JPS63230094A - ５′−イノシン酸の製造法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は５′−イノシン酸く以下ｒ１ＭＰ」と略記する
）の製造方法に関する。ＩＭＰは調味料として用いられ
、従って本発明は食品工業の分野に関する。

従来の技術 これまでＩＭＦの製造法としては、（１）酵母菌体から
抽出したリボ核酸を酵素的に分解して製造する方法、（
２）発酵法によって生産されるイノシンを化学的にリン
酸化する方法、（３）　ＩＭＦ生産能を有する微生物を
培養し培地中に蓄積されたＩＭＰを取得する方法、など
が知られておりそれぞれ実用化されている。

発明が解決しようとする問題点 ＩＭＦは調味料として一般家庭で用いられているのをは
じめ、蒲鉾、竹輪、インスタントラーメン、各種スープ
類などの加工食品に広く使われおり、より効率的、経済
的な製造方法が望まれている。

イノシンと５′−アデノシン−三−リン酸（以下ＡＴＰ
と略称する）を基質として酵素的にイノシンをＩＭＦに
リン酸化する反応は、イノシンキナーゼ［１ｎｏｓｉｎ
ｅ　ｋｉｎａｓｅ　（［ｉＣ２，７，１，７３）　］に
相当する活性により触媒され、次式に示すようにＩＭＦ
と同時にＡＴＰの前駆体を生成する。

イノシン＋ＡＴＰ−−−Ｉ　Ｍ　Ｐ　＋、Ａ　Ｔ　Ｐの
前駆体経済的に実用性のあるＩＭＦ製造法にふいては、
ＡＴＰの安価な供給方法が必要である。イノシンのリン
酸化反応では、ＡＴＰの末端のリン酸基がＩＭＦに取り
込まれるのみで、ＡＴＰの前駆体部分はそのまま残る。

適当な基質からＡＴＰ合成に要するエネルギーを獲得し
、それによってＡＴＰの前駆体からＡＴＰを生合成する
ことができる反応系（以下ＡＴＰ再生系と称することが
ある）があれば、イノシンリン酸化活性と共役させるこ
とによって、次式に示すように、ＡＴＰの前駆体相当部
分を反復使用し得るＩＭＦ生成系、すなわちＡＴＰの添
加が不要なＩＭＰ生産系が構築できる可能性が考えられ
る。その場合、リン酸基供与体およびエネルギー供給基
質が安価なものであれば経済的に有利なＩＭＦ生産法に
なり得ると考えられる。

イノシン＋Ａ　Ｔ　Ｐ−Ｉ　Ｍ　Ｐ　＋　Ａ　Ｔ　Ｐ前
駆体ＡＴＰ前駆体＋リン酸基供与体＋エネルギー供与体
−ＡＴＰ 問題点を解決するための手段 本発明者は、糖質などの炭素源からイノシンを直接発酵
生産する能力を有するイノシン生産菌（以下イノシン菌
と称することがある）と、ＡＴＰ前駆体とエネルギー供
与体およびリン酸基供与体とからＡＴＰを生合成する活
性（以下ＡＴＰ再生活性と称することがある）を有する
微生物（以下ＡＴＰ再生菌と称することもある）、およ
びイノシンとＡＴＰからＩＭＦおよびＡＴＰ前駆体を生
成する酵素（°以下リン酸化酵素と称することもある）
または同活性を有する微生物（以下リン酸化菌と称する
こともある）との共同作用を利用すれば、糖質（グルコ
ースなど）をイノシン生産の主原料とし、またＡＴＰの
代わりにＡＴＰを再生するための安価なエネルギー供給
基質およびリン酸基供与体を用いて実用的なＩＭＦの製
造ができること、さらにはＡＴＰ再生系としてイノシン
菌が併せ持っているＡＴＰ再生活性を利用することも可
能であることを見出し、本発明を完成するに至った。

以下に本発明の詳細な説明する。

本発明は、発酵法によりイノシンを生産し、引き続きＡ
ＴＰをリン酸基供与体とする酵素反応によりイノシンを
リン酸化してＩＭＦを製造する方法に関する。さらに詳
細には、イノシン閑の培養液と、ＡＴＰ再生菌の培養液
、およびリン酸化菌の培養液、もしくはそれらの各培養
液の処理物とを存在させることにより、ＩＭＦを培地中
もしくは反応液中に蓄積させ、該培養液もしくは反応液
中からＩＭＦを採取することによりＩＭＦを製造する方
法に関する。

イノシン菌としては、培養液中にイノシンを蓄積する能
力を有する菌株であればいずれでも用いられる。なかで
も ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１２
９５゜コリネバクテリウム・グルタミクム　　ＡＴＣＣ
１９１８５゜バチルス・サチルス　　　　　　　　　Ａ
ＴＣＣ１４６１８゜などが好適である。

これらの菌を通常の培養方法によって培養することによ
って、培地中にイノシンを著量蓄積させることができる
。すなわち、これらの細菌を適当な炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中
において、好気的条件下にて温度、ｐＨなどを調節しつ
つ培養を行えば良い。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下で、温度は２０〜４０℃、好ましくは２５〜３５℃
において、ｐＨは中性付近に維持しつつ、通常１０〜１
２０時間行う。

ＡＴＰ再生菌としては、前記のイノシン生産菌のほか、 エシェリヒア・コリ　Ｃ６００ＡＴＣＣ３３５２５エシ
エリヒア・コリ　ＢＡＴＣＣ１１３０３スタフィロコッ
カス・オーレウス　ＡＴＣＣ４０１２サツカロミセス・
セレビシェ−ＡＴＣＣ２００１８キヤンデイダ・ゼイラ
ノイデス　　ＡＴＣＣ２０３５６トルロプシス・サイク
ロフィラ　　ＡＴＣＣ２２１６３などを例示することが
できる。

これらの菌を通常の培養方法によって培養することによ
って、ＡＴＰ生合成活性を有する培養液、もしくは菌体
を得ることができる。すなわち、これらの細菌を適当な
炭素源、窒素源、無機物、アミノ酸、ビタミンなどを含
有する通常の培地中において、好気的条件下にて温度、
ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば良い。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下で、温度は２０〜５０℃、好ましくは２５〜４３℃
において、ｐ＋は中性付近に維持しつつ、通常１０〜１
２０時間行う。

リン酸化菌としては、イノシンおよびＡＴＰからＩＭＦ
を生成するイノシンリン酸化活性を有する微生物であれ
ばいずれでも使用できる。具体的には、 エシェリヒア・コリ　　　　　　　ＡＴＣＣ３９０２３
エシエリヒア・コリ　　　　　　　ＡＴＣＣ１１３０３
バチルス・サチルス　　　　　　　ＡＴＣＣ１４６１７
フラボバクテリウム・デボランス＾ＴＣＣ１０８２９セ
ラチア・マルセッセンスＹＴＩＯＩ　　ＦＦＲＭ　ＢＰ
−１２９１などを例示することができる。また、遺伝子
組換えや細胞融合などの分子育種手法によって、これら
微生物のイノシンリン酸化活性を強化した菌株なども好
適である。

これらの微生物を通常の培養方法によって培養すること
によって、イノシン右よびＡＴＰからＩＭＦを生成する
強力な活性を有する培養液、菌体、またはそれらの処理
物を得ることができる。

すなわち、これらの微生物を適当な炭素源、窒素源、無
機物、アミノ酸、ビタミンなどを含有する通常の培地中
において、好気的条件下で温度。

ｐＨなどを調節しつつ培養を行えば良い。

培養は、振盪培養あるいは通気攪拌培養などの好気的条
件下で行う。培養温度は２０〜５０℃が良く、２８〜４
３℃がより好ましい。培養中の培地のｐＨは中性付近に
維持することが望ましい。培養時間は通常１〜４８時間
である。

イノシン菌、ＡＴＰ再生菌、およびリン酸化菌の培養に
用いる炭素源としてはグルコース、フラクトース、シュ
ークロース、マルトース、マンニトール、ソルビトール
などの炭水化物や糖アルコール、グリセロール、さらに
ピルビン酸、乳酸。

クエン酸などの各種のアルコールや有機酸、グルタミン
酸、メチオニン、リジンなどの各種アミノ酸などが使用
できる。また、澱粉加水分解物、糖蜜、廃糖蜜、白糠、
キャブサバ。バガス、コーン・ステイープ・リカーなど
の天然有機栄養源も各画が資化できるものであればいず
れでも用い得る。

窒素源としては、アンモニアあるいは塩化アンモニウム
、硫酸アンモニウム、炭酸アンモニウム。

酢酸アンモニウムなどの各種無機および有機アンモニウ
ム塩類、グルタミン酸、グルタミン、メチオニンなどの
アミノ酸、あるいはペプトン、ＮＺアミン、コーン・ス
テイープ・リカー、肉エキス。

酵母エキス、カゼイン加水分解物、フィツシュミールあ
るいはその消化物、さなぎ加水分解物などの含窒素有機
物などの種々の物が使用可能である。

さらに、無機物としては、リン酸二水素カリウム。

リン酸−水素ナトリウム、硫酸マグネシウム、塩化ナト
リウム、塩化カルシウム、塩化鉄、硫酸銅。

塩化マンガン、モリブデン酸アンモン、硫酸亜鉛などを
必要に応じて添加する。微生物の生育に必要なビタミン
、アミノ酸、ミネラル、核酸その他のものは必要に応じ
て添加するが、前記したような他の培地成分に伴って培
地に供給されれば特に加えなくても良い。

かくして得られるイノシンを含有するイノシン菌の発酵
液、菌体、もしくはそれらの処理物と、ＡＴＰ再生再生
上養液、菌体、もしくはそれらの処理物と、リン酸化菌
の培養液、菌体、もしくはそれらの処理物とを合わせる
のは、それぞれを別個に培養し培養終了後混合しても良
いし、またイノシン発酵の開始時点もしくはそれから終
了時点までのいずれかの時点で、ＡＴＰ再生再生上びリ
ン酸化菌の培養液、菌体、もしくはそれらの処理物を混
合しても良く、さらにはリン酸化菌培養の開始時点から
培養終了時点までのいずれかの時点においてイノシン菌
およびＡＴＰ再生再生上養液、菌体もしくはそれらの処
理物を混合してもよい。

さらに、ＡＴＰ再生再生上養開始時点から培養終了まで
のいずれかの時点に、イノシンを含有する培養液、およ
びリン酸化菌培養液の、菌体もしくはそれらの処理物を
添加しても良い。また、イノシン生産菌とリン酸化菌お
よびＡＴＰ再生再生上合培養し、その培養液もしくは処
理物を用いても良い。

ＡＴＰ再生系としてイノシン閑の有しているＡＴＰ再生
活性を利用する場合、イノシンおよびイノシン発酵菌体
を含有する培養液と、リン酸化菌培養液、菌体、もしく
はその処理物とを合せるのは、それぞれを別個に培養し
培養終了後混合しても良いし、またイノシン発酵の開始
時点もしくはそれから終了時点までのいずれかの時点で
リン酸化菌培養液、菌体もしくはその処理物を混合して
も良く、さらにはリン酸化菌培養の開始時点から培養終
了時点までのいずれかの時点においてイノシン発酵液、
菌体もしくはそれらの処理物を混合してもよい。また、
イノシン生産菌とリン酸化菌とを混合培養し、その培養
液もしくは処理物を用いても良い。

かくして得られるイノシンまたはイノシン含有物、イノ
シン菌培養液もしくは菌体、およびリン酸化菌培養液も
しくは菌体を含有する液、またはそれらの処理物を含有
する液を用いて、これとリン酸基供与体右よびＡＴＰ再
生基質とを接触させることによってＩＭＦを得ることが
できる。なお、必要に応じてＡＴＰ前駆体を添加しても
良い。

イノシンからＩＭＦへのリン酸化は、上記混合液に必要
に応じてマグネシウムイオン、界面活性剤および／また
は有機溶剤などを加え、ｐＨを６〜１０、より好ましく
は７〜８に調節しつつ、かつ２０〜５０℃に１〜４８時
間保ちつつ行わせる。イノシンからＩＭＰへのリン酸化
時のイノシンの濃度は、１〜１００　ｍｇ／ｍ＋の範囲
にあることが望ましい。

イノシンまたはイノシン含有物としては、イノシンの精
製品、粗精製品、イノシン発酵液の濃縮物、除菌体上清
液およびその濃縮物など、イノシンからＩＭＰへのリン
酸化反応を妨げないものであればいずれでも用いること
ができる。

イノシン菌、ＡＴＰ再生再生上よびリン酸化菌の各培養
液もしくは菌体の処理物としては、培養液の濃縮物およ
び乾燥物、培養物を遠心分離して得られる上清液、菌体
、凍結菌体、さらには菌体−の乾燥物、凍結乾燥物、ア
セトン処理物、界面活性剤および／または有機溶剤処理
物、溶菌酵素処理物、固定化菌体などがあげられる。ま
た、ＡＴＰ再生再生上くはリン酸化菌の菌体処理物とし
ては、前記の他に、該菌体から抽出したΔＴＰ再生酵素
もしくはリン酸化酵素含有液、それらの酵素の精製標品
、固定化物なども用いられる。

ＡＴＰ再生基質としては、使用するＡＴＰ再生再生上っ
て利用され得るものであれば、グルコース。

アラビノース、ラクトース、マルトース、シュークロー
ス、マンニトール、ソルビトール、トレハロース、糖蜜
、廃糖蜜、その他の糖質、澱粉加水分解物などの炭水化
物、ピルビン酸、乳酸、酢酸。

α−ケトゲルタール酸などの有機酸、グリシン。

アラニン、アスパラギン酸、グルタミン酸、グルタミン
などのアミノ酸などいずれでも良い。また、アセチルリ
ン酸、カルバミルリン酸、クレアチンリン酸などのリン
酸化化合物も用いることができる。

リン酸基供与体としては、オルソリン酸、ビロリン酸、
ポリリン酸、ポリメタリン酸などの無機リン酸のナトリ
ウム塩、カリウム塩、マグネシウム塩などいずれでも使
用できる。また、アセチルリン酸、カルバミルリン酸、
クレアチンリン酸。

フラクトース−１，６−二リン酸などの有機リン酸化化
合物も用いることができる。その濃度は、１０〜４００
ｍＭの範囲を保つことが望ましい。

ＡＴＰの前駆体としては、５′−アデノシン−ニーリン
酸、５′−アデノシンーーーリン酸、アデノシン、アデ
ニンなどの精製標品、粗精製品。

またはそれらの含有物など、イノシンからＩＭＦへのリ
ン酸化反応を阻害しないものであればいずれでも使用で
きる。なお、菌体や培養液などから反応系中に持ち込ま
れる潰が十分であれば、特に添加する必要はない。

界面活性剤としては、ポリオキシエチレン・ステアリル
アミン（例えばナイミーンＳ−２１５゜日本油脂社製・
以下同じ）、セチルトリメチルアンモニウム・ブロマイ
ド、カチオンＦＢ、カチオンＦ２−４０Ｅなどのカチオ
ン性界面活性剤、ナトリウムオレイルアミド硫酸、二ニ
ーレックスＴＡＢ、　　ラビゾール８０などのアニオン
系界面活性剤、ポリオキシエチレンソルビタン・モノス
テアレート（例えばノニオンＳＴ２２１）などの両性界
面活性剤、その他三級アミンＰＢ、ヘキサデシルジメチ
ルアミンなど、イノシンからＩＭＰへのリン酸化を促進
する物であればいずれでも使用でき、これらは通常０．
１〜５０　ｍｇ／ｍ＋、好ましくは１〜２０　ｍｇ／ｍ
ｌの濃度にて用いられる。また、有機溶剤としては、ト
ルエン、キシレン、脂肪族アルコール、ベンゼン、酢酸
エチルなどが用いられ、その濃度は０．１〜５０　μｌ
／ｍ＋、好ましくは１〜２０ＪｄＩ／ｍ　Ｉが良い。

イノシンからＩＭＦへのリン酸化を行う際のマグネシウ
ムイオンの濃度は、４〜４００ｍＭの範囲を保つことが
望ましい。培養液もしくは菌体などからリン酸化系に持
ち込まれる量がこの濃度範囲を満たす場合は添加の必要
はなく、一方、不足する場合は上記の濃度範囲に入るよ
うに添加する。マグネシウムイオンとしては無機塩でも
、有機酸の塩でも使用できる。

以下に１本発明の実施例を示す。

実施例１゜ プレビバクテリウ゛ム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ２
１２９５を、ポリペプトン１％、肉エキス０．５％。

酵母エキス０．５％１食塩０．２５％を含む種培地（ｐ
Ｈ７，２）１０ｍｌを分注した５０ｍ１容大型試験管に
一白金耳植菌し３０℃で２４時間往復振盪培養した。こ
の種培養液を、グルコース１５％、カゼイン加水分解物
０．０１％。

酵母エキス０．７％、硫安１．［１％、　ＫＨ２Ｐ０．
０．３％。

Ｋ、ＨＰｏ、　０，３％、　Ｍｇ５Ｏ，・７Ｈ，００，
５％、アデニン、グアニン各１０μｇ／ｍｌ、　　ビオ
チンＩＯμｇ／ｌの組成の培地をｐＨ７，２に調整後３
００ｍ１容バッフル付き三角フラスコに２０ｍ１ずつ分
注し、１２０℃、２０分間蒸煮殺菌した培地に２ｍｌ植
菌した。回転振盪培養にて３０℃で培養中、必要に応じ
尿素を添加するごとによって、ｐＨを中性付近に保った
。培養７２時間目でイノシンが２１．１　ｍｇ／ｍｌ生
成した。遠心分離によりイノシン発酵菌体を除いた土浦
液を得た。

サツカロミセス・セレビシェ　＾ＴＣＣ２００１８，）
ルロブシス・サイクロフィラ　八ＴＣＣ２２１６３，キ
ャンディダ・ゼイラノイデス　ＡＴＣＣ２０３５６の３
株を、グルコース　３０ｇ／Ｉ、硫酸アンモニウム５ｇ
／Ｉ。

ＫＨ，ＰＯ４１ｇ／１．Ｍｇ５ｏ、・７　Ｈ２００，５
ｇ／　Ｉ　。

酵母エキス３ｇ／ｌ、　ＣａＣＯ３１０ｇ／ｌ　（殺菌
前ｐＨ６，５）の種培養培地３ＱＱｍｌを含む２．００
０ｍ１三角フラスコに植菌し、３０℃にて２４時間培養
した種培養液を１０％（容量比）の割合でグルコース１
５０ｇ／Ｉ。

硫酸アンモニウムｌＯｇ／Ｉ、　ＫＨ２ＰＯ４１ｇ／ｌ
。

Ｍ　ｇ　Ｓ　Ｏ４・７　Ｈ２００，５ｇ／ｌ、　　コー
ンステイープリカー５ｇ／ｌ　　（殺菌前ｐＨ６，５＞
からなる菌体生産培地３００ｍ１を含む２Ｉｌ三角フラ
スコに植菌し、培養期間中アンモニアにてｐＨ６，５付
近に調節しつつ、３０℃にて４８時間２回転振盪培養を
行った。培養液から遠心分離により菌体得た。

エシェリヒア・コリ　Ｃ６００＾ＴＣＣ３３５２５，同
じ＜　　Ｂ　、ＡＴＣＣ１１３０３，スタフィロコッカ
ス・オーレウスＡＴＣＣ４０１２，セラチア・マルセッ
センスＹＴ１０１（ＦＢＲＭ　ＢＰ−１２９１＞の各菌
株を、上記と同じ組成の種培地（ｐＨ７，２）　１０ｍ
１を分注・殺菌した大型試験管に一白金耳接種し、３０
℃にて２０時間往復振盪培養した。これをＭ９培地（Ｎ
ａ２ＨＰＯａ　６ｍｇ／ｍｌ、　Ｋｔ（、ＰＯａ３ｍｇ
／ｍｌ、　　ＮａＣ］　５ｍｇ／ｍｌ、　　ＮＨ４Ｃｌ
　１ｍｇ／ｍ！、サイアミ７・ＭＣＩ　４μｇ／ｍｌ、
　　グルコ−ｘ　３ｍｇ／ｍｌ、　Ｍｇ５Ｏｎ・７Ｈ２
００，２５ｍｇ／ｍｌ、ｐＨ７，２＞を３ＱＱｍｌ含む
２β三角フラスコ培地に２ｍｌ植菌し、３０℃にて１７
時間回転振盪培養した。この培養液から菌体を遠心分離
により集めた。

前記のブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ
２１２９５株のイノシン発酵液上清に、ＡＴＰ再生活性
を有するサツカロミセス・セレビシェＡＴＣＣ２００１
８，ｌ−ルロブシス・サイクロフィラ＾ＴＣＣ２２１６
３、キャンディダ・ゼイラノイデス＾ＴＣＣ２０３５６
゜エシェリヒア・コリ　Ｃ６００＾ＴＣＣ３３５２５，
同じ＜　　Ｂ　　ＡＴＣＣ１１３０３，スタフィロコッ
カス・オーレウス＾ＴＣＣ４０１２の各菌株を、１００
ｍｇ／ｍｌ　（湿菌体重量〉となるように、またイノシ
ンをＩＭＰに転換する活性を有するセラチア・マルセッ
センスＹＴＩＯＩ（ＦＢＲＭ　ＨＰ−１２９１）の菌体
を１００ｍｇ／ｍｌとなるように添加した。この菌体懸
濁液に、グルコース５０ｍｇ７ｍ１　。

２５％フィチン酸ソーダ（ｐＨ７，０＞　　８＋ｎｇ／
ｍｌ、　ＮａＪＰＯ。

５ｍｇ／ｍｌ、　ＭｇＳ口、・７Ｈ，０５ｍｇ／ｍｌを
添加し、さらにナイミーンＳ−２１５４ｍｇ／ｍｌおよ
びキシレン１０μｌ／ｍｌ（エシェリヒアおよびスタフ
ィロコッカスの場合）または、三級アミンＰＢ　Ｉｇ／
Ｉ　（サツカロミセス、トルロプシスおよびキャンディ
ダの場合）を添加し、２００ｍ１ビーカーに２０１１１
１ずつ分注した。これをマグネチック・スターラーにて
９０Ｏｒｐｍにて攪拌し、アンモニア水にてｐＨを７．
４付近に調節しつつ、３０℃に２４時間保ち、イノシン
からＩＭＰへのリン酸化反応を行った。結果を第１表に
示す。

第　　　１　　　表 菌　　株　　　　　　　　　　　　　　Ｉ　Ｍ　Ｐ　（
ｍｇ／ｍｌ）サラ加ミセス・　セしピシエ　　　　ＡＴ
ＣＣ２００１８５，７０トルロプシス・サイクロフィラ
　　　　ＡＴＣＣ２２１６３４，０１キヤンデイダ・ぜ
イラノイデス　　　　ＡＴＣＣ２０３５６４，３０エシ
エリヒア・コリ　Ｃ６００ＡＴＣＣ３３５２５５，５６
エシエリヒア・コリ　ｅ　　　　　　　　ＡＴＣＣ１１
３０３６，８２スタプイロコツカス・トレウス　　　＾
ＴＣＣ４０１２３，３５実施例２゜ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ２１
２９５を、ポリペプトン１％、肉エキス０．５％。

酵母エキス０．５％９食塩０．２５％を含む種培地（ｐ
Ｈ７，２＞ｌＱｍｌを分注した７０ｍ１容大型試験管ｊ
ご一白金耳植菌し３０℃で２４時間往復振盪培養した。

これを、グルコース１５％、カゼイン加水分解物０．０
１％、酵母エキス０．７％、硫安１．０％、　ＫＨ，Ｐ
ｏ、　０．３％、　Ｋ、ＨＰｏ。

０．３％、　Ｍｇ５Ｏ＜　７１（２００，５％、アデニ
ン、グアニン各１０μｇ／ｍｌ、　　ビオチン１０ｕｇ
／ｌの組成の培地をｐ）１７．２に調整後３００ｍ１容
バッフル付き三角フラスコに２０ｍ１ずつ分注し、１２
０℃、２０分間蒸煮殺菌した培地に２ｍｌ植菌した。回
転振盪培養にて３０℃で培養中、必要に応じ尿素を添加
することによって、ｐＨを中性付近に保った。培養７６
時間目でイノシンが２０．０ｍｇ／ｍｌ生成した。

セラチア・マルセッセンスＹＴＩＯＩ（ＦＥＲＭ　ＢＰ
−１２９１）株を、上記と同じ組成の種培地（ｐＨ７，
２）　１０ｍ１を分注・殺菌した大型試験管に一白金耳
接種し、３０℃にて２０時間往復振盪培養した。これを
、Ｍ９培地を３ＱＱｍｌ含む２１三角フラスコに２ｍｌ
植菌し、３０℃にて１７時間回転振盪培養した。この培
養液から菌体を遠心分離により集め、凍結保存（−２０
℃）した。

セラチア・マルセッセンスＹＴＩＯＩ（ＦＩＥＲＭ　Ｂ
Ｐ−１２９１）の凍結菌体を水に懸濁し、湿菌体重量に
て５０ｍｇ／ｍｌとなるようにイノシン発酵液に添加し
、この液にグル：Ｉ−ス５Ｑ＋ｎｇ／ｍｌ　、　２５％
フィチン酸ソーダ（ｐＨ７，０）　　８ｍｇ／ｍｌ、　
Ｎａ２ＨＰＯｎ　５ｍｇ／ｍｌ、　ＭｇＳＯ４・７Ｈ７
Ｈ２Ｏ５／ｍｌとなるように添加し、さらにナイミーン
Ｓ−２１５４ｍｇ／ｍｌ、およびキシレン１０μｌ／ｍ
ｌを添加し、２００ｍ１ビーカーに２Ｑ＋ｎ　Ｉずつ分
注した。これをマグネチック・スターラーにて９０Ｏｒ
ｐｍにて攪拌し、アンモニア水にてｐＨを７．４付近に
調節しつつ、３０℃に２４時間保ち、イノシンからＩＭ
Ｆへノリン酸化反応を行った。その結果、　８．８０ｍ
ｇ／ｍｌのＩＭＰ（以下ＩＭＰ−Ｎａ２’７ＨｗＯ相当
量として表示、以下同じ）が生成蓄積した。なお、ナイ
ミーンＳ−２１５およびキシレンを添加しなかった場合
は０゜５ｍｇ／ｍｌであった。また、セラチア・マルセ
ッセンスの菌体を無添加の場合、ＩＭＰの蓄積量は０、
３ｍｇ／ｍｌ以下であった。

実施例３゜ イノシン発酵菌として、コリネバクテリウム・グルタミ
クム　ＡＴＣＣ１９１８５を用いたほかは実施例２と同
様に培養・反応を行った。イノシン生成量ハフ、　３５
ｍｇ／ｍｌ、　Ｉ　Ｍ　Ｆ生成量は３．４４ｍｇ／ｍｌ
　であった。

実施例４゜ セラチア・マルセッセンスＹＴＩＯＩ（ＦＢＲＭ　０Ｐ
−１２９１）の代わりに第２表に示す各菌株を用いる他
は、実施例２．と同様（Ａ）またはイノシン発酵の培養
液の遠心分離上清（Ｂ）を用いて反応を行った。

第２表に結果を示す。なお、イノシンの生成量は１８、
９　ｍｇ／ｍｌであった。

エシェリヒア・コリ　　　　　　　　ＡＴＣＣ３９０２
３３，２１０，２２エフシエリヒア・コリ　　　　　　
　ＡＴＣＣ１１３０３２，３３０，１８バチルス　・サ
チルス　　　　　　　ＡＴＣＣ１４６１７２，２９０，
２１フラボバクテ１乃ム・デボランス　　ＡＴＣＣ１０
８２９３，４１０，２２実施例５゜ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネスＡＴＣＣ２１２
９５株を実施例２と同様に培養し、培養７４時間にてイ
ノシン１８．３ｍｇ／ｍｌを含有する発酵液を得た。

一方、セラチア・マルセッセンスＹＴＩＯＩ（ＦＥＲＭ
　ＢＰ−１２９１）を、同じ〈実施例２と同様に培養し
、得られた菌体を遠心分離にて集菌した。該菌体をｐＨ
７，０のリン酸緩衝液に湿菌体量にて２０Ｏｎ＋ｇ／ｍ
ｌとなるように懸濁し、水冷条件下で断続的に計１０分
間超音波破砕機（トミー精工社製＋、　ＬＩＲ−２００
Ｐ型）にて細胞を破砕した。この細胞破砕液１００ｍ１
を１０．００Ｏｒｐｍ×１０分間遠心分離した上清液を
、分子篩膜にて１０ｍ１に濃縮（アミコン社製スタンダ
ードセルモデル５２に、アミコン社のグイヤフローメン
ブレンＹＭＩＯを装着して使用）し、反応に用いた。

イノシン発酵液１３ｍ１に、セラチア・マルセッセンス
の菌体抽出・濃縮液２１Ｔｌｌを添加し、さらにグルコ
ース、２５％フィチン酸ソーダ（ｐＨ７，０）　。

Ｎａ、ｔｌＰＯ，、ＭｇＳロ４’７Ｈ２０をそれぞれ５
０．８．５．５（ｍｇ／ｍ！＞となるように添加し、２
００ｍ１ビーカーに２０ｍ１ずつ分注した。以下、実施
例２と同様に反応を実施した。その結果、６．４４ｍｇ
／ｍｌのＩＭＰが生成した。

実施例６゜ ブレビバクテリウム・アンモニアゲネス　ＡＴＣＣ２１
２９５を実施例２と同様に培養し、イノシン１９、３ｍ
ｇ／ｍｌ　と菌体を含有するイノシン発酵液を得り。マ
タ、セラチア・マルセツセンスＹＴ１０１（Ｆ［！ＲＭ
　ＢＰ−１２９１）株を実施例２と同様に培養し、菌体
を遠心分離により集めた。セラチア・マルセツセンスの
菌体を、（１）蒸留水、（２）４％ナイミーン溶液、（
３）１％キシレン含有液、（４）４％ナイミーンおよび
１％キシレンを含有する液、にそれぞれ懸濁し１．湿潤
菌体重量にて５０ｍｇ／ｍｌとなるように前記のイノシ
ン発酵液に添加し、さらにグルコース５０ｍｇ／ｍ１　
、２５％フィチン酸ソーダ（ｐＨ７，０）　　８ｍｇ／
ｍｌ、　Ｎａ２ＨＰＯｓ　５ｍｇ／ｍｌ、　Ｍｇ５ｏ４
・７Ｌ０５ｍｇ／ｍｌとなるようにそれぞれ添加し、２
００１１１１ビーカーに２０ｍ１ずつ分注した。以下、
実施例２と同様にＩＭＦ生成反応を実施した。結果を第
３表に示す。

第３表　菌体処理方法 処理条件　　ＩＭＦ　（ｍｇ／＋ｎｌ）無処理　　　　
０．３ ＋Ｎ、　　　　　３．４ ＋Ｘ　　　　　　５．４ 十Ｎ＋Ｘ　　　　８．５ Ｎ十Ｘ：４％ナイミーン＋１％キシレン発明の効果 イノシン生産能がイノシン生産能と同時に有しているＡ
ＴＰ再生活性とＡＴＰとイノシンからＩＭＰを生成する
能力をもつ微生物のイノシンのリン酸化酵素活性とを共
役させることにより、グルコースを主炭素源とし、ＡＴ
Ｐの代わりに安価なエネルギー供与体およびリン酸基供
与体を用いてＩＭＦを工業的に製造することができる。

Claims (3)

【特許請求の範囲】
1. （１）イノシンまたはイノシンを生産する能力を有する
   微生物を培地中に培養して得たイノシン発酵の培養液と
   、５′−アデノシン−三−リン酸（以下ＡＴＰと略記す
   る）の前駆体、エネルギー供与体およびリン酸基供与体
   からＡＴＰを生合成する能力を有する微生物の培養液と
   、イノシンとＡＴＰとから５′−イノシン酸とＡＴＰの
   前駆体とを生成する能力を有する微生物の培養液と、も
   しくはそれら各培養液の処理物とを存在させることによ
   り、５′−イノシン酸を培地もしくは反応液中に蓄積さ
   せ、該培養液もしくは反応液から５′−イノシン酸を採
   取することを特徴とする５′−イノシン酸の製造法。
2. （２）ＡＴＰの前駆体とエネルギー供与体およびリン酸
   基供与体とからＡＴＰを生合成する能力を有する微生物
   として、イノシン生産菌を利用することを特徴とする、
   特許請求の範囲第１項記載の方法。
3. （３）微生物の処理方法が、有機溶剤および／または界
   面活性剤を用い、これらを菌体とあらかじめ接触させる
   か、または培地中もしくは反応液中に存在させる方法で
   あることを特徴とする特許請求の範囲第１項記載の方法
   。