufficient ability to reproduce ATP sacrificed by the reaction, wherein the inosine and / or guanosine is 5′-inosinic acid and Z or 5 ′.
  • microorganisms for regenerating ATP consumed by the reaction can be separately cultured without allowing the gene to be present in the reaction solution. It is intended to provide a method for obtaining 5′-inosinic acid and Z or 5′-guanylic acid efficiently, easily and with high accumulation in the presence of only a microorganism into which chromic acid is introduced.
  • the present invention can be obtained from a microorganism belonging to Exiguopaterium 'acetylicum, and further comprises converting inosine and / or guanosine to 5'-inosinic acid and Z or 5'-guanylic acid.
  • Novel protein having an activity of converting it into a gene, an it gene encoding it, a recombinant DNA containing the gene, a microorganism transformed therewith, and a 5′-ino using the microorganism.
  • An object of the present invention is to provide a method for producing synic acid and / or 5'-guanylic acid.
  • the novel protein of the present invention is a novel protein having a significantly different amino acid sequence as compared with a protein having a known inosine-guanosine kinase activity.
  • Inosine-guanosine kinase from Escherichia coli is already known.
  • the present inventors have produced a protein having inosine-guanosine kinase activity even in a microorganism belonging to Exiguopaterium, which was not previously known to have inosine-guanosine kinase activity. And isolated it and cloned the coding gene. These proteins differed significantly in amino acid sequence from those known.
  • a transformant obtained by introducing a gene encoding a protein having inosine-guanosine kinase activity into a microorganism capable of regenerating ATP is transformed into inosine or guanosine or a precursor thereof.
  • 5'-Inosinic acid or 5'-Guanylic acid in the reaction mixture by reacting with a body, an energy donor, and a phosphoric acid donor, and collecting it.
  • microorganism capable of regenerating ATP is a microorganism selected from the group consisting of Corynebacterium, Escherichia, Saccharomyces, Staphylococcus, and Candida. Process for producing 5'-inosinic acid or 5'-guanylic acid,
  • a gene encoding a protein having an inosine-guanosine kinase activity is a gene derived from Exiguobacterium acetilicam or a gene capable of hybridizing to the gene;
  • a gene encoding a protein having an inosine-guanosine kinase activity is a gene derived from Escherichia coli or a gene capable of hybridizing to the gene. 5′-inosinic acid or any of the above (1) to (3) 5'-Guanylic acid production method,
  • (6) a transformant obtained by introducing a gene encoding a protein having inosine-guanosine kinase activity into a microorganism capable of regenerating ATP;
  • the microorganism capable of regenerating ATP is a microorganism selected from the group consisting of the genus Corynebacterium, the genus Escherichia, the genus Saccharomyces, the genus Staphylococcus and the genus Candida. ), A transformed strain,
  • the gene encoding a protein having an inosine-guanosine kinase activity is a gene derived from Exibacterium acetylicum, or a gene capable of hybridizing to the gene; (6) the transformed strain of any of (8),
  • a gene encoding a protein having an inosine-guanosine kinase activity is a gene derived from Escherichia coli or a gene capable of hybridizing to the gene.
  • a recombinant DNA comprising a gene capable of replicating in C. ammogenes and encoding a protein having an inosine-guanosine kinase activity;
  • Inosin a gene encoding a protein having guanosine kinase activity is derived from Exibacterium acetylicum, or a gene capable of hybridizing to the gene.
  • the recombinant DNA of the above (11) is derived from Exibacterium acetylicum, or a gene capable of hybridizing to the gene.
  • a gene encoding a protein having inosine-guanosine kinase activity is a gene derived from Escherichia coli, or a gene capable of hybridizing to the gene.
  • the phosphate group at the 7 "position of a nucleoside triphosphate transfers to another nucleoside.
  • the Km value is 0.03 mM for guanosine
  • the inosine-guanosine kinase referred to in the present invention undergoes a reaction to generate 5′-inosinic acid and 5′-guanylic acid by phosphorylating inosine and guanosine with ATP or the like.
  • It is an enzyme that catalyzes, and its origin is not particularly limited, but those derived from microorganisms are preferable, and not only novel enzymes obtained from microorganisms belonging to Exiguobacterium acetylicum, but also Escherichia coli. It also includes the known inosine-guanosine kinase obtained from E. coli.
  • a novel protein which can be obtained from a microorganism belonging to Exiguobacterium acetylicum or the like and which has an inosine-guanosine kinase activity of the present invention is Exiguobacterium acetylicum. And the obtained cells can be crushed to obtain a crude enzyme extract, which is then purified to obtain a crude enzyme extract.
  • these microorganisms include:
  • the taxonomic excibacterium acetilicum was previously called Brevibacterium acetilicum (Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, P. 1301-1313 (1986)). However, it has been proposed from the results of the gene analysis that they be transferred to the genus Exiguobacterium as Exiguobacterium acetilicam (Int. J. Syst. Bacteriol. 44, 74-82 ( 1994)).
  • the method for purifying inosine-guanosine kinase is based on inosine-guanosine kinase activity. Any method can be used as long as it does not lose its properties, but purification using liquid column chromatography is common. Specifically, ion exchange column chromatography using a concentration gradient with potassium chloride, hydrophobic column chromatography using an ammonium sulfate concentration gradient, and adsorption column chromatography using a phosphate buffer concentration gradient K May be used in combination as appropriate.
  • the enzyme of the present invention which can be obtained from a microorganism belonging to Exiguobacterium acetylicum or the like and has an inosine-guanosine kinase activity, has the following properties.
  • Phosphoric acid donors are nucleoside triphosphates, such as ATP, 2'-dexoxydenosine triphosphate, guanosine triphosphate, 2'-deoxyguanosine triphosphate, thymidine Gin triphosphoric acid and the like can be mentioned.
  • nucleotide to which the phosphate group is transferred examples include inosine, guanosine, 2'-deoxyguanosine and the like.
  • the 5'-monophosphate of a nucleoside is the 5'-monophosphate of the above-mentioned nucleoside, for example, 5'-inosinic acid, 5'-guanylic acid, 2'-dexoxy. 5'-guanylic acid and the like.
  • Nucleoside triphosphates include adenosine triphosphate ( ⁇ ), 2'-deoxyadenosine triphosphate, guanosine triphosphate, and 2'-deoxyguanosine triphosphate. And thymidine triphosphate.
  • nucleosides to which the phosphate group is transferred include inosine, guanosine, 2'-deoxyguanosine and the like.
  • the optimal pH is pH 7.7-9.9. 4. pH stability
  • the activity is stable in the pH range of 6.7-12.1.
  • the optimal temperature is 30-50 ° C.
  • Metal ions are necessary for the progress of the reaction, and the progress of the reaction is observed with magnesium ions, manganese ions, conorate ions, or iron ions.
  • the Km value is 0.03 mM for guanosine, 1 mM for inosine, and 1.6 mM for ATP when guanosine is used as a substrate.
  • 5 DS- is a polyacrylate about 36 Kirodaruto down Ri by the Rua Mi Dogeru electrophoresis £
  • a DNA fragment containing a structural gene encoding a protein having inosine-guanosine kinase activity can be obtained by a known method using the purified protein. For example, a method for preparing an antibody against the protein and searching for a chromosome gene expression library, analyzing the amino acid sequence of a purified protein, and preparing a probe based on the amino acid sequence based on the amino acid sequence. There is a way to explore.
  • the amino acid sequence in addition to the N-terminal sequence, an internal amino acid K sequence determined from a fragment obtained by digestion with an appropriate protease can be used.
  • an oligonucleotide synthesized from the N-terminal amino acid sequence or the internal amino acid sequence, or an oligonucleotide prepared in the N-terminal amino acid S sequence or the internal amino acid sequence can be used.
  • the region corresponding to the polymerase, chain, and reaction (PCR) method used as a primer Based on the sequence of the gene, the N-terminal amino acid sequence and the internal amino acid sequence ae were used to synthesize primers for each oligonucleotide, and the gene region extending from the N-terminus to the inside was converted to pcR. Amplified by the method can be used.
  • the chromosome is linked to a double-stranded oligonucleotide, called a nucleic acid, and synthesized based on the oligonucleotide primer and cassette sequences synthesized based on the N-terminal amino acid sequence.
  • a method of obtaining the target fragment by PCR using the obtained primer Molecular and Cellular Probes, 6, 467 (1992)). More specifically, a gene encoding a protein having the inosine-guanosine kinase activity of exiguobacterium acetylicum is obtained by PCR of a DNA fragment corresponding to the region from the N-terminal amino acid sequence.
  • the primers are synthesized based on the amplified DNA, and can be obtained by PCR using a cassette.
  • the protein of Exiguobacterium acetylene is a known inosine-protein described in W091Z08286 obtained from Escherichia coli. It is a protein completely different from that of guanosine kinase.
  • the chromosome of a microorganism belonging to Exiguobacterium acetylicum is used as a type I, and a PCR method is performed using a primer synthesized based on the N-terminal amino acid sequence described above.
  • the gene encoding the N-terminal amino acid S-sequence portion of the protein having inosine-guanosine kinase activity is specifically amplified and cloned.
  • Primers satisfy the conditions that the base composition is random, the G + C content is around 50%, no special secondary structure is formed, and they are not complementary to each other. Usually, 16 to 30 bases are often used.
  • the structure of the primer is located at both ends of the N-terminal amino acid ffi row, and specific examples thereof include those shown in Column Nos.
  • the sixth nucleotide is T and C
  • the ninth nucleotide is A and G
  • the second nucleotide is T, C and ⁇ , 15
  • the nucleotides of the eye are a mixture of T, C, A and G.
  • the 3rd and 12th nucleotides are T and J
  • the 6th nucleotide is T, C, A and G
  • the 9th and 15th nucleotides Is a mixture of A and G.
  • the chromosome of the microorganism belonging to Exiguobacterium acetylicum is cut with an appropriate restriction enzyme, the cut product and the cassette are ligated into type I, and the N-terminal amino acid sequence is removed.
  • DNA containing the structural gene portion of a protein having inosine-guanosine kinase activity or its upstream region by PCR using a primer synthesized based on the sequence of the gene to be coded and a primer based on the cassette. Specific amplification and cloning of the fragment. Any primer can be used as long as it satisfies the above conditions. Specific examples include those shown in SEQ ID NOs: 6 and 7 in the Sequence Listing.
  • the vector used for cloning the gene may be any vector that can autonomously replicate in Escherichia coli used as a host.
  • Escherichia coli used as a host.
  • pHUC19, pHSG298, pHSG398, pHBR322 and the like are used.
  • any strain can be used as long as it is suitable for vector replication.
  • DH5 a vector that can autonomously replicate in Escherichia coli used as a host.
  • nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the vector By determining the nucleotide sequence of the DNA fragment inserted into the vector, the nucleotide sequence of the inosine-guanosine kinase gene present on the DNA fragment and the protein encoded by it are determined.
  • the amino acid sequence can be determined.
  • the nucleotide S sequence and amino acid sequence of the inosine anosine kinase of Exibacterium acetylicum ATCC953 thus identified are shown in SEQ ID NOs: 1 and 2, respectively.
  • This protein consists of 303 amino acids and has a molecular weight of about 32.5 kilodaltons.
  • the protein of the present invention is not limited to SEQ ID NO: 2 in the sequence listing, Other natural mutants can be obtained as long as they can be obtained from a microorganism belonging to P. acetimilicum and have inosine-guanosine kinase activity.
  • the amino acid sequence may be partially substituted or partially deleted. It is obvious to those skilled in the art that they may be those obtained by further adding an amino acid thereto, or that the proteins may be partially modified.
  • it encodes inosine-guanosine kinase, it can hybridize with the arrested child in place of the exogenous gene derived from Exibacterium acetylicum. Children can also be used.
  • Genes that can hybridize with genes derived from Exiguobacterium acetylicum can be obtained from the following strains.
  • Such a gene can be obtained by a known method utilizing homology, and specifically, the method described below can be used.
  • the chromosome DNA of the above microorganism is cut with an appropriate restriction enzyme, and agarose gel electrophoresis is performed.
  • the digested fragment is blotted into an appropriate transcription filter, and the inosin-guanosine kinase gene derived from excibacterium acetylicum is used as a probe in the Southern hybridization method. Detect more homologous fragments and determine size.
  • the fragment of the desired size is purified from the fragments cut with the restriction enzyme.
  • purification methods include sucrose density gradient centrifugation, and recovery from agarose gel using glass powder.
  • the purified fragment is ligated into an appropriate vector and transformed into a yeast: ⁇ : H. Coli strain. From these transformants, a strain having a fragment containing the target inosine-guanosine kinase gene can be selected by the colony hybridization method.
  • a gene encoding a known inosine-guanosine kinase can be used in place of the gene encoding the novel inosine-guanosine kinase.
  • Known inosine-guanosine kinase genes include those derived from Escherichia coli (J. Gen. Microbiol., 135, 1263-1237 (1989)). It can be obtained from the following strains.
  • the S gene encoding a known inosine-guanosine kinase is a force that can be obtained by a known method; the Escherichia coli ATCC 273 25 can be obtained by the method described below.
  • a gene encoding inosine-guanosine kinase that can be used in the present invention can also be obtained from the chromosome DNA of the present invention.
  • a primer is synthesized based on the sequence of the inosine-guanosine kinase gene derived from Escherichia ⁇ coli shown in the sequence listing ⁇ column No. 10 (WO91Z08286).
  • Primers have a random base composition, a G + C content of around 50%, do not form a special secondary structure, and are not complementary to each other. Those with 16 to 30 bases are often used.
  • the K line of the primer is located at both ends of the inosine monoguanosine kinase structural gene, and specific examples thereof include those shown in SEQ ID NOs: 11 and 12 in the sequence listing.
  • the inosin-guanosine kinase construct gene was synthesized from the primer and Escherichia coli chromosomal DNA by the polymerase chain reaction (PCR) method.
  • PCR polymerase chain reaction
  • the vector a vector derived from Escherichia coli, for example, pUC19, pBR322 or the like is used.
  • any strain can be used as long as it is suitable for vector replication.
  • Escherichia coli such as HB101, JM109> DH5, etc. Li strains are used.
  • a plasmid into which a DNA fragment containing the inosine-guanosine kinase gene of Escherichia coli is obtained.
  • inosinosine kinase kinase As long as the inosinosine kinase kinase is coded, it has homology to the gene derived from Escherichia coli as in the case of exiguobacterium acetylicum. Alternatively, a gene that can be hybridized can be obtained and used.
  • the DNA fragment containing the gene encoding the protein having the inosine-guanosine kinase activity obtained as described above was recombined into another appropriate vector or inserted into the replication origin, and then subjected to ATP production. Is introduced into a host cell having
  • ATP-producing bacterium a microorganism having sufficient ability to regenerate ATP consumed by the reaction from an ATP precursor (referred to as ATP-producing ability or ATP-reproducing ability). Or ATP regenerating bacteria).
  • the microorganism capable of regenerating ATP as referred to in the present invention is sacrificed by a reaction that converts inosine and Z or guanosine to 5′-inosinic acid and Z or 5′-guanylic acid.
  • a reaction that converts inosine and Z or guanosine to 5′-inosinic acid and Z or 5′-guanylic acid.
  • the microorganism that has the ability to regenerate ATP from the ATP precursor in the reaction system and allow the reaction to proceed.
  • Examples of the microorganism include Corynebacterium, Escherichia, and Staphylococcus. Microorganisms belonging to the genera Roccocus, Saccharomyces, or Candida can be mentioned. In particular, microorganisms belonging to Corynebacterium ammoniagenes having high ATP regeneration ability are preferably used. In addition, C. coligenum's ammoniagenes has been previously classified as Brevibacterium's ammoniagenes.
  • microorganisms having ATP regeneration ability used in the present invention include the following strains and mutants derived therefrom.
  • Corynebacterium ammoniagenes (former name: Brevibacterium ammoniagenes) A T C C 6872
  • Corynebacterium ammonia ammonia (former name: Brevipactium 'Ammoniagenes) AT CC 2 1 2 9 5 Coli Nepterium Ammoniagenes (former name: Brevipacterium Ammoniagenes) ATCC 2 1 4 7 7
  • Corynebacterium guru mimic ATCCC1 3020
  • ALPCC Glutamicum (former name: Brevibacterium flavum) A T C C 1 4 06 7
  • Corynebacterium glutamicum (former name: Brevibacterium lactoflumentum) A T C C 13 869
  • Candida-cyclofila (former name: Torulopsis cyclofiler) ATCC 221 6 3 Furthermore, as microorganisms having ATP regenerating ability, there are inosin and no or guanosine degrading activity. Weak or missing ones are desirable. As an example of such a microorganism, among the above microorganisms,
  • an ATP-regenerating bacterium capable of producing inosine or guanosine from an inosine or guanosine precursor together with ATP regenerating ability can also be used.
  • 5′-inosinic acid or 5′-monoguanylic acid can be produced from these precursors instead of inosine or guanosine.
  • examples of such precursors include sugars such as glucose, sucrose, molasses, and starch hydrolysate, organic acids such as acetic acid, and alcohols such as glycerol and ethanol.
  • ATP regenerating bacteria capable of producing inosine or guanosine include: Coli Nepterium Ammoniagenes ATCC 2 1 4 7 8
  • Escherichia coli When Escherichia coli is used as an ATP regenerating bacterium, for example, ColEl-based plasmid, P15A-based plasmid, R-factor-based plasmid, F-factor-based plasmid, or phage System plasmid or the like can be used.
  • ColEl-based plasmid P15A-based plasmid, R-factor-based plasmid, F-factor-based plasmid, or phage System plasmid or the like
  • PBR322 Gene, 2, 95 (1977)
  • pUC19 Gene, 33, 103 (1985)
  • pACYC184 J. Bacteriol, 134, 1141 (1978)
  • pSC101 Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 70, 3240 (1973)
  • Saccharomyces cerevisiae When Saccharomyces cerevisiae is used as the ATP-reproducing bacterium, YEp ⁇ plasmid, YCp-based plasmid, YRp-based plasmid, YLp-based plasmid, or the like can be used. Specifically, YEp24, YRp7, YCp50 and the like can be mentioned. When Staphylococcus aureus is used as an ATP regenerating bacterium, pRIT5 (EMBO J., 4, 1075 (1985)) and the like can be used.
  • the promoter sequence and the SD sequence may be placed S upstream of the gene encoding inosine-guanosine kinase.
  • the method for introducing these sequences is not particularly limited, but using a vector having a promoter sequence and an SDS sequence, A method of inserting the gene downstream of those sequences, or a promoter and s
  • a method of synthesizing the sequence D and inserting it upstream of the gene can be used. There is no particular restriction on the promoter sequence and SD sequence.
  • A. When using C. lipolyticum bacteria as regenerating bacteria, tac, lac, and trp promoters derived from Escherichia coli Alternatively, a trp promoter derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium (Gene, 53, 191 (1987)), an fda promoter (Mo and Microbiol., 3, 1625 (1989)), a ppc promoter (Gene, 77 , 237 (1989)), 1 ysC promoter (Mo 1.
  • the spa promoter U. Bacteriol., 159, 713 (1984)
  • the recombinant DNA containing the gene encoding the protein having the activity of converting the inosine and / or guanosine of the present invention to 5′-inosinic acid and Z or 5′-guanylic acid can be converted to ATP.
  • the method of introducing the microorganism into a microorganism having the above and it can be carried out by a usual method. For example, when a C.
  • the protoplast method Japanese Patent Application Laid-Open No. 57-189379
  • the compress-air perforation method Japanese Patent Application Laid-Open No. 2 0 7 7 9 1
  • Escherichia coli is used as the ATP-regenerating bacterium
  • the calcium chloride method J. Mol. Biol., 53, 159 (1970)
  • the Hanahan method J. MoI. Bioi., 166) , 557 (1983)
  • SEM method Gene, 96, 23 (1990)
  • Chung et al. Method Pro Nat I. Acad. Sc.
  • Bacillus subtilis there is a method for preparing a recombinant cell from cells at the stage of culture and introducing DNA (H. Gene, 1, 153 (1977)). is there Alternatively, as is known for Bacillus subtilis, actinomycetes, and yeast, the cells of the DNA recipient are transformed into protoplasts or spheroplasts that readily take up the recombinant DNA, and the recombinant DNA is transformed into the DNA recipient. How to introduce (Mole Gen. Genet ...
  • Saccharomyces cerevisiae is used as an ATP-regenerating bacterium, the spore mouth method (Acad. Sci. USA, 75, 1929 (1978) for Pro Nat), the lithium nitrate method (J, Bacterio, 153, 163 (1983)), electroporation
  • Methods in Enzyraology can introduce a recombinant gene.
  • Staphylococcus aureus is used as an ATP regenerating bacterium
  • the recombinant gene can be introduced by the protoplast method (Plasmid, 5, 292 (1981)).
  • the protoplast method the ability to obtain a sufficiently high frequency even by the method used in Bacillus subtilis described above; as disclosed in JP-A-57-183799, A method in which DNA is taken in a state in which protoplasts of bacteria belonging to the genus Bacteria are brought into contact with one of polyethylene glycol or polyvinyl alcohol and a divalent metal ion can also be used.
  • DNA uptake can be promoted by adding carboxymethylcellulose, dextran, polyester, or Pull-Nick F68 (manufactured by Selva). .
  • Recombinant DNA can also be introduced into recipient bacteria by the electric pulse method (see Japanese Patent Application Laid-Open No. 2-27971).
  • the transformation method used in Examples of the present invention is an electric pulse method.
  • the inosine-guanosine kinase gene may be integrated into the chromosomal DNA of a microorganism capable of regenerating ATP.
  • the plasmid vector may contain a temperature-sensitive replication origin derived from a bacterium belonging to the genus Corynebacterium, an inosine-guanosine kinase gene, chloramphenicol, or the like.
  • a recombinant DNA is prepared by inserting a marker resistant to the drug, The recombinant DNA is used to transform a bacterium belonging to the genus Corynepacteria. Subsequently, by culturing the transformant in a medium containing the drug and at a temperature at which the temperature-sensitive replication origin does not function, a transformant in which the recombinant DNA is integrated into the chromosomal DNA is obtained.
  • the transformant of the present invention into which the gene encoding the protein having inosine-guanosine kinase activity thus obtained was introduced was transformed into a carbon source, a nitrogen source, inorganic salts, and if necessary, an organic trace. Inosine-guanosine kinase activity can be expressed at a high level by culturing in a normal medium containing nutrients.
  • saccharides such as glucose, sucrose, molasses, and starch hydrolysate
  • organic acids such as acetic acid and citric acid, and alcohols such as ethanol
  • alcohols such as ethanol
  • Urea ammonium salt, aqueous ammonia, ammonia gas, etc.
  • inorganic salts phosphates, potassium salts, magnesium salts, iron salts, manganese salts and the like are used.
  • amino acids, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and other peptones, yeast extracts, and soybean protein hydrolysates containing these substances are used.
  • the cultivation is carried out under aerobic conditions at a temperature of 25 to 37 ° C and a pH of 5 to 9 for 10 to 40 hours.
  • confirm the titer by measuring the inosine-guanosine kinase activity generated in the culture solution.
  • the cells recovered from the culture by operations such as centrifugation were crushed by sonication, French press, etc., and then centrifuged to remove the cell residues and reduced by gel filtration. It can be carried out by the method described in Mole Gen. Genet. 143, 85-91 (1975) or the like using a substance from which a molecular substance is removed.
  • a culture of a microorganism having the ability to biosynthesize ATP from the ATP precursor thus obtained and having a gene encoding inosine-guanosine kinase said culture Contacting the isolated cells or the processed product of the cells with inosine or guanosine or their precursors, an energy donor and a phosphoric acid group donor.
  • an energy donor and a phosphoric acid group donor e.g., 5'-inosinic acid or 5'-guanylic acid can be produced in the reaction solution.
  • the cells can be separated from the culture by a centrifuge or the like. Examples of the processed cells include acetate-treated cells, immobilized cells, and crushed cells. Are mentioned. The following can be mentioned as the material preferably used in the present invention.
  • sugars such as glucose, sucrose, waste sugar, and starch hydrolyzate, organic acids such as acetic acid, and alcohols such as glycerol and ethanol are used. You.
  • sugars such as glucose, sucrose, starch hydrolyzate, molasses, etc.
  • organic acids such as sulfuric acid, citric acid, and alcohols such as ethanol are used.
  • Examples of the phosphoric acid donor include inorganic phosphoric acids such as orthophosphoric acid, pyrrolic acid, polyphosphoric acid, tripolyphosphoric acid, polymetaric acid, and hexametaric acid.
  • inorganic phosphoric acids such as orthophosphoric acid, pyrrolic acid, polyphosphoric acid, tripolyphosphoric acid, polymetaric acid, and hexametaric acid.
  • organic phosphoric acids such as fu-x-n-linic acid, acetyl-phosphoric acid, and rubamyl-phosphoric acid can be used.
  • the efficiency of the reaction may be improved by adding an ATP precursor, a surfactant, a metal ion, or the like to the reaction solution.
  • ATP precursor examples include adenosine diphosphate, adenylate, adenosine, adenine, adenine mineral acid, and a hydrolyzed solution of ribonucleic acid.
  • the surfactant may be cationic, anionic or amphoteric, as long as it promotes the phosphorylation of inosine or guanosine.
  • metal ions magnesium ions, manganese ions and the like are appropriately used.
  • JP-A-63-230094, WO 91 Z08286 In this reaction system, the reaction proceeds efficiently even when no organic solvent is added.
  • the reaction is carried out under aerobic conditions for 10 to 30 hours at a temperature of 25 to 37 while controlling the pH to 6 to 8-After the reaction is completed, 5'-a formed in the reaction solution Nosinic acid or 5'-guanylic acid can be collected by methods such as ion exchange resin treatment and crystallization.
  • Example 1
  • inoguanosine kinase gene Amplification and cloning of innoguanosine kinase gene by PCR method
  • the inosine-guanosine kinase gene derived from Escherichia coli is located at both ends of the gene, and the restriction enzymes Pst1 and Pst1, respectively.
  • the oligonucleotides shown in SEQ ID NOS: 11 and 12 having a Hind cleavage site were synthesized by a phosphoramidite method using a DNA synthesizer (Model 394, manufactured by Applied Biosystems).
  • oligonucleotide as a primer and Escherichia coli prepared by the method of Saito and Miura (Biochera. Biophys. Acta., 72, 619, (1963)).
  • 0.1 g of the chromosomal DNA of H3 coli W3110 (ATCC27325) and 2.5 units of tack DNA polymerase (Takara Shuzo) were added to dATP, dCTP, d GT P, d TTP 200 / M each, 50 mM potassium chloride, 5 mM magnesium chloride, and 0.001% gelatin containing l O mMN— tris (hydroxymethyl) methyl-2-aminoaminoethane Tris)
  • Add 0.1 ml of monohydrochloric acid buffer (pH 8.3) to 30 ml at 94 ° C for 30 seconds, 55 ° C for 30 seconds, 72 ° C Was repeated 25 times for 30 seconds, and a PCR method was performed.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the target DNA fragment was recovered using glass powder (Takara Shuzo). Approximately 2 wg of the DNA fragment and 20 units of each of the restriction enzymes PstI and Hind each containing 50 mM of 100 mM magnesium chloride, 100 mM of sodium chloride and 50 mM of dithiothreitol were used. It is mixed with a mM tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) and reacted at a temperature of 37 for 2 hours to obtain a digested solution.
  • PstI and Hind each containing 50 mM of 100 mM magnesium chloride, 100 mM of sodium chloride and 50 mM of dithiothreitol were used. It is mixed with a mM tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) and reacted at a temperature of 37 for 2 hours to obtain a digested solution.
  • Plasmid PHSG298 (Takara Shuzo) DNA ⁇ ug and restriction enzymes PstI and HindIH20 units were treated with 1 OmM magnesium chloride, 100 Mm sodium chloride and ImM dithiothreitol. Was mixed with a 50 mM Tris-hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5), and reacted at 37 ° C. for 2 hours. The reaction-terminated liquid was subjected to phenol extraction by a conventional method and ethanol precipitation to obtain a plasmid pHSG298 digested with PstI and Hindffl.
  • the Pst I and Hind digested PHSG298 was digested with 0.1 lwg, Pst I and Hind ffl-digested PCR fragments 0.5 ⁇ g and T4 DNA ligase 1 unit ( Takara Shuzo Co., Ltd.) was added to a 66 mM tris-hydrochloric acid buffer ( ⁇ 6.7.5) containing 6.6 mM magnesium chloride, 10 mM dithiothreitol, and 10 mM ATP. For 8 hours to ligate the DNA. Next, the DNA mixture was used to transform Escherichia coli XR.
  • Coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) by a conventional method, and this was transformed into an L agar medium containing 100 g / m1 kanamycin. Seed above, to obtain a transformant.
  • Escherichia * coli 1 "Insertion of promoter Sequences having restriction sites BamHI and PstI at the 5'-end and 3'-end, respectively.
  • the oligonucleotide shown in SEQ ID NO: 13 and the oligonucleotide having a complementary sequence are shown in SEQ ID NO: 13. I was done. After 1 g of each of the obtained oligonucleotides was mixed, the mixture was treated for 100 and 5 minutes, and then gradually cooled to anneal.
  • This oligonucleotide solution and BamHI20 units were added to a 20 mM tris-hydrochloride buffer (pH 8) containing 1 OmM magnesium chloride, 100 Mm lithium chloride and 1 mM dithiothreitol. Each mixture was mixed at 5) and reacted at a temperature of 30 ° C for 2 hours to obtain a digested solution, which was extracted with phenol and precipitated with ethanol. The obtained precipitate was digested with the same method as in the above (1), and the digested solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation. Thus, a DNA fragment containing the Escherichia coli trp promoter digested with BamHI and PstI was obtained.
  • the recombinant plasmid pIGK-1 lg containing the inosine guanosine kinase gene obtained in (1) above was similarly digested with BamHI and PstI, and the reaction-terminated solution was digested by a conventional method. (4) The mixture was subjected to ethanol extraction, ethanol precipitation, and a plasmid digested with TBamHI and PstI was obtained.
  • Plasmid DNA was prepared from the resulting transformant by the alkaline lysis method and subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method, whereby the plasmid PIGK-1 was added to the Escherichia coli trp promoter DNA.
  • a recombinant plasmid containing the fragment was selected and named pIGK-2.
  • the inosine guanosine kinase gene and trp promoter obtained in (2) above One gram of the recombinant plasmid PIGK-2 lg was digested with BamHI using the reaction composition described in the above item (2), subjected to phenol extraction, and ethanol precipitated. Brassmid p IGK-2 digested by BamHI digestion was used to prevent recombination, using Molecular Cloning 2nd edition (J. Sanbrook, EF Fritsc and T. Man itis, Cold Spring Harbor Laboratory Press, pi.60 (1989)), the DNA fragment was dephosphorylated by bacterial alkaline phosphatase treatment, and was subjected to ethanol extraction and ethanol precipitation.
  • plasmid PHC4 obtained by inserting a region containing an origin of replication derived from C. glutamicum into pHSG39 (Takara Shuzo) (Japanese Patent Application Laid-Open No. 5-7491). Add 1 g and 10 units of KpnI restriction enzyme to 10 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 10 mM magnesium chloride and I mM dithiothreitol, and incubate at 37 for 2 hours. Then, the solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation.
  • This KpnI-cleaved pHC4 was blunt-ended using the DNA Blunting Kit (Takara Shuzo) according to the designated method, followed by phosphorylated BamHI linker (Takara Shuzo). ) was ligated using T4 polynucleotide ligase. As a result, a DNA fragment having a BamHI cleavage site on each side of the region containing the replication origin of the plasmid derived from C. glutamicum was obtained. This DNA fragment and 20 units of BamHI were mixed in the buffer described in (2) above, and reacted at a temperature of 30 ° C for 2 hours. The reaction solution was extracted with phenol and precipitated with ethanol.
  • One unit of gauze (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) was mixed in the buffer solution described in the above (1), and reacted at a temperature of 16 ° C for 8 hours to link DNA.
  • Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo) was transformed with the DNA mixture, and this was spread on an L agar medium containing 100 / g / m1 kanamycin. A transformant was obtained.
  • Plasmid DNA was prepared from the resulting transformant by the alkaline lysis method and subjected to agarose gel electrophoresis according to a conventional method, whereby a DNA fragment capable of autonomously replicating in the bacterium PIGK-2 in the corynepacterium was obtained. Including recombinant plasm And named it PIGK-3.
  • Escherichia coli J12616-17 which holds plasmid pHC4, is located at 1-1-1 Tsukuba East, Ibaraki, Japan (zip code: 3005). Biotechnology Deposited at the National Institute of Advanced Industrial Science and Technology under the accession number FE RM P-122-215 on April 24, 1991, and based on the Bush-West Treaty on August 26, 1991 The deposit has been transferred and given the accession number FE RM BP—3 5 3 2
  • the pi GK-30.lwg obtained in (3) was subjected to a conventional method of transformation using the electric pulse method (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 2 (1990) -7971), and the lines and patterms were used.
  • Ammonigenes ATCC was introduced into ATCC 214777. This was spread on an agar medium consisting of 1% polypeptone, 1% yeast yeast, 5% sodium chloride, 0.5% glucose, and 50 UE / m1 kanamycin. 1 4 7 7 / p IGK-13 was obtained.
  • the cells were suspended in a 0.9% aqueous sodium chloride solution and centrifuged twice to wash the cells.
  • the cells were suspended in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.9) containing 20% glycerol, 100 mM rhodium chloride, and 5 mM 2-mercaptoethanol. After sonication (Kubota) for 20 minutes at W, the mixture was centrifuged at 1500 rpm for 30 minutes to obtain the supernatant. This is Sef Index G-25 (manufactured by Pharmacia) was subjected to column chromatography, from which low molecular weight substances were removed to obtain a crude enzyme solution.
  • the inosine-guanosine kinase activity of the obtained crude enzyme solution was determined to be 10 OmMTris, 10 mM magnesium chloride, 1 mM ATP, 250 mM potassium chloride, 0.2 mM [8- "C"
  • silica gel plate Merck
  • n-butanol, ethanol and Water was developed with a developing solution having a volume ratio of 2: 1: 1, respectively.
  • Spots of 5'-inosinic acid were detected and quantified using a bio-image analyzer (Fuji Photo Film Co., Ltd.).
  • the protein concentration of the enzyme solution was measured using a protein assay kit manufactured by Bio-Rad, Inc. using serum albumin as a standard, and the specific activity of the enzyme was calculated. 4 Transformant AT CC 2 1 4 77Zp HK 4 The specific activity was determined, and the results are shown in Table 1. No activity was detected in ATCC 214777Zp HK4, whereas high activity was observed in ATCC214777Zp IGK-3. The results showed that the introduced fragment derived from Escherichia coli X. coli expressed inosine-guanosine kinase activity in Corynebacterium ammoniagenes. .
  • Plasmid P HK4 had a structure in which the trp promoter and the inosine monoguanosine kinase gene were removed from pIGK-3, and was used as a control.
  • the strain in which pHK4 was retained in HB101 in Escherichia coli was named AJ13136 and was 1st Higashi 1-chome, Tsukuba, Ibaraki, Japan, dated August 1, 1995. No. 1 (postal code 305) Deposited internationally under the Budapest Treaty with the Institute of Biotechnology and Industrial Technology, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, and given the accession number FE RM BP—5 186.
  • Strain specific activity (nmo 1 / min / mg protein)
  • Example 2 Production of 5'-inosinic acid from inosine using inosine-guanosine kinase ⁇ gene transfer strain derived from Escherichia coli
  • 450 m 1 was inoculated with colinone, 'Cterium-ammoniumgenes ATCCC214777 / pIGK-3, and cultured at 32 ° C for 24 hours to obtain a culture.
  • the culture was centrifuged at 7,000 rpm for 10 minutes to obtain 20 g of wet cells as a precipitate.
  • the obtained bacterial cells were treated with inosine 50 g / l, potassium dihydrogen phosphate 20 g / l, glucose 30 g Z], magnesium sulfate 5 g1, phytic acid (50% by weight) 1 Reaction solution (pH 7.2) consisting of OgZl, Nymein S—2 1 5 4 g / adeninelgZl (200 mL / 20 ml)
  • the reaction was carried out at a temperature of ° C.
  • the pH was appropriately adjusted to 7.2 using 4 N sodium hydroxide, and a reduced amount of potassium dihydrogen phosphate was added as appropriate.
  • ATC C214777 ZPHK4 was reacted, and after 30 hours of reaction, 5'-inosinic acid in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography. Table 2 shows the results.
  • 5'-Inosinic acid accumulation value is shown in terms of 5'-indium sodium inosinate heptapentahydrate equivalent.
  • the results show that ATC C214777 / p IGK-3, which carries the inosine-guanosine synthase gene from Escherichia coli, is 5'-inosinic acid from inosine. Conversion to was seen.
  • Table 2
  • Example 3 Production of 5'-inosinic acid from inosine using inosine-guanosine kinase-gene retention from Escherichia coli
  • Example 2 The cells obtained in Example 2 were inoculated with 60 g Zl of inosine, 20 g Zl of potassium dihydrogen phosphate, 3 g of glucose, 5 g of magnesium sulfate, and 1 g of phytic acid (weight ratio). (5 0%) 10 g no 1, Nymeen S— 2 1 5 4 g / Adenine 1 g / 1 Reaction solution (PH 7.2) Suspend in 50 ml to 200 ⁇ 1 and aerate. While stirring
  • the mixture was adjusted by adding 4 N sodium hydroxide, and the reduced amount of dihydrogen phosphate phosphate was appropriately added.
  • the accumulated value after 22 hours of reaction was 113.8 g / 1, and the molar yield based on the added inosine was about 100%.
  • Example 4 Production of 5'-guanylic acid from guanosine using inosin-guanosine kinase derived from Escherichia coli / H. Coli and gene transfer)
  • the cells were suspended in 10 ml of lOOmM-tris-hydrochloric acid buffer (pH 7.5) (buffer A) containing lOOmM calcium chloride and ImM dithiothreitol, and the diameter of the suspension was reduced to 0 ml.
  • buffer A lOOmM-tris-hydrochloric acid buffer
  • a glass bead of 1 mm was added and crushed with a bead beater (Biospec).
  • the crushed liquid was centrifuged at 15,500 rpm for 10 minutes, and the supernatant was dialyzed with the same buffer to obtain about 20 ml of a crude enzyme extract.
  • the inosine-guanosine kinase activity of the crude enzyme extract was measured by the following method.
  • the spot of 5'-inosinic acid is detected and determined using a bio-image analyzer (FU JIX)! :did.
  • the protein concentration of the crude enzyme solution was measured using a protein assay (manufactured by Bio-Rad, Inc.) using serum albumin as a standard to calculate the specific activity of the enzyme.
  • the crude enzyme extract showed inosine / guanosine kinase activity of 0.445 nmol / iin / ng protein.
  • the resulting supernatant was applied to a butyl toyopearl (Toyo Soda) column equilibrated with buffer A containing 30% ammonium sulfate. After washing with the same buffer, a protein having inosine-guanosine kinase activity was eluted with a linear concentration gradient K of buffer A containing 200 ml of 30% to 15% ammonium sulfate. Approximately 15 ml of the obtained active fraction was subjected to 25 mM tris-HCl buffer containing 21 mM mM chloride, ImM dithiothreitol and 20% glycerol.
  • nucleoside triphosphate selected from the group consisting of 2'-deoxyadenosine triphosphate, guanosine triphosphate, 2'-deoxyguanosine triphosphate and thymidine triphosphate
  • a phosphate donor a phosphate group is transferred to a nucleoside selected from the group consisting of guanosine, inosine and 2'-deoxyguanosine, each of which is 5'-guanylic acid 5'-Inosinic acid and 2'-Doxy-5'-Guanylic acid to form 5'-monophosphate esters of nucleotides selected from the group consisting of:
  • Table 4 shows the results obtained by conducting a reaction using 5 mM of various nucleoside triphosphates instead of ATP and examining a phosphate donor.
  • the binding solution was prepared by adding 100 mM sodium acetate acetate buffer (pH 4.2 ⁇ 5.6) 2-morpholinoethanesulfonic acid (MES) to sodium hydroxide buffer (PH5. 4 — 6. 3) 3-morpholinopropanesulfonic acid (MOPS)-sodium hydroxide buffer (PH6.3-7.2), tris-hydrochloride buffer (PH7.2-) 8.8), cyclohexylaminopropanesulfonic acid (hereinafter referred to as CAPS)-sodium hydroxide buffer (pH 8.8-10.4) or glycine monohydroxide buffer ( ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ . 3—1 1.0) and the reaction was performed.
  • the optimal pH was 7.7-9.9.
  • the enzyme was supplemented with a 25 OmM sodium phosphate acetate buffer (PHI.5) containing 2.5 mg 1 1C blood albumin, 25 mM potassium chloride, 0.25 mM dithiothreitol and 5% glycerol. -5.6)), MES sodium hydroxide buffer (P H ⁇ .4-1-6.4), MOPS-sodium hydroxide buffer (pH 6.3-7.3), Tris-hydrochloride buffer (pH 7.2-8.8), CAPS-sodium hydroxide buffer (pH 8.9-10.4) or glycine sodium hydroxide buffer (pH 10.5-13.3) at room temperature After performing the treatment for 30 minutes, the activity was measured. The activity was stable in the pH range of 6.7—1.2.1.
  • the optimal temperature was 30 to 50
  • Enzyme was purified with 12.5 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 5 mg ml of serum albumin, 50 mM potassium chloride, 0.5 mM dithiothreitol and 10% glycerol. After treatment at 60 ° C for 30 minutes, the residual activity was measured. In the following treatments, 50% or more of the activity remained, and was inactivated at 40 ° C or more.
  • the reaction was carried out by changing magnesium chloride in the reaction solution to various metal ions.
  • the results are shown in Table 5. This activity requires metal ions, and the reaction proceeded with manganese, cobalt, and iron ions in addition to magnesium ions.
  • Table 6 shows the relative activities when various metal ions were added to the reaction composition at I mM. This enzyme was strongly inhibited by copper ions and mercury ions, and also inhibited by zinc ions and cadmium ions.
  • the Km value of this enzyme measured by changing the substrate concentration of the reaction composition was 0.03 mM for guanosine, 1 mM for inosine, and TP for ATP when guanosine was used as the substrate. 1.6 mM.
  • Example 5 About 2 ml of the active fraction obtained in Example 5 (2) was Was concentrated to about 0.2 ml by centrifugation at 6.00 rpm for 3 hours. The protein was blotted on a filter by centrifugation using Prospin (manufactured by Applied Biosystems). After washing the filter three times with 20% methanol, the filter was dried, and the amino acid sequence at the N-terminal was determined using Protein Sequencer 1476A (Applied Biosystems). The determined amino acid sequence is shown in Column No. 3 in the column list. X aa indicates those that could not be identified. An N-terminal 28 amino acid containing one unidentified amino acid was determined.
  • Example 5 In the same manner as in Example 5 (1), 3 g of wet cells of Excibacterium acetilicum ATCC 953 were obtained from a 500 ml culture solution.
  • the chromosome D ⁇ was extracted from the cells by the method of Saito and Miura (Biochem. Biophys. Acta., 72.619, (1963)).
  • C The N-terminal amino acid sequence obtained in the preceding section (1). Based on this, oligonucleotides were synthesized. The nucleotide sequence was a mixture of the oligonucleotides shown in SEQ ID NOs: 4 and 5 in consideration of codon degeneracy.
  • oligonucleotide 0.25 mole of the oligonucleotide as a primer, 0.1 ug of the chromosomal DNA of Excigobacterium 'acetilicum ATCC 953 as a ⁇ type, and 0.1 g of the tack gene polymerase ( 2.5 units were added with dATP, dCTP, dGTP, dTTP each 200 ⁇ , 50 mM potassium chloride, 1.5 mM magnesium chloride and 0.001% gelatin. Containing 10 mM Tris-Surface Hydrochloride Solution (PH 8.3) 0.1 ml, repeat 94 cycles for 30 seconds, 55 for 30 seconds, and 72 for 1 minute PCR 30 times The method was performed.
  • PH 8.3 Tris-Surface Hydrochloride Solution
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the amplified DNA fragment of about 80 bases was recovered using glass powder (Takara Shuzo). Approximately 0.2 ⁇ g of this DNA fragment contains 2 units of Klenow fragment, 200 ⁇ M each of dATP, dCTP, dGTP, and dTTP, 1 mM 2-mercaptoethanol, and 7 mM magnesium chloride. 0 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) was added to 50 w 1 and blunt-ended at 37 ° C. for 30 minutes. The reaction solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation. The blunt-ended DNA fragment obtained as a precipitate was converted to T4 polynucleotide kinase. 10 units, lO mM magnesium chloride, 5 mM dithiothreitol, 0.
  • Plasmid vector PUC18 (Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 uR and the restriction enzyme SmaI20 unit were mixed with 10 mM magnesium phosphate, 66 mM potassium phosphate, 0.5 mM dithiothreitol and 0 mM 0 Mix with 50% of 33 mM trisulfate buffer (pH 7, 9) containing 1% bovine serum albumin and react at a temperature of 30 for 2 hours to digest the digestive fluid. The resulting solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation according to a conventional method.After that, the DNA fragment was subjected to dephosphorylation to prevent recombination of the plasmid fragment derived from the plasmid vector.
  • a phenol extraction treatment was performed by the method, and ethanol precipitation ⁇ was performed.
  • 0.1 yg of the PUC18 digested with SmaI, blunt-ended PCR product and about 0.1 g of phosphorylation, and 1 unit of T4 DNA ligase (Takara Shuzo) were added to 6.
  • ATP-containing 66 mM Tris-HCl buffer pH 7.5
  • ATP-containing 66 mM Tris-HCl buffer pH 7.5
  • the DNA mixture was used to transform Escherichia coli * JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) by a conventional method, and this was spread on an L agar medium containing 100 g Zml of ampicillin. A transformant was obtained.
  • Plasmid DNA was prepared from the resulting transformant by the alkaline lysis method.
  • the plasmid DNA contained an approximately 80-based DNA fragment derived from the chromosomal DNA of Exiguobacterium acetylicum ATCC 953.
  • the nucleotide sequence of the DNA fragment was determined.
  • the nucleotide sequence is determined using the Taq Dye Deoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (No. In accordance with the method of Sanger (J. Mol. Biol., 143.161 (1980)).
  • a DNA83-based nucleotide sequence corresponding to the ⁇ -terminal region of the inosin-guanosine kinase protein of Exiguobacterium acetylicum ATCC 953 was determined.
  • oligonucleotides S1 and S2 having a base SE sequence shown in column K and column Nos. 6 and 7, respectively, were synthesized.
  • Exigo-Pakteri in which oligonucleotide S1 and cassette primer C1 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) were used as primers, respectively, at 0.2 mo 1 e, and Eco RI cassettes were used as type II.
  • oligonucleotide S 2 and cassette primer C 2 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) synthesized as primers were used in a PCR reaction under the same conditions using 0.2 mole each. went.
  • a part of the reaction solution was subjected to agar CI gel electrophoresis, only a fragment of about 1,000 bases was specifically amplified, and ⁇ on the downstream side of the gene from the N-terminal region of the protein. A DNA fragment containing up to the RI cleavage site was obtained.
  • the DNA fragment was recovered using glass powder (Takara Shuzo). About 0.2 g of this DNA fragment was subjected to blunt-end reaction at 37 ° C for 30 minutes using Klenow fragment. The reaction solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation. The DNA fragment recovered as a precipitate was subjected to a terminal phosphorylation reaction at 37 ° C. for 1 hour using T4 polynucleotide kinase. The reaction solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation, and the resulting product was blunt-ended at the end of the PCR product and the phosphorus oxide was recovered as a precipitate.
  • Plasmid vector PUCI 8 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) 1 Z ⁇ is reacted with the restriction enzyme SmaI at a temperature of 30 for 2 hours to obtain a digested solution, and the solution is subjected to phenol extraction and phenol extraction by a conventional method. Ethanol precipitated. Thereafter, the DNA fragment was dephosphorylated by treatment with bacterial 'alkaline phosphatase, followed by phenol extraction, and ethanol precipitation.
  • This plasmid was named PCS 2. Oligonucleotides complementary to oligonucleotides S 1 and S 2 were synthesized and designated as S 4 and S 3, respectively. Exonucleotides acetilicum ATCC 9 with oligonucleotide S3 and force-set primer C1 (Takara Shuzo Co., Ltd.) as primers and Eco RI cassette as type III Using the 53 chromosomal DNA digests, amplification was performed by PCR under the same conditions. The resulting reaction solution was designated as type I, and PCR was performed using oligonucleotide S4 and cassette primer C2 (Takara Shuzo) as primers to obtain a protein of about 2,300 base. The DNA fragment containing the region from the N-terminal region to the Eco RI cleavage site on the upstream side of the gene was amplified.
  • DNA fragment was subjected to a blunt-end reaction at 37 ° C. for 30 minutes using Klenow fragment.
  • the reaction solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation.
  • the DNA fragment recovered as a precipitate was subjected to a 10 mM tris-monohydrochloride buffer (PH7.5) containing 10 units of restriction enzyme I, 10 mM magnesium chloride and 10 mM dithiothreitol. 1 and reacted at 37 ° C. for 2 hours to obtain a digested solution, which was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation.
  • PH7.5 tris-monohydrochloride buffer
  • Plasmid vector PUC 18 (Takara Shuzo) 1 1 ⁇ and restriction enzyme ⁇ ⁇ I, 5 units each of Hin CD, 10 mM each of 10 mM magnesium chloride, 50 mM sodium chloride and ImM dithiothreate Toluene containing 33 mM tris-acetate buffer (PH 7.9) 501 mixed with 501 and reacted at 37 ° C for 2 hours to obtain a quenched solution, which is extracted with phenol After treatment, ethanol precipitation was performed.
  • Plasmid DNA is prepared from the resulting transformant by the alkaline lysis method, and a DNA fragment containing from the N-terminal region of about 600 base protein to the ⁇ _ ⁇ _ ⁇ I cleavage site on the upstream side of the gene is obtained. A plus containing was selected. This plus mid-life was called PKS 4. Named.
  • the nucleotide sequences of plasmids PCS2 and pKS4 obtained in (3) above were determined.
  • the base S sequence of the open reading frame estimated from this is shown in SEQ ID NO: 1.
  • the amino acid sequence of the product deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 2 in the Sequence Listing. That is, the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 2 in the S column list is an inosine-guanosine kinase gene of the excibacterium acetylcellum ATCC 953. It is.
  • Example 7 Construction of Inosine-guanosine Kinase Gene Expression Plasmid Derived from Exiguobacterium acetylicum ATC C953 and Introduction into a Colinepactum / Ammoniagenes
  • Inosine-guanosine kinase gene derived from Exibacterium acetylicum is located at both ends of the gene and restriction enzymes PstI and Sst, respectively.
  • Oligonucleotides having the phI cleavage site and shown in Sequence Listing K, column Nos. 8 and 9 were synthesized.
  • the oligonucleotide was used as a primer, 0.25 mo 1 e, and as a ⁇ type, the excigopacterium 'Acetilicum ATCC 953 prepared in Example 6 (2).
  • Chromosomal DNA O.lg and tack DNA Polymerase (Takara Shuzo Co., Ltd.) 2.5 Units are salified at dATP, dCTP, dGTP, and dTTP at 200 ⁇ M and 50 mM, respectively.
  • the PCR method was repeated 25 times at 55 ° C for 30 seconds and at 72 ° C for 30 seconds.
  • the reaction solution was subjected to agarose gel electrophoresis, and the desired DNA fragment was recovered using glass powder (Takara Shuzo).
  • Approximately 2 g of the DNA fragment and 10 units of each of the restriction enzymes PstI and SphI were added to a 50 mM tris containing 1 OmM magnesium chloride, 10 OmM sodium chloride and ImM dithiothreitol.
  • the mixture was mixed with 50% hydrochloric acid buffer solution (pH 7.5) and reacted at a temperature of 37 for 2 hours to obtain a digested solution, and the solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation.
  • Plasmid DNA was prepared from the resulting transformant by the alkaline lysis method and subjected to agarose gel electrophoresis, whereby the plasmid PHSG298 was transformed with the inosinosine anosine kinase gene derived from Excibacterium acetisilicum. Inserted The selected recombinant plasmid was selected. This plasmid was named pBA-1.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1 (2), a DNA fragment containing the Escherichia coli trp promoter cut with BamHI and PstI was obtained.
  • the recombinant plasmid pBA-1 lg into which the DNA fragment containing the inosine guanosine kinase gene obtained in the previous section ( ⁇ ) was inserted was digested with BamHI and PstI, and the reaction mixture was used as the reaction mixture.
  • the extract was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation according to a conventional method to obtain a plasmid digested with BamHI and PstI.
  • Plasmid DNA was prepared from the resulting transformant and subjected to agarose gel electrophoresis to obtain a recombinant plasmid in which Escherichia's coli trp promoter was inserted into plasmid pBA-1. A mid was selected and named pBA-2.
  • Essi X Lihia 'Kori AJ 13 094 which holds Plasmid p BA —2, is located at 1-1-1 Higashi, Tsukuba, Ibaraki, Japan (zip code: 3005). Deposited at the Institute of Engineering, Industrial Technology, and Technology on April 27, 1995 based on the Budapest Treaty, and assigned the accession number FERMBP — 509.
  • the mixture was digested with ⁇ ____mH I using the reaction mixture composition of (2), extracted with ethanol, and subjected to ethanol precipitation. This was digested with the reaction composition of Example 6 (2)] ⁇ EJi I, and Enol extraction treatment was performed and ethanol precipitation was performed.
  • the resulting plasmid PBA_2 digested with BamHI and KPJlI was subjected to dephosphorylation of DNA fragments by treatment with bacterial 'alkaline phosphatase, followed by phenol extraction. Processing and ethanol precipitation were performed.
  • Plasmid pBA 20.1 g digested with BamHI and KpnI obtained above and plasmin ′ PHC4-derived DNA fragment digested with BamHI and KpnI Using 0.2 wg and T4 DNA ligase (Takara Shuzo), a ligation reaction was carried out at a temperature of 16 ° C for 8 hours to ligate the DNA.
  • Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo) was transformed with the DNA mixture, and this was spread on an L agar medium containing 100 g of Zm1 kanamycin, and the transformant was transformed. I got
  • Plasmid DNA was prepared from the resulting transformant by the alkaline lysis method and subjected to agarose gel electrophoresis to replicate the plasmid derived from Corynebacterium genus bacteria into plasmid pBA-2.
  • a recombinant plasmid containing the origin was selected and named pBA-3.
  • the 0.1 g of pBA-3 obtained in the preceding section was transformed in accordance with the conventional method of transformation using the electric pulse method (Japanese Patent Application Laid-Open No. Hei 2-20077-191) to obtain a gene from AT. Introduced to 1 4 7 7 strains. This was spread on an agar medium consisting of 1% polypeptone, 1% yeast yeast, 0.5% sodium chloride, 0.5% glucose and 50 g kanamycin, and the transformant ATCC 2 1 4 7 7 / pBA-3 was obtained.
  • Corynebacterium ammogenes ATCC 214777-no-pBA-3 obtained in the previous section was replaced with 1% polypeptone, 1% yeast extract, 5% glucose, 0.4% potassium dihydrogen phosphate, Magnesium sulfate 0.1%, ammonium sulfate 0.5% Urea 0.5%, ferrous sulfate 0.01%, manganese sulfate 0.01%, thiamine hydrochloride 0.05g Zl, calcium pantothenate 0.01g Zl Inoculate 50 ml of a medium (PH 7.2) consisting of 30 g of pyotin / 0.05% adenine and 50 mg Z1 of kanamycin, and incubate for 24 hours at 32 ° C. did. The culture was centrifuged according to a conventional method to collect the cells.
  • the cells were suspended in a 0.9% aqueous sodium chloride solution and centrifuged twice to wash the cells.
  • the cells were turbidized in 50 mM Tris-HCl buffer (pH 7.5) containing 20% glycerol and 100 mM chlorinated potassium at a power of 150 W and output at 200 W. After sonication for 15 minutes, the mixture was centrifuged at 15,000 rpm for 30 minutes to obtain a supernatant.
  • the cell lysate was subjected to Sephadex G-25 (Pharmacia) column chromatography to remove the low molecular weight substances to obtain a crude enzyme solution.
  • the inosin-guanosine kinase activity of the obtained crude enzyme solution was similarly transformed with plasmid pHK4, and ATCC214777 ZPHK4 obtained as a control was used as a control in Example 5 (1). )).
  • Table 7 shows the results. No activity was detected with ATCC2147 / PHK4, whereas ATCC2177 / pBA-3 had high activity. This result indicated that the introduced exigopacterium-derived gene expressed inosine-guanosine kinase activity in corynepacterium and ammoniagenes.
  • Plasmid pHHK4 had a structure in which the trp promoter and the inosine-guanosine kinase gene region were removed from pBA-3, and was used as a control.
  • Example 8 Provide of 5′-inosinic acid from inosine using an inosine monoguanosine kinase gene-bearing strain derived from Exiguobacterium acetilicum.
  • a medium pH 7.2
  • the obtained cells were treated with 50 g of inosine, 20 g of potassium dihydrogen phosphate, 30 g / l of glucose, 5 g / l of magnesium sulfate, and phytic acid (50% by weight).
  • Reaction solution (pH 7.2) consisting of gZl, Nymeen S—2 1 5 4/1, adenine l gZl A suspension was added to 20 ml of 200 gZl with agitation and stirred. The reaction was carried out at a temperature of ° C. The pH was appropriately adjusted to 7.2 using 4N sodium hydroxide, and a reduced amount of potassium dihydrogen phosphate was appropriately added.
  • As a control the same reaction was performed for ATCC214777ZpHK4. After reaction for 30 hours, 5′-inosinic acid in the reaction solution was quantified using high performance liquid chromatography.
  • Table 8 shows the results. 5 '— Inosinic acid tantalum is 5' — indium inosinic acid 7. It was shown in terms of pentahydrate. From these results, conversion of inosine to 5'-inosinate was observed in ATCC2147 / pBA-3, which expresses inosine-guanosine kinase activity. Table 8
  • Example 9 (Conversion of Inosine to 5′-Inosinic Acid Using Inosine Monoguanosine Kinase Gene-Retaining Strain Derived from Exiguobacterium acetylicum)
  • the Bacteria Obtained in Example 8 60 g of inosine, 1 g of dihydrogen phosphate, 201 g of glucose, 30 g / l of glucose, 5 g of magnesium sulfate, 1 g of phytic acid (50% by weight) 1 O g Z l, and Kaka ⁇ so that Nai Mean S- 2 1 5 4 g / l , adenine 1 g Z reaction liquid consisting of l (PH 7.
  • This culture was centrifuged at 7,000 rpm for 10 minutes, and the precipitate was washed twice with 0.9% sodium chloride to obtain wet cells.
  • the cells were suspended in 3 ml of buffer A and disrupted by sonication.
  • the crushed liquid was subjected to a centrifugal separation treatment at 15.000 rpm for 30 minutes, and the supernatant was desalted using a Sephadex G-25 column (manufactured by Pharmacia) to obtain about 3.5 ml of a crude enzyme extract.
  • Crude enzyme extract 51 was used as a 1 O OmM solution containing 5 mM magnesium chloride, 5 mM ATP, lO OmM potassium chloride, 0.06 mM guanosine, and 0.04 mM [8-HC] -guanosine.
  • the reaction solution added to hydrochloric acid buffer (PH 7.5) 501 was reacted for 30 and 10 minutes, and the generated 5'-guanylic acid was quantified, and the specific activity of inosine-guanosine kinase was measured. did.
  • Table 9 shows the results. Inosine-guanosine kinase activity was detected in all strains. Table 9
  • Example 12 Fragment having homology to exinobacterium * aurantiacum, Kurtia * gibsonii, inosin-1 guanosine kinase gene derived from Exiguobacterium acetilicum in Kurtia zopfi chromosome 3
  • the excito-pharmaceutical aurantia cam ATCC 355, 52 and Kurtia * gibbsoni ATCC 4 3 195 and Kurtia Zopfi ATCC 3 3 4 0 3 The cells were cultured at 0 ° C for 16 hours, and each chromosomal DNA was prepared from the culture medium in the same manner as in Example 5 (2).
  • the chromosomal DNA 10 / g and the restriction enzyme Ec0RI 100 units were buffered with 50 mM Tris-HCl containing 1 OmM magnesium chloride, 100 M sodium chloride and ImM dithiothreitol. The mixture was mixed with the solution (pH 7.5), reacted at a temperature of 37 for 14 hours, and then subjected to phenol extraction and ethanol precipitation by a conventional method. The obtained chromosomal DNA cut with EcoRI was subjected to 8% agarose gel electrophoresis to obtain a Molecular C1 on ng 2nd edition (J. Sarobrook, EF Fritzsch and T.
  • Example 13 Isolation of a fragment homologous to the inosine-guanosine kinase gene derived from Exiguobacterium acetilicum from chromosome Excibacterium aurantiacum ATCC 36552)
  • plasmid vector p MW2 18 (manufactured by Nippon Gene Co., Ltd.) was reacted at 37 ° C. for 3 hours with 20 units of restriction enzyme EcoRI, and the digested solution was subjected to phenol extraction and ethanol precipitation. . After that, the DNA fragment was dephosphorylated by alkaline phosphatase treatment, followed by phenol extraction, and ethanol precipitation. 5 ug of 2 g of Exiguobacterium auranticam chromosome fragment digested with EcoRI was ligated using T4 DNA ligase (Takara Shuzo).
  • the DNA mixture was used to transform Escherichia coli JM109 (manufactured by Takara Shuzo Co., Ltd.) according to a conventional method, and this was transformed with 100 ug / m1 of kanamycin on an agar medium. In addition, about 1,000 transformants were obtained.
  • transformants hybridizing with the probe DNA were selected by the colony hybridization method.
  • Plasmid DNA was prepared from the transformant by an alkaline lysis method.
  • the plasmid DNA contained an approximately 4.6 kb DNA fragment derived from the chromosome of Exiguo pacterium auranticam.
  • Example 14 Determination of the base sequence of the inosine monoguanosine kinase gene derived from Exiguobacterium auranticaum ATC C355562
  • nucleotide K sequence of the open reading frame estimated from the determined nucleotide sequence is shown in S column, SEQ ID NO: 14.
  • amino acid sequence of the product deduced from the nucleotide sequence is shown in SEQ ID NO: 15 of the Sequence Listing. Both the base S sequence and the amino acid K sequence showed high homology with inosine-guanosine kinase from exiguobacterium acetilicum, but were clearly novel genes.
  • the gene encoding the protein consisting of the amino acid sequence shown in SEQ ID NO: 15 in the sequence listing is an inosine-guanosine of Excigopacteria aurantiacum ATCC 35652.
  • Kinase II is a gene.
  • CTGCTTCAGC AATTCCAGCC AGAAAACGAA ACCAGCGCTG CCTGGGTAGT GGGTATCGAT 120

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Description

明 細 書
核酸類の製造方法
本発明は、 イ ノ シン又はグアノ シンから 5 ' —イ ノ シン酸又は 5' —グァニル 酸を生成させる活性を有する蛋白質をコー ドする DN Aを保持させた、 アデノ シ ン三リ ン酸 （A T P) 再生能を有する微生物を利用して、 イ ノ シン若し く はグァ ノ シン又はそれらの前駆体から、 調味料などに利用される 5 ' —イ ノ シン酸又は 5 ' 一グァニル酸を製造する方法に関する。
また、 本発明は、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する新規な蛋白質、 それをコー ドする遺伝子、 当該遺伝子を含有する組換え D N A、 それで形質転換 された微生物にも関する。 背景技術
従来、 微生物を用いてイ ノ シ ンをリ ン酸化し 5' —イ ノ シン酸を製造する方法 と して、 p—二 トロフエニルリ ン酸を用いる方法 （特公昭 3 9— 2 98 58号） ， 無機リ ン酸を用いる方法 （特公昭 4 2— 1 1 86号、 特公昭 49一 44 350号） ァセチルリ ン酸を用いる方法 （特開昭 56— 8209 8号） 、 A T Pを用いる方 法 （特開昭 63— 230094号） 等が開発されている。 しかしながら、 これら によ り製造される 5 ' —イ ノ シン酸の蓄積は必ずしも满足すべきものではなかつ た。
また、 A T Pによ り イ ノ シンをリ ン酸化する方法の改良方法と して、 ェシエ リ ヒア · コリのイ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコー ドする遗伝子を得て、 遗伝子 組換え技術によ り イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を增強したェシヱ リ ヒア ' コリ菌株を用いて、 イ ノ シンまたはグアノ シンをリ ン酸化し 5' —イ ノ シン酸ま たは 5' —グァニル酸を製造する方法も開発されているが （W09 1 /0828 6号） 、 反応によ り消費される AT Pを再生する微生物を別途培養し反応液中に 存在させる必要があり、 さらに効率よ く 5 ' —イ ノ シン酸及び 5' —グァニル酸 を得る方法が望まれていた。 さらに、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子は、 ェシエ リ ヒア ' コ リ （J.Ge n. Microbiol, 135, 1263- 1273 ( 1989) )など一部の微生物について存在が知られてい るのみであった。
本発明者らは、 5 ' —イ ノ シン酸及びノ又は 5 ' —グァニル酸のさらに効率的 な製造法の開発を行っていたと ころ、 ィ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコー ドす る遺伝子を、 反応により消费される AT Pを再生するに充分な能力を有する微生 物に導入することによ り、 簡便かつ高 ¾積で 5' —イ ノ シン酸及び/又は 5 ' - グァニル酸を製造することができることを見出した。 また、 エシ リ ヒア ， コリ から得られるイ ノ シン一グアノ シンキナーゼとは異なるアミ ノ酸 列を有する新 規なィ ノ シン一グアノ シンキナーゼをも見出した。 発明の開示
本発明は、 イ ノ シン若し く はグアノ シン又はそれらの前駆体から簡便かつ高蓄 積で、 調味料などに利用される 5 ' —イ ノ シン酸も し く は 5 ' —グァニル酸を製 造する方法に関する。 よ り詳細には、 本発明は反応により消贄される A T Pを再 生するに充分な能力を有する微生物に、 イ ノ シン及び/又はグアノ シンを 5 ' — イ ノ シン酸及び Z又は 5 ' -グァニル酸に変換する活性を有する蛋白質をコード する遺伝子を導入することにより、 反応によ り消費される AT Pを再生する微生 物を別途培養し反応液中に存在させることなく 、 前記遺伝子を導入した微生物の みの存在下に簡便かつ高蓄積で、 効率よ く 5' —イ ノ シン酸及び Z又は 5 ' —グ ァニル酸を得る方法を提供するものである。
また、 本発明は、 エキシグォパクテリ ゥム ' ァセチリ カムに属する微生物など から得ることができ、 かつ、 イ ノ シン及び 又はグアノ シンを 5 ' —イ ノ シン酸 及び Z又は 5' —グァニル酸に変換する活性を有する新規な蛋白質、 それをコ一 ドする it伝子、 当該遺伝子を含有する組換え DNA、 それで形質転換された微生 物、 及び、 当該微生物を用いた 5' —イ ノ シン酸及び/又は 5 ' —グァニル酸の 製造法を提供するものである。
本発明の前記の新規な蛋白質は、 既知のイ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を 有する蛋白質に比べてアミ ノ酸 列を大幅に異にしており、 新規な蛋白質である エシ リ ヒア ' コ リ 由来のイ ノ シン—グアノ シンキナーゼは既に知られている。 本発明者らは従来イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性があるとは知られていなか つた、 エキシグォパクテリゥム厲に属する微生物においてもイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質を産生していることを見いだし、 これを単離し、 コー ドする遺伝子をクローニングすることに成功した。 これらの蛋白質は既知の ものに比べてア ミ ノ酸配列を大幅に異にしていた。
従来の f ノ シン一グアノ シン活性を有する蛋白質と、 アミ ノ酸 列を大幅に異 にする蛋白質が同様な活性を有していることは、 本発明者らの新たな知見による ものである。 すなわち、 本発明は、
( 1 ) ィ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子を A T P再生能を有する微生物に導入した形質転換株を、 イ ノ シ ン若し く はグアノ シン又はこれらの前駆体、 エネルギー供与体、 及びリ ン酸供与体に接触反応させ て、 反応液中に 5 ' —イ ノ シン酸又は 5' —グァニル酸を生成蓄積せしめ、 これ を採取することを特徴とする 5 ' —イ ノ シン酸又は 5 ' —グァニル酸の製造法、
( 2 ) A T P再生能を有する微生物がコリ ネバクテリ ウム属、 ェシ リ ヒア属、 サッ カロ ミセス属、 スタフ イ ロコ ッカス属及びキャ ンディ ダ属からなる群より選 ばれる微生物である上記 （ 1 ) の 5' —イ ノ シン酸又は 5' —グァニル酸の製造 法、
( 3 ) A T P再生能を有する微生物がコリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネスで ある上記 （ 1 ) の 5' —イ ノ シン酸又は 5' —グァニル酸の製造法、
(4 ) イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子が エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムに由来する遺伝子、 又は該遺伝子にハイ ブリ ダィズすることができる遗伝子である上記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) のいずれかの 5 ' 一イ ノ シン酸又は 5 ' —グァニル酸の製造法、
( 5 ) イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子が ェシ X リ ヒア · コリ に由来する遗伝子、 又は該遗伝子にハイブリ ダィズすること ができる遺伝子である上記 （ 1 ) 〜 （ 3 ) のいずれかの 5' —イ ノ シン酸又は 5 ' ーグァニル酸の製造法、
(6 ) イ ノ シ ン—グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子を A T P再生能を有する微生物に導入した形質転換株、
( 7 ) A T P再生能を有する微生物がコ リ ネバクテリ ウム属、 ェシエ リ ヒア属、 サッ カロ ミセス属、 スタフ ィ ロコ ッ カス属及びキヤ ンディ ダ属からなる群よ り選 ばれる微生物である上記 （ 6 ) の形質転換株、
( 8 ) A T P再生能を有する微生物がコリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネスで ある上記 （ 6 > の形質転換株、
( 9 ) イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子が エキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ カムに由来する遺伝子、 又は該遗伝子にハイ ブリ ダィズすることができる遺伝子である上記 ( 6 ) 〜 （ 8 ) のいずれかの形質 転換株、
( 1 0 ) イ ノ シ ン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子 がェシ X リ ヒア · コ リ に由来する遗伝子、 又は該遗伝子にハイブリ ダィズするこ とができる遺伝子である上記 （ 6 ) 〜 （ 8 ) のいずれかの形質転換株、
( 1 1 ) コ リ ネバクテリ ウム · アンモニアゲネスにおいて複製可能であり、 かつ イ ノ シ ン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコードする遺伝子を含む組 換え D N A、
( 1 2 ) ィ ノ シ ン — グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ト'する遺伝子 がエキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ カムに由来する遺伝子、 又は該遗伝子にハ イブリ ダィズすることができる遺伝子である上記 （ 1 1 ) の組換え DN A、
( 1 3 ) イ ノ シ ン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子 がェシエ リ ヒア . コ リ に由来する遺伝子、 又は該遗伝子にハイプリ ダイズするこ とができる ¾伝子である上記 （ 1 1 ) の組換え DN A、
( 1 4 ) エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムに属する微生物から得ることが でき、 かつ、 以下の性質を有するイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋 白質、
1. 作用
リ ン酸供与体の存在下に、 ヌ クレオシ ドにリ ン酸基を転移し、 ヌ ク レオ シ ドの 5 ' 一モノ リ ン酸エステルを生成する。
2. 基質特異性
ヌ ク レオシ ド三リ ン酸の 7"位のリ ン酸基が、 他のヌ ク レオシ ドに転移す る。
3 - 至適 p H
7. 7 - 9. 9
4. p H安定性
p H 6. 7 - 1 2. 1
5. 至適温度
30 - 50 °C
6. 金属要求性
マグネシウムイオン、 マンガンイオン、 コバル ト イオン、 又は、 鉄ィォ ン。
7. 金属イオンによる影響
銅イオン、 水銀イオンで強く 阻害される。
亜鉛イオン、 カ ド ミ ウムイ オンでも阻害される。
8. K m値
Km値は、 グアノ シンに対して 0. 03mM、
イ ノ シンに対して l mM、
グアノ シンを基質と した場台、 A T Pに対しては 1. 6 mMf
9. 分子量
S D S—ポリ アク リルアミ ドゲル罨気泳動により約 36キロダルト ン。
( 1 5 ) イ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を有し、 列表配列番号 2に記載の アミ ノ酸配列を有する、 又は、 該アミ ノ酸 K列の一部においてア ミ ノ酸が削除、 置換若し く は追加されている蛋白質、
( 1 6 ) 上記 （ 1 4 ) 又は （ 1 5 ) の蛋白質をコー ドする遗伝子、
( 1 7 ) イ ノ シン一グアノ シンキナーゼを活性を有する蛋白質をコードし、 配列 表配列番号 1 に示される塩基 S£列を有する、 又は該塩基 S列を有する遗伝子とハ イブリ ダイズすることのできる遗伝子、 に関する。 以下、 本明細書においては、 イ ノ シン及びグアノ シンを A T Pにより リ ン酸化 し、 それぞれ、 5 ' — イ ノ シン酸及び 5 ' —グァニル酸を生成させる活性のこと を、 「イ ノ シ ン —グアノ シ ンキナーゼ活性」 ともいう。 また、 同活性を有する蛋 白質のことを 「イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ」 ともいう。 反応により消費され る A T Pを再生するに充分な能力を有する微生物のこ とを、 「A T P生産菌」 又 は ΓΑ Τ Ρ再生菌」 ともいう。 本発明をさ らに詳細に説明する。
本発明でいう イ ノ シン一グアノ シンキナーゼは、 イ ノ シン及びグアノ シンを A T Pなどによ り リ ン酸化し、 それぞれ、 5 ' — イ ノ シン酸及び 5 ' —グァニル酸 を生成する反応を触媒する酵素であり、 その由来は特に限定されないが微生物由 来のものが好ま し く 、 エキ シグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム等に属する微生物 から得られる新規な酵素のみならず、 ェシ X リ ヒア · コ リから得られる公知のィ ノ シン一グア ノ シンキナーゼをも包含している。
本発明のエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム等に属する微生物から得るこ とができ、 かつ、 イ ノ シ ン一グアノ シンキナーゼ活性を有する新規な蛋白質は、 エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムに属する微生物を培養し、 得られた菌体 を破砕して粗酵素抽出液を得、 これから精製するこ とにより得ることができる。 これらの微生物の具体的な例と しては、
エキシグォバクテリゥム ' ァセチリ カム A TC C 953
を挙げることができる。
なお、 分類学上、 エキシグォバクテリゥム ' ァセチリ カムは、 従来、 ブレビバ クテリ ゥム · ァセチリ カムと呼ばれていた（Bergey 's Manual of Systematic Bac teriology, P. 1301-1313 ( 1986))が、 遠伝子解析の結果からエキシグォパクテリ ゥム属にエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムと して移すことが提案されてい ¾ (Int. J. Syst. Bacteriol.44, 74-82 ( 1994) )。
ィ ノ シン一グアノ シンキナーゼの精製法は、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活 性を失わない方法であればいかなる方法でも用いるこ とができるが、 液体カラム クロマ ト グラフ ィ ーを用いる精製が一般的である。 具体的には、 塩化カリ ウムに よる濃度勾 を用いたイオン交換カラムクロマ トグラフ ィ ー、 硫酸アンモニゥム 濃度勾配を用いた疎水カラムクロマ トグラフ ィ ー、 リ ン酸緩衝液濃度勾 Kを用い る吸着カラムクロマ ト グラフ ィ ー等を適宜組み合わせて用いればよい。
本発明のエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム等に属する微生物から得るこ とができ、 かつ、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する酵素は、 以下の性 質を有している。
1. 作用
リ ン酸供与体の存在下に、 ヌ ク レオシ ドにリ ン酸基を転移し、 ヌクレオシ ド の 5 ' —モノ リ ン酸エステルを生成する。
リ ン酸供与体はヌ クレオシ ド三リ ン酸であり、 AT P、 2 ' - デォキシァ デノ シン三リ ン酸、 グアノ シン三リ ン酸、 2 '—デォキシグアノ シ ン三リ ン 酸、 チミ ジン三リ ン酸などを挙げることができる。
リ ン酸基が転移されるヌ ク レオシ ドと しては、 イ ノ シン、 グアノシン、 2 ' ーデォキシグアノ シンなどが挙げられる。
ヌ クレオシ ドの 5 ' 一モノ リ ン酸エステルは、 前記ヌク レオシ ドの 5 ' ーモ ノ リ ン酸エステルであり、 例えば、 5 ' — イ ノ シン酸、 5 ' —グァニル酸、 2 ' ーデォキシー 5 ' -グァニル酸などが挙げられる。
2. 基質特異性
ヌ クレオシ ド三リ ン酸の r位のリ ン酸基が、 他のヌ クレオシ ドに転移する。 ヌ クレオシ ド三リ ン酸と しては、 アデノ シン三リ ン酸 （ΑΤ Ρ) 、 2 ' —デ ォキシアデノ シン三リ ン酸、 グアノ シン三リ ン酸、 2 ' —デォキシグアノ シン 三リ ン酸、 チ ミ ジン三リ ン酸などが挙げられる。
リ ン酸基が転移される他のヌ クレオシ ドと しては、 イ ノ シン、 グアノ シン、 2 ' ーデォキシグアノ シンなどが挙げられる。
3. 至適 p H
至適 p Hは、 p H 7. 7 - 9. 9である。 4. p H安定性
P H 6. 7 - 1 2. 1の範囲で活性は安定である。
5. 至適温度
至適温度は、 30— 50 °Cである。
6. 温度安定性
4 0°C以上では失活する。
7. 金属要求性
反応の進行には金属イオンが必要であり、 マグネシウムイオン、 マンガンィ オン、 コノりレ ト イオン、 又は、 鉄イオンによ って反応の進行がみられる。
8. 金属イオンによる影響
銅イオン、 水銀イオンで強く阻害され、 亜鉛イオン、 カ ド ミ ウムイオンでも 阻害がみられる。
9. K m値
Km値は、 グアノ シンに対して 0. 0 3 mM、 イ ノ シンに対して l mM、 グ ァノ シ ンを基質と した場合、 AT Pに対しては 1. 6 mMである。
1 0. 分子量
5 D S—ポリ アクリ ルア ミ ドゲル電気泳動によ り約 36キロダルト ンである £
イ ノ シ ン 一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする構造遗伝子を 含む D NA断片は、 精製した蛋白質を利用して公知の方法で得ることができる。 例えば、 当該蛋白質に対する抗体を作製し、 染色体の遗伝子発現ライブラ リーを 探索する方法、 精製された蛋白質のア ミ ノ酸配列を解析し、 これを基にプローブ を作製し遗伝子ライブラリーを探索する方法がある。 ア ミ ノ酸配列は、 N末端 列の他、 適当なプロテアーゼで切断して得た断片から決定した内部ァミ ノ酸 K列 も利用することができる。 プローブと しては、 N末端アミ ノ酸 列あるいは内部 ァミ ノ酸配列から合成したオリゴヌ ク レオチ ド、 N末端アミ ノ酸 S列あるいは内 部ア ミ ノ酸配列内で作製したオリゴヌ クレオチ ドをプライマーと して用いたポリ メラ—ゼ . チェ イ ン . リ アクシ ョ ン法 （P C R法） によ りその領域に相当する遗 伝子を增幅したもの、 N末端ア ミ ノ酸配列と内部アミ ノ酸 ae列を基にしてそれぞ れのオリゴヌ クレオチ ドのプライマーを合成して、 N末端から内部に至る遺伝子 領域を p c R法により増幅したもの等を用いることができる。 また、 染色体を力 セ ) ト と呼ばれる二本鎖のォリ ゴヌ クレオチ ドと連結し、 N末端アミ ノ酸配列を 基に合成したオリゴヌ クレオチ ドのプライマーとカセ ッ トの配列を基に合成した ブライマーを用いて P C R法により 目的断片を取得する方法がある （Molecular and Cellular Probes, 6, 467 (1992)) 。 さらに具体的には、 エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムのイ ノ シンーグァ ノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子は、 N末端アミ ノ酸 列 からその領域に相当する D N A断片を P C R法によ り増幅し、 これを基にプライ マ一を合成し、 カセッ トを用いた P C R法によ り增幅して取得できる。
エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム A TC C 953から得られる蛋白質 の N末端の 28個のア ミ ノ酸の K列を解析した結果は、 配列表 列番号 3に示す 通りである （ 1 8番目のアミ ノ酸は未同定） 。
この N末端のアミ ノ酸配列においても、 エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ 力 ムの蛋白質は、 ェシヱ リ ヒア ' コ リから得られた W09 1 Z 08 286号に記載 の公知のイ ノ シン—グアノ シンキナーゼのものとは全く 異なる蛋白質である。 目的遺伝子の取得には、 まず、 エキシグォパクテリ ゥム ' ァセチリ カムに属す る微生物の染色体を銬型と し、 上記の N末端アミ ノ酸 列を基に合成したプライ マーを用いて P C R法により イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質 の N末端アミ ノ酸 S列部分をコードする遺伝子を特異的に増幅し クローニングす る。 プライマ一と しては、 塩基組成がランダムで G + C含量が 50 %付近であり、 特殊な 2次構造を形成せず、 互いに相補的でない、 との条件を满たすものであり、 長さは通常 1 6ないし 30塩基のものがよ く 用いられる。 プライマーの構造は N 末端アミ ノ酸 ffi列の両端に位置するものであり具体的に例示すると、 列表 S列 番号 4及び 5に示すようなものが挙げられる。
但し、 列番号 4において、 6番目のヌ クレオチ ドは T及び Cの、 9番目のヌ クレオチ ドは、 A及び Gの、 1 2番目のヌ クレオチ ドは T、 C及び Αの、 1 5番 目のヌ ク レオチ ドは T、 C、 A及び Gの混合物である。 また、 配列番号 5におい て、 3番目及び 1 2番目のヌク レオチ ドは T及びじの、 6番目のヌ クレオチ ドは T、 C、 A及び Gの、 9番目及び 1 5番目のヌ クレオチ ドは A及び Gの混合物で ある。 ついで、 エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムに属する微生物の染色体を適 当な制限酵素により切断し、 その切断物とカセッ トを連結したものを铸型と し、 N末端アミ ノ酸配列部分をコー ドする遺伝子の配列を基に合成したプライマーと カセッ トを基にしたプライマーを用いて P C R法によ り イ ノ シン一グアノ シンキ ナーゼ活性を有する蛋白質の構造遺伝子部分あるいはその上流領域を含む D N A 断片を特異的に增幅し クローニングする。 プライマーと しては上記の条件を満た すものであれば用いることができるが、 具体的に例示すると配列表配列番号 6及 び 7に示すようなものが使用できる。
遺伝子のクローニングに使用するベクターと しては宿主と して使用するェシェ リ ヒア · コ リで自律複製できるベクタ一であればいかなるものでも構わない。 例 えば、 p U C 1 9、 p H S G 2 98、 p H S G 398、 p B R 322等が用いら れる。 作製した組換え DN Aの受容菌と してはベクターの複製に好適なものであ ればいずれの菌株ででもよ く 、 例えば HB 1 0 1、 J M 1 09 , DH 5等のェシ エ リ ヒア · コ リ菌株が用いられる。
ベクターに挿入された DN A断片の塩基配列を決定することにより、 該 D NA 断片上に存在する、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子の塩基 £列及びそれが コー ドしている蛋白質のアミ ノ酸 列を決定することができる。 かく して明らか となったエキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ カム A T C C 9 53のイ ノ シングァ ノ シンキナーゼの塩基 S列及びア ミ ノ酸配列をそれぞれ配列表の配列番号 1及び 2に示す。
本蛋白質は 303個のアミ ノ酸からなり、 その分子量は約 32. 5キロダルト ンである。 本発明の蛋白質は配列表の配列番号 2で示されるもののみならず、 エキシグォ パクテリ ゥム · ァセチリ カムに属する微生物から得ることができ、 かつ、 イ ノ シ ンーグアノ シンキナーゼ活性を有するものであれば、 他の天然の変異体をも包含 する。
また、 イ ノ シ ン一グア ノ シ ンキナーゼ活性を有するものであれば、 このア ミ ノ 酸配列の一部が置換されたものでつてもよいし、 一部が削除しているものであつ てもよいし、 それらにさらにア ミ ノ酸が付加されたものであってもよいし、 また, 蛋白質が一部修飾されたものであってもよいことは当業者には明らかである。 また、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコー ドしている限り、 上記のエキシグ ォバクテリ ゥム · ァセチリ カム由来の遠伝子に代えて、 該逮伝子とハイブリ ダィ ズすることができる遗伝子も使用することができる。
エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来の遺伝子とハイブリ ダィズするこ とができる遺伝子は、 以下のような菌株から取得することができる。
エキ シグォバクテリ ゥム · ァウランティ アカム A T C C 3 5 6 5 2
クルチア · ギブソニ A T C C 4 3 1 9 5
クルチア · ゾプフ ィ J C M 6 1 0 1
このような遺伝子は、 相同性を利用した公知の方法で取得することができるが、 具体的には以下に述べる方法を用いることができる。
まず、 上記微生物の染色体 D N Aを適当な制限酵素で切断し、 ァガロースゲル 電気泳動を行う。 切断断片を適当な転写フ ィ ルタ一にブロッテイ ングし、 エキシ グォバクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のイ ノ シ ン 一 グア ノ シ ンキナーゼ ¾伝子を プローブと してサザンハイブリ ダィゼ一シ ヨ ン法によ り相同性を持つ断片を検出 し、 大きさを決定する。
ついで、 制限酵素で切断した断片のうち目的とする大きさのものを精製する。 精製法は、 シ ョ糖密度勾配遠心法、 グラスパウダーによるァガロースゲルからの 回収等が一般的である。 精製した断片は、 適当なベクターに連結し、 ェシ： <： リ ヒ ァ · コリ菌株に形質転換する。 これら形質転換体の中からコロニーハイブリ ダィ ゼーシ ヨ ン法によ り 目的とするイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遺伝子を含む断片 を持つ菌株を選択できる。 本発明では、 前記した新規なイ ノ シン—グアノ シンキナーゼをコ一 ドする遗伝 子に代えて、 公知のイ ノ シン—グアノ シンキナーゼをコードする遛伝子も使用す ることができる。
公知のィ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ遗伝子と しては、 ェシエ リ ヒア · コ リ に 由来するものがあり （J. Gen. Microbiol. , 135, 1263- 1237 ( 1989))、 例えば、 以 下のような菌株から取得することができる。
ェシ ： リ ヒア * コ リ A T C C 2 7 32 5
公知のィ ノ シン—グアノ シンキナーゼをコー ドする S伝子は、 公知の方法によ り取得することができる力；、 以下に述べる方法によ り、 ェシヱ リ ヒア ' コリ A T C C 2 73 2 5の染色体 DN Aから本発明で使用することができるィ ノ シン一 グアノ シンキナーゼをコ一 ドする遺伝子を取得するこ ともできる。 まず、 配列表 κ列番号 1 0に示すェシエ リ ヒア ♦ コ リ 由来のィ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ遗伝子の配列 （WO 9 1 Z08286号） をもとにプライマ一を合 成する。 プライマーと しては、 塩基組成がランダムで G + C含量が 50 %付近で あり、 特殊な 2次構造を形成せず、 互いに相補的でない、 との条件を満たすもの であり、 長さは通常 1 6ないし 30塩基のものがよ く 用いられる。 プラ イマ一の K列はイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ構造遺伝子の両端に位置するものであり、 具体的に例示すると、 配列表配列番号 1 1 及び 1 2に示すようなものが挙げられ る。
ついで、 本プライマ一とェシ ヱ リ ヒア · コ リ染色体 D N Aからポリ メラ一ゼ · チェ イ ン . リ アクシ ョ ン法 （ P C R法） によ りイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ構 造遗伝子を增輻し クローニ ングすることができる。 ベクターと してはェシ リ ヒ ァ ' コ リ 由来のベクター、 例えば、 p U C 1 9、 p B R 322等が用いられる。 作成した組換え D N Aの受容菌と しては、 ベクターの複製に好適なものであれば いずれの菌株でもよ く、 例えば H B 1 0 1、 J M 1 09 > DH 5等のェシヱ リ ヒ ァ · コ リ菌株が用いられる。 かく して、 ェシヱ リ ヒア · コ リのイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子を含む D N A断片が挿入されたプラス ミ ドが得られる。
なお、 エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムの場合と同様に、 イ ノ シンーグ ァノ シ ンキナーゼをコー ドする限り、 ェシ ヱ リ ヒア · コ リ由来の該遗伝子と相同 性を有し、 ハイブリ ダィズすることができる遺伝子を取得し、 使用することもで きる。
上記のようにして得られるイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質 をコー ドする遺伝子を含む DN A断片は、 他の適当なベクターに再度組換えるか 複製起点を挿入した後、 A T P生産能を有する宿主細胞に導入させる。
すなわち、 宿主細胞と しては、 反応によ り消費される A T Pを A T P前駆体か ら再生するに充分な能力 （AT P生産能又は AT P再生能という。 ） を有する微 生物 （ A T P生産菌又は A T P再生菌という。 ） が用いられる。
本発明でいう A T P再生能を有する微生物と しては、 イ ノ シン及び Z又はグァ ノ シンを 5' —イ ノ シン酸及び Z又は 5 ' —グァニル酸に変換する反応によ り消 贄される A T Pを当該反応系において AT P前駆体から再生し、 当該反応を進行 することができる能力を有する微生物であれば特に制限はないが、 例えば、 コリ ネバクテリ ウム属、 ェシエ リ ヒア属、 スタフ イ ロコ ッ カス属、 サッ カロ ミセス属、 又はキ ャ ンデ ィ ダ属に属する微生物を挙げることができる。 特に、 AT P再生能 が高いコリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネスに属する微生物が好適に用いられ る。 なお、 コ リ ネパクテリ ゥム ' アンモニアゲネスは、 従来ブレビパクテリ ゥム • アンモニアゲネスと して分類されていたものである。
本発明で使用される AT P再生能を有する微生物の具体的な例と しては、 以下 のような菌株及びこれから誘導される変異株が挙げられる。
コ リ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネス （旧名称 ： ブレビバクテリウム · アンモ ニァゲネス） A T C C 6872
コ リ ネバクテリ ゥム · アンモニアゲネス （旧名称 ： ブレビパクテリ ゥム ' アン モニァゲネス） AT C C 2 1 2 9 5 コリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネス （旧名称 ： ブレビパクテリ ゥム · アン モニァゲネス） A T C C 2 1 4 7 7
コ リ ネバクテリ ウム · グル夕 ミ カム A T C C 1 3020
コ リ ネパクテリ ゥム ' グルタ ミ カム （旧名称 ： ブレビバクテリ ウム ' フラバム） A T C C 1 4 06 7
コ リ ネバクテリ ウム · グルタ ミ カム （旧名称 ： ブレビバクテリ ウム · ラク トフ ルメ ンタム） A T C C 1 3 869
ェシ X リ ヒア 《 コリ B (A T C C 1 1 303 ) 、
サッ カロ ミセス ， セレビシ A T C C 200 1 8,
スタフ イ ロコ ッ カス · オーレウス A T C C 4 0 1 2、
キ ャ ンデ ィ ダ * ゼイ ラ ノ イデス A T C C 203 56、
キャ ンデイ ダ - サイ クロフ イ ラ （旧名称 ： トルロプシス · サイ クロフ イ ラ） A T C C 2 2 1 6 3 さらに、 A T P再生能を有する微生物と しては、 イ ノ シン及びノ又はグアノ シ ンの分解活性が弱いあるいは欠失したものが望ま しい。 このような微生物の例と して、 上記の微生物の中からは、
コ リ ネバクテリ ウム ' アンモニアゲネス A T C C 2 1 2 9 5
コ リ ネバクテリ ゥム · アンモニアゲネス AT C C 2 1 4 7 7
が挙げられる。 本発明の A T P再生能を有する微生物と して、 AT P再生能と共にイ ノ シン又 はグアノ シンの前駆体からィ ノ シン又はグアノ シンの生産能を有する A T P再生 菌を使用するこ と もできる。 この場合には、 イ ノ シン又はグアノ シンに代えてこ れらの前駆体から 5 ' ーィ ノ シン酸又は 5 ' 一グァニル酸を製造することができ る。 そのような前駆体と しては、 グルコース、 シュ クロース、 廃糖蜜、 澱粉加水 分解物などの糖類、 齚酸などの有機酸類、 グリセロール、 エタノールなどのアル コール類が挙げられる。
ィ ノ シン又はグアノ シ ンの生産能を有する A T P再生菌と しては、 例えば、 コリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネス A T C C 2 1 4 7 8
コ リ ネバクテリ ウム ' アンモニアゲネス A T C C 2 1 4 7 9
コリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネス A T C C 2 1 4 8 0
などが挙げられる。 前記したイ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコ一 ドする遺伝子を組み込むベク夕 一 と しては、 受容菌である A T P再生菌において複製可能なものであれば特に制 限はないが、 例えば、 A T P再生菌と してコ リ ネパクテリ ゥム属細菌を用いる場 合には、 当該細菌で自立複製できるプラス ミ ドを挙げることができる。 具体的に 例示すれば、 PAM330 (特開昭 5 8 - 6 7 6 9 9号） 、 pHM1519 (特開昭 5 8 — 7 7 8 9 5号） pAJ655、 pAJ611、 AJ1844 (以上、 特開昭 5 8 - 1 9 2 9 0 0号） 、 P CG1 (特開昭 5 7 - 1 3 4 5 0 0号） 、 pCG2 (特開昭 5 8 — 3 5 1 9 7号） pCG4、 pCGll (特開昭 5 7 - 1 8 3 7 9 9号） 、 pGAl (Gene, 107, 69 ( 1991 )) 、 ρΗ 、 PHC4 (特開平 5 — 7 4 9 1 号） 等が挙げられる。 また、 A T P再生菌と してェシ エ リ ヒア · コ リ を用いる場合には、 例えば、 ColEl系プラスミ ド、 P15A系プラスミ ド、 R因子系プラス ミ ド、 F因子系プラス ミ ド、 フ ァージ系プラスミ ド等を用い ることができる。 具体的に例示すれば、 PBR322 (Gene, 2, 95 ( 1977)) 、 pUC19 (Gene, 33, 103 (1985)) 、 pACYC184 (J. Bacteriol, 134, 1141 (1978)) 、 pSC 101 (Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. , 70, 3240 ( 1973)) 等が挙げられる。 A T P再 生菌と してサッ カロ ミセス · セレビシェを用いる場合には、 YEp^プラス ミ ド、 Y Cp系プラスミ ド、 YRp系プラスミ ド、 YLp系プラスミ ド等を用いることができる。 具体的には、 YEp24、 YRp7、 YCp50等が挙げられる。 A T P再生菌と してスタフィ ロコ ッ カス . オーレウスを用いる場合には、 pRIT5 (EMBO J. , 4, 1075 ( 1985)) 等を用いることができる。 ィ ノ シン—グアノ シンキナーゼをコ一ドする遺伝子を高頻度に発現させるため にプロモー夕一配列および S D配列をイ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコー ドす る遺伝子の上流に S置させることが好ましい。 これらの 列を導入する方法と し ては特に制限はないが、 プロモーター配列および S D S列をもつベクターを用い、 それら配列の下流に前記遺伝子を挿入する方法、 あるいはプロモーターおよび s
D 列を合成し、 前記遺伝子の上流に挿入する方法を用いることができる。 プロ モーター配列および S D配列と しては特に制限はない力 A Τ Ρ再生菌と してコ リ ネパクテリ ゥム厲細菌を用いる場合には、 ェシヱ リ ヒア ' コ リ 由来の tac、 lac、 trpプロモーター、 あるいはコ リ ネパクテリ ゥム属細菌由来の trpプロモータ一（G ene, 53, 191 ( 1987))、 f daプロモータ一（Moし Microbiol. , 3, 1625 ( 1989))、 ppcプロモーター（Gene, 77, 237 ( 1989))、 1 ysCプロモーター（Mo 1. Microbiol. , 5, 1197 ( 1991 ))、 gdhプロモーター（Mo 1. Microbiol. , 6, 317 ( 1992))、 cspl、 csp2プロモーター （特表平 6 — 5 0 2 5 4 8号） を例示することができる。 A T P再生菌と してェシヱ リ ヒア ' コ リ を用いる場合には、 ェシエ リ ヒア ' コ リ 由来 の tac、 lac, trpプロモータ一、 ス フ ァージの P ,プロモーターを例示するこ と力； できる。 A T P再生菌と してサッ カロ ミセス ' セレピシェを用いる場合には、 AD Hl、 ENOK PGKK GAP- DH、 GAL GAL10, GAL7、 PH05、 MF cr 1プロモーターを例示 することができる。 A T P再生菌と してスタフ イ ロコ ッ カス · オーレウスを用い る場合には、 spaプロモータ一 U. Bacteriol. , 159, 713 ( 1984) ) を例示するこ とができる。 本発明のイ ノ シン及び/又はグアノ シンを 5 ' —イ ノ シン酸及び Z又は 5 ' — グァニル酸に変換する活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子を含む組換え D N Aを A T P再生能を有する微生物に導入する方法と しては特に制限はなく 、 通常 の方法により行う こ とが出来る。 例えば、 A T P再生菌と して、 コ リネパクテリ ゥム厲細菌を用いる場合には、 プロ トプラス ト法 （特開昭 5 7 — 1 8 3 7 9 9号） 、 罨気穿孔法 （特開平 2 — 2 0 7 7 9 1 号） が特に有効である。 A T P再生菌と し てェシエ リ ヒア · コ リ を用いる場合には、 塩化カルシウム法 （J. Mol. Biol. , 53, 159 ( 1970)) 、 Hanahan法 （ J. Mo I . B i o i . , 166, 557 ( 1983)) 、 SEM法 （Gene, 9 6, 23 ( 1990)) 、 Chungらの方法 （ Pro Nat I . Acad. Sc i . U. S. A. , 86, 2172 ( 1989)) 、 電気穿孔法 （Nucleic Acids Res. , 16. 6127 (1988)) などを用いることができ る。 枯草菌について報告されているような、 增殖段階の細胞からコンビテン トセ ルを調製して D N Aを導入する方法 （ H. Gene, 1, 153 (1977)) がある。 ある いは、 枯草菌、 放線菌類及び酵母について知られているような、 D N A受容菌の 細胞を、 組換え D N Aを容易に取り込むプロ トプラス トまたはスフエロプラス 卜 の状態にして組換え D N Aを D N A受容菌に導入する方法 （Mole Gen. Genet..
168, 111 (1979)、 Nature, 274, 398 (1978), Pro Nat!. Acad. Sci. USA, 7 5, 1929 ( 1978)) も応用できる。 A T P再生菌と してサツカロミセス · セレビシ ェを用いる場合には、 スフヱ口プラス ト法 （Pro Natに Acad. Sci. U. S. A. , 75, 1 929 ( 1978)) 、 齚酸リチウム法 （J, Bacterioし， 153, 163 ( 1983)) 、 電気穿孔法
("Methods in Enzyraology" 194, 182 ( 1991 )) などによって、 組換え遺伝子の導 入を行う こ とができる。 A T P再生菌と してスタフ イ ロコ ッ カス · オーレウスを 用いる場合には、 プロ トプラス ト法によって組換え遺伝子の導入を行う ことがで きる （Plasmid, 5, 292 (1981)) 。 プロ トプラス ト法では上記の枯草菌において使用されている方法でも充分高い 頻度を得ることができる力；、 特開昭 5 7 — 1 8 3 7 9 9号公報に開示されるよう に、 コ リ ネバクテリ ゥム属細菌細胞のプロ トプラス トをポリ エチレングリ コール またはポリ ビニルアルコールの一方及び二価金属イオンに接触させた状態で D N Aを取り込ませる方法も利用できる。 ポリエチレングリ コールまたはポリ ビニル アルコールの代りに、 カルボキシメチルセルロース、 デキス トラン、 フ イ コール、 プル口ニ ッ ク F 6 8 (セルバ社製） などの添加によっても D N Aのとり込みを促 進させることができる。
また、 電気パルス法 （特開平 2 — 2 0 7 7 9 1 号公報参照） によっても組換え D N Aを受容菌へ導入することもできる。 本発明の実施例で用いた形質転換の方 法は電気パルス法である。 さ らに、 イ ノ シ ン—グアノ シ ンキナーゼの遠伝子を A T P再生能を有する微生 物の染色体 D N Aに組み込むこともできる。 染色体遺伝子に組み込む方法と して は特に制限はないが、 例えば、 プラスミ ドベクターにコ リ ネパクテリ ゥム属細菌 由来の温度感受性複製起点とイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子とクロラムフ ェニコール等の薬剤に耐性を示すマ一カーとを挿入して組換え D N Aを調製し、 この組換え DN Aでコ リ ネパクテリ ゥム属細菌を形質転換する。 続いて、 形質転 換体を薬剤を含む培地でかつ温度感受性複製起点が機能しない温度で培養するこ とによ り、 組換え DN Aが染色体 DN Aに組み込まれた形質転換株が得られる
( J. Bacteriol. , 162, 1196 ( 1985)、 特開平 5 — 7 4 9 1 号公報） 。 あるいは、 コ リ ネバクテリ ゥム属細菌由来の転移因子を利用する方法も適用可能である （"M obi le Genet ic Elements", Academic Press, New York ( 1983), W O 9 3 / 1 8
1 5 1 号） 。 このようにして得られたイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質を コー ドする遺伝子を導入した本発明の形質転換体を、 炭素源、 窒素源、 無機塩類、 さらに必要に応じて有機微量栄養素を含有する通常の培地で培養することにより イ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を高レベルで発現させることができる。
炭素源と しては、 グルコース、 シュ クロース、 廃糖蜜、 澱粉加水分解物などの 糖類の他、 酢酸、 クェン酸などの有機酸類、 エタノールなどのアルコール類が使 用され、 窒素源と しては、 尿素、 アンモニゥム塩、 アンモニア水、 アンモニアガ スなどが使用される。 無機塩類と しては、 リ ン酸塩、 カ リ ウム塩、 マグネシウム 塩、 鉄塩、 マンガン塩などが使用される。 有機微量栄養素と しては、 アミ ノ酸類、 ビタ ミ ン類、 脂肪酸類、 核酸類、 その他これらのものを含有するペプト ン、 酵母 エキス、 大豆蛋白加水分解物などが使用される。
培養は、 温度 2 5ないし 3 7 °Cにて、 p Hを 5ないし 9に制御しつつ、 1 0な いし 4 0時間好気的条件下にて行う。 培養終了後、 培養液中に生成 したイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を測 定することによ り力価を確認する。 活性測定は、 遠心分離などの操作により培養 物から回収した菌体を、 超音波処理、 フレンチプレス処理などによ り破砕した後 遠心分離して菌体残渣を除去し、 ゲル «過にて低分子物質を除いたものを用いて、 Mole Gen. Genet. 143, 85-91 ( 1975)記載の方法等により行う ことができる。 かく して得られた A T P前駆体から AT Pを生合成する能力を有し、 イ ノ シン 一グアノ シンキナーゼをコ一ドする遗伝子を保持する微生物の培養物、 該培養物 よ り分離した菌体も し く は該菌体の処理物をイ ノ シン若し く はグアノ シン又はこ れらの前駆体、 エネルギー供与体及びリ ン酸基供与体に接触反応させることによ り、 反応液中に 5 ' —イ ノ シン酸もし く は 5 ' —グァ二ル酸を生成することがで きる。 培養物からの菌体の分離は遠心分離機等によ り行うことができ、 また、 菌 体の処理物と しては、 アセ ト ン処理菌体、 固定化菌体、 破碎した菌体などが挙げ られる。 本発明において好適に用いられる材料物質と しては以下のものを挙げることが できる。
イ ノ シン又はグアノ シンの前駆体と しては、 グルコース、 シュ クロース、 廃糖 密、 澱粉加水分解物などの糖類、 酢酸などの有機酸類、 グリセロール、 エタ ノー ルなどのアルコール類などが使用される。
エネルギー供与体と しては、 グルコース、 シュ クロース、 澱粉加水分解物、 廃 糖蜜などの糖類の他、 齚酸、 クェン酸などの有機酸類、 エタノールなどのアルコ —ル類が使用される。
リ ン酸供与体と しては、 オル ト リ ン酸、 ピロリ ン酸、 ポリ リ ン酸、 ト リ ポリ リ ン酸、 ポリ メ タ リ ン酸、 へキサメ タ リ ン酸等の無機リ ン酸およびその塩類のほか、 フ Xニルリ ン酸、 ァセチルリ ン酸、 力ルバミルリ ン酸等の有機リ ン酸を用いるこ とができる。
また、 反応液中に、 A T P前駆体、 界面活性剤、 金属イオン等を添加すること によ り、 反応の効率が改善される場合がある。
A T P前駆体と しては、 アデノ シン二リ ン酸、 アデニル酸、 アデノ シン、 アデ ニン、 アデニン鉱酸塩、 及びリ ボ核酸の加水分解液などが使用できる。
界面活性剤は、 カチオン系、 ァニオン^もしく は両性のいずれでも、 イ ノ シン も し く はグアノ シ ンのリ ン酸化を促進するものであればよい。 また、 金属イオン と しては、 マグネシウムイオン、 マンガンイオン等が適宜使用される。 なお、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼを A T P再生菌と組合せて使用する従来 のリ ン酸化反応においては、 反応系に有機溶剤を添加するのが一般的であつたが (特開昭 6 3 - 2 30094号、 WO 9 1 Z08286号） 、 本反応系では有機 溶媒を添加しない場合でも効率的に反応が進行する。
反応は温度 2 5ないし 3 7 にて p Hを 6ないし 8に制御しつつ、 1 0ないし 30時間好気条件下にて行う- 反応終了後、 反応液中に生成葚積した 5 ' — イ ノ シ ン酸も し く は 5' —グァニ ル酸は、 イオン交換樹脂処理、 晶析等の方法によ り採取することができる。
発明を実施するための最良の形態
以下、 実施例によ り本発明をさ らに具体的に説明する力 本発明はこれらの例 に限定されるものではない。 実施例 1
(ェシ X リ ヒア · コ リ 由来のィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遺伝子発現プラス ミ ドの構築とコリ ネバクテリ ゥム · アンモニアゲネスへの導入）
( 1 ) P C R法によるイ ノ ンングアノ シンキナーゼ遺伝子の增幅と クローニング ェシ ヱ リ ヒア · コ リ 由来のィ ノ シン— グアノ シンキナーゼ遗伝子の両端に位匱 し、 それぞれ制限酵素 P s t 1 、 H i n d ΙΠ切断部位を有する配列表 ¾列番号 1 1 及び 1 2に示すオリゴヌ クレオチ ドをホスホロアミ ダイ ド法によ り D N A合成 装置 （アプライ ドバイオシステム社製モデル 3 94 ) を用いて合成した。
プライマーと して該オリゴヌ ク レオチ ド 0. 2 5 w m o l e、 铸型と して斉藤, 三浦の方法 （Biochera. Biophys. Acta. , 72, 619， ( 1963)) によ り調製したェシ エ リ ヒア ' コ リ W 3 1 1 0 ( A T C C 2 732 5 ) の染色体 D N A 0. 1 g及びタ ッ ク DN Aポリ メラーゼ （宝酒造社製） 2. 5ユニッ トを、 d AT P、 d C T P、 d GT P、 d TT P各 200 / M、 塩化カ リ ウム 50mM、 塩化マグ ネシゥム 5mM及びゼラチン 0. 000 1 %を含有する l O mMN— ト リ ス (ヒ ドロキシメチル） メチルー 2—アミ ノエタン （以下、 ト リ ス） 一塩酸緩衝液 ( p H 8. 3 ) 0. 1 m l に添加し、 94 °Cを 30秒、 55 °Cを 30秒、 7 2 °C を 3 0秒のサイ クルを 2 5回繰り返す P C R法を行った。 反応液をァガロースゲ ル電気泳動に供し、 目的とする D N A断片をグラスパウダー （宝酒造社製） を用 いて回収した。 該 D N A断片約 2 w g及び制限酵素 P s t I および H i n d ΠΙそ れぞれ 2 0ュニッ トを 1 O mM塩化マグネシウム、 1 O O mM塩化ナ ト リ ウム及 び I mMジチオスレイ トールを含有する 5 0 mM 卜 リ ス一塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に混合し、 温度 3 7 で 2時間反応させて消化液を得、 該液を常法によりフ
X ノール抽出及びエタノール沈澱した。
プラスミ ド P H S G 2 9 8 (宝酒造社製） D N A \ u g及び制限酵素 P s t I およひ H i n d IH 2 0ュニッ トを 1 O mM塩化マグネシウム、 1 O O mM塩化ナ ト リ ウム及び I mMジチオスレィ トールを含有する 5 0 mM ト リ ス一塩酸緩衝液 ( p H 7. 5 ) におのおの混合し、 温度 3 7 °Cで 2時間反応させた。 反応終了液 を常法により フ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈澱処理して P s t I および H i n d fflで消化されたプラス ミ ド p H S G 2 9 8を得た。 この P s t I および H i n d mで消化された P H S G 2 9 8を 0. l w g、 P s t I および H i n d ffl で消化された P C Rによる增幅断片 0. 5 〃 g及び T 4 D N A リ ガーゼ 1 ュニッ ト （宝酒造社製） を 6. 6 mM塩化マグネシウム、 1 0 mMジチオスレィ トール 及び l O mMA T Pを含有する 6 6 mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ ρ Η 7. 5 ) に添 加し、 温度 1 6てで 8時間反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物 で、 常法によ りェシ X リ ヒア · コ リ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 0 0 g /m 1 のカナマイ シンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体 を得た。
得られた形質転換体から Molecular Cloning 2nd edition (J. Sambrook, E. F.
Fr i tsch and T. Maniatis, Cold Spring Harbour Laboratory Press, p.1.25(1 989)) 記載のアルカリ溶菌法によりベクター D N Aを調製し常法に従ってァガロ —スゲル電気泳勳を行う ことにより、 プラス ミ ド P H S G 2 9 8にイ ノ シングァ ノ シンキナーゼ遗伝子が挿入された組換えプラスミ ドを選択した。 このプラスミ ドを P I G K— 1 と命名した。
( 2 ) ェシエ リ ヒア * コリ 1: 「 プロモーターの挿入 5 ' —端、 3 ' 一端にそれぞれ制限酵素 B a mH I 、 P s t I 切断部位を有す る配列表 列番号 1 3に示すオリ ゴヌ クレオチ ドおよび相補 列を有するォリゴ ヌ ク レオチ ドを台成した。 得られたオリゴヌ クレオチ ド各々 1 gを混合し、 1 0 0 、 5分処理の後、 徐冷してァニールさせた。 このオリゴヌ クレオチ ド溶液 と B a m H I 2 0ュニッ トを 1 O mM塩化マグネシウム、 1 O O mM塩化力 リ ウ ム及び 1 mMジチオスレィ トールを含有する 2 0 mM ト リ ス一塩酸緩衝液 （ p H 8. 5 ) におのおの混合し、 温度 3 0 °Cで 2時間反応させ消化液を得、 該液をフ ノール抽出及びエタ ノール沈澱した。 得られた沈澱物を前項 （ 1 ) と同様に £ で消化し、 消化液をフヱ ノール抽出及びエタ ノール沈澱した。 かく して B a m H I および P s t I で切断されたェシ ヱ リ ヒア · コ リ t r pプロモーターを 含む D N A断片を得た。
前項 （ 1 ) で得られたイ ノ シ ングアノ シ ンキナーゼ遺伝子を含む組換えプラス ミ ド p I G K— 1 l gを同様に B a m H I および P s t I で消化し、 反応終 了液を常法によりフヱ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈澱処理し T B a m H I お よび P s t I で消化されたプラス ミ ドを得た。 この B a m H I および P s t I で 消化された P I G K— 1 を 0. 1 w g、 上記で得た B a m H I および P s t I で 消化された断片 0. 5 g及び T 4 D N A リ ガ一ゼ 1 ュニッ ト （宝酒造社製） を 6. 6 mM塩化マグネシウム、 1 0 mMジチオスレィ トール及び l O mM A T P を含有する 6 6 mM ト リ スー塩酸緩衝液 （ P H 7. 5 ) に添加し、 温度 1 6 で 8時間反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物で、 ェシヱ リ ヒア ' コ リ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを l O O g Zm l のカナ マイ シ ンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカ リ溶菌法によ りプラス ミ ド D N Aを調製し常法 に従ってァガロースゲル電気泳動を行う こ とにより、 プラスミ ド P I G K— 1 に ェシ リ ヒア ' コ リの t r pプロモーター D N A断片を含む組換えプラスミ ドを 選択し、 これを p I G K— 2 と命名した。
( 3 ) コ リ ネパクテリ ゥム由来複製起点の挿入
前項 （ 2 ) で得られたイ ノ シ ングアノ シンキナーゼ遺伝子および t r pプロモ 一ターを含む組換えプラス ミ ド P I G K— 2 l gを前項 （ 2 ) の反応組成で B a m H I 消化し、 フ χ ノール抽出処理し、 エタノール沈澱を行なった。 B a m H I 消化で消化されたブラス ミ ド p I G K— 2は、 再結合するのを防止するため、 Molecular Cloning 2nd edition (J. Sanbrook, E. F. F r i t s c and T. Man i t i s, Cold Spring Harbour Laboratory Press, pi.60 ( 1989)) の方法でバクテリ ア ル · アルカリ フ ォ スフ ァ ターゼ処理によ り D N A断片の脱リ ン酸化を行い、 つ ノール抽出処理、 エタ ノール沈濺を行なった。
一方、 コリ ネパクテリ ゥム · グルタ ミ カム由来の複製起点を含む領域を p H S G 3 9 9 (宝酒造社製） に挿入して得たプラス ミ ド P H C 4 (特開平 5 — 7 4 9 1 号） 1 g及び制限酵素 K p n I 1 0ュニッ トを 1 0 mM塩化マグネシゥム 及び I mMジチオスレィ トールを含む 1 0 mM ト リ スー塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に加え、 3 7 で 2時間反応し、 該液をフ ノール抽出及びエタ ノール沈殿した。 この K p n I で切断された p H C 4の平滑末端化を DNA Blunting Kit (宝酒造社 製） を用いて指定された方法にて行い、 ついでリ ン酸化済 B a m H I リ ンカ一 (宝酒造社製） を T 4ポリ ヌ クレオチ ドリ ガ一ゼを用いて連結した。 これにより コ リ ネバクテリウム · グルタ ミ カム由来のブラス ミ ドの複製起点を含む領域の両 側に B a m H I 切断部位を持つ D N A断片を得た。 この D N A断片と 2 0ュニッ トの B a m H I を前項 （ 2 ) に記載した緩衝液中で混合し、 温度 3 0 °Cで 2時間 反応した。 反応液をフェ ノール抽出及びェタ ノール沈澱した。
上記で得られた B a m H I 消化で消化されたプラスミ ド P I G K— 2 0. 1 gおよび B a m H I で消化されたプラス ミ ド p H C 4 由来の D N A断片 0. 2 >u g及び T 4 D N A リ ガーゼ （宝酒造社製） 1 ユニッ トを前項 （ 1 ) 記載の緩 衝液中で混合し、 温度 1 6 °Cで 8時間反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物で、 ェシ リ ヒア · コ リ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 0 0 / g /m 1 のカナマイ シンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体 を得た。
得られた形質転換体からアルカ リ溶菌法によ りプラスミ ド D N Aを調製し常法 に従ってァガロースゲル電気泳動を行う ことにより、 プラスミ ド P I G K— 2に コリ ネパクテリゥム厲細菌内で自律複製可能な D N A断片を含む組換えプラスミ ドを選択し、 これを P I G K— 3 と命名した。
なお、 プラス ミ ド p H C 4 を保持するェシ ヱ リ ヒア ' コリ J 1 2 6 1 7は、 日本国茨城県つく ば巿東 1 丁目 1 番 1 号 （郵便番号 3 0 5 ) 工業技術院生命工学 工業技術研究所において平成 3年 4 月 24 日付で受託番号 F E RM P— 1 2 2 1 5のもとに寄託され、 平成 3年 8月 2 6 日付でブ夕ぺス ト条約に基づく 寄託に 移管され受託番号 F E RM B P— 3 5 3 2が付与されている。
( ) p I G K - 3の A T C C 2 1 4 7 7株への遺伝子導入
( 3 ) で得られた p i G K— 3 0. l w gを電気パルス法を用いた形質転換 の常法 （特開平 2 — 2 0 7 7 9 1 号公報） に従い、 コ リ ネ、パクテリ ゥム ' アンモ ニァゲネス A T C C 2 1 4 7 7に導入した。 これをポリペプト ン 1 %、 酵母ェ キス 1 %、 塩化ナ ト リ ウム◦. 5 %、 グルコース 0. 5 %及びカナマイ シン 5 0 U E / m 1 から成る寒天培地上にまき、 形質転換体 A T C C 2 1 4 7 7 / p I G K一 3を得た。
( 5 ) 組換え体のィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性の測定
( 4 ) で得られたコ リ ネバクテリ ゥム ' アンモニアゲネス A T C C 2 1 4 7 7 p I G K— 3をポリペプ ト ン 1 %、 酵母エキス 1 %、 グルコース 5 %、 リ ン 酸二水素カリ ウム 0. 4 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 %、 硫酸アンモニゥム 0. 5 %、 尿素 0. 5 %、 硫酸第一鈇 0. 0 0 1 %、 硫酸マンガン 0· 00 1 %、 千 ァ ミ ン塩酸塩 0. 0 0 5 g Z l 、 パン トテン酸カルシウム 0. O l g Z l ピオ チン 3 0 g / し アデニン 0. 0 5%、 及びカナマイ シン 5 0 m gZ l から成 る培地 （ p H 7. 2 ) 5 0 m l に接種し.. 3 2 °Cで 2 4時間培養した。 該培養液 を常法に従って遠心分離し、 菌体を集めた。
この菌体を 0. 9 %塩化ナ ト リ ウム水溶液で懸獨し、 遠心分離する操作を 2回 繰り返し菌体を洗浄した。 該菌体を 2 0 %グリセロール、 l O O mM塩化力 リウ ム、 5 mM 2—メルカプ トエタノールを含む 5 0 mM ト リ スー塩酸緩衝液 （ p H 7. 9 ) に懸獨し、 1 5 0 W、 2 0分超音波処理 （ K u b o t a社製） した後、 1 5， 00 0 r p m、 3 0分遠心分離して上淸を得た。 この上淸をセフ アデクス G— 2 5 (Pharmacia社製） カラムクロマ ト グラフ ィ ーに供し、 低分子量物質を除 いたものを粗酵素液と した。
得られた粗酵素液のィ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を 1 0 OmMT r i s、 l OmM塩化マグネシウム、 l mMAT P、 2 50mM塩化カ リ ウム、 0· 2m M [ 8 - "' C ] 一イ ノ シンからなる反応組成液をもちいて測定した。 粗酵素液と 混合し、 30 、 30分反応の後、 1部をシリ カゲルプレー ト （メルク社製） に スポッ ト し、 n—ブタノール、 ェタノール、 水それぞれ 2 : 1 : 1 の体積比から なる展開液で展開した。 バイオイメージアナライザー （富士写真フ ィ ルム社製） で 5 ' —イ ノ シン酸のスポッ トを検出し定量した。 また、 粗酵素液の蛋白質濃度 はゥシ血清アルブミ ンを標準と してバイオ · ラ ッ ド社製プロティ ンアツセィキッ トを用いて測定し、 酵素の比活性を算出した。 対照と して、 プラス ミ ド p H K 4 による形質転換体 AT C C 2 1 4 77Zp HK 4の比活性を求めた。 その結果を 表 1 に示した。 A T C C 2 1 4 7 7 Z p H K 4では活性が検出されなかったのに 対し、 A T C C 2 1 4 7 7 Z p I G K— 3は高い活性を有していた。 この結果 から、 導入したェシ X リ ヒ · コ リ 由来の断片がコリ ネパクテリ ゥム · アンモニア ゲネスにおいてイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を発現していることが示され た。
なお、 プラス ミ ド P HK 4は、 p I GK— 3から t r pプロモーター及びイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子を除去した構造を有しており、 対照と して使用 した。
ェシェ リ ヒア ' コ リ H B 1 0 1 に p HK 4を保持させた株は、 A J 1 3 1 36 と命名され、 1 99 5年 8月 1 日付で、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 1号 (郵便番号 305 ) 工業技術院生命工学工業技術研究所にブタぺス ト条約に基づ き国際寄託され、 受託番号 F E RM B P— 5 1 86が付与されている。 菌 株 比活性（nmo 1 /m i n/mg protein)
ATCC21477/pHK4 検出されず
ATCC21477/plGK-3 1 86. 6
実施例 2 (ェシヱ リ ヒア ' コ リ由来のィ ノ シン—グアノ シンキナーゼ遗伝子保 持株を用いたイ ノ シンからの 5 ' —イ ノ シン酸の生産）
ポリペプト ン 1 %、 酵母エキス 1 %、 グルコース 5 %、 リ ン酸二水素カ リ ウム 0. 4 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 %、 硫酸アンモニゥム 0. 5 %、 尿素 0. 5 %、 硫酸第一鉄 0. 00 1 %、 硫酸マンガン 0. 00 1 %、 チア ミ ン塩酸塩 0. 005 g / 1 , ノ《ン トテン酸カルシウム 0. 0 1 g / l 、 ピオチン 30 w g / し アデニン 0. 0 5%、 及びカナマイ シン S Om gZ l から成る培地 （ p H 7. 2 )
4 50 m 1 にコ リ ネノ、'クテリ ゥム · アンモニアゲネス A T C C 2 1 4 7 7 / p I G K— 3を接種し、 32 °Cで 24時間培養し培養物を得た。 この培養物を 7， 0 00 r p mで 1 0分間遠心分離処理し沈濺物と して湿菌体 20 gを得た。
得られた菌体をイ ノ シン 50 g / l、 リ ン酸二水素カ リウム 20 g/ l、 グル コース 30 g Z 】 、 硫酸マグネシウム 5 g 1 、 フ ィ チン酸 （重量比 50%) 1 O g Z l 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g / アデニン l g Z l からなる反応液 ( p H 7. 2 ) 20m l に 200 gノ 1 となるように懸獨し、 攬抻しつつ 32 °C に保ち反応を行った。 p Hは 4 N水酸化ナ ト リ ウムを用いて適宜 7. 2となるよ うに調整し、 リ ン酸二水素カリ ウムの減少分を適宜添加した。 対照と して A TC C 2 1 4 7 7 ZP H K 4について反応を行い 30時間反応後の反応液中の 5' — ィ ノ シン酸を高速液体クロマ ト グラフ ィ ーを用いて定量した。 結果を表 2に示す。
5 ' 一イ ノ シン酸蓄積値は 5' —イ ノ シン酸ニナ ト リ ウム 7 · 5水和物換算値に て示した。 この結果からェシ リ ヒア ' コ リ 由来のイ ノ シン一グアノ シンキナー ゼ遺伝子を保持している A TC C 2 1 4 7 7 / p I G K— 3でイ ノ シンから 5' —ィ ノ シン酸への変換がみられた。 表 2
Figure imgf000029_0001
実施例 3 (ェシ ヱ リ ヒア ' コ リ 由来のイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子保 持株を用いたイ ノ シンからの 5 ' —イ ノ シン酸の生産）
実施例 2で得た菌体をイ ノ シン 60 g Z l、 リ ン酸ニ水素カ リ ウム 20 g Z l 、 グルコース 3◦ g Zし 硫酸マグネシウム 5 g Z 1 、 フ イ チン酸 （重量比 5 0%) 1 0 gノ 1 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g / アデニン 1 g / 1 からなる反応 液 （ P H 7. 2 ) 50m l に 200 ΕΖ 1 となるように懸濁し、 通気桷拌しつつ
3 2 °Cに保ち反応を行った。 p Hは p H計で測定しつつ常に 7. 2となるように
4 N水酸化ナ ト リ ゥムを添加して調整し、 リ ン酸ニ水素力リ ゥムの減少分を適宜 添加した。 2 2時間反応後の蓄積値は 1 1 3. 8 g / 1 であり添加したイ ノ シ ン に対するモル収率は約 1 00 %であった。
実施例 4 (ェシ X リ ヒア · コ リ 由来のイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子保 持株を用いたグアノ シンからの 5 ' —グァニル酸の生産）
反応液中のイ ノ シンの代わり にグアノ シン 1 gZ l を用いて、 実施例 2と同様 にして反応を行った。 30時間反応後、 反応液中の 5 ' —グァニル酸を高速液体 クロマ トグラフ ィ ーを用いて定量した結果、 AT C C 2 1 4 7 7 / p I G K - 3 を用いた反応液中には、 5' —グァニル酸ニナ ト リ ウム塩 · 6. 5水和物換算で 0. 05 gZ l の 5 ' グァニル酸が S積していた。 実施例 5 (エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムからのイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質の単離精製およびその諸性質）
( 1 ) 菌体および粗酵素抽出液の調製
ポリペプ ト ン 1 %、 ノ ク ト ' イース トエキス トラク ト 1 %、 グルコース 0. 5 %及び塩化ナ ト リ ウム 0. 5%から成る培地 （ p H 7. 2 ) 1 00m l に、 ェキ シグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム AT C C 95 3を接種し、 30 で 24時 間培養し培養物を得た。 これを 2 1 の同培地に接種し、 30°Cで 8時間培養し、 得られた培養物を 7, 000 r p mで 1 0分間遠心分離処理し、 沈澱物を 2度 0. 9 %塩化ナ ト リ ウムで洗浄し湿菌体 1 0 gを得た。 この菌体を l O OmM 塩化 カルシウム、 及び、 I mM ジチオスレィ トールを含む l O OmM— ト リ ス塩酸 緩衝液 （ p H 7. 5 ) (緩衝液 A ) 1 0m l に懸 «し、 径 0. 1 mmのガラスビ ーズを加えビーズビータ一 （バイオスペッ ク社製） にて破砕した。 該破砕液を 1 5, O O O r p mで 1 0分遠心分離処理し上淸を同緩衝液にて透析し粗酵素抽出 液約 20 m 1 を得た。 粗酵素抽出液のイ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を以下の方法により測定し た。 粗酵素抽出液 5 w l を 5 mM 塩化マグネシウム、 5 mM A T P、 1 00 mM塩化カリ ウム及び 0. 2 mM [8— '' 'C] 一イ ノ シンを含む l O OmM ト リ スー塩酸緩衝液 （ P H 7. 5 ) からなる反応液に加え 50〃 1 と し、 30°C、 3 0分反応した。 反応液のうち 2 1 をシリ 力ゲルプレー ト （メルク社製） にスポ ッ トすることにより反応を停止し、 n—ブタノール、 エタノール、 水それぞれ 2 ： 1 ： 1の体積比からなる展開液で展開し、 バイオイ メージアナライザー （FU J I X社製） で 5 ' —イ ノ シン酸のスポッ トを検出し定！:した。 また、 粗酵素液 の蛋白質濃度はゥシ血清アルブミ ンを標準と してプロテイ ンアツセィ （バイオ ' ラ ッ ド社製） を用いて測定し、 酵素の比活性を算出した。 粗酵素抽出液には 0. 4 5 nmol/iin/ng蛋白質のィ ノ シン · グアノ シンキナーゼ活性が認められた。
( 2 ) イ ノ シン一グアノ シンキナ一ゼ活性を有する蛋白質の精製
前項で得られた粗酵素抽出液を緩衝液 Aで平衡化した D E A E— トヨパール (東洋曹達社製） カラムに供し、 緩衝液 Aで洗浄した後、 塩化カ リ ウムを 200 mMを含む同緩衝液でイ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出 した。 得られた活性画分 25m l に硫安を 30%飽和となるように加え 4でで 3 0分攬はんの後、 遠心分離によ り沈 ίδ物を除去した。 得られた上清を 30%硫安 を含む緩衝液 Aで平衡化したブチルトヨパール （東洋曹達社製） カラムに供した。 同緩衝液で洗净した後、 200m l の 30%から 1 5 %硫安を含む緩衝液 Aの直 線的濃度勾 Kによ り イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出し た。 得られた活性画分約 1 5m l を 2 1 の 50mM 塩化カ リ ウム、 I mM ジ チオスレィ トール及び 20%グリセロールを含む 2 5 mM ト リ ス—塩酸緩衝液
( P H 7. 5 ) (緩衝液 B) に対して透析した。 該液を 1 5. O O O r p mで 1 0分遠心分離した上清を塩化カ リ ウムを 1 00 mMと した緩衝液 Bで平衡化した MonoQ FPLC HR5/5 (フアルマシア社製） カラム に供した。 同緩衝液で洗浄した後、 1 00 mMから 500 mM硫安の直線的濃度 勾 によ り イ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。 得ら れた活性画分約 5m l を 2 1 の I mMジチオスレィ トール及び 20%グリセロー ルを含む 1 0 mMリ ン酸カ リウム緩衝液 （ p H 7. 4 ) (緩衝液 C) に対して透 祈し、 同緩衝液にて平衡化したヒ ドロキシルァパタイ ト TSK-GEL HA-1000 (東洋曹 達社製） カラムに供した。 同緩衝液で洗浄した後、 3 Om 1 の 1 OmMから 50 OmMのリ ン酸カ リ ウムを含む緩衝液 Cの直線的濃度勾 にてイ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質を溶出した。
得られた活性画分約 6 m 1 を再度同様の操作を緣り返しヒ ドロキシルァパタイ トカラムに供し、 30m 1 の 1 OmMから 200πιΜのリ ン酸カ リ ウムを含む緩 衝液 Cの直線的濃度勾 にてイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質 を溶出した。 得られた活性画分のうち髙活性画分 2 m 1 を 1 mM ジチオスレィ トール、 20% グリセロール及び l O O mM 塩化カ リ ウムを含む 25 mM 卜 リ スー塩酸緩衝液 （ P H 7. 5 ) で平衡化したゲル濾過 Hiload Superdex 200p g 16/60 (フ アルマシア社製） カラムに供し、 同緩衝液にて溶出した。 高活性画分 2 m l のうち 5 1 を S D Sポリ アク リルァミ ドゲル電気泳動に供したところ、 銀染色 （ナカライテスク社製） にて分子量約 36キロダルト ンの蛋白が検出され た。 これによりエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質が単離されその分子量は S D S—ポリ アク リ ル ア ミ ドゲル電気泳動上 36キロダル ト ンであることが明かとなった。
( 3 ) エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のイ ノ シン一グアノ シンキ ナーゼの諸性質
精製されたイ ノ シン一グアノ シンキナーゼを 5mM 塩化マグネシウム、 5m A T P、 l O OmM 塩化カ リ ウム、 0. 1 6 mM グアノ シン及び 0. 0 4 mM [ 8 - 1 " C ] —グアノ シンを含む l O OmM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に加えた反応液 50 1 を基本組成と して 30°C、 1 0分反応した: 該酵素は次の諸性質を有していた。
1. 作用
A T P、 2 ' ーデォキシアデノ シン三リ ン酸、 グアノ シン三リ ン酸、 2' —デ ォキシグアノ シン三リ ン酸及びチミ ジン三リ ン酸からなる群より選ばれるヌ クレ オシ ド三リ ン酸をリ ン酸供与体と して、 グアノ シン、 イ ノ シン及び 2' —デォキ シグアノ シンからなる群よ り選ばれるヌ ク レオシ ドに リ ン酸基を転移し、 それぞ れ 5' —グァニル酸、 5' —イ ノ シン酸及び 2' —デォキシ— 5' —グァニル酸 からなる群よ り選ばれるヌ ク レオシ ドの 5 ' —モノ リ ン酸エステルを生成する。
2. 基質特異性
グアノ シンに変えて各種ヌ ク レオシ ドを 0. 5mM加え、 AT Pに [r一 32 P] 一 A T Pを添加するこ とにより反応を行った。 生成したヌクレオシ ド 5' — リ ン 酸エステルを測定した結果を表 3に示した。 グアノ シ ン、 イ ノ シ ン及び 2 ' —デ ォキシグアノ シンがリ ン酸受容体となった。 表 3
ヌ ク レオシ ド ( 0. 5 mM) 相対活性 （％ ) グア ノ シン 1 00
2 ' 一デォキシグアノ シン 4
イ ノ シン 5
キサン ト シ ン 0
アデノ シン 0
2 ' —デォキシアデノ シン 0
A T Pに代えて各種ヌ ク レオシ ド三リ ン酸を 5mM用いて反応を行い、 リ ン酸 供与体を検討した結果を表 4 に示した。
A T Pの他に、 2 ' —デォキシアデノ シ ン三リ ン酸、 グア ノ シ ン三リ ン酸、 2 ' ーデォキシグア ノ シ ン三リ ン酸及びチ ミ ジン三リ ン酸がリ ン酸供与体となった:
表 4
Figure imgf000034_0001
3. 至適 p H
綴衝液成分を 1 00 mMの酢酸ナ ト リウム 酢酸緩衝液 （ p H 4 · 2— 5. 6 ) 2—モルホリ ノエタンスルホン酸 （以下 ME S ) 水酸化ナ ト リ ウム緩衝液 （P H 5. 4 — 6. 3 ) 3—モルホリ ノプロパンスルホン酸 （以下 MO P S ) —水 酸化ナ ト リ ウム緩衝液 （ P H 6. 3 - 7. 2 ) 、 ト リ スー塩酸緩衝液 （ P H 7. 2— 8. 8 ) 、 シクロへキシルァミ ノプロパンスルホン酸 （以下 C A P S ) —水 酸化ナ ト リ ウム緩衝液 （ p H 8. 8 - 1 0. 4 ) あるいはグリ シン一水酸化ナ ト リ ウム緩衝液 （ ρ Η Ι Ο. 3— 1 1. 0) に変更し、 反応を行った。 至適 P Hは 7. 7 - 9. 9であった。
4. p H安定性
酵素を 2. 5 m g 1 ゥシ血澝アルブミ ン、 2 5 mM塩化カ リ ウム、 0. 2 5 mMジチオスレィ トール及び 5%グリセロールを含む 25 OmM齚酸ナ ト リウ ムー酢酸緩衝液 （P H I . 5 - 5. 6 ) 、 M E S 水酸化ナ ト リ ウム緩衝液 （ P H δ . 4 一 6. 4 ) 、 MO P S—水酸化ナ ト リウム緩衝液 （ p H 6. 3— 7. 3 ) ト リ ス—塩酸緩衝液 （p H 7. 2 - 8. 8 ) 、 C A P S—水酸化ナ ト リ ウム緩衝 液 （ p H 8. 9— 1 0. 4 ) あるいはグリ シン一水酸化ナ ト リウム緩衝液 （ p H 1 0. 5— 1 3. 3 ) にて室温で 30分処理を行った後活性を測定した。 P H 6. 7— 1 2. 1の範囲で活性は安定であった。
5. 至適温度
温度を 1 6 °C— 60 °Cの範囲で反応を行ったところ、 至適温度は 30 — 50
°Cであった。
6. 温度安定性
酵素を 5m g m l ゥシ血清アルブミ ン、 50mM塩化カ リ ウム、 0. 5 mM ジチオスレィ トール及び 1 0%グリセロールを含む 1 2. 5 mM ト リ スー塩酸緩 衡液 ( P H 7. 5 ) で 4 一 60°C、 30分処理し、 残存活性を測定した。 2 5て 以下の処理で 50%以上の活性が残存し、 4 0°C以上では失活した。
7. 金属要求性
反応液中の塩化マグネシウムを各種金属イオンに変更し反応を行った。 結果を 表 5に示した。 本活性には金属イオンが必要であり、 マグネシウムイオン以外に マンガンイオン、 コバル ト イオン及び、 鉄イオンによって反応が進行した。
表 5
Figure imgf000036_0001
8. 金属イオンによる影 S
反応組成に各種金属イ オンを I mM加えたときの相対活性を表 6に示した。 本 酵素は、 銅イオン及び、 水銀イオンで強く 阻害を受け、 亜鉛イオン及び、 カ ドミ ゥムイオンでも阻害を受けた。
表 6
Figure imgf000037_0001
9. K m値
反応組成の基質濃度を変化させ測定した本酵素の K m値はグアノ シンに対して 0. 0 3 mM, イ ノ シンに対して l mM、 グアノ シンを基質と した場合、 A T P に対しては 1 . 6 m Mであった。
1 0. 分子量
S D S —ポリ アク リルァ ミ ドゲル電気泳動により約 3 6キロダル ト ンである。 実施例 6 (エキシグォバクテリゥム · ァセチリ カム染色体からの遺伝子の単離）
( 1 ) N末端ァミ ノ酸配列の決定
実施例 5 ( 2 ) で得られた活性画分約 2 m l をセン ト リ コンー 1 0 (アミ コン 社製） を用いて 6. 00◦ r p mで 3時間の遠心操作により約 0. 2m l に濃縮 した。 これをプロスピン （アプライ ドバイオシステム社製） を用いて遠心操作に よ り蛋白をフ ィ ルター上にブロ ッ 卜 した。 このフ ィ ルターを 20%メ タノールで 3回洗浄の後、 乾燥しプロテイ ンシークェンサ一 4 7 6 A (アプライ ドバイ オシ ステムズ社） を用いて N末端のア ミ ノ酸 列を決定した。 决定したアミ ノ酸配列 を 列表 列番号 3に示す。 X a aは同定できなかったものを示す。 未同定アミ ノ酸 1個を含む N末端の 2 8ア ミ ノ酸が決定された。
( 2 ) エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムの染色体 D NAの調製と N末端 領域の增幅
実施例 5 ( 1 ) と同様に 500 m 1 の培養液からエキシグォバクテリ ウム · ァ セチリ カム A T C C 9 5 3の湿菌体 3 gを得た。 該菌体から斉藤、 三浦の方法 (Biochem. Biophys. Acta. , 72. 619, ( 1963)) によ り染色体 D Ν Αを抽出した c 前項 （ 1 ) で得られた N末端アミ ノ酸配列を基にオリゴヌ クレオチドを合成し た。 塩基配列は、 コ ドンの縮退を考慮し、 配列表配列番号 4及び 5に示すオリゴ ムク レオチ ドの混合物と した。
プライマーと して該オ リ ゴヌ ク レオチ ド 0. 25 m o l e、 铸型と してェキ シグォバクテリ ウム ' ァセチリ カム A T C C 9 5 3の染色体 D N A 0. 1 u g 及びタ ッ ク遗伝子ポリ メラーゼ （宝酒造社製） 2. 5ユニッ トを d AT P、 d C T P、 d G T P、 d TT P各 2 00〃Μ、 50 mM 塩化カ リ ウム、 1. 5 mM 塩化マグネシウム及び 0. 000 1 %ゼラチンを含有する 1 0mM ト リ ス— 塩酸綏衝液 （ P H 8. 3 ) 0. 1 m 1 に添加し、 94 を 30秒、 55でを 30 秒、 7 2 を 1 分のサイ クルを 30回繰り返す P C R法を行った。 反応液をァガ ロースゲル電気泳動に供し、 増幅された約 80ベースの DNA断片をグラスバウ ダー （宝酒造社製） を用いて回収した。 この DNA断片約 0. 2〃 gをクレノウ フラグメ ン ト 2ユニッ ト、 d A T P、 d C T P、 d GT P、 d TT P各 200〃 M、 1 mM 2—メルカプトエタノール及び 7 mM 塩化マグネシウムを含む 5 0 mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) 50 w 1 に添加し、 3 7 °Cで 30分 平滑末端化反応した。 該反応液をフエ ノール抽出及びエタノール沈澱した。 沈澱 物と して得られた平滑末端化された DNA断片を T 4ポリ ヌ クレオチドキナーゼ 1 0ユニッ ト、 l O mM 塩化マグネシウム、 5 mM ジチオスレィ トール、 0.
1 mM スペルミ ジン、 0. I mM E D T Aを含む 5 0 mM ト リ スー塩酸緩衝 液 （ P H 7. 6 ) に溶解し、 末端リ ン酸化反応を 3 7 °Cで 1 時間行った。 該反応 液をフ ノール抽出及びエタノール沈澱し、 沈澱物と して P C R産物の末端平滑 化及びリ ン酸化物を回収した。 プラス ミ ドベクター P U C 1 8 (宝酒造社製） 1 u R及び制限酵素 S m a I 2 0ユニッ トを、 1 0 mM 齚酸マグネシウム、 6 6 mM 齚酸カ リウム、 0. 5 mM ジチオスレィ トール及び 0. 0 1 %牛血清アルブミ ンを含有する 3 3 m M ト リ スー齚酸緩衝液 （ p H 7, 9 ) 5 0〃 1 に混合し、 温度 3 0 で 2時間反 応させて消化液を得、 該液を常法によ りフ X ノール抽出及びエタ ノール沈澱した この後、 プラスミ ドベクター由来の D N A断片が再結合するのを防止するため、 D N A断片の脱リ ン酸化を行い、 常法によ りフエ ノール抽出処理し、 エタノール 沈 ίδを行なつた。 この S m a I で消化された P U C 1 8を 0. 1 y g、 P C R産物の末端平滑化 及びリ ン酸化物約 0. 1 g及び T 4 D N A リ ガーゼ 1 ユニッ ト （宝酒造社製） を 6. 6 mM 塩化マグネシウム、 l O mM ジチオスレィ トール及び l O mM
A T Pを含有する 6 6 mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) 2 0 I に添 加し、 温度 1 6 °Cで 8時間反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物 で、 常法によ りェシエ リ ヒア * コリ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 0 0 g Zm l のアンピシリ ンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体 を得た。 得られた形質転換体からアルカ リ溶菌法によりプラスミ ド D N Aを調製した。 該プラスミ ド D N Aはエキシグォパクテリゥム · ァセチリ カム A T C C 9 5 3の染色体 D N A由来の約 80ベースの D N A断片を含んでいた。 得られたプラ スミ ド D N Aを用いて該 D N A断片の塩基配列の决定を行った。 塩基配列の決定 は、 Taq DyeDeoxy Terminator Cycle Sequencing Kit (ノ、。一キンェ Jレマ一社製） を用い Sangerの方法 （J. Mol. Biol. , 143. 161 ( 1980)) に従って行った。 これ によ りエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム A T C C 9 53のイ ノ シンーグ ァノ シ ンキナーゼ蛋白の Ν末端領域に相当する DN A 83ベースの塩基配列が決 定された。
( 3 ) エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムのイ ノ シ ン一グアノ シ ンキナー ゼをコー ドする遺伝子断片の単離
前項 （ 2 ) で調製したエキシグォパクテリ ゥム ' ァセチリ カム A T C C 9 5 3の染色体 DN A 1 0 gを E c o R I 4 0ユニッ ト、 1 0 m M塩化マグネシ ゥム、 1 O O mM塩化ナ ト リ ウム及び 1 mMジチオス レィ 卜一ルを含有する 50 mMト リ ス—塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に混合し、 温度 3 7 °Cで 2時間反応させ た。 反応終了液を常法によ りフ X ノール抽出処理し、 エタノール沈澱処理して £ c 0 R 1 で消化されたエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム A T C C 9 53 の染色体 D N Aを得た。 この E c o R Iで消化された D N Aを 1 〃 g、 E c o R I カセ ッ ト （宝酒造社製） 0 · 05〃 g及び T 4 D N A リ ガーゼ 1 0ユニッ ト (宝酒造社製） を 6. 6 mM 塩化マグネシウム、 1 0 mM ジチオスレイ ト一 ル及び 1 0 mM AT Pを含有する 66 mM ト リ ス—塩酸緩衝液 （ρ Η 7. 5 ) に添加し、 温度 1 6 °Cで 8時間反応し、 D N Aを連結させた。 該反応液をフ ェ ノ ール抽出処理し、 エタ ノール沈澱処理して E c o R I カセッ トを連結したエキシ グォパクテリ ゥム · ァセチリ カム A T C C 9 53の染色体 D N A消化物を得た。 前項 （ 2 ) で決定された 列を基にそれぞれ K列表 £列番号 6及び 7に示す塩 基 SE列を有するオリゴヌ ク レオチ ド S 1及び S 2を合成した。 プライマーと してオリ ゴヌク レオチ ド S 1及びカセッ トプライマー C 1 (宝酒 造社製） をそれぞれ 0. 2 m o 1 e、 铸型と して E c o R I カセッ トを連結し たエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム AT C C 9 53の染色体 DN A消化 物 0. 2 u も及びタ ッ ク D N Aポリ メラーゼ （宝酒造社製） 2. 5ユニッ トを d AT P, d C T P、 d G T P、 d TT P各 200〃M、 50 mM 塩化カ リ ウム、 1. 5 mM 塩化マグネシウム及び 0. 000 1 % ゼラチンを含有する 1 0m M ト リ ス一塩酸緩衝液 （ p H 8. 3 ) 0. 1 m 1 に添加し、 94 °Cを 30秒、 55°Cを 2分、 7 2°Cを 3分のサイ クルを 2 5回繰り返す P C R法を行った。 該 反応液の 1 1 を銬型と し、 プライマーと して合成したオリゴヌ ク レオチ ド S 2 及びカセッ トプライマ一 C 2 (宝酒造社製） それぞれ 0. 2〃 m o l eを用いて 同条件で P C R反応を行った。 該反応液の一部をァガ CIースゲル電気泳動に供し たところ、 約 1、 000ベースの断片のみが特異的に増幅されており蛋白の N末 端領域から遗伝子の下流側の^^ R I切断部位までを含む D N A断片が取得さ れた。
該 D N A断片をグラスパウダー （宝酒造社製） を用いて回収した。 この D NA 断片約 0. 2 gをクレノウフラグメ ン トを用いて 3 7 °Cで 30分平滑末端化反 応した。 該反応液をフ ノール抽出及びエタノール沈澱した。 沈濺物と して回収 した D N A断片を T 4ポリ ヌ ク レオチ ドキナーゼを用いて末端リ ン酸化反応を 3 7°Cで 1時間行った。 該反応液をフエ ノール抽出及びエタノール沈澱し、 沈澱物 と して P C R産物の末端平滑化及びリ ン酸化物を回収した。 プラス ミ ドベクタ一 P U C I 8 (宝酒造社製） 1 Z κを制限酵素 S m a I を用 いて温度 30でで 2時間反応させて消化液を得、 該液を常法によ りフエ ノール抽 出及びエタノール沈濺した。 この後、 バクテリ アル ' アルカ リ フ ォ スフ ァ ターゼ 処理によ り DN A断片の脱リ ン酸化を行い、 フヱ ノール抽出処理し、 エタノール 沈澱を行なつた。 この S m a I で消化された P U C 1 8を 0. 1 g、 P C R産物の末端平滑化 及びリ ン酸化物約 0. 1 は g及び T 4 DN Aリガーゼ 1ュニッ ト （宝酒造社製） を用いて温度 1 6 で 8時間反応し、 DN Aを連結させた。 次いで該 D N A混合 物で、 ェシ リ ヒア . コ リ J M 1 09 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 00 g/m 1 のアンピシリ ンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体を得た。 得られた形質転換体からアルカ リ溶菌法によりプラスミ ド DN Aを調製し、 P C Rによる増幅断片を含むプラス ミ ドを得た。 このプラスミ ドを P C S 2と命名 した。 オリゴヌ クレオチ ド S 1 、 S 2に対して相補的なオリゴヌ クレオチドを合成し、 それぞれ S 4、 S 3 と した。 プライマーと してオリ ゴヌ クレオチ ド S 3および力 セ ッ トプライマー C 1 (宝酒造社製） 、 铸型と して E c o R I カセッ トを連結し たエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム A T C C 9 5 3の染色体 D N A消化 物を用いて同条件の P C R法による增幅を行った。 得られた反応液を铸型と し、 プライマーと してオリゴヌ クレオチ ド S 4 及びカセ ッ トプライマ一 C 2 (宝酒造 社製） を用いて P C R法を行い、 約 2, 3 0 0ベースの蛋白の N末端領域から遗 伝子の上流側の E c o R I 切断部位までを含む D N A断片を增幅した。
該 D N A断片約 0. 2 〃 gをクレノウフラグメ ン トを用いて 3 7 °Cで 3 0分平 滑末端化反応した。 該反応液をフエ ノール抽出及びエタノール沈澱した。 沈澱物 と して回収した D N A断片を制限酵素 I 1 0ユニッ ト、 l O mM 塩化 マグネシウム及び I mM ジチオスレィ トールを含有する 1 0 mM ト リ ス一塩 酸鍰衝液 （ P H 7. 5 ) 5 0 1 に混合し、 温度 3 7 °Cで 2時間反応させて消化 液を得、 該液をフヱ ノール抽出及びエタノール沈澱した。 プラスミ ドベクター P U C 1 8 (宝酒造社製） 1 υ κ及び制限酵素 Κ ρ η I 、 H i n C Dそれぞれ 5ユニ ッ トずつを 1 0 mM 塩化マグネシウム、 5 0 mM 塩化ナ ト リ ウム及び I mM ジチオスレィ トールを含有する 3 3 mM ト リ ス— 酢酸緩衝液 （ P H 7. 9 ) 5 0 1 に混合し、 温度 3 7 °Cで 2時間反応させて消 化液を得、 該液をフエ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈澱を行なった。
この K p n I 及び H i n c !Iで消化された P U C 1 8を 0. l g、 P C R産 物の末端平滑化及び K p n I 消化物約 0· 1 gを T 4 D N A リ ガ一ゼ （宝酒造 社製） を用いて温度 1 6てで 8時間反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物で、 ェシ リ ヒア ' コ リ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 こ れを 1 O O g / 1 のアンピシリ ンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体を 得た。
得られた形質転換体からアル力 リ溶菌法によ りプラスミ ド D N Aを調製し、 約 6 0 0ベースの蛋白質の N末端領域から遛伝子の上流側の ϋ_Β_ΙΙ I 切断部位まで を含む D N A断片を含むプラス ミ ドを選択した。 このプラス ミ ドを P K S 4 と命 名した。
( 4 ) エキシグォバクテリ ウム * ァセチリ カム A T C C 9 53のイ ノ シンーグ ァ ノ シ ンキナーゼ遺伝子の塩基配列の決定
前項 （ 3 ) で得られたプラス ミ ド P C S 2及び p K S 4の塩基配列の決定を行 つた。 これから推定されるオープン · リーディ ング · フレームの塩基 S列を配列 表 列番号 1 に示す。 また、 その塩基配列よ り推定される産物のアミ ノ酸 列を 列表配列番号 2に示した。 すなわち、 S列表配列番号 2に示されるアミ ノ酸配 列から成る蛋白質をコー ドする遗伝子が、 エキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ 力 ム A T C C 9 53のイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子である。
塩基配列、 ア ミ ノ酸配列おのおのについて既知の配列との相同性比較を行った 用いたデータベースは EMB L及び SW I S S— P ROTである。 その結果、 配 列表 列番号 1 に示される DN A及びそれにコードされる蛋白質は新規であるこ とが判明した。 また、 これまでイ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコードする遺伝 子と して唯一明らかになつているェシヱ リ ヒア · コリ 由来のイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼをコー ドする Λ伝子 ffi列とは相同性は低く 全く別のィ ノ シン一グアノ シンキナーゼをコ一ドする遗伝子であるこ とが明かとなつた。
本遗伝子のコー ドする蛋白質は、 303個のアミ ノ酸から成り、 その 列から 予想される蛋白の分子量は 32. 5キロダル ト ンであった。 実施例 7 (エキシグォパクテリ ゥム ' ァセチリ カム A T C C 9 53由来のィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子発現プラスミ ドの構築とコ リ ネパクテリ ゥム • アンモニアゲネスへの導入）
( 1 ) P C R法によるィ ノ シングアノ シンキナーゼ遺伝子の増幅とクローニング エキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ 遗伝子の両端に位置し、 それぞれ制限酵素 P s t I、 S p h I 切断部位を有する 配列表 K列番号 8及び 9に示すォリゴヌクレオチドを合成した。
プライマーと して該オリゴヌ ク レオチ ド 0. 25 m o 1 e、 铸型と して実施 例 6 ( 2 ) で調製したエキシグォパクテリ ゥム ' ァセチリ カム A T C C 95 3の 染色体 D N A O. l g及びタ ッ ク DN Aポリ メラ一ゼ （宝酒造社製） 2. 5ュ ニッ トを d A T P、 d C T P、 d G T P、 d TT P各 2 00〃M、 50 m M 塩 化カリ ウム、 1. 5 mM 塩化マグネシウム及び 0. 000 1 %ゼラチンを含有 する 1 OmM ト リ スー塩酸緩衝液 （ p H 8. 3 ) 0. 1 m 1 に添加し、 94 °C を 30秒、 5 5 °Cを 30秒、 7 2 °Cを 30秒のサイ クルを 2 5回繰り返す P C R 法を行った。 反応液をァガロースゲル電気泳動に供し、 目的とする DN A断片を グラスパウダー （宝酒造社製） を用いて回収した。 該 D N A断片約 2 g及び制 限酵素 P s t I および S p h I それぞれ 1 0ュニッ トを 1 OmM 塩化マグネシ ゥム、 l O OmM 塩化ナ ト リ ウム及び I mM ジチオスレィ トールを含有する 50 mM ト リ ス一塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) 50〃 1 に混合し、 温度 3 7 で 2時間反応させて消化液を得、 該液をフ ノール抽出及びエタ ノール沈澱した c プラス ミ ド P H S G 2 98 (宝酒造社製） l 〃 g及び制限酵素 P s t I および S p h I それぞれ 20ユニ ッ トを 1 0 mM塩化マグネシウム、 l O OmM 塩 化ナ ト リ ウム及び I mM ジチオスレィ トールを含有する 50mM ト リ ス一塩 酸緩衝液 （ P H 7. 5 ) におのおの混合し、 温度 3 7 °Cで 2時間反応させた。 反 応終了液を常法によ りフ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈澱処理して P s t 1 および S p h I で消化されたプラス ミ ド p H S G 2 98を得た。 この P s t Iお よび S p h I で消化された p H S G 2 98を 0. 1 〃 g、 P s t Iおよび S P h Iで消化された P C Rによる増幅断片 0. 5 g及び T 4 D N Aリ ガーゼ 1ュ ニッ ト （宝酒造社製） を 6. 6 mM 塩化マグネシウム、 1 OmM ジチオスレ ィ トール及び 1 0mM A T Pを含有する 66 mM ト リ スー塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に添加し、 温度 1 6°Cで 8時間反応し、 DN Aを連結させた。 次いで該 DN A混合物で、 常法によりェシ リ ヒア ' コリ J M 1 09 (宝酒造社製） を 形質転換し、 これを 1 00 g /m 1 のカナマイ シ ンを含む L寒天培地上にまき, 形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカ リ溶菌法によりプラス ミ ド D N Aを調製しァガ ロースゲル電気泳動を行う ことにより、 プラスミ ド P H S G 298にエキシグォ バクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のィ ノ シングアノ シンキナーゼ遺伝子が挿入さ れた組換え体プラス ミ ドを選択した。 このプラスミ ドを p B A— 1 と命名した。
( 2 ) ェシ ヱ リ ヒア ' コ リの t r pプロモーターの挿入
実施例 1 ( 2 ) と同様にして、 B a m H I 及び P s t I で切断されたェシエ リ ヒア · コ リ t r pプロモーターを含む D N A断片を得た。 前項 （ 〗 ） で得られたイ ノ シ ングアノ シンキナーゼ遺伝子を含む D N A断片が 挿入された組換え体プラス ミ ド p B A— 1 l gを B a m H I および P s t I で消化し、 反応終了液を常法によ りフユ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈澱処理 して B a m H I および P s t I で消化されたプラス ミ ドを得た。 この B a m H I および P s t I で消化された p B A — 1 を 0. 1 〃 g及び B a m H I 及び P s t I で切断されたェシヱ リ ヒア ' コ リ t r pプロモーターを含む D N A断片を T 4 D N A リ ガーゼ 1 ユニッ ト （宝酒造社製） を用いて連結反応し、 D N Aを連結さ せた。 次いで該 D N A混合物で、 ェシエ リ ヒア ' コリ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 0 0 g Zm l のカナマイ シ ンを含む L寒天培地上にま き、 形質転換体を得た。
得られた形質転換体からプラス ミ ド D N Aを調製しァガロースゲル電気泳動を 行う ことによ り、 プラス ミ ド p B A — 1 にェシエ リ ヒア ' コ リ t r pプロモー夕 一が挿入された組換え体プラス ミ ドを選択し、 これを p B A — 2 と命名した。 なお、 プラスミ ド p B A — 2を保持するェシ X リ ヒア ' コリ A J 1 3 0 94は、 、 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 1 号 （郵便番号 3 0 5 ) 工業技術院生命工学 工業技術研究所において、 平成 7年 4 月 2 7 日付でブタペス ト条約に基づき寄託 され、 受託番号 F E R M B P — 5 0 8 9が付与されている。
( 3 ) コ リ ネパクテリ ゥム由来複製起点の揷入
前項 （ 2 ) で得られたイ ノ シングアノ シンキナーゼ遗伝子に t r pプロモータ 一を連結した D N A断片を含む組換え体プラス ミ ド p B A— 2 1 u gを前項
( 2 ) の反応液組成で^ _§_mH I にて消化し、 フ： c ノール抽出処理し、 エタ ノー ル沈濺を行なった。 これを実施例 6 ( 2 ) の反応組成にて]^ EJi I で消化し、 フ ェ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈濺を行なった。 得られた B a mH I 及び K P Jl I で消化されたプラス ミ ド P B A _ 2をバクテリ アル ' アルカ リ フ ォ スフ ァ タ ーゼ処理により D N A断片の脱リ ン酸化を行い、 フ エ ノール抽出処理、 エタ ノー ル沈澱を行なつた。
一方、 特開平 5 — 7 4 9 1 号に記載のプラス ミ ド p H C 4 1 gを同様に旦 a m H I 及び K p n I で消化し、 フ ヱ ノール抽出処理し、 エタ ノール沈濺を行な つた。 上記で得られた B a m H I 及び K p n I で消化されたプラス ミ ド p B A— 2 0. 1 gおよび B a mH I 及び K p n I で消化されたプラス ミ ト ' P H C 4 由来の D N A断片 0. 2 w g及び T 4 D N A リ ガーゼ （宝酒造社製） を用いて, 温度 1 6 °Cで 8時間連結反応し、 D N Aを連結させた。 次いで該 D N A混合物で, ェシエ リ ヒア · コ リ J M 1 0 9 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 0 0 g Zm 1 のカナマイ シ ンを含む L寒天培地上にまき、 形質転換体を得た。
得られた形質転換体からアルカ リ溶菌法によ りプラス ミ ド D N Aを調製しァガ ロースゲル電気泳勳を行うことによ り、 プラス ミ ド p B A— 2にコリネパクテリ ゥム属細菌由来の複製起点を含む組換え体プラスミ ドを選択し、 これを p B A— 3 と命名した。
( 4 ) p B A— 3の A T C C 2 1 4 7 7株への導入
前項で得られた p B A— 3 0. 1 gを電気パルス法を用いた形質転換の常 法 （特開平 2— 2 0 7 7 9 1 号公報） に従い、 コリ ネパクテリ ゥム ' アンモニア ゲネス A T C C 2 1 4 7 7株に導入した。 これをポリペプト ン 1 %、 酵母ェキ ス 1 %、 塩化ナ ト リ ウム 0. 5 %、 グルコース 0. 5 %及びカナマイ シン 5 0 g Zm 1 から成る寒天培地上にまき、 形質転換体 A T C C 2 1 4 7 7 / p B A— 3を得た。
( 5 ) 組換え体のイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性の測定
前項で得られたコリ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネス A T C C 2 1 4 7 7 ノ p B A— 3をポリペプト ン 1 %、 酵母エキス 1 %、 グルコース 5 %、 リ ン酸 2 水素カ リウム 0. 4 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 %、 硫酸アンモニゥム 0. 5 % 尿素 0. 5 %、 硫酸第一鉄 0. 0 0 1 %、 硫酸マンガン 0. 0 0 1 %、 チアミ ン 塩酸塩 0. 0 0 5 g Z l 、 パン トテン酸カルシウム 0. 0 1 g Z l 、 ピオチン 3 0 g / \ . アデニ ン 0. 0 5 %、 及びカナマイ シ ン 5 0 m g Z 1 から成る培地 ( P H 7. 2 ) 5 0 m l に接種し、 3 2 °Cで 2 4時間培養した。 該培養液を常法 に従って遠心分離し、 菌体を集めた。
この菌体を 0. 9 %塩化ナ ト リ ウム水溶液で懸濁し、 遠心分離する操作を 2回 繰り返し菌体を洗浄した。 該菌体を 2 0 %グリセロール、 l O O mM塩化力 リ ウ ムを含む 5 0 mM ト リ スー塩酸緩衝液 （ p H 7. 5 ) に 、濁し、 1 5 0 W、 の出 力で 2 0分超音波処理した後、 1 5 , 0 0 0 r p m、 3 0分遠心分離して上清を 得た。 この細胞破砕液をセフ アデクス G— 2 5 (フ アルマシア社製） カラムクロ マ トグラフ ィ 一に供し、 低分子量物質を除いたものを粗酵素液と した。
得られた粗酵素液のイ ノ シ ン —グアノ シ ンキナーゼ活性を、 プラスミ ド p H K 4 で同様に形質転換して得た A T C C 2 1 4 7 7 Z P H K 4 を対照と して実施例 5 ( 1 ) の方法にて測定した。 その結果を表 7 に示した。 A T C C 2 1 4 7 7 / P H K 4では活性は検出されなかったのに対し、 A T C C 2 1 7 7 / p B A - 3は高い活性を有していた。 この結果から、 導入したエキシグォパクテリ ゥム由 来の遗伝子がコリ ネパクテリゥム · アンモニアゲネスにおいてィ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を発現していることが示された。 なお、 プラスミ ド p H K 4は、 p B A— 3から t r pプロモータ一及びイ ノ シ ン—グアノ シ ンキナーゼ遺伝子領域を除去した構造を有しており、 対照と して使 用した。
ェシヱ リ ヒア · コリ H B 1 0 1 に p H K 4 を保持させた株は、 A J 1 3 1 3 6 と命名され、 1 9 9 5年 8月 1 日付で、 日本国茨城県つく ば市東 1 丁目 1 番 1 号 (郵便番号 3 0 5 ) 工業技術院生命工学工業技術研究所にブタぺス ト条約に基づ き国際寄託され、 受託番号 F E RM B P — 5 1 8 6が付与されている。 表 7
Figure imgf000048_0001
実施例 8 (エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ遺伝子保持株を用いたィ ノ シンから 5' — ィ ノ シン酸の生産）
ポリペプト ン 1 %、 酵母エキス 1 %、 グルコース 5 %、 リ ン酸二水素カ リ ウム 0. 4 %、 硫酸マグネシウム 0. 1 %、 硫酸アンモニゥム 0. 5 %、 尿素 0. 5 %、 硫酸第一鉄 0. 00 1 %、 硫酸マンガン 0. 00 1 %、 チアミ ン塩酸塩 0. 00 5 g / パン トテン酸カルシウム 0. O l g Z し ピオチン 30 g Zし アデニン◦. 0 5 %、 及びカナマイ シン 50m gZ l から成る培地 （ p H 7. 2 ) 4 50 m l にコ リ ネノ クテ リ ゥム ' アンモニアゲネス A TC C 2 1 4 7 7 Z P B A— 3を接種し、 32 °Cで 24時間培養し培養物を得た。 この培養物を 7， 00 0 r p mで 1 0分間遠心分離処理し沈澱物と して湿菌体 20 gを得た。
得られた菌体をイ ノ シン 50 g / 1、 リ ン酸二水素カ リウム 20 g し グル コース 30 g / l、 硫酸マグネシウム 5 g / l、 フ ィ チン酸 （重量比 50%) 1 0 g Z l 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 / 1 , アデニン l gZ l からなる反応液 ( p H 7. 2 ) 20m l に 200 gZ l となるように懸馮し、 «拌しつつ 3 2°C に保ち反応を行った。 p Hは 4 N水酸化ナ ト リ ウムを用いて適宜 7. 2となるよ うに調整し、 リ ン酸二水素カ リ ウムの減少分を適宜添加した。 対照と して A T C C 2 1 4 7 7Zp H K 4について同様に反応を行った。 30時間反応後の反応液 中の 5' — ィ ノ シン酸を高速液体クロマ ト グラフ ィ 一を用いて定量した。
結果を表 8に示す。 5 ' —イ ノ シン酸蓼積値は 5 ' —イ ノ シン酸ニナ ト リ ウム 7. 5水和物換算値にて示した。 この結果からイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活 性を発現している A T C C 2 1 4 7 7 / p B A— 3でイ ノ シンから 5 ' —イ ノ シ ン酸への変換がみられた。 表 8
Figure imgf000049_0001
実施例 9 (エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ遺伝子保持株を用いたイ ノ シンから 5 ' —ィ ノ シン酸への変換） 実施例 8で得た菌体をイ ノ シン 6 0 gノ 1 、 リ ン酸ニ水素力 リ ウム 2 0 1 、 グルコース 3 0 g / l 、 硫酸マグネシウム 5 gノ 1 、 フ ィ チン酸 （重量比 5 0 %) 1 O g Z l 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g / l 、 アデニ ン 1 g Z l からなる反応液 ( P H 7. 2 ) 5 0 m l に 2 0 0 8 1 となるように懸獨し、 通気桷抻しつつ 3 2 に保ち反応を行った。 p Hは p H計で測定しつつ常に 7. 2 となるよう に 4 N水酸化ナ ト リウムを添加して調整し、 リ ン酸ニ水素カ リ ウムの減少分を適宜添 加した。 3 0時間反応後の蓄積値は 1 1 1. 3 g 1 であり添加したイ ノ シンに 対するモル収率は約 1 0 0 %であった。 実施例 1 0 (イ ノ シ ン—グアノ シ ンキナーゼ遗伝子保持株を用いたグアノ シ ン から 5 ' —グァニル酸への変換）
実施例 8で得た菌体をグアノ シン 2 5 g Z 1 、 リ ン酸ニ水素力 リ ウム 2 0 g Z し グルコース 3 0 g Z し 硫酸マグネシウム 5 g Z l 、 フ ィ チン酸 （重量比 5 0%) 1 0 gノ 1 、 ナイ ミーン S— 2 1 5 4 g / アデニン l g Z l からな る反応液 （ p H 7. 2 ) 50m l に 200 S Z 1 となるように懸濁し、 通気浸拌 しつつ 32でに保ち反応を行った。 p Hは p H計で測定しつつ常に 7. 2となる ように 4 N水酸化ナ ト リ ウムを添加して調整した。 8 h反応後の 5' —グァニル 酸の蓄積値は 7. 3 g Z 】 であり添加したグァノ シンに対するモル収率は約 1 4 %であった。 実施例 1 1 (エキシグォバクテリ ウムバクテリ ゥム · アウランティ アカム、 ク ルチア · ギブソ一二、 クルチア · ゾプフ ィ におけるイ ノ シン一グアノ シンキナー ゼ活性の検出）
ポリペプト ン 1 %、 ノ、'ク ト · イース トエキス トラク ト 1 %、 グルコース 0. 5 %及び塩化ナ ト リ ウム 0. 5%及び炭酸ナ ト リ ウム 1 %から成る培地 （ ρ Η 9· 7 ) 50 m l に、 エキシグォバクテリ ウムバクテリ ゥム · アウランティ アカム A T C C 3 56 52を接種し、 また、 ポリペプ ト ン 1 %、 ノ ク ト ' イース トヱキ シ トラ ク ト 1 %、 グルコース 0. 5 %及び塩化ナ ト リ ウム 0. 5 %からなる培地 ( H 7. 2 ) 50m l に、 クルチア ' ギブソー二 AT C C 4 3 1 95、 クル チア · ゾプフ ィ A T C C 334 03をそれぞれ接種し、 30 で 4時間培養し 培養物を得た。 この培養物を 7, 000 r p mで 1 0分間遠心分離処理し、 沈殿 物を 0. 9 %塩化ナ ト リ ウムで 2度洗浄し湿菌体を得た。 この菌体を緩衝液 A 3m l に懸濁し、 超音波処理にて破砕した。 該破砕液を 1 5. O O O r p mで 3 0分間遠心分離処理し上淸をセフアデクス G— 25カラム （フアルマシア社製） を用いて脱塩し、 粗酵素抽出液約 3. 5 m l を得た。 粗酵素抽出液 5 1 を 5m M 塩化マグネシウム、 5 mMAT P、 l O OmM塩化カリ ウム、 0. 06 mM グアノ シン及び 0. 04 mM[8— H C ]—グアノ シンを含む 1 O OmMト リ スー 塩酸緩衝液 （ P H 7. 5 ) 50 1 中に加えた反応液を 30 、 1 0分反応した 生成した 5' —グァ二ル酸を定量し、 イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ比活性を測 定した。 その結果を表 9に示した。 いずれの株においてもイ ノ シン一グアノ シン キナーゼ活性が検出された。 表 9
Figure imgf000051_0001
実施例 1 2 (エキシグォバクテリ ウム * ァウランティ アカム、 クルチア * ギ ブソー二、 クルチア · ゾプフ ィ 染色体におけるエキシグォパクテリ ゥム · ァセチ リ カム由来イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遺伝子と相同性を有する断片の検出） 実施例 1 1 と同様にエキシグォパクテリ ゥム · ァウランテ ィ ァカム A T C C 3 5 6 5 2、 クルチア * ギブソー二 A T C C 4 3 1 9 5及びクルチア · ゾプフ ィ A T C C 3 3 4 0 3を 3 0 °Cで 1 6時間培養し， 培養液から実施例 5 ( 2 ) と同様にそれぞれの染色体 D N Aを調製した。 該染色体 D N A 1 0 / g及び制 限酵素 E c 0 R I 1 0 0ュニッ トを 1 OmM塩化マグネシウム、 1 O O mM塩化 ナ ト リ ウム及び I mMジチオスレィ トールを含有する 5 0mM ト リ ス一塩酸緩衝 液 （ p H 7. 5 ) におのおの混合し、 温度 3 7 で 1 4時間反応させた後、 常法 により フ ノール抽出及びエタ ノール沈澱した。 得られた E c o R I によつて切 断された染色体 D N Aを◦. 8 %ァガロースゲル電気泳動に供し、 Molecular C1 on i ng 2nd edition (J. Sarobrook, E. F. Fr i tsch and T. Man i at i s, Cold Spr i ng Harbour Laboratory Press, p9.31 ( 1989)) に記載の方法でァガロースゲル力、 らナイロンフ ィ ルタ一 （デュポン社製） にアルカリ転写を行った。 該フ ィ ルター をエキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ カム由来イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗 伝子を含む断片をプローブと して、 4 2てで 1 4時間、 2 0 %ホルムアミ ド存在 下でハイブリ ダィゼーシ ヨ ンを行った。 該フ ィ ル夕一を 0. 2 X S S C ( 0. 0 3 M塩化ナ ト リ ウム、 3 mMクェン酸ナ ト リウム） 、 0. 1 % S D Sで洗浄した ところ、 いずれの菌株においても相同断片が検出された。 中でもエキシグォパク テリ ゥムパクテリ ゥム · ァウランティ アカムの染色体において最も強い相同性を 示す約 4. 6 k bの断片が検出された。 実施例 1 3 (エキシグォバクテリ ウム ' ァウランティ アカム AT C C 3 5 6 52染色体からのエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来イ ノ シン -グァ ノ シ ンキナーゼ遗伝子と相同な断片の単離）
エキシグォバクテリ ゥム · ァウランティ ァカム A T C C 3 5 6 52の染色体 D N A 1 8 w gと制限酵素 E c o R I 200ュニッ トを 3 7 °Cで 3時間反応し、 フエ ノール抽出処理し、 エタノール沈濺処理した。 該消化断片をァガロースゲル 電気泳動に供し、 4. 6 k b付近の断片をガラスパウダー （宝酒造社製） を用い て回収し、 エキシグォパクテリ ゥム · アウランティ アカム A T C C 3 56 52 株染色体断片を得た。
プラスミ ドベクタ一 p MW 2 1 8 (日本ジーン社製） 1 u gを制限酵素 E c o R I 20ュニッ トを用いて温度 3 7 °Cで 3時間反応させて消化液をフエ ノール抽 出及びエタノール沈澱した。 この後、 アルカ リ フ ォ スフ ァ タ一ゼ処理により DN A断片の脱リ ン酸化を行い、 フ ノール抽出処理し、 エタノール沈澱を行なった この E c o R Iで消化された pMW2 1 8を 0. 2 g、 E c o R I で消化さ れたエキシグォパクテリ ゥム · ァウランティ ァカム染色体断片 5 u gを T 4 D N Aリ ガーゼ （宝酒造社製） を用いて連結した。 次いで該 DN A混合物で、 常法に よりェシ エ リ ヒア . コ リ J M 1 09 (宝酒造社製） を形質転換し、 これを 1 0 0 u g /m 1 のカナマイ シンを含むし寒天培地上にまき、 約 1 000個の形質転 換体を得た。
得られた形質転換体から、 コロニーハイブリ ダィゼーシ ヨ ン法により、 プロ一 ブ DN Aとハイブリ ダィズする形質転換体を選択した。 該形質転換体からアル力 リ溶菌法によりプラスミ ド DN Aを調製した。 該プラスミ ド DN Aはエキシグォ パクテリゥム · ァウランティ ァカム染色体由来の約 4. 6 k bの DNA断片を含 んでいた。 実施例 1 4 (エキシグォパクテリ ゥム ' アウランティ アカム A TC C 3 56 5 2由来のイ ノ シン一グアノ シンキナーゼ遗伝子の塩基配列の決定）
実施例 1 3で得たプラス ミ ドを各種制限酵素で切断の後、 サザンハイブリ ダイ ゼ一シ ョ ンを行いプローブ DN Aとハイプリ ダイズする断片を同定した。 その結 果、 E c 0 R I 及び P s t I に切断された約 2. 7キロベースの切断断片がハイ プリ ダイズすることが判明した。 該 DNA断片を E c o R I 及び P s t I で切断 したプラス ミ ドベクター P S T V 28 (宝酒造社製） に連結し、 ェシヱ リ ヒア ' コ リ J M 1 09に形質転換した。 得られた形質転換体の中から Molecular CI on in g 2nd ed i t i on (J. Sambrook, E. F. Fritsch and T. Maniat is, Cold Spring H arbour Laboratory Press, p.1.90 ( 1989)) 記載のコロニーハイブリ ダィゼーシ ヨ ン法によりプローブ DN Aとハイブリ ダィズする断片をクローン化した。 該 D N A断片を含むプラスミ ドを保持するェシ リ ヒア · コ リ菌体の粗酵素抽出液の イ ノ シンキナーゼ活性を実施例 7 ( 5 ) 記載の活性測定法によ り測定したところ 対照と したベクター保持株と比較して約 300倍の活性を示し、 クローン化した 断片がエキシグォパクテリ ゥム · ァウランテ ィ アカム由来のイ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ遗伝子を含んでいることが確認された。
得られたプラス ミ ド DN Aを用いて E c o R I及び P s t I切断断片の塩基 S 列の决定を行った。 決定された塩基 列から推定されるオープン · リーディ ング • フレームの塩基 K列を S列表 列番号 1 4に示した。 また、 その塩基配列より 推定される産物のアミ ノ酸配列を配列表配列番号 1 5に示した。 塩基 S列、 アミ ノ酸 K列いずれもエキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のイ ノ シン—グァ ノ シンキナーゼと高い相同性を示したが、 明らかに新規な遺伝子であった。 すな わち、 配列表配列番号 1 5に示されるアミ ノ酸配列から成る蛋白質をコー ドする 遗伝子が、 エキシグォパクテリ ゥム ' ァウランティ アカム A T C C 3 56 52 のィ ノ シン—グアノ シンキナーゼ遗伝子である。
以上のように、 エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カム由来のィ ノ シンーグァ ノ シンキナーゼ遗伝子とハイブリ ダィズすることができる遺伝子が取得され、 該 遺伝子がイ ノ シ ン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドすることが 配 列 表 情報
(i 出願人 味の素株式会社
(i i) 発明の名称 ： 核酸類の製造方法
(i i i) 配列数 1 5
(iv) 連絡先
(A) 宛名 味の素株式会社
(B) 番地 京撟 1 丁目 1 5番 1 号
(C) 市 中央区
(D) 州 東京都
(E) 国 日本国
(F) ZIP 1 0 4
(V) コンピュータ一読取り可能形式
(A) 媒体 ：
(B) コンピューター ：
(C) 操作システム ：
(D) ソフ トウ ェア ：
(vi) 現行出願データ
(A) 出願番号 J P
(B) 出願日 1 9 9 6年 3 月 日
(C) 分類 (vi i) 優先権主張出願データ
(A) 出願番号 特願平 7— 1 0 2 8 8 8号
(B) 出願日 ： 1 9 9 5年 3 月 2 4 日
(C) 出願番号 ： 特顳平 7— 1 7 7 9 0 0号
(D) 出願日 ： 1 9 9 5年 6月 9日
(vi i i) 代理人/事務所情報
(A) 名前 ： 佐伯 憲生
(B) 登録番号 ： 1 0 2 2 6
(ix) 通信情報
(A) 電話番号 ： 0 3— 5 6 8 8— 5 1 3 6
(B) フ ァ クシ ミ リ番号 ： 0 3— 5 6 8 8— 5 1 3 7
列番号 1 の S列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 列の長さ 9 0 9 base pa i rs
(B) S列の型 核酸
(C) 鎖の数 二本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
(i i) 配列の種類 ： Genomic DNA
(i i i) ハイポセティ カル ： NO
(iv) アンチセンス ： NO
(vi) 起源 ：
(A) 生物名 ： エキシグォパクテリ ゥム ' ァセチリ カム
(B) 株名 A T C C 9 5 3 ( i x ) 配列の特徴 ：
( A ) 特徴を表す記号 ： CDS
( B ) 存在位置 ： 1 . . 909
( C) 特徴を決定した方法 ： E
( x i ) S列 ： SEO I D NO : 1 ：
ATGAATAAAA TCGCGGTAAT CGGAAAAGTA TTCGTCGACA TAAAAGGAAC TTCGTTCGCT 60 CCTTTGCATA AGGATGCGAA AAACGTAGGA GACATCACGT TTTCAAATGG AGGAACAGGA 1 20 CGCAACGTAG CACAAAATCT AGCCGTCCTC GGGAATGAAG TTCG CTTTAT CTCGACGGTT 1 80 ACGAATGATC AGATTGGCGT GGGAGTGCTC GATGAGCTGA AATCCTACGG TGCGAATGTG 240 GATCACGTCG AAATGTTAGA AGATCATGGA ATGGGTATGT GGCTAGCTGT CATGGATAAC 300 GAGGGTGACT TGCAAACATC GATCTCGAAA CAACCGGATG CCAAGTTGCT CGAAGAGGCG 360 ATTTTACGTC AATCGATCTA TGCACTCGAT GGAGTCGATG CCGTTGCAAT CGATTTGGAT 420 TTGTCCGTCA CGGTCTTAGA ACGTTTGATT CATTTATGTC GTAAGATGGA GTTGCCATTG 480 TTTGGTGTTT GTGGTCACTT GAGCGTCATC GAACGAAATC GTCATCTGCT ACAAGGGTTC 540 ACTGGATTCA TTTGTAGCCG AGAAGAGGCT GAAATTCTGT CTGATCTATC GATCGTGACG 600 GTCGAAGATG CGATTCATGT AGCAAATGAG CTAGCGAAAA AGGGCGCTCC GTTTACGGTC 660 GTGACGATGA GTGAACTGGG GGCGGT CTAC GTTGATCGTC GTACGGCGAC ATCAGGTCAC 720 GTCGGAACGA AAAAAGTGAA GGTTGTCGAC TCAACGGGAG CAGGCGATTC CTTCTTCTCC 780 GCAGTCTTGT CCGAATTGAC ACAGGAAAAG TCAGCAGAAG AGGCTTTGAA GCTTGGTATG 840 AAGGTCGCAG CAGAAGTCAT CGCTTCAACA GAGAATGGAC TCGTTCCTGA AATGCTAGAT 900 GCTCTTCAA 909
( 2 ) 配列番号 2の配列の情報
( i ) 配列の性質 ：
( A ) 配列の長さ ： 3 0 3 アミ ノ酸 (B) 配列の型 アミ ノ酸
(D) トポロジー ： 直鎖状
(i i) 配列の種類 蛋白質
(xi) 配列 ： SEQ ID NO: 2：
Met Asn Lys l ie A 1 a Val l ie Gly Lys Val Phe Val Asp l ie Lys G I y
5 10 15
T r Ser Phe Ala Pro Leu His Lys Asp Ala Lys Asn Val Gly Asp 11 e
20 25 30
Thr Phe Ser Asn Gly Gly Thr Gly Arg Asn Val Ala Gin Asn Leu Ala
35 40 45
Val Leu G!y Asn Gl u Val Arg Phe l ie Ser Thr Val Thr Asn Asp Gin
50 55 60
He Gly Val Gly Val Leu Asp Glu Leu Lys Ser Tyr Gly Ala Asn Val 65 70 75 80
Asp His Va! Glu Met Leu Glu Asp His Gly Met Gly Met Trp Leu Ala
85 90 95
Val Met Asp Asn Glu Gly Asp Leu Gin Thr Ser l ie Ser Lys Gin Pro
100 105 110
Asp A 1 a Lys Leu Leu Glu Glu Ala l ie Leu Arg Gin Ser l ie Tyr Ala
115 120 125
Leu Asp Gly Val Asp A I a Val Ala l ie Asp Leu Asp Leu Ser Val Thr
130 135 140
Val Leu Glu Arg Leu l ie His Leu Cys Arg Lys Met Glu Leu Pro Leu 145 150 155 160
Phe Gly Val Cys Gly His leu Ser Val l ie Glu Arg Asn Arg His Leu
165 170 175 Leu Gin Gly Phe Thr Gly Phe lie Cys Ser Arg Glu Glu Ala Glu lie
180 185 190
Leu Ser Asp Leu Ser lie Val Thr Va 1 Glu Asp A 1 a lie His Va I Ala
195 200 205
Asn Glu Leu Ala Lys Lys Gly Ala Pro Phe Thr Val Val Thr Met Ser
210 215 220
Glu Leu Gly Ala Val Tyr Val Asp Arg Arg Thr Ala Thr Ser Gly His 225 230 235 240
Va) Gly Thr Lys Lys Val Lys Val Val Asp Ser Thr Gly Ala Gly Asp
245 250 255
Ser Phe Phe Ser Ala Val Leu Ser Glu Leu Thr Gin Glu Lys Ser Ala
260 265 270
Glu Glu Ala Leu Lys Leu Gly Met Lys Val Ala Ala Glu Val J le Ala
275 280 285
Ser Thr Glu Asn Gly Leu Val Pro Glu Met Leu Asp Ala Leu Gin 290 295 300
( 2 ) 列番号 3の S列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 2 8 アミ ノ酸
(B) S列の型 アミ ノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
U i) 列の種類 ぺプチ ド
(xi) S列 ： SEQ ID NO: 3：
Met Asn Lys lie Ala Val lie Gly Lys Val Phe Val Asp I le Lys Gly 1 5 10 15 Thr Xaa Phe Ala Pro Leu His Lys Asp A 1 a Lys Asn 20 25
( 2 ) 配列番号 4の 列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 1 7
(B) K列の型 核酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
(ii) K列の種類 他の核酸 合成 D N A ( i i i ) ハイポセテ ィ カル NO
( i V) アンチセンス NO
(xi ) 配列 ： SEQ ID NO: 4 ：
ATGAAYAARA THGCNGT 17
( 2 ) 配列番号 5の 列の情報
(i) 列の性質 ：
(A) 列の長さ 1 7
(Β) 列の型 核酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状 ( i i ) 配列の種類 他の核酸 合成 D N A (i i i) ハイポセティ カル NO (iv) アンチセンス ： NO
(xi) 配列 ： SEQ ID NO: 5：
TTYTTNGCRT CYTTRTG 17
( 2 ) 配列番号 6の 列の情報
(i) K列の性質 ：
(A) S列の長さ ： 23
(B) 配列の型 核酸
(C) 銷の数 ： 一本鎖
(D) トポロジー ： 直鎖状 (ii) 配列の種類 他の核酸 合成 D N A
(i i i) ハイ ポセテ ィ カル NO
(iv) ァンチセンス NO
(xi) 配列 SEQ ID NO: 6：
TAATCGGAAA AGTATTCGTC GAC 23
( 2 ) 配列番号 7の 列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ ： 2 1
(B) 配列の型 核酸
(C) 鎖の数 一本鎖 (D) トポロジー ： 直鎖状 (ii) E列の種類 他の核酸 合成 D N A (i i i) ハイポセティ カル NO
( iv) アンチセンス NO
(xi) 配列 ： SEQ ID NO: 7 ：
GGAACTTCGT TCGCTCCTTT G 21
( 2 ) 配列番号 8の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) S列の長さ ： 30
(B) 配列の型 ： 核酸
(C) $負の数 ： 一本鎖
(D) トポロジー ： 直鎖状 (ii) 配列の種類 ： 他の核酸 合成 D N A
( i i i ) ハイポセテ ィ カル NO
(iv) ァンチセンス NO
(xi) 配列 SEQ ID NO: 8：
GGCTGCAGGA ATGAATAAAA TCGCGGTAAT 30 ( 2 ) 配列番号 9の 列の情報
(i) K列の性質 ：
(A) S列の長さ 30
(B) 列の型 核酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状 (i 配列の種類 他の核酸 合成 D N A (iii) ハイポセテ ィ カル NO
( i V) アンチセンス NO
(xi) 列 ： SEQ ID NO: 9：
GGGCATGCTG GAAAGACATA ATACGTTTCG 30
( 2 ) 配列番号 1 0の 列の情報
(i) K列の性質 ：
(Α) 配列の長さ ： 1 30 2 base pairs
(B) 配列の型 ： 核酸
(C) 鎖の数 ： 二本鎖
(D) トポロジー ： 直鎖状
( i i ) K列の種類 ： Genomic DNA
(iii) ハイポセテ ィ カル ： NO
( i v) アンチセンス ： NO
(vi) 起源 ：
(A) 生物名 ： ェシ リ ヒア ' コリ
(B) 株名 HM 70 (ix) 配列の特徴 ： ( A ) 特徴を表す記号 ： CDS
( B ) 存在位置 ： 1. . 1302
( C ) 特徴を決定した方法 ： E
( X ! ) 配列 ： SEQ I D NO : 1 0 ：
ATGAAATTTC CCGGTAAACG TAAATCCAAA CATTACTTCC CCGTAAACGC ACGCGATCCG 60
CTGCTTCAGC AATTCCAGCC AGAAAACGAA ACCAGCGCTG CCTGGGTAGT GGGTATCGAT 120
CAAACGCTCG TCGATATTGA AGCGAAAGTG GATGATGAAT TTATTGAGCG TTATGGATTA 180
AGCGCCGGGC ATTCACTGGT GATTGAGGAT GATGTAGCCG AAGCGCTTTA TCAGGAACTA 240
AAACAGAAAA ACCTGATTAC CCATCAGTTT GCGGGTGGCA CCATTGGTAA CACCATGCAC 300
AACTACTCGG TGCTCGCGGA CGACCGTTCG GTGCTGCTGG GCGTCATGTG CAGCAATATT 360
GAAATTGGCA GTTATGCCTA TCGTTACCTG TGTAACACTT CCAGCCGTAC CGATCTTAAC 420
TATCTACAAG GCGTGGATGG CCCGATTGGT CGTTGCTTTA CGCTGATTGG CGAGTCCGGG 480
GAACGTACCT TTGCTATCAG TCCAGGCCAC ATGAACCAGC TGCGGGCTGA AAGCATTCCG 540
GAAGATGTGA TTGCCGGAGC CTCGGCACTG GTTCTCACCT CATATCTGGT GCGTTGCAAG 600
CCGGGTGAAC CCATGCCGGA AGCAACCATG AAAGCCATTG AGTACGCGAA GAAATATAAC 660
GTACCGGTGG TGCTGACGCT GGGCACCAAG TTTGTCATTG CCGAGAATCC GCAGTGGTGG 720
CAGCAATTCC TCAAAGATCA CGTCTCTATC CTTGCGATGA ACGAAGATGA AGCCGAAGCG 780
TTGACCGGAG AAAGCGATCC GTTGTTGGCA TCTGACAAGG CGCTGGACTG GGTAGATCTG 840
GTGCTGTGCA CCGCCGGGCC AATCGGCTTG TATATGGCGG GCTTTACCGA AGACGAAGCG 900
AAACGTAAAA CCCAGCATCC GCTGCTGCCG GGCGCTATAG CGGAATTCAA CCAGTATGAG 960
TTTAGCCGCG CCATGCGCCA CAAGGATTGC CAGAATCCGC TGCGTGTATA TTCGCACATT 1020
GCGCCGTACA TGGGCGGGCC GGAAAAAATC ATGAACACTA ATGGAGCGGG GGATGGCGCA 1 080
TTGGCAGCGT TGCTGCATGA CATTACCGCC AACAGCTACC ATCGTAGCAA CGTACCAAAC 1 1 40
TCCAGCAAAC ATAAATTCAC CTGGTTAACT TATTCATCGT TAGCGCAGGT GTGTAAATAT 1 200
GCTAACCGTG TGAGCTATCA GGTACTGAAC CAGCATTCAC CTCGTTTAAC GCGCGGCTTG 1260
CCGGAGCGTG AAGACAGCCT GGAAGAGTCT TACTGGGATC GT 1 302 ( 2 ) 配列番号 1 1 の S列の情報
(i ) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ ： 3 0
(B) 配列の型 ： 核酸
(C) 鎖の数 ： 一本鎖
(D) トポロジー ： 直鎖状
(i i) K列の種類 他の核酸 合成 D N A
(i i i ) ハイポセテ ィ カル NO
( i V) アンチセンス NO
(xi ) 配列 ： SEQ ID NO: 1 1
GGCTGCAGCC ATGAAATTTC CCGGTAAACG 30
( 2 ) 配列番号 1 2の K列の情報
(i ) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 3 0
(B) 配列の型 核酸
(C) 鍋の数 一本鎖
(D) トポロジー 直錢状
( i i ) 配列の種類 他の核酸 合成 D N A
(i i i) ハイポセテ ィ カル NO
(iv) ァンチセンス NO
(xi ) 列 ： SE(J ID NO: 1 2 ：
GGAAGCTTAA CGATCCCAGT AAGACTCTTC 30 ( 2 ) 配列番号 1 3の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) e列の長さ 7 2
(B) 列の型 核酸
(C) 鎖の数 一本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
( i i ) 配列の種類 他の核酸 合成 D N A
( i i i ) ハイポセテ ィ カル NO
( i V ) アンチセンス NO
( x i ) 配列 SEQ ID NO: 1 3：
GGGGATCCTG TTGACAATTA ATCATCGAAC TAGTTAACAG TACGCAAGTT CACGTAAAAA 60 GGGTCTGCAG CC 72
( 2 ) S列番号 1 4の配列の情報
(i) 配列の性質 ：
(A) 配列の長さ 924 base pai rs
(B) 配列の型 核酸
(C) 鎖の数 二本鎖
(D) トポロジー 直鎖状
(i i) 配列の種類 ： Genomic DNA
(i i i) ハイポセテ ィ カル ： NO
( iv) アンチセンス ： NO
(vi ) 起源 ： (A) 生物名 ： エキシグォパクテリ ゥム · ァウランティ アカム
(B) 株名 ： A T C C 3 5 6 5 2
(ix) 配列の特徴 ：
(A) 特徴を表す記号 ： CDS
(B) 存在位置 ： 1..924
(C) 特徴を決定した方法 ： E
(xi 1 配列 ： SEQ ID NO: 1 4 ：
ATGAATACGA TTGCAGTAAT CGGCAAAGTG TTTGTCGACA TAAAAGGAAC GTCGTTCGCC 60
CCCATCCATA AAGATGCGAA AAACGTCGGA GATATCGCCT TCTCAAACGG TGGCACCGGA 120
CGAAACGTCG CTCAGAACTT AGGTGTCCTC GGTAACGATG TTCGGTTCGT CTCGACCGTG 180
ACGAACGATC AAATCGGAAT CGGTGTCCTC GAAGAACTAC GCAGTTTGAA CGTCAATGTC 240
GAACACGTCG ACTTGCTCGA AGACAACGGC ATGGGTATGT GGCTCGCGGT CATGGACAAT 300
AACGGTGACC TCCAGACGTC AATCTCAAAA CAACCTGACG AGGCGATGAT GGAACAATGC 360
ATCCTCCGTC GCATCGATAC CGTTTTCGCC GAGAGCACGG CTGTCGCCAT CGACCTCGAC 420
TTATCGGTCA ACGTCTTAAA CGAGACGATT GAATTGTGCC GTGAGATGAA ACTCCCGCTA 480
TACGGTGTAT GTGGTCACCT CTCGGTCATC GAACGCAACC GTCACTTGCT CCAAGGGTTC 540
ACGGGCTTCA TCTGTAGCCG CGAAGAAGCC GAGATTCTCT CGGATATGTC CATCGTCACG 600
GTTGACGATG CCCTTCGCGT CGCCGAGGTG CTCGCCATGA AAGGAGCGCC GCTCACGATT 660
GTCACGATGA GCGAGCTCGG AGCCGTCTAC GTCGACCTTC GCACGAACGA ACAAGGTCAC 720
GTGCCGACGA CGAAAGTGAA AGTTGCCGAC TCCACAGGCG CCGGGGATTC CTTCTTCTCT 780
GCCGTTATTT CCGAGCTCAT GAAAGAGCAT TCGATTGAAG ATGCACTTCG TCTCGGCATG 840
CGTGTCGCCG GGAAAGTCAT CGGCTCTCAT GACAACGGAC TGACGCCTGA GATGTATGCT 900
TCACTTGAAC AACCAACACG TGAC 924
( 2 ) 列番号 1 5の 列の情報
(i) 列の性質 ： (A) 列の長さ 308 ァ ノ酸
(B) 配列の型 アミ ノ酸
(D) トポロジー 直鎖状
(i i ) 配列の種類 ： 蛋白質
(xi ) 配列 ： SEQ ID NO: 1 5 ：
Met Asn Thr l ie Ala Val l ie Gly Lys Val Phe Val Asp l ie Lys Gly
5 10 15
Thr Ser Phe A I a Pro l ie His Lys Asp A 1 a Lys Asn Va J Gly Asp l ie
20 25 30
Ala Phe Ser Asn G!y Gly Thr Gly Arg Asn Val Ala Gin Asn Leu Gly
35 40 45
Val Leu Gly Asn Asp Val Arg Phe Val Ser Thr Val Thr Asn Asp Gin
50 55 60
l ie Gly l ie Gly Val Leu G 1 u Gl u Leu Arg Ser Leu Asn Va I Asn Val 65 70 75 80
Glu His Val Asp Leu Leu Glu Asp Asn Gly Met Gly Met Trp Leu Ala
85 90 95
Val Met Asp Asn Asn Gly Asp Leu Gin Thr Ser l ie Ser Lys Gin Pro
100 105 110
Asp Glu Ala Met Met Glu Gin Cys l ie Leu Arg Arg l ie Asp Thr Val
115 120 125
Phe Ala Glu Ser Thr Ala Val Ala l ie Asp Leu Asp Leu Ser Val Asn
130 135 140
Val Leu Asn Glu Thr l ie Glu Leu Cys Arg Glu Met Lys Leu Pro Leu 145 150 155 160
Tyr Gly Val Cys Gly His Leu Ser Val l ie Glu Arg Asn Arg His Leu
165 170 175 99 -
Figure imgf000068_0001
ΟΟδ 062 u| n |o nai jas ^| γ J^i law n|o OJ<J 丄 nsi /i 13 usy dsy s!n aas
98Z 08Z 5iZ
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OLZ G9Z 09Z a| I J3S s!H nio sxq law ηθη ni J3S I 八 B|V S aqd 9Md
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Claims

請求の範囲 】 . イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子を A T P再生能を有する微生物に導入した形質転換株を、 ィ ノ シン若し く はグ ァノ シン又はこれらの前駆体、 エネルギー供与体、 及びリ ン酸供与体に接触 反応させて、 反応液中に 5 ' —イ ノ シン酸又は 5 ' —グァ二ル酸を生成蓄積 せしめ、 これを採取することを特徴とする 5 ' —イ ノ シン酸又は 5 ' —グァ ニル酸の製造法。 2. A丁 P再生能を有する微生物がコリ ネバクテリ ウム属、 ェシ ヱ リ ヒア属、 サッ カロ ミセス属、 スタフ イ ロコ ッカス属及びキ ャ ンデ ィ ダ属からなる群よ り選ばれる微生物である請求項 1 記載の 5 ' — イ ノ シン酸又は 5' —グァニ ル酸の製造法。 3. A T P再生能を有する微生物がコリ ネバクテリ ゥム · アンモニアゲネスで ある請求項 1 記載の 5' —イ ノ シン酸又は 5' —グァニル酸の製造法。4. ィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子が エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムに由来する遺伝子、 又は該遺伝子に ハイプリ ダイズすることができる遗伝子である請求項 1 〜 3のいずれか一項 に記載の 5' —イ ノ シン酸又は 5 ' -グァニル酸の製造法。 5. イ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子が ェシ X リ ヒア · コリ に由来する遺伝子、 又は該遺伝子にハイブリ ダィズする ことができる遺伝子である請求項 1〜 3のいずれか一項に記載の 5 ' — イ ノ シン酸又は 5 ' —グァニル酸の製造法。 6. イ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子を A T P再生能を有する微生物に導入した形質転換株。 7. A T P再生能を有する微生物がコリ ネバクテリ ウム属、 ェシヱ リ ヒア属、 サッ カロ ミセス属、 ス夕フ イ ロコ ッ カス属及びキャ ンディ ダ属からなる群よ り選ばれる微生物である請求項 6記載の形質転換株。 8. AT P再生能を有する微生物がコリ ネバクテリ ゥム · アンモニアゲネスで ある請求項 6記載の形質転換株。 . ィ ノ シン一グアノ シンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子が エキシグォパクテリ ゥム · ァセチリ カムに由来する遺伝子、 又は該遗伝子に ハイプリ ダイズするこ とができる遺伝子である請求項 6〜 8のいずれか一項 に記載の形質転換株。 0 . ィ ノ シン—グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遗伝子 がェシヱ リ ヒア · コ リ に由来する遗伝子、 又は該遗伝子にハイプリ ダイズ することができる遺伝子である請求項 6〜 8のいずれか一項に記載の形質 転換株。
1 . コ リ ネパクテリ ゥム · アンモニアゲネスにおいて複製可能であり、 かつ イ ノ シン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子を 含む組換え D N A。
2 . イ ノ シ ン —グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子 がエキシグォバクテリゥム · ァセチリ カムに由来する a伝子、 又は該遗伝 子にハイブリ ダィズすることができる遺伝子である請求項 1 1 記載の組換 え D N A。
3 . イ ノ シ ン一グアノ シ ンキナーゼ活性を有する蛋白質をコー ドする遺伝子 がェシ リ ヒア . コ リ に由来する遺伝子、 又は該遺伝子にハイプリ ダイズ するこ とができる遺伝子である請求項 1 1 記載の組換え D N A。
4 . エキシグォバクテリ ゥム · ァセチリ カムに属する微生物から得るこ とが でき、 かつ、 以下の性質を有するイ ノ シン—グアノ シンキナーゼ活性を有 する蛋白質。
1 . 作用
リ ン酸供与体の存在下に、 ヌ クレオシ ドにリ ン酸基を転移し、 ヌ クレオ シ ドの 5 ' 一モノ リ ン酸エステルを生成する。
2 . 基質特異性
ヌ クレオシ ド三リ ン酸の 丫位のリ ン酸基が、 他のヌ クレオシ ドに転移す る。
3 . 至適 p H
7 . 7 - 9 . 9 4 - p H安定性
p H 6. 7 - 1 2. 1
5. 至適温度
30 - 50 °C
6. 金属要求性
マグネシウムイオン、 マンガンイオン、 コバル トイオン、 又は、 鉄ィォ ン。
7. 金属イオンによる影饗
銅イオン、 水銀イオンで強く 阻害される。
亜鉛イオン、 カ ドミ ウムイオンでも阻害される。
8. K m値
Km値は、 グアノ シンに対して 0. 03 mM、
イ ノ シンに対して l mM、
グアノ シ ンを基質と した場合、 A T Pに対しては 1. 6 ΓΠΜ
9. 分子量
S D S—ポリ アクリルアミ ドゲル電気泳動により約 36キロダルト ン。5. イ ノ シ ン —グアノ ンンキナーゼ活性を有し、 配列表配列番号 2に記載の アミ ノ酸配列を有する、 又は、 該ア ミ ノ酸配列の一部においてアミ ノ酸が 削除、 置換若し く は追加されている蛋白質。
6. 請求項 1 4又は 1 5記載の蛋白質をコー ドする遗伝子。
7. イ ノ シ ン一グアノ シンキナーゼを活性を有する蛋白質をコー ドし、 配列 表 列番号 1 に示される塩基 K列を有する、 又は該塩基 s列を有する遺伝 子とハイブリ ダィズすることのできる遺伝子。
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Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100694427B1 (ko) * 2005-12-02 2007-03-12 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조 방법
WO2007125783A1 (ja) 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
WO2007125782A1 (ja) 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
WO2008102572A1 (ja) 2007-02-20 2008-08-28 Ajinomoto Co., Inc. Ｌ－アミノ酸または核酸の製造方法
WO2009088049A1 (ja) 2008-01-10 2009-07-16 Ajinomoto Co., Inc. 発酵法による目的物質の製造法
WO2009107631A1 (ja) 2008-02-25 2009-09-03 味の素株式会社 ５’－グアニル酸の製造法
WO2015060391A1 (ja) 2013-10-23 2015-04-30 味の素株式会社 目的物質の製造法

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100463983B1 (ko) * 1998-03-14 2005-06-02 씨제이 주식회사 유전자 재조합 미생물에 의한 5'-구아닐산의 제조방법
TWI222464B (en) * 1999-02-08 2004-10-21 Kyowa Hakko Kogyo Kk Process for producing purine nucleotides
KR100397321B1 (ko) * 2000-12-26 2003-09-06 씨제이 주식회사 5'-이노신산을 고수율로 생산하는 미생물 코리네박테리움암모니아게네스 씨제이아이피009 및 그를 이용한5'-이노신산 생산방법
KR101089559B1 (ko) * 2004-03-31 2011-12-06 아지노모토 가부시키가이샤 바실러스 또는 에스케리키아 속에 속하는 세균을 사용하여 발효에 의해 퓨린 뉴클레오사이드 및 뉴클레오타이드를 제조하는 방법
WO2010045326A1 (en) 2008-10-14 2010-04-22 Barnes Wayne M In vitro recombination methods using 5' exonuclease
KR102284843B1 (ko) * 2019-10-08 2021-08-02 씨제이제일제당 주식회사 5'-구아닐산이나트륨 7수화물 결정의 제조 방법

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4944350B1 (ja) * 1967-06-16 1974-11-27
JPS5682098A (en) * 1979-12-06 1981-07-04 Ajinomoto Co Inc Production of purine nucleoside-5'-monophosphate
JPS63230094A (ja) * 1987-03-18 1988-09-26 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ５′−イノシン酸の製造法

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NL7209936A (ja) 1972-07-19 1974-01-22
DE69024639T2 (de) * 1989-12-05 1996-06-05 Kyowa Hakko Kogyo Kk Inosin-guanosin-kinase
US5756315A (en) * 1989-12-05 1998-05-26 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Inosine-guanosine kinase

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS4944350B1 (ja) * 1967-06-16 1974-11-27
JPS5682098A (en) * 1979-12-06 1981-07-04 Ajinomoto Co Inc Production of purine nucleoside-5'-monophosphate
JPS63230094A (ja) * 1987-03-18 1988-09-26 Kyowa Hakko Kogyo Co Ltd ５′−イノシン酸の製造法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOURNAL OF GENERAL MICROBIOLOGY, (1989), pages 1263-1273. *

Cited By (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR100694427B1 (ko) * 2005-12-02 2007-03-12 씨제이 주식회사 코리네박테리움 속 미생물 및 이를 이용한 5'-이노신산의제조 방법
WO2007125783A1 (ja) 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
WO2007125782A1 (ja) 2006-04-24 2007-11-08 Ajinomoto Co., Inc. プリン系物質生産菌及びプリン系物質の製造法
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