CN101300344B

CN101300344B - 经修饰的转酮酶及其用途

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Publication number: CN101300344B
Application number: CN2006800411816A
Authority: CN
Inventors: 马丁·莱玛恩; 汉斯-彼得·霍曼; 迪特马尔·卢达尔特; 迈克尔·汉斯
Original assignee: DSM IP Assets BV
Current assignee: DSM IP Assets BV
Priority date: 2005-11-02
Filing date: 2006-10-25
Publication date: 2012-07-04
Anticipated expiration: 2026-10-25
Also published as: US20130189731A1; EP1957640B1; EP1957640A1; KR101285515B1; JP2009514513A; JP5364376B2; WO2007051552A1; ES2425756T3; US8257944B2; US9315784B2; CN101300344A; US20080311617A1; KR20080071168A

Abstract

本发明涉及用于生物技术生产化合物的改良方法，所述化合物以5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作为生物合成的前体，如核黄素(维生素B₂)、FAD、FMN、磷酸吡哆醛(维生素B₆)、鸟苷、GMP、腺苷、AMP。本发明还涉及生产这些化合物的生物。其还涉及突变的转酮酶及其编码多肽的产生，所述突变的转酮酶被引入生产菌株时允许在葡萄糖上正常生长，但是在葡萄糖酸盐上的生长被降低。

Description

经修饰的转酮酶及其用途

本发明提供了经修饰的转酮酶。合成经修饰的转酮酶之一以代替野生型转酮酶的微生物对氨基酸而言是原养型的(prototroph)并在使用碳源中受损，所述碳源通过戊糖磷酸(pentose phosphate)途径被同化。经修饰的酶和编码该酶的多核苷酸可以用于物质的发酵过程，该过程使用5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作为底物用于生物合成例如核黄素、核黄素前体、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及其衍生物。它们也可以用于生产磷酸吡哆醛(维生素B₆)、尿苷和腺苷及这些核苷酸的衍生物。

所有的植物和许多微生物可以合成核黄素(维生素B₂)，但是高等动物不能产生核黄素。因为它是碳水化合物酶促氧化所必需的辅酶(例如黄素腺嘌呤二核苷酸和黄素单核苷酸)的前体，所以核黄素对于基础代谢是必需的。在高等动物中，核黄素不足可以引起脱发、皮肤炎症、视觉衰退和生长不足。

催化从三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖生物合成核黄素所需的酶由B.subtilis(枯草芽孢杆菌)中的四个基因(ribG，ribB，ribA和ribH)编码。这些基因位于一个操纵子上，其基因顺序与酶催化的酶反应的顺序不同。例如，催化核黄素生物合成中第一步的GTP环水解酶II由操纵子中第三个基因ribA编码。ribA基因也编码另一酶活性，即4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮合酶(DHBPS)，其催化5-磷酸核酮糖到四碳单元4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮(DHBP)的转化。脱氨基酶和还原酶由操纵子的第一个基因ribG编码。核黄素生物合成中倒数第二个步骤由2，4-二氧四氢喋啶合酶催化，所述2，4-二氧四氢喋啶是最后一个rib基因ribH的产物。控制该途径最后一步的核黄素合酶由操纵子的第二个基因ribB编码。位于rib操纵子3’端的基因的功能目前尚不清楚；然而，其基因产物不是核黄素生物合成所需要的。

从ribP1启动子的核黄素操纵子的转录由衰减机制控制，所述机制涉及位于ribP1和ribG之间的调节前导区。该前导区内ribO突变导致核黄素操纵子的去调节的(deregulated)表达。ribC基因中含有错义突变的株系中也观察到去调节的表达。已经显示ribC基因编码B.subtilis的黄素激酶/FAD合酶(Mack，M.，et al.，J.Bacteriol.，180：950-955，1998)。去调节的突变降低了ribC基因产物的黄素激酶活性，导致降低的黄素单核苷酸(FMN)细胞内浓度，所述黄素单核苷酸是核黄素调节体系的效应分子。

过去，已经以大量不同的方式完成了具有提高的核黄素生产率和产率的核黄素生产菌株的工程改造。例如，(1)使用经典的诱变产生所选生物基因组中具有随机突变的变体，随后选择更高的嘌呤类似物抗性和/或筛选提高的核黄素生产。(2)或者，过表达核黄素生物合成的末端酶(即催化三磷酸鸟苷(GTP)和5-磷酸核酮糖转化为核黄素的酶)，也得到朝向靶产物的更高通量。进入和通过生物合成途径(例如核黄素生物合成途径)的代谢通量由该具体途径的限速酶和这些酶底物的细胞内浓度决定。只有在饱和底物浓度下或高于饱和底物浓度时，酶才能够以其最大活性运作。饱和底物浓度是每种酶的特征性质。例如，可以通过将5-磷酸核酮糖的细胞内浓度保持在4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮合酶的饱和底物浓度之上或尽可能接近该浓度，来提高进入核黄素途径的代谢通量或将其保持在高水平，所述4-磷酸3，4-二羟基-2-丁酮合酶是核黄素生物合成途径的假定限速酶。可例如如下达到5-磷酸核酮糖的高细胞内浓度：阻止或干扰5-磷酸核酮糖通过戊糖磷酸途径的非氧化部分进入中枢代谢的引流。

戊糖磷酸途径的非氧化部分中一个关键酶是转酮酶(transketolase)，其催化5-磷酸核糖和5-磷酸木酮糖可逆转化为7-磷酸景天庚酮糖(seduheptulose-7-phosphate)和3-磷酸甘油醛。另外，转酮酶还催化6-磷酸果糖和3-磷酸甘油醛转化为5-磷酸木酮糖和4-磷酸赤藓糖(Kochetov，G.A.1982，Transketolase from yeast，rat liver，and pig liver，Methods Enzymol.，90：209-23)。

先前已经报导过转酮糖编码基因中带有敲除突变的转酮酶缺陷的Bacillus subtilis菌株产生核糖，所述核糖在发酵液中累积(De Wulf，P.，andE.J.Vandamme.1997.Production of D-ribose by fermentation，Appl.Microbiol.Biotechnol.48：141-148；Sasajima，K.，和Yoneda，M.1984，Production of pentoses by microorganisms.Biotechnol.and Genet.Eng.Rev.2：175-213)。显然，在转酮酶敲除突变体中提高的细胞内C5碳糖库可以达到高达超出细菌生理需要的水平，并导致过量的核糖分泌。

如上所述，还需要转酮酶催化的反应来产生4-磷酸赤藓糖，从所述糖衍生了三种蛋白质生成的芳香族氨基酸。因此，转酮糖缺陷的微生物对于这些氨基酸是营养缺陷型的。只有当这些氨基酸或它们的生物合成前体(例如莽草酸)可以通过培养基被提供时它们才能生长。

除了对芳香族氨基酸或莽草酸的不期望的营养缺陷型以外，转酮酶缺陷的B.subtilis突变体显示大量严重的多效作用(pleiotropic effect)，如在葡萄糖上非常缓慢的生长、受损的磷酸烯醇丙酮酸依赖性的磷酸转移酶系统、去调节的碳分解代谢物阻遏和改变的细胞膜和细胞壁组成(De Wulf，P.，and E.J.Vandamme.1997)。

另一转酮酶缺陷的分泌核黄素的B.subtilis菌株由Gershanovich et al.描述(Gershanovich VN，Kukanova AIa，Galushkina ZM，Stepanov AI(2000)Mol.Gen.Mikrobiol.Virusol.3：3-7)。

另外，US 6,258,554 B1公开了过量生产核黄素的谷氨酸棒状杆菌菌株(Corynebacterium glutamicum)，其中缺乏转酮酶活性。从US 6,258,554B1的公开内容可以注意到：转酮酶活性的缺乏和产生的氨基酸营养缺陷型对于经改善的核黄素生产力是必需的，因为原养型回复突变体以类似于具有野生型转酮酶背景的谷氨酸棒状杆菌菌株的量生产核黄素。

这些缺点(即芳香族氨基酸营养缺陷型)和上文讨论的多效作用使得转酮酶缺陷的突变体成为稳定工业加工(例如在这类菌株内工业生产核黄素)较不优选的生产菌株。

通常，提供转酮酶突变体菌株是本发明的一个目的，所述转酮酶突变体菌株以下述方式被修饰：经修饰的转酮酶的催化特性允许与未经修饰的转酮酶相比更高的细胞内5-磷酸核酮糖和5-磷酸核糖浓度，但是其不具有上述转酮酶缺陷型菌株的缺点。

令人惊奇的是，目前已经发现通过遗传改变微生物(例如B.subtilis)可以显著地提高发酵产物例如核黄素的生产，而不丢失原养型特性，所述遗传改变通过将野生型基因替换为突变基因进行，所述突变基因编码经修饰的转酮酶，所述经修饰的转酮酶通过具有经调节的比活性而允许一些残余通量通过戊糖磷酸途径。

本发明涉及经修饰的转酮酶、多核苷酸序列(其包含编码具有上述特性的经修饰的转酮酶的基因)、用这类多核苷酸序列转化的宿主细胞，和以宿主细胞(其中野生型转酮酶基因已经被编码突变的转酮酶的多核苷酸替代)为基础用生物技术生产发酵产物(例如核黄素、核黄素前体、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一种或多种衍生物)的方法。

作为分离突变体(其中野生型转酮酶被这类修饰的转酮酶之一替换)的第一个步骤，可以产生缺失突变体，其对于产蛋白质的芳香族氨基酸而言是营养缺陷型，并且在通过戊糖磷酸途径同化的碳源(例如葡萄糖酸盐)上不能生长。然后可以用编码多种转酮酶突变体的DNA片段的混合物转化转酮酶缺失突变体。可以分离原养型的转化体，从中选择在葡萄糖酸盐上显示减缓的生长率的转化体。根据该方法分离的突变体可以合成经修饰的转酮酶，所述酶允许足够的4-磷酸赤藓糖生物合成以阻止营养缺陷型生长，但是起到葡萄糖酸盐同化的瓶颈作用。另外，可以预防在B.subtilis转酮糖缺失突变体中典型地观察到的不希望有的多效作用。US6,258,554 B1指出：伴随着营养缺陷型到原养型生长的回复，分泌核黄素的C.glutamicum转酮酶突变体丧失了它们生产比类似菌株(其含有野生型转酮酶基因)更多的核黄素的能力。如本发明的实施例中所示，如上所述分离的原养型B.subtilis转酮酶突变体出人意料地生产比转酮酶野生型亲本菌株更多的核黄素，但是转酮酶缺失突变体部分地丧失它们的核黄素生产能力。

用于向DNA片段中引入突变的方法是本领域公知的。转酮酶突变体可以例如通过蛋白质工程或通过随机诱变产生，所述蛋白质工程使用例如酵母转酮酶的可用的3D结构(Lindqvist，Y.，G.Schneider，U.Ermler，and M.Sundstrom.1992.Three-dimensional structure of transketolase，a thiaminediphosphate dependent enzyme，at 2.5A resolution.Embo.J.11：2373-9)用于选择氨基酸序列的合适位置。在两种情况下选择过程均可以如上所述完成。当用于取代野生型转酮酶时，经修饰的转酮酶显示催化特性，即经调节的比活性，所述活性允许宿主细胞在只能由戊糖磷酸途径代谢的碳源(例如葡萄糖酸盐)上生长时，与含有野生型转酮酶的宿主细胞相比生长率降低。这些特性导致更高的细胞内5-磷酸核酮糖和5-磷酸核糖浓度和经由戊糖磷酸途径的残余通量，从而能够产生足够的4-磷酸赤藓糖以防止营养缺陷型生长。

可用于本发明的“野生型酶”或“野生型转酮酶”可包括上文定义的任何转酮酶，其被用作设计本发明突变体的起点。野生型转酮酶可以是真核的或原核来源的，优选真菌或细菌(特别是选自Escherichia、Bacillus、Corynebacterium、Saccharomyces、Eremothecium、Candid或Ashbya，优选地来自E.coli(大肠杆菌)、B.subtilis(枯草芽孢杆菌)、B.licheniformis，B.halodurans、S.cerevisiae(酿酒酵母)、E.gossypii、C.flareri或A.gossypii)来源的，或是具有下述氨基酸序列的任何转酮酶，所述氨基酸序列与图1所示氨基酸序列同源。最优选转酮酶来自Bacillus subtilis。“同源的”是指与图1所示一个或多个氨基酸序列至少约50％相同、优选地至少约60％相同、更优选地至少约70％、80％、85％、90％、95％相同、最优选地至少约98％相同的转酮糖。在本发明上下文中“野生型”可包括可来自天然的转酮酶序列以及合成转酮酶的变体(只要它们与图1所示任一序列同源即可)。术语“野生型转酮酶”和“未经修饰的转酮酶”在本文可互换使用。

如本领域所已知的，术语“％相同”表示(根据情况的)多肽或多核苷酸序列之间的相关性程度，其通过这类序列字符串之间的匹配决定。“相同”可容易地通过已知方法确定，例如用程序BESTFIT(GCGWisconsin Package，version 10.2，Accelrys Inc.，9685 Scranton Road，SanDiego，CA 92121-3752，USA)使用以下参数：缺口建立罚分8，缺口延伸罚分2(默认参数)。

本文使用“突变体”、“突变体酶”、“突变的酶”或“突变体转酮酶”或“经修饰的转酮酶”表示根据本发明的教导可来自给定的野生型酶/转酮酶(根据上述定义)的任何变体，其用于替换宿主生物/细胞的野生型基因时应当对例如葡萄糖酸盐和/或核糖的生产具有作用。就本发明的范围而言，如何获得突变体是无关的；可以例如通过定向诱变、饱和诱变、随机诱变/定向进化(directed evolution)、化学或UV诱变整个细胞/生物等等获得这类突变体。这些突变体也可以例如通过设计合成基因产生，和/或通过体外(无细胞)翻译产生。为了测试比活性，可以通过本领域技术人员已知的方法(过)表达突变体。术语“突变体转酮酶”、“经修饰的转酮酶”或“突变的转酮酶”在本文可互换使用。

“宿主细胞”是下述细胞，所述细胞能够生产给定的发酵产物，并含有野生型转酮酶或编码本发明的经修饰的核酸。合适的宿主细胞包括微生物细胞。

本文使用的术语“比活性”表示野生型和突变体转酮酶在适当地确定的反应条件下的反应速率，所述反应条件描述于Kochetov(Kochetov，G.A.1982.Transketolase from yeast，rat liver，and pig liver.Methods Enzymol90：209-23)。“比活性”定义了在给定温度下，在给定的时间段和每确定量的蛋白质所消耗的底物和/或生产的产物的量。典型地，“比活性”表示为每分钟每mg蛋白质消耗的μmol底物或形成的μmol产物。典型地，μmol/分钟被缩写为U(＝单位)。因此，μmol/分钟/(mg蛋白质)或U/(mg蛋白质)的比活性单位定义在本说明书书全文可互换使用。应当理解在本发明的上下文中，比活性可以以相似的或优选相同的多肽链长度为基础进行比较。

许多突变可以以下述方式改变野生型转酮酶：在葡萄糖酸盐上的生长如上所述被影响。

提供具有上述特性的经修饰的转酮酶是本发明的一个目的，其中经修饰的转酮酶的氨基酸序列与对应的未经修饰的转酮酶的氨基酸序列相比，含有至少一个突变。

所述至少一个突变可以是添加、缺失和/或取代。

优选地，所述至少一个突变是至少一个氨基酸取代，其中存在于未经修饰的转酮酶氨基酸序列中的给定氨基酸被本发明的经修饰的转酮酶氨基酸序列中的不同氨基酸替换。经修饰的转酮酶的氨基酸序列与相应的来经修饰的转酮酶氨基酸序列相比，可含有至少一个氨基酸取代。特别地，本发明的经修饰的转酮酶在对应于SEQ ID NO：2所示的Bacillus subtilis转酮酶氨基酸序列位置357的氨基酸位置上，含有至少一个突变。

在其它实施方案中，经修饰的转酮酶与相应的转酮酶氨基酸序列相比，含有至少两个、至少三个、至少四个或至少五个取代。例如，经修饰的转酮酶与相应的未经修饰的转酮酶氨基酸序列相比，含有一个到十个、一个到七个、一个到五个、一个到四个、两个到十个、两个到七个、两个到五个、两个到四个、三个到十个、三个到七个、三个到五个或三个到四个氨基酸取代。

在本发明优选的实施方案中，未经修饰的转酮酶可从Bacillus(优选Bacillus subtilis)中获得，如SEQ ID NO：2所示。相应的DNA序列显示于SEQ ID NO：1中。经修饰的转酮酶在SEQ ID NO：2的位置357上含有至少一个突变，产生具有上述特性的经修饰的转酮酶。

未经修饰的转酮酶中，位于对应于SEQ ID NO：2中所示氨基酸357的位置上的至少一个氨基酸取代可以选自取代R357H、R357A、R357S、R357N、R357T、R357K、R357I、R357V、R357G和R357L。

在特别优选的实施方案中，突变的转酮酶由一个取代组成，所述取代影响对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨基酸位置357的氨基酸位置，并可选自取代R357H、R357A、R357S、R357N、R357T、R357K、R357I、R357V、R357G和R357L。

在另一优选的实施方案中，经修饰的转酮酶与相应的未经修饰的转酮酶氨基酸序列相比，含有至少两个氨基酸取代，其中至少一个突变对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的氨基酸位置357，并可选自取代R357H、R357A、R357S、R357N、R357T、R357K、R357I、R357V、R357G和R357L。

存在于未经修饰的转酮酶中位置357的氨基酸优选地为精氨酸。未经修饰的转酮酶序列中的氨基酸可以被改变为位置357的组氨酸、丙氨酸、丝氨酸、天冬酰胺、赖氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甘氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。优选地，对应于SEQ ID NO：2所示序列位置357的氨基酸位置上的取代由精氨酸与组氨酸、精氨酸与丙氨酸、精氨酸与丝氨酸、精氨酸与亮氨酸、精氨酸与赖氨酸、精氨酸与天冬酰胺、精氨酸与苏氨酸、精氨酸与甘氨酸、精氨酸与异亮氨酸、精氨酸与缬氨酸的替换组成。

本发明的经修饰的转酮酶可包含(特别是在其N端或C端)外源氨基酸。“外源氨基酸”表示不存在于天然(天然发生的)转酮酶中的氨基酸，优选至少约3个、至少约5个或至少约7个不存在于天然转酮酶中的一段连续氨基酸。优选的外源氨基酸片段包括但不仅限于“标签”，所述标签有助于重组产生的经修饰的转酮酶的纯化。这类标签的例子包括但不限于“His₆”标签、FLAG标签、myc标签等等。为了计算比活性，数值需要针对这些额外的氨基酸进行校正(也参阅上文)。

在另一实施方案中，经修饰的转酮酶与相应的未经修饰的转酮酶相比，可含有一个或多个(例如两个)缺失。优选地，缺失影响相应的未经修饰的转酮酶的N端或C端氨基酸，并且不显著地降低酶的功能特性例如比活性。

本发明还涉及包含下述核苷酸序列的多核苷酸，所述核苷酸序列编码本发明的经修饰的转酮酶。本文使用“多核苷酸”是指多核糖核苷酸或多脱氧核糖核苷酸，其可以是未经修饰的RNA或DNA或经修饰的RNA或DNA。多核苷酸包括但不限于单链的和双链的DNA、属于单链区域和双链区域混合物的DNA、单链和双链的RNA，和属于单链区域和双链区域混合物的RNA、可以是单链的或(更典型地)双链的或单链区域和双链区域混合物的包含DNA和RNA的杂种分子。术语“多核苷酸”包括含有一个或多个异常碱基(例如肌苷)或一个或多个经修饰的碱基(例如三苯甲基化的碱基)的DNA或RNA。

本发明的多核苷酸可以通过修饰编码未经修饰的转酮酶的多核苷酸序列容易地获得。这类编码未经修饰的转酮酶的多核苷酸序列的例子包括但不限于图1的氨基酸序列。优选地，未经修饰的转酮酶来源于Bacillus，特别是Bacillus subtilis，更优选的是编码SEQ ID NO：2所示未经修饰的转酮酶的多核苷酸。

向编码未经修饰的转酮酶的核苷酸序列中引入突变(例如添加、缺失和/或取代)的方法包括但不限于定向诱变和基于PCR的方法。

本发明的DNA序列可以通过体外诱变的方法[参阅例如Sambrook etal.，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor Laboratory Press，New York]从本领域已知编码转酮酶的下述基因组或cDNA序列开始构建，所述序列可得自例如Genbank(Intelligenetics，California，USA)、European BioinformaticsInstitute(Hinston Hall，Cambridge，GB)、NBRF(Georgetown University，Medical Centre，Washington DC，USA)和Vecbase(University of Wisconsin，Biotechnology Centre，Madison，Wisconsin，USA)或来自图1公开的序列信息。也适用于实现本发明的突变给定DNA序列的另一可能方法是通过使用聚合酶链式反应(PCR)诱变。作为起始材料的DNA可以通过本领域已知并描述于例如Sambrook et al.(Molecular Cloning)中的方法从各自的菌株/生物中分离。然而应当理解，根据本发明要构建/突变的编码转酮酶的DNA序列也可以以已知DNA序列为基础通过本领域已知方法(例如描述于EP747483中的)例如通过构建合成基因来制备。

一旦获得了完整的本发明DNA序列，可以通过本领域已知并描述于例如Sambrook et al.(s.a.)中的方法将它们整合进载体中或直接引入宿主生物基因组中，以在合适的宿主系统中(过)表达所编码的多肽。然而，本领域技术人员知道DNA序列自身也可以被用于转化本发明的合适的宿主系统以获得所编码的多肽的(过)表达。

在优选的实施方案中，本发明提供了：

(i)编码经修饰的转酮酶的DNA序列，其带有上文定义的至少一个突变，并在标准条件下与特异修饰的转酮酶的任何DNA序列杂交，例如与根据SEQ ID NO：1的DNA序列杂交的DNA序列，或

(ii)编码经修饰的转酮酶的DNA序列，其带有上文定义的至少一个突变，但是因为遗传密码子的简并性而不杂交，但是其编码与下述DNA序列具有完全相同氨基酸序列的多肽，所述DNA序列在标准条件下与本发明的经特异修饰的转酮酶的任何DNA序列杂交，或

(iii)DNA序列，其属于这类经修饰的DNA序列的片段并保留其多肽活性特性。

杂交的“标准条件”在本发明的上下文中表示下述条件，所述条件通常由本领域技术人员用于检测特异的杂交信号并描述于例如Sambrook etal.，″Molecular Cloning″，second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press1989，New York中，或优选地是所谓的严格杂交和非严格洗涤条件，或更优选地是所谓的严格杂交和严格洗涤条件，所述杂交和洗涤条件是本领域技术人员熟悉的并描述于例如Sambrook et al.(s.a.)中。严格杂交条件的一个特异例子是在下述溶液中于42℃下过夜孵育(例如15个小时)后在0.1xSSC中于约65℃下洗涤杂交支持物，所述溶液含有：50％甲酰胺、5xSSC(150mM NaCl、15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH 7.6)、5xDenhardt′s溶液、10％硫酸葡聚糖和20μg/ml经变性、剪切的鲑精DNA。

在另一优选的实施方案中，本发明还提供了可以通过所谓的聚合酶链式反应方法(″PCR″)通过图2所示PCR引物获得的DNA序列，所述PCR引物以具体描述的DNA序列为基础设计。

本发明的多肽和多核苷酸优选地以经分离的形式提供，并优选地被纯化为均质。

术语“经分离的”表示材料从其初始环境(例如，如果其为天然存在时的天然环境)取出。例如，存在于活的微生物中的天然存在的多核苷酸或多肽不是经分离的，但是从天然体系中的一些或所有共存材料中分离的相同多核苷酸或多肽是经分离的。这类多核苷酸可以是载体的一部分和/或这类多核苷酸或多肽可以是组合物的一部分并且仍然是分离的，因为这类载体或组合物不是其天然环境的一部分。

本文使用的经分离的多核苷酸或核酸可以是与下述两个编码序列均不紧邻的DNA或RNA，所述编码序列在所述DNA或RNA来源的生物的天然存在的基因组中与所述DNA或RNA紧邻(一个在5’端一个在3’端)。因此，在一个实施方案中，核酸包括与编码序列紧邻的一些或所有5’非编码(例如启动子)序列。因此术语“经分离的多核苷酸”包括例如被整合进载体中、自主复制的质粒或病毒中、或原核生物或真核生物的基因组DNA中的重组DNA，或作为独立于其它序列的独立分子存在的重组DNA(例如通过PCR或限制性内切酶处理产生的cDNA或基因组DNA片段)。其还包括属于杂种基因一部分的重组DNA，所述杂种基因编码额外的多肽，所述重组DNA基本不含细胞材料、病毒材料或培养基(当通过重组DNA技术产生时)或化学前体或其它化学品(当化学合成时)。另外，“经分离的核酸片段”是不作为片段天然存在并且不会在天然状态下发现的核酸片段。

本文使用术语经分离的多肽是指基本不含其它多肽的多肽。经分离的多肽优选地大于80％纯净，更优选地大于90％纯净，进一步更优选地大于95％纯净，最优选地大于99％纯净。纯度可以根据本领域已知方法测定，例如通过SDS-PAGE和随后的蛋白质染色。然后可以通过密度测定法定量蛋白质条带。用于测定纯度的其它方法属于现有常规技术。

如上所述，本发明的经修饰的转酮酶和相应的多核苷酸可以用于合适宿主细胞的基因工程，使得其在下述物质的发酵过程中更好和更有效力，所述物质使用5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作为底物用于生物合成。合适宿主细胞中所述经修饰的转酮酶的存在可以导致更高的细胞内5-磷酸核酮糖和5-磷酸核糖浓度和所述重组宿主中通过戊糖磷酸途径的残余通量，使得能够生产足够的4-磷酸赤藓糖来预防营养缺陷型生长。

适当的宿主细胞为例如真菌，如Aspergilli例如Aspergillus niger或Aspergillus oryzae，或如Trichoderma例如Trichoderma reesei，或Ashbya例如Ashbya gossypii，或Eremothecium例如Eremothecium ashbyii；或酵母，如Saccharomyces 例如Saccharomyces cerevisiae，或Candida如Candida flareri，或Pichia如Pichia pastoris，或Hansenula polymorpha例如H.polymorpha(DSM 5215)。可以使用的细菌为例如Bacilli例如Bacillussubtilis，或Streptomyces例如Streptomyces lividans。可以使用的Escherichia coli为例如E.coli K12菌株，例如M15或HB 101。

因此，本发明涉及微生物，其中转酮酶的活性被修饰使得微生物能够在只通过戊糖磷酸途径代谢的碳源(例如葡萄糖酸盐)上生长，与含有野生型转酮酶的宿主细胞相比生长率降低。通常可以在相同的生物中再次引入来自某生物(例如Bacillus subtilis)的获得的转酮酶突变体并立刻用作宿主细胞，或将任何获得的突变体引入任何其它相关的宿主细胞。

本文使用术语“生长率”表示下文：细菌细胞通过一分为二复制。如果生长不受限制，倍增以恒定速率持续，从而细胞数量和种群速率在每个连续的时间段倍增。对于该指数增长类型，将细胞数的自然对数针对时间(优选以小时计)作图得到直线。该直线的斜率是生物的比生长速率，其为每单位时间每个细胞的分裂数。在食物中，细菌不能持续生长，因为可获得的营养是有限的，且废物会累积。在这些条件下，生长曲线趋向于S形。

提供下述重组宿主细胞是本发明的一个目的，其中根据本发明的所述带有经修饰的转酮酶的重组宿主细胞(例如微生物)在仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源(特别是葡萄糖酸盐)上的生长率与野生型生物相比少于100％。特别地，所述生长速率与野生型生物的生长率相比可以降低至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或甚至90％和更多。优选地，与含有野生型转酮酶基因的细胞相比，生长速率降低在10％和90％之间，更优选地在20％和80％之间，还更优选地在25％和75％之间。

特别地，本发明涉及经遗传工程改造的/重组产生的宿主细胞(也称作重组细胞或经转化的细胞)，其中野生型转酮酶基因已经被替换为编码下述酶的经修饰的转酮酶基因，所述酶允许在不仅仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上轻微降低或不降低的生长，但是当生物在仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上生长时显示显著降低的生长速率。这类经遗传工程改造的宿主细胞显示发酵产物产率和生产过程效率的提高，优点是可以预防不期望的营养缺陷型生长和多效作用。

本发明还涉及生产能够表达本发明转酮酶的宿主细胞的方法，包括步骤：

(i)制造突变的转酮酶，其与各自的野生型酶相比显示经调控的活性，即

a)提供编码第一转酮酶或未经修饰的转酮酶的多核苷酸，所述转酮酶具有应当被改变的特性；

b)向多核苷酸序列中引入一个或多个突变，使得突变的多核苷酸序列编码新的或经修饰的转酮酶，所述转酮酶与所述第一转酮酶相比含有至少一个氨基酸突变，其中所述至少一个氨基酸突变可以是对应于SEQ ID NO：2所示氨基酸序列位置357上的氨基酸；

c)任选地在载体或质粒中插入经突变的多核苷酸；

(ii)用来自相同生物或另一生物的转酮酶变体代替宿主细胞的野生型转酮酶，所述转酮酶变体允许在不仅仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上正常或轻微降低的生长，但是当生物在仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上生长时显示显著降低的生长速率，即

a)替换合适的野生型宿主细胞的野生型转酮酶而不改变基因的调节序列；

b)测定在最小培养基中葡萄糖酸盐上的生长速率并与野生型宿主菌株比较；和

c)选择转酮酶突变体，其允许在葡萄糖酸盐上小于野生型菌株100％的生长速率。

本发明还涉及用于生产下述物质的方法，所述物质是5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖的次级产物，所述方法包括：

a)在合适的培养基中、允许经修饰的转酮酶表达的条件下，培养经遗传工程改造的/重组产生的宿主细胞，其中野生型转酮酶基因已经被编码下述酶的经修饰的转酮酶基因替换，所述酶允许在不仅仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上轻微降低或不降低的生长，但是当生物在仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上生长时显示显著降低的生长速率；

和b)从培养基中分离发酵产物。

本文使用“发酵产物”可以是由上文定义的合适宿主细胞产生的任何产物，所述产物的生物合成使用5-磷酸核糖、5-磷酸核酮糖或5-磷酸木酮糖作为底物。这类发酵产物的例子包括但不限于核黄素、核黄素前体、黄素单核苷酸(FMN)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD)及其衍生物、磷酸吡哆醛(维生素B₆)、鸟苷、腺苷和这些核苷酸的衍生物。

本发明的上下文中，“核黄素前体”和“核黄素、FMN或FAD的衍生物”应当包括其(生物)合成中需要5-磷酸核酮糖或5-磷酸核酮糖作为中间产物或底物的任何和所有的代谢物。在本发明的上下文中，这类(生物)合成途径是天然的还是非天然的(即不是天然发生而是经生物技术工程改造的途径)没有关系。优选地，合成途径是生物化学的途径。核黄素前体和核黄素、FMN或FAD的衍生物包括但不限于：DRAPP；5-氨基-6-核糖基氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸盐；2，5-二氨基-6-核糖醇基氨基-4(3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸盐；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮-5′-磷酸盐；5-氨基-6-核糖醇基氨基-2，4(1H，3H)-嘧啶二酮；6，7-二甲基-8-核糖醇基氨基-2，4-二氧四氢蝶啶(DMRL)；和黄素蛋白。术语“核黄素”也包括其衍生物，例如5-磷酸核黄素及其盐，例如核黄素5-磷酸钠。

多核苷酸、多肽、重组宿主细胞和本文所述的方法可用于上文定义的一种或多种发酵产物的生物技术生产。

本发明的合适宿主细胞的遗传工程改造和代谢改造方法是本领域技术人员已知的。类似地，用于例如核黄素、核黄素前体、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一种或种衍生物的合适纯化方法(可能)是精细化学品生物合成和制造领域所公知的。

应当理解用于生物技术生产发酵产物(例如根据本发明的核黄素、核黄素前体、FMN、FAD、磷酸吡哆醛或其一种或多种衍生物)的方法不限于上文所述的全细胞发酵方法，而是也可以使用例如透化的宿主细胞、细胞粗提物、细胞抽提物，所述细胞抽提物通过例如离心或过滤、或甚至重建的反应途径用经分离的酶从细胞残余物中澄清。这类方法的组合也在本发明的范围内。在无细胞生物合成的情况下(例如通过重建的反应途径)，经分离的酶是否由宿主细胞制备并从中分离、通过体外转录/翻译制备或通过其它手段制备是无关的。

发酵培养基必须含有合适的碳源。合适的底物可包括，但不限于单糖如葡萄糖或果糖，寡糖如乳糖或蔗糖，多糖如淀粉或纤维素或其混合物，和来自可更新的给料的未经纯化的混合物。应当理解本发明中使用的碳源可包括多种含碳底物，并仅受生物选择的限制。

本文描述的本发明的多种实施方案可以交叉组合。

本发明即将通过以下的非限制性例子更详细地阐述。这些例子参考附图描述。

如上文所述，图1显示编码未经修饰的转酮酶的多核苷酸序列的例子，图2显示一组引物。

特别地，图1显示通过程序clustalW(1.83)计算的、来自Escherichiacoli(TKT_ECOLI)、Bacillus subtilis(TKT_BACSU)、Bacillus licheniformis(TKT_BACLD)、Bacillus halodurans(TKT_BACHD)、Corynebacteriumglutamicum(TKT_CORGL)、Saccharomyces cerevisiae(TKT_YEAST)和Ashbya gossypii(TKT_ASHGO)的转酮酶氨基酸序列的多序列比对。以下实施例之一中讨论的与Bacillus subtilis转酮酶的氨基酸残基357同源的/等效的位置是黑体字母。用于这些位置的编号根据Bacillus subtilis野生型氨基酸序列完成。这种类型的比对可以用CLUSTAL或PILEUP使用标准参数完成。如所示的，转酮酶的氨基酸序列是高度保守的。特别是在所示的所有转酮酶中和更多的未显示的转酮酶中，精氨酸357(根据Bacillussubtilis转酮酶编号)是保守的。因此，也可以用其它转酮酶进行所述类型的实验(所述实验使用本文报导的概念和突变)用于促进核黄素、核黄素衍生物或化合物(其使用5-磷酸核糖、5-磷酸木酮糖或5-磷酸核酮糖作为前体)的生产，所述其它转酮酶在与Bacillus subtilis转酮酶氨基酸序列位置357同源的位置上具有精氨酸，如Ashbya gossypii转酮酶。也可能用位置357上突变的Bacillus subtilis转酮酶突变体基因替换生物的原始转酮酶基因，并可针对新生物对所述DNA序列进行或不进行适应性修饰。转酮酶突变体基因来自其即将被引入的生物中不是必须的。另一宿主生物所需的实践步骤是公开的，并是本领域技术人员已知的和在别处描述的。

实施例1：分离来自Bacillus subtilis的基因组DNA

使用来自Qiagen(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724 Hilden，Germany)的DNeasy Tissue Kit试剂盒根据供应商的说明书制备gDNA。使用3ml在37℃(250rpm)在VY液体培养基(Becton Dickinson，Sparks，MD21 152，USA)中孵育的Bacillus subtilis过夜培养物中的1ml作为细菌细胞来源。最后将gDNA洗脱进200μl的AE缓冲液(试剂盒中提供)中。

实施例2：扩增来自Bacillus subtilis的转酮酶基因

使用来自B.subtilis PY79(P.Youngman，J.Perkins，and R.Losick(1984)，Construction of a cloning site near one end of Tn917 into which foreignDNA may be inserted without affecting transposition in Bacillus subtilis orexpression on the transposon-borne erm gene.Plasmid 12：1-9；参阅实施例1)的gDNA扩增tkt基因。根据基因组DNA序列，tkt基因在其编码序列(SEQ ID NO：1)内含有一个Eco RI位点。因为Eco RI限制性位点通常被用于克隆进Escherichia coli表达载体如pQE80(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724 Hilden，Germany)中，所以通过用T代替C315(这是将苯丙氨酸密码子从TTC改变为TTT的沉默突变)删除该位点。为此，进行两个独立的PCR A和B。PCR A使用以下的PCR条件：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物tkt 1S(根据序列SEQ ID No：3，也参阅图2)和tkt 2AS(根据SEQ ID No：4，图2)、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，GebouwCalifornia，1101 CB Amsterdam Zuidoost，The Netherlands)、100ng基因组DNA(实施例1)。

温度调节如下：

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：52℃30秒

步骤4：72℃30秒

步骤5：72℃5分钟

步骤2到4重复35次。

在以下条件下进行PCR B：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物tkt 2S(根据SEQ ID No：8，图2)和tkt 1AS(根据SEQ IDNo：13，图2)、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB AmsterdamZuidoost，The Netherlands)、100ng基因组DNA(实施例1)。

温度调节如下：

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：52℃30秒

步骤4：72℃2分钟

步骤5：72℃5分钟

步骤2到4重复35次。

通过琼脂糖凝胶电泳和随后使用来自Qiagen(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724 Hilden，Germany)的MinElute Gel Extraction Kit从凝胶中抽提来纯化两种PCR产物A和B。使用PCR产物A和B的重叠区，可能通过第三种PCR将它们组装：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物Rpi MutS(根据SEQ ID No：5，图2)和tkt 1 ASohne(根据SEQ ID No：6，图2)、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CBAmsterdam Zuidoost，The Netherlands)、100ng PCR产物A和PCR产物B。

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：53℃30秒

步骤4：72℃2.5分钟

步骤5：72℃5分钟

步骤2到4重复35次。

在Qiagen PCR purification Kit(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724Hilden，Germany)的帮助下纯化PCR产物并洗脱进50μl洗脱缓冲液中。通过Eco RI消化证实PCR产物。为了进一步证实，用引物tkt 1S、tkt 2S、tkt 2AS、tkt 3S(根据SEQ ID No：9，图2)、tkt 4S(根据SEQ ID No：10，图2)、tkt 5S(根据SEQ ID No：11，图2)、tkt 6S(根据SEQ IDNo：12，图2)、tkt 1AS对其测序。

实施例3：构建tkt突变体

酵母转酮酶的3D结构可以与突变(其显示影响酵母转酮酶底物的结合)的选择一起获得(Nilsson，U.，L.Meshalkina，Y.Lindqvist，and G.Schneider.1997)。在位置R359(Bacillus subtilis转酮酶中编号357)上，原始的精氨酸被几乎所有其它氨基酸取代。突变体的构建基本上如实施例1中所述进行。图1中显示了包括来自酵母、Bacillus subtilis和来自其它生物的转酮酶的氨基酸序列比对。

使用不含Eco RI的tkt基因作为模板(实施例2)，如对Eco RI位点的缺失所述引入突变。对PCR A和B使用以下PCR条件：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物Rpi MutS(A)或tkt 357nnn-S(B)和tkt 357AS(A)(根据SEQ ID No：14，图2)或tkt 1 ASohne(B)、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB Amsterdam Zuidoost，TheNetherlands)、100ng不含Eco RI的tkt基因(实施例2)。在PCR B的情况下，根据被引入的氨基酸选择有义引物：在Bacillus subtilis转酮酶的位置357上引入天冬酰胺用tkt 357N-S(根据SEQ ID No：15，图2)、引入谷氨酰胺用tkt 357Q-S(根据SEQ ID No：16，图2)、引入丙氨酸用tkt 357A-S(根据SEQ ID No：17，图2)、引入赖氨酸用tkt 357K-S(根据SEQ ID No：18，图2)、引入丝氨酸用tkt 357S-S(根据SEQ ID No：19，图2)、引入苏氨酸用tkt 357T-S(根据SEQ ID No：20，图2)、引入组氨酸用tkt 357H-S(根据SEQ ID No：21，图2)、引入缬氨酸用tkt 357V-S(根据SEQ ID No：22，图2)、引入异亮氨酸用tkt 357I-S(根据SEQ ID No：23，图2)、引入亮氨酸用tkt 357L-S(根据SEQ ID No：24，图2)、引入甲硫氨酸用tkt357M-S(根据SEQ ID No：25，图2)和对于甘氨酸用tkt 357G-S(根据SEQID No：26，图2)。

温度调节如下：

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：52℃30秒

步骤4：72℃60秒

步骤5：72℃5分钟

步骤2到4重复35次。

通过琼脂糖凝胶电泳和随后使用来自Qiagen(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724 Hilden，Germany)的MinElute Gel Extraction Kit从凝胶中抽提来纯化两种PCR产物A和B。在第三个PCR中进行PCR产物A和B的组装：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物RpiMutS和tkt 1 ASohne、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB AmsterdamZuidoost，The Netherlands)、100ng PCR产物A和PCR产物B。

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：53℃30秒

步骤4：72℃2.5分钟

步骤5：72℃5分钟

步骤2到4重复35次。

用Qiagen PCR purification Kit(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724Hilden，Germany)纯化转酮酶的PCR产物并洗脱进50μl洗脱缓冲液中。使用PCR产物转化Bacillus subtilis。

实施例4：构建转酮酶缺陷的Bacillus subtilis菌株

向Bacillus subtilis基因组的原始tkt位点中不含标记地引入突变的转酮酶，构建转酮酶缺陷的菌株。将通过PCR获得的、含有Bacillus subtilis转酮酶基因(SEQ ID NO：2)碱基对452到1042和碱基对1562到2001的两个DNA片段与新霉素抗性基因盒组合(M.Itaya，K.Kondo，and T.Tanaka.1989.A neomycin resistance gene cassette selectable in a single copy state inthe Bacillus subtilis chromosome.Nucleic Acids Res 17：4410)。PCR A使用以下的PCR条件：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物tktRec 1S(根据SEQ ID No：27，图2)和tkt Rec 1AS(根据SEQ ID No：28，图2)、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB Amsterdam Zuidoost，TheNetherlands)、100ng实施例2的经扩增的tkt基因。

温度调节如下：

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：52℃30秒

步骤4：72℃30秒

步骤5：72℃5分钟

步骤2到步骤4重复30次。

在以下条件下进行PCR B：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物tkt Rec 2S(根据SEQ ID No：29，图2)和tkt Rec 2AS(根据SEQ ID No：30，图2)、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB AmsterdamZuidoost，The Netherlands)、100ng实施例2的经扩增的tkt基因。

温度调节如下：

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：52℃30秒

步骤4：72℃2分钟

步骤5：72℃5分钟

步骤2到步骤4重复30次。

通过琼脂糖凝胶电泳和随后使用来自Qiagen(QIAGEN GmbH，QIAGEN Str.1，40724 Hilden，Germany)的MinElute Gel Extraction Kit从凝胶中抽提来纯化两种PCR产物A和B。因为PCR产物A和B与新霉素抗性盒序列的的重叠区，可能通过第三种PCR将它们组装：在与DNA聚合酶一起提供的适当缓冲液中2μM引物tkt Rec 1S和tkt Rec 2AS、0.2mM每种核苷酸(ATP，GTP，TTP，CTP)、2.5U校正读码的DNA聚合酶(Stratagene，Gebouw California，1101 CB Amsterdam Zuidoost，TheNetherlands)、100ng PCR产物A、100ng PCR产物B，和100ng新霉素抗性盒。

步骤1：95℃3分钟

步骤2：95℃30秒

步骤3：55℃30秒

步骤4：72℃2.5分钟

步骤5：72℃5分钟

步骤2到4重复35次。

将五个组装的PCR合并并用Qiagen PCR purification Kit(QIAGENGmbH，QIAGEN Str.1，40724 Hilden，Germany)纯化并洗脱进50μl洗脱缓冲液中。通过琼脂糖凝胶电泳证实正确的PCR产物并用于转化Bacillussubtilis PY79。感受态Bacillus subtilis细胞的制备根据Kunst et al.，1988(F.Kunst，M.Debarbouille，T.Msadek，M.Young，C.Mauel，D.Karamata，A.Klier，G.Rapoport，and R.Dedonder.1988.Deduced polypeptides encoded bythe Bacillus subtilis sacU locus share homology with two-component sensor-regulator systems.J Bacteriol 170：5093-101)制备。2ml MNGE+BactoCasamino Acid(CAA)(9ml MN培养基(13.6g/l K₂HPO₄、6.0g/l KH₂PO₄、0.88g/l柠檬酸钠*2H₂O)、1ml葡萄糖(20％)、40μl谷氨酸钾(40％)、50μl柠檬酸铁(III)铵(2.2mg/l，新鲜制备的)、100μl色氨酸(8mg/l)、30μlMgSO₄(1M)、+/-50μl Bacto Casamino Acid(20％，Becton Dickinson AG，Postfach，CH-4002 Basel，Switzerland)用单个菌落接种并在37℃和250rpm下孵育过夜。使用该培养物接种10ml MNGE+CAA(起始OD_500nm为0.1)并在37℃下摇动(250rpm)培养直到OD_500nm达到1.3。用相同体积的MNGE w/o CAA稀释培养物并再孵育1小时。离心步骤(10分钟，4000rpm，20℃)后，将上清液倾倒在无菌管中。将沉淀物重悬于1/8保留的上清液中。将300μl细胞稀释于1.7ml MN(1x)、43μl葡萄糖(20％)和34μl MgSO₄(1M)中。将10和20μl所制备的PCR产物加入400μl经稀释的感受态细胞中并在37℃下摇动30分钟。添加100μl表达混合物(500μl5％酵母提取物(Becton Dickinson AG，Postfach，CH-4002 Basel，Switzerland)、125μl CAA(20％)、如果用于选择的话1/100的最终抗生素浓度(2μg/ml新霉素)和750μl无菌bidest.水)并在37℃下将细胞摇动1小时。最后，将细胞离心沉淀、重悬于200μl的上清液中并涂布在含有2μg/ml新霉素的TBAB平板(Becton Dickinson AG，Postfach，CH-4002 Basel，Switzerland)上。

在VY培养基(5g/l酵母提取物(Becton Dickinson AG，Postfach，CH-4002 Basel，Switzerland)、25g/l牛肉浸出培养液(Sigma))上培养两种转化体。如实施例1中所述从转化体之一(命名为BS3402)分离基因组DNA，并通过标准PCR证实新霉素基因盒对转酮酶DNA从碱基对1043到1561片段的正确替换，所述标准PCR使用tkt Rec 1S和tkt Rec 2AS作为引物。如对转酮酶缺失突变体所期望的那样，菌株不能在核糖或葡萄糖酸盐作为唯一碳源时生长，并需要所有三种芳香族氨基酸或莽草酸用于生长。

实施例5：用转酮酶变体基因转化转酮酶缺陷的Bacillus subtilis菌株BS3402

如实施例4中所述，用0.5和1μg经扩增的转酮酶基因及其变体的DNA(实施例2和3)用于转化BS3402。通过在最小培养基上生长鉴定阳性菌落，所述最小培养基为SMS培养基(2g/l(NH₄)₂SO₄、14g/lK₂HPO₄、6g/l KH₂PO₄、1g/l柠檬酸三钠、0.2g/l MgSO₄*7H₂O；1.5％琼脂(Becton Dickinson AG，Postfach，CH-4002 Basel，Switzerland)和微量元素(500倍浓缩物：5.0g/l MnSO₄x1 H₂O、2.0g/l CoCl₂*6H₂O、0.75g/l(NH₄)₆Mo₇O₂₄*4H₂O、0.5g/l AlCl₃*6H₂O、0.375g/l CuCl.2H₂O))中2g/l葡萄糖和山梨糖醇。菌落在24到48小时后可见。所有的转化体对新霉素敏感指示着新霉素基因被引入的野生型和突变的tkt基因替换。

从转化体中分离基因组DNA并如实施例1所述通过PCR扩增tkt基因。通过测序证实被引入的突变。没有观察到其它核苷酸交换。产生的Bacillus subtilis菌株被称作：R357A-BS3403、R357H-BS3482、R357K-BS3484、R357G-BS3512、R357V-BS3487、R357I-BS3509、R357L-BS3507、R357T-BS3492、R357S-BS3490、R357M-BS3505、R357N-BS3486、R357Q-BS3488。

实施例6：用转酮酶缺陷野生型菌株BS3402的噬菌体PBS-1裂解物转导Bacillus subtilis RB50::[pRF69](EP 0405 370)

如Henkin et al.，1984(Henkin，T.M.，and G.H.Chambliss.1984.Geneticmapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomalprotein S4.Mol Gen Genet 193：364-9)所述用噬菌体PBS-1进行转导工作。为了制备PBS-1裂解物，在TBAB平板(5μg/ml新霉素)上于37℃下将菌株BS3402培养过夜。使用细胞将25ml LB培养基(Becton Dickinson AG，Postfach，CH-4002 Basel，Switzerland)接种至Klett 20-30的OD(使用绿色滤光器)。当50％的细胞能动时，向0.8ml的培养液中加入0.2ml的PBS-1噬菌体裂解物(Henkin，T.M.，and G.H.Chambliss.1984.Geneticmapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomalprotein S4.Mol Gen Genet 193：364-9)。在37℃摇动下孵育30分钟后，加入9ml LB培养基。然后是在37℃下的另一30分钟孵育步骤。然后加入4μg/ml氯霉素，并将孵育再持续2小时。最后，将管转移进37℃的干燥温箱内，在其中过夜。第二天早晨，将培养物滤过0.45μm的滤器并储存于4℃或直接用于转导。

为了转导过量生产核黄素的菌株RB50::[pRF69]，将该菌株在TBAB平板上于37℃过夜培养。使用该平板的细胞接种25ml LB培养基(Klett20-30)。当培养物达到Klett 175时，将0.8ml细胞与如上所述制备的0.2ml来自菌株BS3402的PBS-1裂解物混合。在37℃摇动下孵育30分钟后，将细胞离心并重悬于1ml VY培养基中。随后在同样的条件下孵育1小时。将200到1000μl经转导的细胞涂布在含有2μg/ml新霉素的选择平板上。测试长成的菌落的新霉素抗性。分离gDNA(实施例1)后，进行使用引物tkt 1S和Rec 2AS的标准PCR证实实施例4的构建体对tkt野生型基因的替代。经证实的菌株称作BS3523。

实施例7：将经修饰的转酮酶基因引入菌株BS3523

为了制备菌株BS3403、BS3482、BS3484、BS3486、BS3490和BS3512的PBS-1裂解物，在TBAB平板(5μg/ml新霉素)上将各菌株于37℃过夜培养。使用来自这些平板的细胞将25ml LB培养基接种至Klett20-30的OD(使用绿色滤光器)。当50％的细胞能动(在Klett 150左右)时，向0.8ml的培养液中加入0.2ml的PBS-1噬菌体裂解物(Henkin，T.M.，and G.H.Chambliss.1984.Genetic mapping of a mutation causing analteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4.Mol Gen Genet 193：364-9)。在37℃轻微摇动或转动(转鼓)下孵育30分钟后，向细胞中加入9ml LB培养基。将它们在相同条件下再孵育30分钟。加入氯霉素至4μg/ml的浓度，并将孵育再持续2小时。将管在37℃下不摇动孵育过夜。第二天早晨，将培养物滤过0.45μm的滤器并储存于4℃或直接用于随后的转导。为此，将转酮酶缺陷菌株BS3523(参阅实施例6)在TBAB平板上于37℃过夜培养。使用来自该平板的细胞接种25ml LB培养基(Klett20-30)。将培养物在37℃摇动下孵育。当培养物达到Klett 175时，将0.8ml细胞与0.2ml如上所述的每种菌株BS3403、BS3482、BS3484、BS3486、BS3490和BS3512的PBS-1裂解物混合。在37℃摇动下孵育30分钟后，将细胞离心并重悬于1ml VY培养基中。在同样的条件下孵育1小时后，再次离心细胞，悬浮于0.2ml 1xSMS培养基中并涂布在选择平板(如上所述的1xSMS和1g/l葡萄糖、1g/l山梨糖醇和15％琼脂糖)上。测试长成的菌落的新霉素抗性缺失。分离gDNA(实施例1)后，进行使用引物tkt 1S和Rec 2AS的标准PCR，从基因组DNA中扩增tkt基因。显示灭活的tkt基因被完整tkt基因替换的菌落的tkt基因被测序，以证实突变的存在。产生的菌株称作BS3525(BS3484裂解物)、BS3528(BS3482裂解物)、BS3530(BS3486)、BS3534(BS3403裂解物)、BS3535(BS3490裂解物)、BS3541(BS3512裂解物)。

实施例8：转酮酶突变菌株在葡萄糖和葡萄糖酸盐上的生长

为了评价转酮酶突变对Bacillus subtilis生存力和生长的作用，在2g/l葡萄糖或葡萄糖酸盐上测定产生的菌株的最大生长率。使用以下的培养基：1xSMS(2g/l(NH₄)₂SO₄、14g/l K₂HPO₄、6g/l KH₂PO₄、1g/l柠檬酸三钠、0.2g/l MgSO₄*7H₂O)、2g/l葡萄糖或葡萄糖酸盐、500μg/l酵母提取物和实施例5中所述的微量元素溶液。用过夜培养物(5ml VY，重悬于1ml新鲜的VY中)将300ml带挡板的烧瓶中25ml所述培养基接种至Klett 20到30的OD。将它们在37℃摇动(220rpm)下孵育。在停滞期期间以一小时的间隔检测培养物的OD。在对数期期间，间隔降低至30分钟。对数期期间的至少四个数据点被用于测定最大生长速率。

表1：

B.subtilis突变体	在葡萄糖上的生长速率	％野生型	在葡萄糖酸盐上的生长速率	％野生型	比例
						野生型PY79	0.480	100％	0.351	100％	1.42/1
R357G	0.384	80％	0.300	86％	1.28/0.93
						R357S	0.372	78％	0.254	72％	1.46/1.08
R357T	0.342	71％	0.240	68％	1.43/1.04
						R357N	0.366	76％	0.231	66％	1.58/1.15
R357A	0.381	79％	0.225	64％	1.69/1.23
						R357L	0.324	68％	0.189	54％	1.71/1.25
R357H	0.324	68％	0.174	50％	1.86/1.36
						R357K	0.348	73％	0.171	49％	2.04/1.48
R357I	0.243	51％	0.108	31％	2.25/1.65
						R357Q	0.228	48％	0.09	26％	2.53/1.83
R357V	0.297	62％	0.101	24％	2.94/2.58
						R357M	0.258	54％	0.066	19％	3.91/2.84
R357Y	0.222	46％	0.06	17％	3.70/2.71
						R357F	0.174	36％	0.038	11％	4.58/3.27
R357D	0.156	33％	0	0％	-

野生型菌株PY79如所预期地显示在两种底物上均为最高的生长速率。通过在转酮酶位置357上引入不同突变，如所预期地，在葡萄糖酸盐上的生长比在葡萄糖上的生长受到更多影响。在葡萄糖酸盐上最大生长速率的降低被用作下述影响的度量，所述影响是转酮酶突变对经过非氧化戊糖磷酸分路的通量和对戊糖磷酸累积的影响。大泛围的生长速率被所示突变覆盖。

实施例9：摇瓶中的核黄素生产

用核黄素生产菌株RB50::[pRF69]、BS32525、BS3528、BS34530、BS3434、BS34335和BS3441(参阅实施例7)接种5ml含有氯霉素(10μg/ml)的VY。过夜培养后，将细胞离心(15分钟，4000rpm)并悬浮于1ml筛选培养基(2xSMS、10g/l葡萄糖、1g/l酵母提取物，和如实施例5中所述的微量元素)中。用0.25ml重悬的细胞接种含有25ml筛选培养基的200ml带挡板的烧瓶。培养物在水饱和的大气中于37℃孵育48小时。48小时孵育时间(其中在所有培养物中提供的葡萄糖被耗尽)后，从培养物中取出0.5ml的样品，添加35μl 4N NaOH并将混合物振荡1分钟。然后直接添加465μl 1M磷酸钾缓冲液，pH 6.8。通过在14000rpm(Eppendorf离心机5415D)离心5分钟来澄清混合物。将上清液转移至新管。使用核黄素测定的两种不同方法。对于热测定法而言，用800μl水稀释200μl上清液。444nm处的吸光度乘以因数0.03305以获得每升培养基的核黄素克数。对最终结果而言，将获得的值针对体积差异进行校正。核黄素浓度也通过HPLC根据实施例10测定。结果在表2中显示：

表2：

菌株	UV结果核黄素[mg/l]	相对于RB50::[pRF69]的％	HPLC结果核黄素[mg/l]	相对于RB50::[pRF69]的％
					BS3528(R357H)	179	171％	139	193％
BS3535(R357S)	173	166％	136	188％
					BS3534(R357A)	144	138％	124	172％
BS3525(R357K)	148	142％	112	155％
					BS3559(R357Q)	134	129％	103	143％
BS3530(R357N)	126	120％	93	129％
					RB50::[pRF69]	104	100％	72	100％
BS3541(R357G)	92	89％	66	92％
					BS3523(缺失)	90	87％	58	81％

几乎所有含有转酮酶突变的Bacillus菌株显示清楚提高的核黄素生产，而转酮酶阴性菌株生产比对照菌株更少的核黄素。在R357H突变的情况下，核黄素浓度几乎加倍。

实施例10：核黄素发酵

如EP 405370中所述进行发酵过程。

用菌株(1)RB50::[pRF69]、(2)BS3534(R357A)和(3)BS3528(R357H)进行发酵。在24小时和48小时的发酵时间测量培养液中的核黄素浓度和生物质(细胞干重)。如表3所示，亲本菌株RB50::[pRF69]在48小时内生产9.8g/l的核黄素，对底物的产率为3.59％(w/w)。生物质以对底物20.3％(w/w)的产率产生。表达经修饰的转酮酶基因的RB50::[pRF69]衍生物显示在核黄素生产中的显著提高。BS3528和BS3534分别产生11.7g/l和14.6g/l。这对应于BS3528和BS3534对葡萄糖分别为4.23％和5.14％的产率(表3)。这些结果证明转酮酶活性的修饰导致核黄素生产力的提高。

表3：48小时发酵时间后核黄素和生物质对底物的产率

	B2产率[％](w/w)	差异	生物质产率[％](w/w)	差异
					RB50::[pRF69]	3.59±0.27		20.26±0.80
BS3534	5.14±0.09	+43％	18.92±0.37	-7％
					BS3528	4.23±0.19	+18％	17.78±1.73	-12％

实施例11：用于测定核黄素的分析方法

为了测定核黄素，可以使用以下分析方法(Bretzel et al.，J.Ind.Microbiol.Biotechnol.22，19-26，1999)。

色谱系统是装配有二元泵、柱恒温箱和冷却的自动采样器的Hewlett-Packard 1100系统。串联使用二极管阵列检测器和荧光检测器。记录两组信号，280nm处的的UV和446nm激发、520nm发射的荧光。

与保护管一起使用不锈钢Supercosil LC-8-DB柱(150×4.6mm，3μm颗粒尺寸)。移动相为100mM醋酸(A)和甲醇(B)。使用根据以下流程的梯度洗脱：

时间[分钟] ％A ％B

0 98 2

6 98 2

15 50 50

25 50 50

将柱温度设定为20℃，流速为1.0ml/分钟。运行时间为25分钟。

发酵样品被稀释、过滤和分析，而不进行其它处理。通过与外标比较定量核黄素。计算是以280nm处的UV信号为基础的。使用购自Fluka(9471 Buchs，Switzerland)的核黄素作为标准材料(纯度≥99.0％)。

序列表

<110>帝斯曼知识产权资产管理有限公司

<120>经修饰的酶及其用途

<130>24818

<160>30

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>2004

<212>DNA

<213>Bacillus sp.

<400>1

atggatacaa ttgaaaagaa atcagttgct accattcgca cactgtcaat agacgctatt 60

gaaaaagcaa attctggtca cccagggatg ccgatgggag ccgctccaat ggcatacacg 120

ctgtggacaa aatttatgaa cgtaagtccg gcaaaccctg gctggtttaa ccgtgaccgt 180

tttgttttat ctgctggaca cgggtcagca ctattataca gcatgcttca tttaagcggg 240

tttgatctta gtattgaaga tcttaaggga ttccgccagt ggggcagcaa aacaccagga 300

catccggaat tcggacatac tgccggtgtt gatgctacaa caggtccgct tggccaagga 360

attgccatgg cagtcggtat ggcaattgct gaacgccatt tagcggaaac atacaaccgc 420

gattcattta acgtagtcga tcattataca tacagtattt gcggtgatgg tgatttaatg 480

gaaggtattt cttctgaagc cgcttcactc gcaggccatc ttcagcttgg ccgtctgatc 540

gtactatacg attctaatga catctctctt gatggagacc tcgaccgttc attctctgaa 600

aacgtgaaac agcgttttga agcaatgaat tgggaagttc tttatgttga ggatggaaac 660

aatattgaag aattaacagc ggctatcgaa aaagcacgcc aaaatgaaaa gaaacctaca 720

ttaattgaag tgaaaacgac aatcggattc ggttcaccta accgtgccgg tacatccggt 780

gttcacggtg cgccgcttgg taaagaagaa agcaaattaa caaaagaagc ttacgcgtgg 840

acatatgaag aagacttcta cgttccgtca gaagtttatg agcatttcgc tgtagctgtt 900

aaagaatcag gtgagaaaaa agaacaagaa tggaatgctc aattcgctaa atataaagaa 960

gtttatcctg aacttgctga acagcttgaa ctggcaatca aaggagagct tccgaaggac 1020

tgggatcaag aggttcctgt gtatgaaaaa ggaagcagtt tggcatcccg tgcatcttcc 1080

ggtgaagttc tcaacggact tgcgaaaaaa attcctttct ttgtcggagg ttctgctgac 1140

ctagcgggat cgaacaaaac gactattaaa aatgccggtg attttacagc ggttgattac 1200

tcaggcaaaa acttctggtt tggtgtacgt gaatttgcgatgggtgcggc cttaaacggt 1260

atggcgcttc atggcggtct tcgtgtattc ggcggaactt tctttgtctt ctctgattac 1320

ctgcgtcctg cgattcgcct tgcagcgtta atgggccttc ctgtgacata tgtcttcaca 1380

catgacagta ttgcggttgg tgaagacggt ccgacgcacg agcctgttga acagcttgct 1440

tcactccgtg cgatgcctaa cctttctttg atccgtccag cagacggcaa tgagacagca 1500

gcagcatgga agcttgcagt gcaaagcact gaccacccaa cagcgctagt gcttacacgt 1560

caaaaccttc ctaccatcga tcaaacatct gaagaagcat tggcaggagt agaaaaaggt 1620

gcatatgtcg tttctaaatc taaaaacgaa acacccgacg ctcttctcat cgcttccgga 1680

tcagaggtag gtcttgcaat tgaagcgcag gctgaattgg caaaagaaaa tatcgatgtt 1740

tctgttgtca gcatgccttc aatggaccgt tttgagaaac aatctgatga atacaaaaac 1800

gaagtccttc ctgcagatgt gaaaaaacgt cttgcaattg aaatgggctc atcatttgga 1860

tggggcaaat acacggggct tgaaggtgac gttctcggca tagaccgatt cggtgcatct 1920

gctcctggtg aaaccatcat taacgaatac ggcttctcag ttccgaacgt agtgaatcga 1980

gttaaggcat taatcaataa gtaa 2004

<210>2

<211>667

<212>PRT

<213>Bacillus sp.

<400>2

Met Asp Thr Ile Glu Lys Lys Ser Val Ala Thr Ile Arg Thr Leu Ser

1 5 10 15

Ile Asp Ala Ile Glu Lys Ala Asn Ser Gly His Pro Gly Met Pro Met

20 25 30

Gly Ala Ala Pro Met Ala Tyr Thr Leu Trp Thr Lys Phe Met Asn Val

35 40 45

Ser Pro Ala Asn Pro Gly Trp Phe Asn Arg Asp Arg Phe Val Leu Ser

50 55 60

Ala Gly His Gly Ser Ala Leu Leu Tyr Ser Met Leu His Leu Ser Gly

65 70 75 80

Phe Asp Leu Ser Ile Glu Asp Leu Lys Gly Phe Arg Gln Trp Gly Ser

85 90 95

Lys Thr Pro Gly His Pro Glu Phe Gly His Thr Ala Gly Val Asp Ala

100 105 110

Thr Thr Gly Pro Leu Gly Gln Gly Ile Ala Met Ala Val Gly Met Ala

115 120 125

Ile Ala Glu Arg His Leu Ala Glu Thr Tyr Asn Arg Asp Ser Phe Asn

130 135 140

Val Val Asp His Tyr Thr Tyr Ser Ile Cys Gly Asp Gly Asp Leu Met

145 150 155 160

Glu Gly Ile Ser Ser Glu Ala Ala Ser Leu Ala Gly His Leu Gln Leu

165 170 175

Gly Arg Leu Ile Val Leu Tyr Asp Ser Asn Asp Ile Ser Leu Asp Gly

180 185 190

Asp Leu Asp Arg Ser Phe Ser Glu Asn Val Lys Gln Arg Phe Glu Ala

195 200 205

Met Asn Trp Glu Val Leu Tyr Val Glu Asp Gly Asn Asn Ile Glu Glu

210 215 220

Leu Thr Ala Ala Ile Glu Lys Ala Arg Gln Asn Glu Lys Lys Pro Thr

225 230 235 240

Leu Ile Glu Val Lys Thr Thr Ile Gly Phe Gly Ser Pro Asn Arg Ala

245 250 255

Gly Thr Ser Gly Val His Gly Ala Pro Leu Gly Lys Glu Glu Ser Lys

260 265 270

Leu Thr Lys Glu Ala Tyr Ala Trp Thr Tyr Glu Glu Asp Phe Tyr Val

275 280 285

Pro Ser Glu Val Tyr Glu His Phe Ala Val Ala Val Lys Glu Ser Gly

290 295 300

Glu Lys Lys Glu Gln Glu Trp Asn Ala Gln Phe Ala Lys Tyr Lys Glu

305 310 315 320

Val Tyr Pro Glu Leu Ala Glu Gln Leu Glu Leu Ala Ile Lys Gly Glu

325 330 335

Leu Pro Lys Asp Trp Asp Gln Glu Val Pro Val Tyr Glu Lys Gly Ser

340 345 350

Ser Leu Ala Ser Arg Ala Ser Ser Gly Glu Val Leu Asn Gly Leu Ala

355 360 365

Lys Lys Ile Pro Phe Phe Val Gly Gly Ser Ala Asp Leu Ala Gly Ser

370 375 380

Asn Lys Thr Thr Ile Lys Asn Ala Gly Asp Phe Thr Ala Val Asp Tyr

385 390 395 400

Ser Gly Lys Asn Phe Trp Phe Gly Val Arg Glu Phe Ala Met Gly Ala

405 410 415

Ala Leu Asn Gly Met Ala Leu His Gly Gly Leu Arg Val Phe Gly Gly

420 425 430

Thr Phe Phe Val Phe Ser Asp Tyr Leu Arg Pro Ala Ile Arg Leu Ala

435 440 445

Ala Leu Met Gly Leu Pro Val Thr Tyr Val Phe Thr His Asp Ser Ile

450 455 460

Ala Val Gly Glu Asp Gly Pro Thr His Glu Pro Val Glu Gln Leu Ala

465 470 475 480

Ser Leu Arg Ala Met Pro Asn Leu Ser Leu Ile Arg Pro Ala Asp Gly

485 490 495

Asn Glu Thr Ala Ala Ala Trp Lys Leu Ala Val Gln Ser Thr Asp His

500 505 510

Pro Thr Ala Leu Va lLeu Thr Arg Gln Asn Leu Pro Thr Ile Asp Gln

515 520 525

Thr Ser Glu Glu Ala Leu Ala Gly Val Glu Lys Gly Ala Tyr Val Val

530 535 540

Ser Lys Ser Lys Asn Glu Thr Pro Asp Ala Leu Leu Ile Ala Ser Gly

545 550 555 560

Ser Glu Val Gly Leu Ala Ile Glu Ala Gln Ala Glu Leu Ala Lys Glu

565 570 575

Asn Ile Asp Val Ser Val Val Ser Met Pro Ser Met Asp Arg Phe Glu

580 585 590

Lys Gln Ser Asp Glu Tyr Lys Asn Glu Val Leu Pro Ala Asp Val Lys

595 600 605

Lys Arg Leu Ala Ile Glu Met Gly Ser Ser Phe Gly Trp Gly Lys Tyr

610 615 620

Thr Gly Leu Glu Gly Asp Val Leu Gly Ile Asp Arg Phe Gly Ala Ser

625 630 635 640

Ala Pro Gly Glu Thr Ile Ile Asn Glu Tyr Gly Phe Ser Val Pro Asn

645 650 655

Val Val Asn Arg Val Lys Ala Leu Ile Asn Lys

660 665

<210>3

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>3

aggagaaatc atatggatac aattgaaaag aaatcag 37

<210>4

<211>22

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>4

ggacatactg ccggtgttga tg 22

<210>5

<211>36

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>5

aattaaatga attcattaaa gaggagaaat catatg 36

<210>6

<211>35

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>6

aattaaatgg atcccttat tgattaatgcc ttaac 35

<210>7

<211>19

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>7

gttctgaggt cattactgg 19

<210>8

<211>22

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>8

ggacatactg ccggtgttga tg 22

<210>9

<211>19

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>9

ttgaagaatt aacagcggc 19

<210>10

<211>18

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>10

cagcttgaac tggcaatc 18

<210>11

<211>18

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>11

gtcctgcgat tcgccttg 18

<210>12

<211>18

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>12

acgaaacacc cgacgctc 18

<210>13

<211>38

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>13

aattaaatgg atccttactt attgattaat gccttaac 38

<210>14

<211>18

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>14

ggatgccaaa ctgcttcc 18

<210>15

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>15

agcagtttgg catccaacgc atcttccggt gaagttc 37

<210>16

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>16

agcagtttgg catcccaagc atcttccggt gaagttc 37

<210>17

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>17

agcagtttgg catccgcagc atcttccggt gaagttc 37

<210>18

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>18

agcagtttgg catccaaagc atcttccggt gaagttc 37

<210>19

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>19

agcagtttgg catcctcagc atcttccggt gaagttc 37

<210>20

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>20

agcagtttgg catccacagc atcttccggt gaagttc 37

<210>21

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>21

agcagtttgg catcccatgc atcttccggt gaagttc 37

<210>22

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>22

agcagtttgg catccgtggc atcttccggt gaagttc 37

<210>23

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>23

agcagtttgg catccattgc atcttccggt gaagttc 37

<210>24

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>24

agcagtttgg catccttggc atcttccggt gaagttc 37

<210>25

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>25

agcagtttgg catccatggc atcttccggt gaagttc 37

<210>26

<211>37

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>26

agcagtttgg catccggtgc atcttccggt gaagttc 37

<210>27

<211>21

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>27

ggggcagcaa aacaccagga c 21

<210>28

<211>44

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>28

gatctcgacc ctgcagccca agcacacagg aacctcttga tccc 44

<210>29

<211>47

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>引物

<400>29

gcgtcaaaac gcataccatt ttgaacaaaa ccttcctacc atcgatc 47

<210>30

<211>24

<212>DNA

<213>人造的

<220>

<223>Primer

<400>30

cttattgatt aatgccttaa ctcg 24

Claims

1.一种编码经修饰的转酮酶的经遗传工程改造过的生产核黄素的Bacillus subtilis，所述经修饰的转酮酶是在SEQ ID NO：2的基础上第357位上的精氨酸被赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸或组氨酸取代，并且其中所述经遗传工程改造过的Bacillus subtilis在仅通过戊糖磷酸途径代谢的碳源上的生长速率与其中SEQ ID No：2第357位上的氨基酸是精氨酸的Bacillussubtilis相比被降低10％到90％之间。

2.根据权利要求1的微生物，其中所述取代选自由R357K、R357A、R357S和R357H组成的组。

3.根据权利要求1或2的微生物，其中未经修饰的转酮酶的编码多核苷酸是SEQ ID NO 1。

4.核黄素、FMN和/或FAD的生产方法，包括：在合适的培养基中、允许所述经修饰的转酮酶表达的条件下，培养根据权利要求1的微生物，和从所述培养基中分离生产的核黄素、FMN和/或FAD。

5.根据权利要求4的方法，其中与使用编码下述转酮酶的Bacillussubtilis的生产相比核黄素的生产被提高至少155％，所述转酮酶中SEQ IDNO：2第357位上的氨基酸是精氨酸。

6.经修饰的转酮酶在选自Bacillus subtilis的微生物中生产核黄素的用途，其中所述经修饰的转酮酶是在SEQ ID NO：2的基础上第357位上的氨基酸被赖氨酸、丙氨酸、丝氨酸或组氨酸取代。

7.根据权利要求1的微生物用于生产核黄素、FMN和/或FAD的用途。