ES2425756T3 - Transcetolasa modificada y uso de la misma - Google Patents

Abstract

Un procedimiento para la producción de sustancias para las que ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5-fosfato es un precursor biosintético, que comprende cultivar un microorganismo en un medio adecuado encondiciones que permiten la expresión de una transcetolasa modificada y separar el producto de fermentación delmedio, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado deBacillus o Corynebacterium genéticamente manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dichatranscetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en unaposición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO: 2, y en el que la velocidad decrecimiento de dicho microorganismo sobre una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la rutade fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene unatranscetolasa no modificada, y en el que el microorganismo sigue siendo prototrófico para aminoácidos aromáticos.

Description

Transcetolasa modificada y uso de la misma

La presente invención proporciona enzimas transcetolasas modificadas. Los microorganismos que sintetizan una de las transcetolasas modificadas en lugar de la transcetolasa de tipo salvaje son prototrofos para aminoácidos aromáticos y no pueden usar fuentes de carbono que son asimiladas vía la ruta de fosfato de pentosa. Las enzimas modificadas y polinucleótidos que las codifican se pueden usar en el proceso de fermentación para sustancias que usan ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5-fosfato como sustrato para la biosíntesis, tal como, por ejemplo, riboflavina, precursores de riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN), dinucleótido de flavina y adenina (FAD), y sus derivados. También se pueden usar para la producción de fosfato de piridoxal (vitamina B6), guanosina y adenosina, y derivados de estos nucleótidos.

La riboflavina (vitamina B2) es sintetizada por todas las plantas y muchos microorganismos, pero no es producida por animales superiores. Debido a que es un precursor de coenzimas tales como el dinucleótido de flavina y adenina y el mononucleótido de flavina, que son necesarios en la oxidación enzimática de hidratos de carbono, la riboflavina es esencial para el metabolismo básico. En animales superiores, una insuficiencia de riboflavina puede provocar pérdida del cabello, inflamación de la piel, deterioro de la visión, e insuficiencia del crecimiento.

Las enzimas requeridas que catalizan la biosíntesis de riboflavina a partir de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato están codificadas por cuatro genes (ribG, ribB, ribA, y ribH) en B. subtilis. Estos genes están situados en un operón, cuyo orden génico difiere del orden de las reacciones enzimáticas catalizadas por las enzimas. Por ejemplo, GTP ciclohidrolasa II, que cataliza la primera etapa en la biosíntesis de riboflavina, es codificada por el tercer gen en el operón, ribA. El gen ribA también codifica una segunda actividad enzimática, es decir, 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa (DHBPS), que cataliza la conversión de ribulosa-5-fosfato a la unidad de cuatro carbonos 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato (DHBP). La desaminasa y la reductasa son codificadas por el primer gen del operón, ribG. La penúltima etapa en la biosíntesis de la riboflavina está catalizada por lumazina sintasa, el producto del último gen rib, ribH. La riboflavina sintasa, que controla la última etapa de la ruta, es codificada por el segundo gen del operón, ribB. La función del gen situado en el extremo 3’ del operón rib es actualmente incierta; sin embargo, su producto génico no es necesario para la síntesis de riboflavina.

La transcripción del operón de riboflavina a partir del promotor ribP1 está controlada por un mecanismo de atenuación que implica una región líder reguladora situada entre ribP1 y ribG. Las mutaciones ribO en esta región líder dan como resultado la expresión desregulada del operón de riboflavina. La expresión desregulada también se observa en cepas que contienen mutaciones con cambio de sentido en el gen ribC. Se ha demostrado que el gen ribC codifica la flavina cinasa/FAD sintasa de B. subtilis (Mack, M., et al., J. Bacteriol., 180:950-955, 1998). Las mutaciones desregulantes reducen la actividad de flavocinasa del producto del gen ribC dando como resultado concentraciones intracelulares reducidas de mononucleótido de flavina (FMN), la molécula efectora del sistema regulador de riboflavina.

La manipulación mediante ingeniería de cepas de producción de riboflavina con mayores velocidades y rendimientos de producción de riboflavina se ha logrado en el pasado de muchas maneras diferentes. Por ejemplo, (1) se usó mutagénesis clásica para generar variantes con mutaciones aleatorias en el genoma del organismo de elección, seguido de la selección por mayor resistencia a análogos de purina y/o identificando una mayor producción de riboflavina. (2) Como alternativa, las enzimas terminales de la biosíntesis de riboflavina, es decir, las enzimas que catalizan la conversión de trifosfato de guanosina (GTP) y ribulosa-5-fosfato en riboflavina, estaban sobreexpresadas, dando como resultado también un mayor flujo hacia el producto diana. El flujo metabólico hacia y a través de una ruta biosintética, por ejemplo la ruta biosintética de riboflavina, está determinado por las actividades específicas de las enzimas limitantes de la velocidad de esta ruta particular, y por las concentraciones intracelulares de los sustratos para estas enzimas. Una enzima puede operar a su actividad máxima sólo a o por encima de las concentraciones de sustrato saturantes. La concentración de sustrato saturante es un rasgo característico para cada enzima. Por ejemplo, el flujo metabólico hacia la ruta de riboflavina se puede incrementar o se puede mantener en un nivel elevado manteniendo las concentraciones intracelulares de ribulosa-5-fosfato por encima o tan próximo como sea posible a la concentración de sustrato saturante de la 3,4-dihidroxi-2-butanona 4-fosfato sintasa, una enzima limitante de la velocidad supuesta para la ruta biosintética de riboflavina. Se pueden alcanzar concentraciones intracelulares elevadas de ribulosa-5-fosfato, por ejemplo, evitando o interfiriendo con el drenaje de ribulosa-5-fosfato en el metabolismo central vía la parte no oxidativa de la ruta de fosfato de pentosa.

Una enzima clave en la parte no oxidativa de la ruta de fosfato de pentosa es la enzima transcetolasa, que cataliza la conversión reversible de ribulosa-5-fosfato y xilulosa-5-fosfato a seduheptulosa-7-fosfato y gliceraldehído-3fosfato. Además, transcetolasa cataliza también la conversión de fructosa-6-fosfato y gliceraldehído-3-fosfato en xilulosa-5-fosfato y eritrosa-4-fosfato (Kochetov, G. A. 1982, Transketolase from yeast, rat liver, and pig liver, Methods Enzymol., 90:209-23).

Se ha dado a conocer previamente que cepas de Bacillus subtilis deficientes en transcetolasa, que poseen mutaciones de supresión génica en el gen que codifica transcetolasa, producen ribosa, que se acumula en el caldo de fermentación (De Wulf, P., y E. J. Vandamme. 1997. Production of D-ribose by fermentation, Appl. Microbiol.

Biotechnol. 48:141-148; Sasajima, K., y Yoneda, M. 1984, Production of pentoses by microorganisms. Biotechnol. and Genet. Eng. Rev. 2: 175-213). Obviamente, se pueden alcanzar mayores conjuntos de azúcares intracelulares de C5 carbonos en mutantes a los que se les ha suprimido el gen de transcetolasa hasta un nivel que supera las necesidades fisiológicas de las bacterias y conduce a la secreción de ribosa en exceso.

Como se mencionó anteriormente, las reacciones catalizadas por transcetolasa también son necesarias para producir eritrosa-4-fosfato, a partir del cual derivan tres aminoácidos aromáticos proteinogénicos. Por lo tanto, los microorganismos deficientes en transcetolasa son auxotrofos para estos aminoácidos. Sólo pueden crecer si estos aminoácidos o sus precursores biosintéticos, por ejemplo ácido shikímico, son suministrados vía el medio de cultivo.

Además de la auxotrofia desfavorable para aminoácidos aromáticos o ácido shikímico, los mutantes de B. subtilis deficientes en transcetolasa muestran un número de graves efectos pleyotrópicos, como crecimiento muy lento en glucosa, un sistema de fosfotransferasa dependiente de fosfoenolpiruvato defectuoso, represión de catabolito de carbono desregulada, y composición de la membrana celular y de la pared celular alterada (De Wulf, P., y E. J. Vandamme. 1997).

Otra cepa de B. subtilis que segrega riboflavina deficiente en transcetolasa fue descrita por Gershanovich et al. (Gershanovich VN, Kukanova Ala, Galushkina ZM, Stepanov AI (2000) Mol. Gen. Mikrobiol. Virusol. 3:3-7).

Además, el documento US 6.258.554 B1 describe una cepa de Corynebacterium glutamicum que sobreproduce riboflavina, en la que la actividad de transcetolasa es deficiente. Se puede observar a partir de la descripción del documento US 6.258.554 B1 que la deficiencia en la actividad de transcetolasa y la auxotrofia de aminoácidos resultante fue esencial para la mejor productividad de riboflavina, puesto que un revertiente prototrófico produjo riboflavina en cantidades similares a una cepa de C. glutamicum con un antecedente de transcetolasa de tipo salvaje.

Estas desventajas, es decir, auxotrofia para aminoácidos aromáticos y otros efectos pleyotrópicos explicados anteriormente, hacen a un mutante deficiente en transcetolasa una cepa de producción menos preferible para procesos industriales estables, tales como, por ejemplo, la producción industrial de riboflavina con tal cepa.

En general, es un objeto de la presente invención proporcionar una cepa mutante de transcetolasa que está modificada de tal manera que las propiedades catalíticas de la transcetolasa modificada permiten concentraciones intracelulares de ribulosa-5-fosfato y de ribosa-5-fosfato mayores que aquellas de la transcetolasa sin modificar, pero que no tiene las desventajas de las cepas deficientes en transcetolasa mencionadas anteriormente.

Sorprendentemente, ahora se ha encontrado que alterando genéticamente un microorganismo tal como por ejemplo

B. subtilis, sustituyendo el gen de tipo salvaje por un gen mutado que codifica una transcetolasa modificada que permite cierto flujo residual a través de la ruta de fosfato de pentosa al tener actividades específicas moduladas, se puede mejorar significativamente la producción de un producto de fermentación tal como, por ejemplo, riboflavina sin perder las propiedades prototróficas.

La presente invención se refiere a un a [página 4a]

Como una primera etapa para aislar mutantes, en los que la transcetolasa de tipo salvaje se sustituye por una de tales transcetolasas modificadas, se puede generar un mutante de supresión que es auxotrofo para los aminoácidos aromáticos proteinogénicos y que no puede crecer con fuentes de carbono asimiladas vía la ruta de fosfato de pentosa, por ejemplo gluconato. El mutante de supresión de transcetolasa se puede transformar entonces con una mezcla de fragmentos de ADN que codifican diversos mutantes de transcetolasa. Se pueden aislar transformantes prototróficos, a partir de los cuales se seleccionan aquellos que muestran una velocidad de crecimiento reducida en gluconato. Los mutantes aislados según este método pueden sintetizar enzimas transcetolasas modificadas que permiten una biosíntesis suficiente de eritrosa-4-fosfato para prevenir el crecimiento auxotrófico, pero actúan como un cuello de botella para la asimilación de gluconato. Además, se pueden evitar los efectos pleyotrópicos indeseados, observados típicamente con mutantes de supresión de transcetolasa de B. subtilis. El documento US

6.258.554 B1 indica que, junto con el restablecimiento del crecimiento auxotrófico al crecimiento prototrófico, los mutantes de transcetolasa de C. glutamicum que segregan riboflavina pierden su capacidad para producir más riboflavina que una cepa similar que contiene un gen de transcetolasa de tipo salvaje. Como se muestra en los ejemplos de la presente invención, los mutantes de transcetolasa de B. subtilis prototróficos aislados como se esquematiza anteriormente produjeron inesperadamente más riboflavina que la cepa progenitora de tipo salvaje de transcetolasa, mientras que un mutante de supresión de transcetolasa había perdido parcialmente sus capacidades de producción de riboflavina.

Los métodos para la producción de mutaciones en fragmentos de ADN son bien conocidos en la técnica. Los mutantes de transcetolasa se pueden generar, por ejemplo, mediante manipulación de proteínas por ingeniería genética usando una de las estructuras tridimensionales disponibles de, por ejemplo, la transcetolasa de levadura (Lindqvist, Y., G. Schneider, U. Ermler, y M. Sundstrom. 1992. Three-dimensional structure of transketolase, a thiamine diphosphate dependent enzyme, at 2.5 A resolution. Embo. J. 11:2373-9) para seleccionar posiciones adecuadas de la secuencia de aminoácidos, o mediante mutagénesis al azar. El proceso de selección en ambos casos se puede realizar como se describe anteriormente. La transcetolasa modificada -cuando se usa como

sustitución para la transcetolasa de tipo salvaje -muestra propiedades catalíticas, es decir, actividades específicas moduladas, que permiten el crecimiento de la célula hospedante en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa (por ejemplo gluconato) con una velocidad de crecimiento reducida en comparación con una célula hospedante que contiene la transcetolasa de tipo salvaje. Estas propiedades dan como resultado mayores concentraciones intracelulares de ribulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato y un flujo residual a través de la ruta de fosfato de pentosa, de manera que se puede producir suficiente eritrosa-4-fosfato para evitar el crecimiento auxotrófico.

“Enzima de tipo salvaje” o “transcetolasa de tipo salvaje”, que se puede usar para la presente invención, puede incluir cualquier transcetolasa como se define anteriormente que se usa como punto de partida para diseñar mutantes según la presente invención. La transcetolasa de tipo salvaje puede ser de origen eucariota o procariota, preferiblemente fúngico o bacteriano, seleccionada en particular de Bacillus o Corynebacterium, preferiblemente de

B. subtilis, B. licheniformis, B. halodurans. Lo más preferible, la transcetolasa es de B. subtilis. “Homóloga” se refiere a una transcetolasa que es al menos alrededor de 50% idéntica, preferiblemente al menos alrededor de 60% idéntica, más preferiblemente al menos alrededor de 70%, 80%, 85%, 90%, 95% idéntica, y lo más preferible al menos alrededor de 98% idéntica a una o más de las secuencias de aminoácidos como se muestra en la Figura 1. “Tipo salvaje”, en el contexto de la presente invención, puede incluir tanto secuencias de transcetolasa derivables de la naturaleza así como variantes de enzimas transcetolasas sintéticas (en tanto que sean homólogas a una cualquiera de las secuencias mostradas en la Figura 1). Las expresiones “transcetolasa de tipo salvaje” y “transcetolasa no modificada” se usan aquí de forma intercambiable.

La expresión “% de identidad”, como se conoce en la técnica, significa el grado de relatividad entre secuencias polipeptídicas o polinucleotídicas, según sea el caso, como se determina mediante el emparejamiento entre cadenas de tales secuencias. “Identidad” se puede determinar fácilmente mediante métodos conocidos, por ejemplo con el programa BESTFIT (GCG Wisconsin Package, versión 10.2, Accelrys Inc., 9685 Scranton Road, San Diego, CA 92121-3752, USA) usando los siguientes parámetros: penalización de creación de salto 8, penalización de extensión de salto 2 (parámetros por defecto).

Un “mutante”, “enzima mutante”, “enzima mutada” o “transcetolasa mutante” o una “transcetolasa modificada”, como se usa aquí, significa cualquier variante derivable de una enzima/transcetolasa de tipo salvaje dada (según la definición anterior) de acuerdo con las enseñanzas de la presente invención, y, cuando se usa para sustituir el gen de tipo salvaje de un organismo/célula hospedante, debería tener un efecto sobre el crecimiento en, por ejemplo, gluconato y/o ribosa. Para el alcance de la presente invención, no es relevante cómo se obtiene el mutante o mutantes; tales mutantes se pueden obtener, por ejemplo, mediante mutagénesis dirigida al sitio, mutagénesis de saturación, mutagénesis al azar/evolución dirigida, mutagénesis química o por UV de todas las células/organismos, etc. Estos mutantes también se pueden generar, por ejemplo, diseñando genes sintéticos, y/o se pueden producir mediante traducción in vitro (libre de células). Para ensayar la actividad específica, los mutantes se pueden (sobre)expresar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica. Las expresiones “transcetolasa mutante”, “transcetolasa modificada” o “transcetolasa mutada” se usan aquí de forma intercambiable.

“Célula hospedante” es una célula capaz de producir un producto de fermentación dado y que contiene la transcetolasa de tipo salvaje, o un ácido nucleico que codifica la transcetolasa modificada según la invención. Las células hospedantes adecuadas incluyen células de microorganismos.

Como se usa aquí, la expresión “actividad específica” representa la velocidad de reacción de las enzimas transcetolasas de tipo salvaje y mutantes en condiciones de reacción apropiadamente definidas como se describe en Kochetov (Kochetov, G. A. 1982. Transketolase from yeast, rat liver, and pig liver. Methods Enzymol 90:209-23). La “actividad específica” define la cantidad de un sustrato consumido y/o producto producido en un período de tiempo dado y por cantidad definida de proteína a una temperatura definida. Típicamente, la “actividad específica” se expresa en !moles de sustrato consumido o producto formado por min. por mg de proteína. Típicamente, !mol/min. se abrevia mediante U (= unidad). Por lo tanto, las definiciones de unidad para actividad específica de !mol/min./(mg de proteína) o U/(mg de proteína) se usan de forma intercambiable a lo largo de este documento. Se entiende que en el contexto de la presente invención, la actividad específica se debe de comparar en base a una longitud similar,

o preferiblemente idéntica, de la cadena polipeptídica.

Muchas mutaciones pueden cambiar una transcetolasa de tipo salvaje de tal manera que el crecimiento en gluconato se vea afectado como se describe anteriormente.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento para la producción de sustancias para las que ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5-fosfato es un precursor biosintético, que comprende cultivar un microorganismo en un medio adecuado en condiciones que permiten la expresión de una transcetolasa modificada, y separar el producto de fermentación del medio, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado de Bacillus o Corynebacterium genéticamente modificado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dicha transcetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID No.: 2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente vía la ruta de fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una

célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada, y en el que el microorganismo permanece prototrófico para aminoácidos aromáticos.

La al menos una mutación puede ser una adición, supresión y/o sustitución.

Preferiblemente, la al menos una mutación es al menos una sustitución de aminoácido, en la que un aminoácido dado presente en la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa no modificada se sustituye por un aminoácido diferente en la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa modificada de la invención. La secuencia de aminoácidos de la transcetolasa modificada puede contener al menos una sustitución de aminoácido cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa no modificada correspondiente. La transcetolasa modificada de la presente invención contiene al menos una mutación en una posición de aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 357 de la secuencia de aminoácidos de transcetolasa de B. subtilis como se representa en SEC ID NO:2.

En otras realizaciones, la transcetolasa modificada contiene al menos dos, al menos tres, al menos cuatro o al menos cinco sustituciones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa correspondiente. Por ejemplo, la transcetolasa modificada contiene una a diez, una a siete, una a cinco, una a cuatro, dos a diez, dos a siete, dos a cinco, dos a cuatro, tres a diez, tres a siete, tres a cinco o tres a cuatro sustituciones de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa no modificada correspondiente.

En una realización, la transcetolasa no modificada se puede obtener de Bacillus, preferiblemente B. subtilis, como se representa en SEC ID NO:2. La secuencia de ADN correspondiente se muestra en SEC ID NO:1. La transcetolasa modificada contiene al menos una mutación en la posición 357 de SEC ID NO:2, conduciendo a una transcetolasa modificada que tiene las propiedades descritas anteriormente.

La al menos una sustitución de aminoácidos en la transcetolasa no modificada situada en una posición que corresponde al aminoácido 357 como se muestra en SEC ID NO:2 se puede seleccionar de la sustitución R357H, R357A, R357S, R357N, R357T, R357K, R357I, R357V, R357G, y R357L.

En una realización particularmente preferida, la transcetolasa mutada consiste en una sustitución que afecta a la posición de aminoácido que corresponde a la posición de aminoácido 357 de la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO:2, y que se puede seleccionar de la sustitución R357H, R357A, R357S, R357N, R357T, R357K, R357I, R357V, R357G, y R357L.

En otra realización preferida, la transcetolasa modificada contiene al menos dos sustituciones de aminoácidos cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa no modificada correspondiente, en la que al menos una mutación corresponde a la posición de aminoácido 357 de la secuencia de aminoácidos como se muestra en SEC ID NO:2, y que se puede seleccionar de la sustitución R357H, R357A, R357S, R357N, R357T, R357K, R357I, R357V, R357G, y R357L.

El aminoácido presente en la transcetolasa no modificada es preferiblemente arginina en la posición 357. El aminoácido en la secuencia de la transcetolasa no modificada se puede cambiar a histidina, alanina, serina, asparagina, lisina, treonina, leucina, glicina, isoleucina o valina en la posición 357. Preferiblemente, la sustitución en la posición de aminoácido que corresponde a la posición 357 de la secuencia como se muestra en SEC ID NO:2 consiste en la sustitución de arginina por histidina, arginina por alanina, arginina por serina, arginina por leucina, arginina por lisina, arginina por asparagina, arginina por treonina, arginina por glicina, arginina por isoleucina, arginina por valina.

La transcetolasa modificada de la invención puede comprender aminoácidos extraños, preferiblemente en su término N o C. “Aminoácidos extraños” significa aminoácidos que no están presentes en una transcetolasa nativa (que aparece en la naturaleza), preferiblemente un tramo de al menos alrededor de 3, al menos alrededor de 5 o al menos alrededor de 7 aminoácidos contiguos que no están presentes en una transcetolasa nativa. Los tramos preferidos de aminoácidos extraños incluyen, pero no se limitan a, “etiquetas” que facilitan la purificación de la transcetolasa modificada producida recombinantemente. Los ejemplos de tales etiquetas incluyen, pero no se limitan a, una etiqueta “His6”, una etiqueta FLAG, una etiqueta myc, y similar. Para el cálculo de la actividad específica, es necesario que los valores sean corregidos para estos aminoácidos adicionales (véase también anteriormente).

En otra realización, la transcetolasa modificada puede contener una o más, por ejemplo dos, supresiones cuando se compara con la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa no modificada correspondiente. Preferiblemente, las supresiones afectan a los aminoácidos N o C-terminales de la transcetolasa no modificada correspondiente, y no reducen significativamente las propiedades funcionales, por ejemplo la actividad específica, de la enzima.

La invención se refiere además a un polinucleótido que comprende una secuencia nucleotídica que codifica una transcetolasa modificada usada para la invención. “Polinucleótido”, como se usa aquí, se refiere a un polirribonucleótido o polidesoxirribonucleótido que puede ser ARN o ADN sin modificar, o ARN o ADN modificado. Los polinucleótidos incluyen, pero no se limitan a, ADN mono-o bicatenario, ADN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias, ARN mono- y bicatenario, y ARN que es una mezcla de regiones mono- y bicatenarias,

moléculas híbridas que comprenden ADN y ARN que pueden ser monocatenarios o, más típicamente, bicatenarios,

o una mezcla de regiones mono-y bicatenarias. El término “polinucleótido” incluye ADN o ARN que comprende una

o más bases inusuales, por ejemplo inosina, o una o más bases modificadas, por ejemplo bases tritiladas.

El polinucleótido puede obtenerse fácilmente modificando una secuencia polinucleotídica que codifica una transcetolasa no modificada. En la Figura 1 se dan ejemplos de secuencias polinucleotídicas que codifican enzimas transcetolasas no modificadas. Preferiblemente, la transcetolasa no modificada se origina de Bacillus, en particular

B. subtilis, más preferiblemente es un polinucleótido que codifica una transcetolasa no modificada como se representa en SEC ID NO:2.

Los métodos para introducir mutaciones, por ejemplo adiciones, supresiones y/o sustituciones, en la secuencia nucleotídica que codifica la transcetolasa no modificada incluyen, pero no se limitan a, mutagénesis dirigida al sitio y métodos a base de PCR.

Las secuencias de ADN usadas para la presente invención se pueden construir partiendo de secuencias de ADN genómico o de ADNc que codifican enzimas transcetolasas conocidas en el estado de la técnica, como están disponibles a partir de, por ejemplo, Genbank (Intelligenetics, California, USA), European Bioinformatics Institute (Hinston Hall, Cambridge, GB), NBRF (Georgetown University, Medical Centre, Washington DC, USA) y Vecbase (University of Wisconsin, Biotechnology Centre, Madison, Wisconsin, USA), o a partir de una información de secuencia descrita en la Figura 1 mediante métodos de mutagénesis in vitro [véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York]. Otra posibilidad de mutar una secuencia de ADN dada que también puede ser adecuada para la práctica de la presente invención es la mutagénesis usando la reacción en cadena de la polimerasa (PCR). El ADN como material de partida se puede aislar mediante métodos conocidos en la técnica y descritos, por ejemplo, en Sambrook et al. (Molecular Cloning) a partir de las cepas/organismos respectivos. Sin embargo, se entiende que el ADN que codifica una transcetolasa a construir/mutar según la presente invención también se puede preparar en base a una secuencia de ADN producida, por ejemplo mediante construcción de un gen sintético mediante métodos conocidos en la técnica (como se describe, por ejemplo, en el documento EP 747483).

Una vez que se han obtenido secuencias de ADN completas, se pueden integrar en vectores o se pueden introducir directamente en el genoma de un organismo hospedante mediante métodos conocidos en la técnica y descritos en, por ejemplo, Sambrook et al. (s.a.) para (sobre)expresar en sistemas hospedantes apropiados el polipéptido codificado. Sin embargo, un experto en la técnica sabe que también las propias secuencias de ADN se pueden usar para transformar los sistemas hospedantes adecuados de la invención para obtener la (sobre)expresión del polipéptido codificado.

En una realización preferida, la presente invención proporciona el uso de una transcetolasa modificada que posee al menos una mutación como se define anteriormente.

Los polipéptidos y polinucleótidos se proporcionan preferiblemente en forma aislada, y preferiblemente purificada hasta homogeneidad.

El término “aislada” significa que el material se retira de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si es de origen natural). Por ejemplo, un polinucleótido o polipéptido de origen natural presente en un microorganismo vivo no está aislado, pero el mismo polinucleótido o polipéptido, separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural, está aislado. Tales polinucleótidos podrían ser parte de un vector, y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrían ser parte de una composición y todavía estar aislados por cuanto tal vector o composición no es parte de su entorno natural.

Un polinucleótido o ácido nucleico aislado, como se usa aquí, puede ser un ADN o ARN que no está inmediatamente contiguo con ambas secuencias codificantes con las que está inmediatamente contiguo (una en el extremo 5’ y una en el extremo 3’) en el genoma de origen natural del microorganismo a partir del que deriva. De este modo, en una realización, un ácido nucleico incluye algunas o todas las secuencias no codificantes de 5’ (por ejemplo, promotoras) que están inmediatamente contiguas a la secuencia codificante. La expresión “polinucleótido aislado” incluye por lo tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que se incorpora en un vector, en un plásmido o virus que se replica autónomamente, o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o que existe como molécula separada (por ejemplo, un ADNc o un fragmento de ADN genómico producido mediante PCR o tratamiento con endonucleasas de restricción) independiente de otras secuencias. También incluye un ADN recombinante que es parte de un gen híbrido que codifica un polipéptido adicional que está sustancialmente libre de material celular, material vírico, o medio de cultivo (cuando se produce mediante técnicas de ADN recombinante), o precursores químicos u otros compuestos químicos (cuando se sintetiza químicamente). Además, un “fragmento de ácido nucleico aislado” es un fragmento de ácido nucleico que no es de origen natural como fragmento y no se encontraría en el estado natural.

Como se usa aquí, la expresión polipéptido aislado se refiere a un polipéptido que está sustancialmente libre de otros polipéptidos. Un polipéptido aislado es preferiblemente mayor que 80% puro, más preferiblemente mayor que 90% puro, incluso más preferiblemente mayor que 95% puro, lo más preferible mayor que 99% puro. La pureza se puede determinar según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo mediante SDS-PAGE y tinción proteica

subsiguiente. Las bandas de proteínas se pueden cuantificar entonces mediante densitometría. Otros métodos para determinar la pureza están dentro del nivel de la pericia normal.

Como se menciona anteriormente, las transcetolasas modificadas y los polinucleótidos correspondientes de la invención se utilizan en la ingeniería genética de una célula hospedante adecuada para hacerla mejor y más eficiente en el proceso de fermentación para sustancias que usan como sustrato ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato,

o xilulosa-5-fosfato para la biosíntesis. La presencia de dicha transcetolasa modificada en una célula hospedante adecuada puede dar como resultado mayores concentraciones intracelulares de ribulosa-5-fosfato y ribosa-5-fosfato y un flujo residual a través de la ruta de fosfato de pentosa en dicho hospedante recombinante, de manera que se puede producir suficiente eritrosa-4-fosfato para evitar el crecimiento auxotrófico.

Las células hospedantes apropiadas se seleccionan de Corynebacterium o Bacilli, como por ejemplo, Bacillus subtilis.

De este modo, la presente invención se refiere a [página 4]. En general, es posible introducir un mutante de transcetolasa obtenido que se origina a partir de un cierto organismo, por ejemplo B. subtilis, en el mismo organismo nuevamente y usarlo ahora como célula hospedante, o introducir cualquier mutante obtenido en cualesquiera otras células hospedantes relevantes.

Como se usa aquí, la expresión “velocidad de crecimiento” representa lo siguiente: Las células bacterianas se reproducen dividiéndose en dos. Si el crecimiento no está limitado, la duplicación continúa a una velocidad constante de manera que tanto el número de células como la velocidad de la población se duplica con cada período de tiempo consecutivo. Para este tipo de crecimiento exponencial, la representación gráfica del logaritmo natural del número de células frente al tiempo (preferiblemente en horas) produce una línea recta. La pendiente de esta línea es la velocidad de crecimiento específica del organismo, que es una medida del número de divisiones por célula por tiempo unitario. En alimento, las bacterias no pueden crecer continuamente puesto que la cantidad de nutriente disponible será finita y se acumularán productos de desecho. En estas condiciones, las curvas de crecimiento tienden a ser sigmoides.

Es un objeto de la presente invención proporcionar un procedimiento en el que la velocidad de crecimiento de dicha célula hospedante recombinante (por ejemplo microorganismo) según la presente invención que posee una transcetolasa modificada en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa, en particular gluconato, se reduce entre 10 y 90% cuando se compara con el organismo de tipo salvaje. Preferiblemente, la reducción de la velocidad de crecimiento es entre 20% y 80%, todavía más preferiblemente entre 25% y 75%, en comparación con una célula que contiene un gen de transcetolasa de tipo salvaje.

La invención se refiere además a un a [página 4], que comprende:

a) cultivar la célula hospedante manipulada genéticamente/producida recombinantemente en la que el gen de transcetolasa de tipo salvaje se ha sustituido por un gen de transcetolasa modificada que codifica una enzima que permite un crecimiento ligeramente reducido o no reducido en una fuente de carbono que no es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa, pero que muestra una velocidad de crecimiento reducida cuando el organismo crece en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa, en un medio adecuado en condiciones que permiten la expresión de la transcetolasa modificada; y

b) separar del medio el producto de fermentación.

El “producto de fermentación”, como se usa aquí, puede ser cualquier producto producido mediante una célula hospedante adecuada como se define anteriormente, cuya biosíntesis usa como sustrato ribosa-5-fosfato, ribulosa5-fosfato, o xilulosa-5-fosfato. Los ejemplos de tales productos de fermentación incluyen, pero no se limitan a, riboflavina, precursores de riboflavina, mononucleótido de flavina (FMN), dinucleótido de flavina y adenina (FAD) y sus derivados, fosfato de piridoxal (vitamina B6), guanosina, adenosina y derivados de estos nucleótidos.

“Precursor de riboflavina” y “derivados de riboflavina, FMN o FAD”, en el contexto de esta invención, debe incluir cualquiera y todos los metabolitos que requieran como intermedio o sustrato ribulosa-5-fosfato o ribulosa-5-fosfato en su (bio)síntesis. En el contexto de esta solicitud de patente, es irrelevante si tales rutas (bio)sintéticas son naturales o no naturales (es decir, rutas que no se producen en la naturaleza, sino que están manipuladas biotecnológicamente mediante ingeniería). Preferiblemente, las rutas sintéticas son de naturaleza bioquímica. Los precursores de riboflavina y derivados de riboflavina, FMN o FAD, incluyen pero no se limitan a: DRAPP; 5-amino-6ribosilamino-2,4(1H,3H)-pirimidindiona-5’-fosfato; 2,5-diamino-6-ribitilamino-4(3H)-pirimidinona-5’-fosfato; 5-amino-6ribitilamino-2,4(1H,3H)-pirimidindiona-5’-fosfato; 5-amino-6-ribitilamino-2,4(1H,3H)-pirimidindiona; 6,7-dimetil-8ribitilumazina (DMRL); y flavoproteínas. El término “riboflavina” también incluye sus derivados, tales como, por ejemplo, riboflavin-5-fosfato, y sus sales, tales como, por ejemplo, riboflavin-5-fosfato de sodio.

Los polinucleótidos, polipéptidos, células hospedantes recombinantes y métodos descritos aquí se pueden usar para la producción biotecnológica de uno o más de los productos de fermentación como se define anteriormente.

Los métodos de manipulación genética y metabólica mediante ingeniería de células hospedantes adecuadas según la presente invención son conocidos por la persona experta en la técnica. De forma similar, los métodos de purificación (potencialmente) adecuados para por ejemplo riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, fosfato de piridoxal o uno o más de sus derivados, son bien conocidos en el campo de la biosíntesis química fina y de la producción.

Se entiende que un método para la producción biotecnológica de un producto de fermentación tal como por ejemplo riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, fosfato de piridoxal o uno o más de sus derivados según la presente invención no está limitado a procedimientos de fermentación de células completas como se describe anteriormente, sino que también puede usar, por ejemplo, células hospedantes permeabilizadas, extractos celulares brutos, extractos celulares aclarados de restos celulares mediante, por ejemplo, centrifugación o filtración, o incluso rutas de reacción reconstituidas con enzimas aisladas. También las combinaciones de tales procedimientos están dentro del alcance de la presente invención. En el caso de la biosíntesis libre de células (tal como con rutas de reacción reconstituidas), es irrelevante si las enzimas aisladas se han preparado mediante y aislado de una célula hospedante, mediante transcripción/traducción in vitro, o todavía por otros medios.

Los medios de fermentación deben contener sustratos de carbono adecuados. Los sustratos adecuados pueden incluir, pero no se limitan a, monosacáridos tales como glucosa o fructosa, oligosacáridos tales como lactosa o sacarosa, polisacáridos tales como almidón o celulosa, o sus mezclas, y mezclas sin purificar a partir de materias primas renovables. Se contempla que la fuente de carbono utilizada en la presente invención puede englobar una amplia variedad de sustratos que contienen carbono, y sólo estará limitada por la elección del organismo.

Las diversas realizaciones de la invención descritas aquí se pueden combinar de forma cruzada.

La presente invención se ilustrará ahora con más detalle mediante los siguientes ejemplos no limitantes. Estos ejemplos se describen con referencia a las Figuras:

La Figura 1 muestra - como ya se mencionó anteriormente - ejemplos de secuencias polinucleotídicas que codifican una transcetolasa no modificada, y la Figura 2 muestra un conjunto de cebadores.

En particular, la figura 1 muestra el alineamiento de múltiples secuencias calculado mediante el programa clustalW

(1.83) de las secuencias de aminoácidos de transcetolasa de Escherichia coli (TKT_ECOLI), Bacillus subtilis (TKT_BACSU), Bacillus licheniformis (TKT_BACLD), Bacillus halodurans (TKT_BACHD), Corynebacterium glutamicum (TKT_CORGL), Saccharomyces cerevisiae (TKT_YEAST), y Ashbya gossypii (TKT_ASHGO). Las posiciones que son homólogas/equivalentes al resto de aminoácido 357 de la transcetolasa de B. subtilis que se explican en uno de los siguientes ejemplos están en letra negrita. La numeración usada para esas posiciones se realiza según la secuencia de aminoácidos de tipo salvaje de B. subtilis. Este tipo de alineamiento se puede realizar con CLUSTAL o PILEUP usando parámetros estándar. Como se muestra, la secuencia de aminoácidos de las transcetolasas está muy conservada. En particular, en todas las transcetolasas mostradas y en muchas más transcetolasas no mostradas, la arginina 357 (numeración según la transcetolasa de B. subtilis) está conservada. Por lo tanto, el tipo de experimento que usa los conceptos y mutaciones dados aquí también se puede realizar con otras transcetolasas que tienen una arginina en una posición homóloga a la posición 357 de la secuencia de aminoácidos de transcetolasa de B. subtilis, como Ashbya gossypii, para mejorar la producción de riboflavina, derivados de riboflavina o compuestos que tienen como precursor ribosa-5-fosfato, xilulosa-5-fosfato o ribulosa-5fosfato. También es posible sustituir un gen de transcetolasa original de un organismo por un gen mutante de transcetolasa de B. subtilis mutado en la posición 357 con o sin adaptación de la secuencia de ADN al nuevo organismo. No es esencial que los genes mutantes de transcetolasa se originen a partir de un organismo en el que se va a introducir. Las etapas prácticas necesarias para otro organismo hospedante están publicadas y son conocidas para un experto en el campo, y están esquematizadas en alguna otra parte.

Ejemplo 1: Aislamiento de ADN genómico a partir de Bacillus subtilis

Se preparó ADNg usando el kit DNeasy Tissue Kit de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania) según la descripción del proveedor. Como fuente para las células bacterianas, se usó 1 ml de un cultivo durante toda la noche de 3 ml de B. subtilis en medio líquido VY (Becton Dickinson, Sparks, MD 21152, USA) incubado a 37ºC (250 rpm). Al final, el ADNg se eluyó en 200 !l de tampón AE (suministrado con el kit).

Ejemplo 2: Amplificación del gen de transcetolasa a partir de Bacillus subtilis

Para la amplificación del gen tkt, se usó ADNg de B. subtilis PY79 (P. Youngman, J. Perkins, y R. Losick (1984), Construction of a cloning site near one end of Tn917 into which foreign DNA may be inserted without affecting transposition in Bacillus subtilis or expression on the transposon-borne erm gene. Plasmid 12:1-9; véase el Ejemplo 1). Según la secuencia de ADN genómico, el gen tkt contiene un sitio Eco RI dentro de su secuencia codificante (SEC ID NO: 1). Puesto que el sitio de restricción Eco RI se usa generalmente para la clonación en vectores de expresión de E. coli, tales como pQE80 (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania), el sitio se suprimió sustituyendo C315 por una T, que es una mutación silenciosa que cambia el codón fenilalanínico de TTC a TTT. Para esto, se llevaron a cabo dos PCR distintas A y B. Para la PCR A se usaron las siguientes condiciones de PCR: 2 !M de cebador tkt 1S (según SEC ID No: 3, véase también la Figura 2) y tkt 2AS (según SEC ID No: 4,

Figura 2), 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng de ADN genómico (Ejemplo 1) en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa.

La regulación de la temperatura fue como sigue: Etapa 1: 3 min. a 95ºC Etapa 2: 30 s a 95ºC Etapa 3: 30 s a 52ºC Etapa 4: 30 s a 72ºC Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 35 veces. La PCR B se realizó en las siguientes condiciones: 2 !M de cebador tkt 2S (según SEC ID No: 8, Figura 2) y tkt 1AS (según SEC ID No: 13, Figura 2), 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa

de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng de ADN genómico (Ejemplo 1) en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa. La regulación de la temperatura fue como sigue:

Etapa 1: 3 min. a 95ºC Etapa 2: 30 s a 95ºC Etapa 3: 30 s a 52ºC Etapa 4: 2 min. a 72ºC Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 35 veces. Los dos productos de la PCR A y B se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y una extracción subsiguiente fuera del gel usando el kit de extracción en gel MinElute de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania). Usando la región solapante de los productos de la PCR A y B, fue posible ensamblarlos mediante una tercera PCR: 2 !M del cebador Rpi MutS (según SEC ID No: 5, Figura 2) y tkt 1ASohne (según SEC ID No: 6, Figura 2), 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng de producto de la PCR A y

producto de la PCR B en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa. Etapa 1: 3 min. a 95ºC Etapa 2: 30 s a 95ºC Etapa 3: 30 s a 53ºC Etapa 4: 2,5 min. a 72ºC Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 35 veces. Los productos de la PCR se purificaron con la ayuda del kit de purificación de PCR de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania) y se eluyeron en 50 !l de tampón de elución. El producto de la PCR se confirmó mediante una digestión con Eco RI. Para una confirmación adicional, se secuenció con los cebadores tkt 1S, tkt 2S, tkt 2AS, tkt 3S (según SEC ID No: 9, Figura 2), tkt 4S (según SEC ID No: 10, Figura 2), tkt 5S (según SEC ID No: 11, Figura 2), tkt 6S (según SEC ID No: 12, Figura 2), tkt 1AS.

Ejemplo 3: Construcción de mutantes tkt

La estructura tridimensional de la transcetolasa de levadura estaba disponible junto con una selección de mutaciones que mostró influencia sobre la unión al sustrato de la transcetolasa de levadura (Nilsson, U., L. Meshalkina, Y. Lindqvist, y G. Schneider. 1997. En la posición R359 (número 357 en la transcetolasa de B. subtilis), la arginina original se sustituyó por casi todos los otros aminoácidos. La construcción de los mutantes se realizó

básicamente como se describe en el ejemplo 1. En la Figura 1 se muestra un alineamiento de secuencias de aminoácidos que comprende las transcetolasas de levadura, de B. subtilis y de otros organismos.

Usando como molde el gen tkt libre de Eco RI (Ejemplo 2), las mutaciones se introdujeron como ya se describió para la supresión del sitio Eco RI: Se usaron las siguientes condiciones de PCR para PCR A y B: 2 !M de cebador Rpi MutS (A) o tkt 357nnn-S (B) y tkt 357AS (A) (según SEC ID No: 14, Figura 2) o tkt 1ASohne (B), 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng del gen tkt libre de Eco RI (Ejemplo 2) en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa. En el caso de la PCR B, el cebador sentido se escogió según el aminoácido que se introdujo: tkt 357N-S (según SEC ID No: 15, Figura 2) para asparagina, tkt 357Q-S (según SEC ID No: 16, Figura 2) para glutamina, tkt 357A-S (según SEC ID No: 17, Figura 2) para alanina, tkt 357K-S (según SEC ID No: 18, Figura 2) para lisina, tkt 357S-S (según SEC ID No: 19, Figura 2) para serina, tkt 357T-S (según SEC ID No: 20, Figura 2) para treonina, tkt 357H-S (según SEC ID No: 21, Figura 2) para histidina, tkt 357V-S (según SEC ID No: 22, Figura 2) para valina, tkt 357I-S (según SEC ID No: 23, Figura 2) para isoleucina, tkt 357L-S (según SEC ID No: 24, Figura 2) para leucina, tkt 357M-S (según SEC ID No: 25, Figura 2) para metionina, y tkt 357G-S (según SEC ID No: 26, Figura 2) para la introducción de glicina en la posición 357 de la transcetolasa de B. subtilis.

La regulación de la temperatura fue como sigue:

Etapa 1: 3 min. a 95ºC

Etapa 2: 30 s a 95ºC

Etapa 3: 30 s a 52ºC

Etapa 4: 60 s a 72ºC

Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 35 veces.

Los dos productos de la PCR A y B se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y una extracción sucesiva fuera del gel usando el kit de extracción en gel MinElute de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania). El ensamblaje del producto de la PCR A y B se realizó en una tercera PCR: 2 !M del cebador Rpi MutS y tkt 1ASohne, 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng de producto de la PCR A y producto de la PCR B en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa.

Etapa 1: 3 min. a 95ºC

Etapa 2: 30 s a 95ºC

Etapa 3: 30 s a 53ºC

Etapa 4: 2,5 min. a 72ºC

Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 35 veces.

Los productos de la PCR de la transcetolasa se purificaron con el kit de purificación de PCR de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania) y se eluyeron en 50 !l de tampón de elución. Los productos de la PCR se usaron para la transformación de B. subtilis.

Ejemplo 4: Construcción de una cepa de B. subtilis deficiente en transcetolasa

Para la introducción libre de marcadores de un gen de transcetolasa mutada en el locus tkt original del genoma de B. subtilis, se construyó una cepa deficiente en transcetolasa. Se combinaron dos fragmentos de ADN obtenidos mediante PCR, que comprenden el par de bases 452 a 1042 y el par de bases 1562 s 2001 del gen de transcetolasa de B. subtilis (SEC ID NO: 2), con el casete génico de resistencia a neomicina (M. Itaya, K. Kondo, y T. Tanaka. 1989. A neomycin resistance gene cassette selectable in a single copy state in the Bacillus subtilis chromosome. Nucleic Acids Res 17:4410). Se usaron las siguientes condiciones de PCR para la PCR A: 2 !M de cebador tkt Rec1S- (según SEC ID No: 27, Figura 2) y tkt Rec1AS (según SEC ID No: 28, Figura 2), 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng del gen tkt amplificado del Ejemplo 2 en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa.

La regulación de la temperatura fue como sigue:

Etapa 1: 3 min. a 95ºC Etapa 2: 30 s a 95ºC Etapa 3: 30 s a 52ºC Etapa 4: 30 s a 72ºC Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 30 veces. La PCR B se realizó en las siguientes condiciones: 2 !M del cebador tkt Rec 2S (según SEC ID No: 29, Figura 2) y tkt Rec 2AS (según SEC ID No: 30, Figura 2), 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN

polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng del gen tkt amplificado del Ejemplo 2 en el tampón apropiado como se suministra junto con la ADN polimerasa. La regulación de la temperatura fue como sigue:

Etapa 1: 3 min. a 95ºC Etapa 2: 30 s a 95ºC Etapa 3: 30 s a 52ºC Etapa 4: 2 min. a 72ºC Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 30 veces. Los dos productos de la PCR A y B se purificaron mediante electroforesis en gel de agarosa y una extracción subsiguiente fuera del gel usando el kit de extracción en gel MinElute de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania). Debido a las regiones solapantes de los dos productos de la PCR A y B con la secuencia del casete de resistencia a neomicina, es posible ensamblarlos mediante una tercera PCR: 2 !M de cebador tkt Rec I S y tkt Rec 2AS, 0,2 mM de cada nucleótido (ATP, GTP, TTP, CTP), 2,5 U de una ADN polimerasa de corrección (Stratagene, Gebouw California, 1101 CB Amsterdam Zuidoost, Países Bajos), 100 ng de producto de la PCR A, 100 ng de producto de la PCR B, y 100 ng de casete de resistencia a neomicina en el tampón apropiado como se

suministra junto con la ADN polimerasa. Etapa 1: 3 min. a 95ºC Etapa 2: 30 s a 95ºC Etapa 3: 30 s a 55ºC Etapa 4: 2,5 min. a 72ºC Etapa 5: 5 min. a 72ºC

Las etapas 2 a 4 se repitieron 35 veces. Se reunieron cinco PCRs que se ensamblan y se purificaron con el kit de purificación de PCR de Qiagen (QIAGEN GmbH, QIAGEN Str. 1, 40724 Hilden, Alemania) y se eluyeron en 50 !l de tampón de elución. El producto de la PCR correcto se confirmó mediante electroforesis en gel de agarosa, y se usó para la transformación de B. subtilis PY79. La preparación de células de B. subtilis competentes se realizó según Kunstet al., 1988 (F. Kunst, M. Debarbouille,

T. Msadek, M. Young, C. Mauel, D. Karamata, A. Klier, G. Rapoport, y R. Dedonder. 1988. Deduced polypeptides encoded by the Bacillus subtilis sacU locus share homology with two-component sensor-regulator systems. J Bacteriol 170: 5093-101). Se inocularon 2 ml de MNGE+Bacto Casamino Acid (CAA) (9 ml de medio MN (13,6 g/l de K2HPO4, 6,0 g/l de KH2PO4, 0,88 g/l de citrato de sodio*2H2O), 1 ml de glucosa (20%), 40 !l de glutamato de potasio (40%), 50 !l de citrato de amonio y hierro(III) (2,2 mg/l, recientemente preparado), 100 !l de triptófano (8 mg/l), 30 !l de MgSO4 (1 M), +/- 50 !l de Bacto Casamino Acid (20%, Becton Dickinson AG, Postfach, CH-4002 Basilea, Suiza) como una única colonia, y se incubó toda la noche a 37ºC y 250 rpm. Este cultivo se usó para inocular 10 ml de MNGE+CAA (OD500nm de partida de 0,1), y se incubó a 37ºC con agitación (250 rpm) hasta que alcanzó una OD500nm de 1,3. El cultivo se diluyó con el mismo volumen de MNGE sin CAA, y se incubó durante otra hora. Tras una etapa de centrifugación (10 min., 4000 rpm, 20ºC), el sobrenadante se decantó a un tubo estéril. El pelete se resuspendió en 1/8 del sobrenadante conservado. Se diluyeron 300 !l de células en 1,7 ml de MN (1x), 43 !l de glucosa (20%) y 34 !l de MgSO4 (1 M). Se añadieron 10 y 20 !l del producto de la PCR preparado a 400 !l de las células competentes diluidas, y se agitó durante 30 min. a 37ºC. Se añadieron 100 !l de mezcla de expresión (500 !l de

extracto de levadura al 5% (Becton Dickinson AG, Postfach, CH-4002 Basilea, Suiza), 125 !l de CAA (20%), 1/100 de la concentración final de antibióticos (2 !g/ml de neomicina), si se usa para selección, y 750 !l de agua bidestilada estéril), y las células se agitaron durante 1 h a 37ºC. Al final, las células se hicieron girar, se suspendieron en 200 !l del sobrenadante y se colocaron en placas TBAB (Becton Dickinson AG, Postfach, CH-4002 Basilea, Suiza) que contienen 2 !g/ml de neomicina.

Se hicieron crecer dos transformantes en medio VY (5 g/l de extracto de levadura (Becton Dickinson AG, Postfach, CH-4002 Basilea, Suiza), 25 g/l de caldo de infusión de ternera lechal (Sigma)). A partir de uno de los transformantes, denominado BS3402, se aisló ADN genómico como se describe en el Ejemplo 1, y la sustitución correcta del fragmento de ADN de transcetolasa del par de bases 1043 a 1561 por el casete del gen de neomicina se confirmó mediante una PCR estándar usando como cebadores tkt Rec 1S y tkt Rec 2AS. Como se esperaba para un mutante de supresión de transcetolasa, la cepa no pudo crecer en ribosa o gluconato como fuente de carbono única, y necesitó los tres aminoácidos aromáticos o ácido shikímico para crecer.

Ejemplo 5: Transformación de la cepa BS3402 de B. subtilis deficiente en transcetolasa con los genes de lasvariantes de transcetolasa

Se usaron 0,5 y 1 !g de ADN del gen de transcetolasa amplificado y sus variantes (Ejemplo 2 y 3) para transformar BS3402 como se describe en el Ejemplo 4. Las colonias positivas se identificaron mediante crecimiento en medio mínimo (2 g/l de glucosa y sorbitol en medio SMS (2 g/l de (NH4)2SO4, 14 g/l de K2HPO4, 6 g/l de KH2PO4, 1 g/l de citrato trisódico, 0,2 g/l de MgSO4*7H2O, agar al 1,5% (Becton Dickinson AG, Postfach, CH-4002 Basilea, Suiza) y oligoelementos (concentrado de 500 veces: 5,0 g/l de MnSO4x1 H2O, 2,0 g/l de CoCl2*6 H2O, 0,75 g/l de (NH4)6Mo7O24*4 H2O, 0,5 g/l de AlCl3*6 H2O, 0,375 g/l de CuCl*2 H2O)). Las colonias fueron visibles después de 24 a 48 h. Todos los transformantes fueron sensibles a neomicina, indicando la sustitución del gen de neomicina por los genes tkt de tipo salvaje y mutado introducidos.

Se aisló ADN genómico de los transformantes, y el gen tkt se amplificó mediante PCR como se describe en el Ejemplo 1. Las mutaciones introducidas se confirmaron mediante secuenciación. No se observaron intercambios nucleotídicos adicionales. Las cepas de B. subtilis generadas se denominaron: R357A -BS3403, R357H -BS3482, R357K - BS3484, R357G - BS3512, R357V - BS3487, R3571 - BS3509, R357L - BS3507, R357T - BS3492, R357S -BS3490, R357M - BS3505, R357N - BS3486, R357Q - BS3488.

Ejemplo 6: Transducción de B. subtilis RB50::[pRF69] (documento EP 0405370) con lisado de bacteriófago PBS-1 de la cepa de tipo salvaje deficiente en transcetolasa BS3402

El trabajo de transducción con el fago PBS-1 se realizó como se describe en Henkin et al., 1984 (Henkin, T. M., y G.

H. Chambliss. 1984. Genetic mapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4. Mol Gen Genet 193:364-9). Para la preparación del lisado de PBS-1, se hizo crecer la cepa BS3402 en placas TBAB (5 !g/ml de neomicina) a 37ºC toda la noche. Las células se usaron para inocular 25 ml de medio LB (Becton Dickinson AG, Postfach, CH-4002 Basilea, Suiza) hasta una OD de Klett 20-30 (usando el filtro verde). Cuando el 50% de las células fue móvil, se añadieron 0,2 ml del lisado del fago PBS-1 (Henkin, T. M., y G. H. Chambliss. 1984. Genetic mapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4. Mol Gen Genet 193:364-9) a 0,8 ml de caldo de cultivo. Después de incubar durante 30 min. a 37ºC con agitación, se añadieron 9 ml de medio LB. A esto le siguió otra etapa de incubación durante 30 min. a 37ºC. Entonces se añadieron 4 !g/ml de cloranfenicol, y la incubación se continuó durante otras 2 horas. Finalmente, los tubos se transfirieron a una incubadora seca a 37ºC en la que se dejaron toda la noche. A la mañana siguiente, el cultivo se filtró a través de un filtro de 0,45 !m y se almacenó a 4ºC o se usó directamente para la transducción.

Para la transducción de la cepa RB50::[pRF69] que sobreproduce riboflavina, se hizo crecer la cepa en una placa TBAB a 37ºC toda la noche. Las células se esta placa se usaron para inocular 25 ml de medio LB (Klett 20-30). Cuando el cultivo alcanzó Klett 175, se mezclaron 0,8 ml de las células con 0,2 ml de un lisado del fago PBS-1 de la cepa BS3402 preparado como se describe anteriormente. Después de incubar durante 30 min. a 37ºC con agitación, las células se hicieron girar y se suspendieron en 1 ml de medio VY. A esto le siguió una incubación durante 1 h en las condiciones idénticas. Se colocaron 200 a 1000 !l de las células transducidas sobre una placa de selección que contiene 2 !g/ml de neomicina. Las colonias que crecieron se estudiaron para determinar la resistencia a la neomicina. Después de aislar ADNg (Ejemplo 1), se llevó a cabo una PCR estándar que usa los cebadores tkt 1 S y Rec 2AS para confirmar la sustitución del gen tkt de tipo salvaje por el constructo del Ejemplo 4. La cepa confirmada se denominó BS3523.

Ejemplo 7: Introducción de los genes de transcetolasa modificada en la cepa BS3523

Para la preparación de lisados de PBS-1 de las cepas BS3403, BS3482, BS3484, BS3486, BS3490, y BS3512, se hicieron crecer las cepas respectivas en placas TBAB (5 !g/ml de neomicina) toda la noche a 37ºC. Las células de esas placas se usaron para inocular 25 ml de medio LB hasta una OD de Klett 20-30 (usando el filtro verde). Cuando el 50% de las células fue móvil (alrededor de Klett 150), se añadieron 0,2 ml del lisado del fago PBS-1 (Henkin, T. M., y G. H. Chambliss. 1984. Genetic mapping of a mutation causing an alteration in Bacillus subtilis ribosomal protein S4. Mol Gen Genet 193:364-9) a 0,8 ml del caldo de cultivo. Después de incubar durante 30 min. a 37ºC con

agitación ligera o volteo (tambor giratorio), se añadieron 9 ml de medio LB a las células. Se incubaron durante otros 30 min. en las mismas condiciones. Se añadió cloranfenicol a una concentración de 4 !g/ml, y la incubación se continuó durante otras 2 horas. Los tubos se incubaron toda la noche a 37ºC sin agitación. A la mañana siguiente, el cultivo se filtró a través de un filtro de 0,45 !m y se almacenó a 4ºC o se usó directamente para la transducción 5 subsiguiente. Para esto, la cepa deficiente en transcetolasa BS3523 (véase el ejemplo 6) se hizo crecer en una placa TBAB toda la noche a 37ºC. Las células de la placa se usaron para inocular 25 ml de medio LB (Klett 20-30). El cultivo se incubó a 37ºC con agitación. Cuando el cultivo alcanzó Klett 175, se mezclaron 0,8 ml de las células con 0,2 ml de lisado del fago PBS-1 de cada una de las cepas BS3403, BS3482, BS3484, BS3486, BS3490, y BS3512 como se describe anteriormente. Después de incubar durante 30 min. a 37ºC con agitación, las células se hicieron 10 girar y se suspendieron en 1 ml de medio VY. Después de incubar durante 1 h en las condiciones idénticas, las células se hicieron girar nuevamente, se suspendieron en 0,2 ml de medio 1xSMS, y se colocaron sobre placas de selección (1xSMS como se describe anteriormente con 1 g/l de glucosa, 1 g/l de sorbitol, y agarosa al 15%). Las colonias que crecieron se ensayaron en busca de la pérdida de resistencia a neomicina. Después de aislar ADNg (Ejemplo 1), se realizó una PCR estándar usando los cebadores tkt I S y Rec 2AS para amplificar el gen tkt a partir

15 del ADN genómico. El gen tkt de las colonias que mostraron una sustitución del gen tkt inactivado por uno intacto se secuenciaron para confirmar la existencia de las mutaciones. Las cepas generadas se denominaron BS3525 (lisado de BS3484), BS3528 (lisado de BS3482), BS3530 (lisado de BS3486), BS3534 (lisado de BS3403), BS3535 (lisado de BS3490), BS3541 (lisado de BS3512).

Ejemplo 8: Crecimiento de las cepas mutantes de transcetolasa en glucosa y gluconato

20 Para evaluar el efecto de las mutaciones de transcetolasa sobre la viabilidad y crecimiento de B. subtilis, se determinó la velocidad de crecimiento máxima de las cepas generadas sobre 2 g/l de glucosa o gluconato. Se usó el siguiente medio: 1 x SMS (2 g/l de (NH4)2SO4, 14 g/l de K2HPO4, 6 g/l de KH2PO4, 1 g/l de citrato trisódico, 0,2 g/l de MgSO4*7H2O), 2 g/l de glucosa o gluconato, 500 !g/l de extracto de levadura y disolución de oligoelementos como se describe en el Ejemplo 5. Se inocularon 25 ml del medio descrito en un matraz de 300 ml con pantallas

25 deflectoras a partir de un cultivo durante toda la noche (5 ml de VY, resuspendido en 1 ml de VY reciente) hasta una OD de Klett 20 a 30. Se incubaron a 37ºC con agitación (220 rpm). La OD de los cultivos fue seguida en intervalos de una hora durante la fase logarítmica. Durante la fase logarítmica, el intervalo se redujo a 30 min. Para la determinación de la velocidad de crecimiento máxima, se usaron al menos cuatro puntos de datos durante la fase logarítmica.

30 Tabla 1:

Mutante de B. subtilis

Velocidad de crecimiento en glucosa % de tipo salvaje Velocidad de crecimiento en gluconato % de tipo salvaje Relación

PY79 tipo salvaje

0,480 100% 0,351 100% 1,42/1

R357G

0,384 80% 0,300 86% 1,28/0,93

R357S

0,372 78% 0,254 72% 1,46/1,08

R357T

0,342 71% 0,240 68% 1,43/1,04

R357N

0,366 76% 0,231 66% 1,58/1,15

R357A

0,381 79% 0,225 64% 1,69/1,23

R357L

0,324 68% 0,189 54% 1,71/1,25

R357H

0,324 68% 0,174 50% 1,86/1,36

R357K

0,348 73% 0,171 49% 2,04/1,48

R357I

0,243 51% 0,108 31% 2,25/1,65

R357Q

0,228 48% 0,09 26% 2,53/1,83

R357V

0,297 62% 0,101 24% 2,94/2,58

R357M

0,258 54% 0,066 19% 3,91/2,84

R357Y

0,222 46% 0,06 17% 3,70/2,71

R357F

0,174 36% 0,038 11% 4,58/3,27

R357D

0,156 33% 0 0% -

La cepa de tipo salvaje PY79 mostró, como se esperaba, la velocidad de crecimiento más elevada en ambos sustratos. Introduciendo las diferentes mutaciones en la posición 357 de transcetolasa, el crecimiento en gluconato se vio afectado, como se esperaba, mucho más que el crecimiento en glucosa. La reducción de la velocidad de crecimiento máxima en gluconato se usó como una medida para el efecto de la mutación de transcetolasa sobre el flujo a través de la derivación de fosfato de pentosa no oxidativa y sobre la acumulación de los fosfatos de pentosa. Se cubrió un amplio intervalo de velocidades de crecimiento mediante las mutaciones mostradas.

Ejemplo 9: Producción de riboflavina en matraces de agitación

Se inocularon 5 ml de VY que contiene cloranfenicol (10 !g/ml) con las cepas RB50::[pRF69], BS32525, BS3528, BS34530, BS3434, BS34335, y BS3441 productoras de riboflavina (véase el Ejemplo 7). Después de incubar toda la noche, las células se hicieron girar (15 min., 4000 rpm) y se suspendieron en 1 ml de medio de cribado (2xSMS, 10 g/l de glucosa, 1 g/l de extracto de levadura, y oligoelementos como se describe en el ejemplo 5). Se inoculó un matraz de 200 ml con pantallas deflectoras que contiene 25 ml de medio de cribado con 0,25 ml de las células resuspendidas. Los cultivos se incubaron durante 48 h a 37ºC en una atmósfera saturada con agua. Después de un tiempo de incubación de 48 h, durante el cual se usó la glucosa suministrada en todos los cultivos, se tomó una muestra de 0,5 ml de los cultivos, se añadieron 35 !l de NaOH 4 N, y la mezcla se sometió a remolino durante 1 min. Después se añadieron directamente 465 !l de tampón de fosfato potásico 1 M, pH 6,8. La mezcla se aclaró mediante centrifugación durante 5 min. a 14000 rpm (centrífuga Eppendorf 5415D). El sobrenadante se transfirió a un nuevo tubo. Se usaron dos métodos diferentes para la determinación de la riboflavina. Para la determinación calorimétrica, se diluyeron 200 !l del sobrenadante con 800 !l de agua. La absorción a 444 nm se multiplicó con el factor de 0,03305 para obtener los gramos de riboflavina por litro de medio. Para los resultados finales, los valores obtenidos se corrigieron para las diferencias de volumen. La concentración de riboflavina también se determinó mediante HPLC según el Ejemplo 10. Los resultados se muestran en la Tabla 2:

Tabla 2:

Cepa

Resultado de UV Riboflavina % de RB50::[pRF69] Resultado de HPLC (riboflavina % de RB50::[pRF69]

[mg/l]

[mg/l]

BS3528(R357H)

179 171% 139 193%

BS3535(R357S)

173 166% 136 188%

BS3534(R357A)

144 138% 124 172%

BS3525(R357K)

148 142% 112 155%

BS3559(R357Q)

134 129% 103 143%

BS3530(R357N)

126 120% 93 129%

RB50::[pRF69]

104 100% 72 100%

BS3541(R357G)

92 89% 66 92%

BS3523(supresión)

90 87% 58 81%

Casi todas las cepas de Bacillus que contienen una mutación de transcetolasa mostraron una producción de riboflavina claramente aumentada, mientras que la cepa negativa a transcetolasa produjo menos riboflavina que la cepa de control. En el caso de la mutación R357H, la concentración de riboflavina casi se duplicó.

Ejemplo 10: Fermentación de riboflavina

Los experimentos de fermentación se llevaron a cabo como se describe en el documento EP 405370.

Las fermentaciones se realizaron con las cepas (1) RB50::[pRF69], (2) BS3534 (R357A), y (3) BS3528 (R357H). A un tiempo de fermentación de 24 horas y de 48 horas, se midieron las concentraciones de riboflavina y la biomasa (peso seco celular) en el caldo de cultivo. Como se muestra en la Tabla 3, la cepa progenitora RB50::[pRF69] produjo 9,8 g/l de riboflavina en 48 h, con un rendimiento en sustrato de 3,59% (p/p). La biomasa se produjo con un rendimiento en sustrato de 20,3% (p/p). Los derivados de RB50::[pRF69] que expresan un gen de transcetolasa modificada mostraron incrementos significativos en la producción de riboflavina. BS3528 y BS3534 produjeron 11,7 g/l y 14,6 g/l, respectivamente. Esto corresponde a un rendimiento en glucosa de 4,23% con BS3528 y 5,14% con BS3534, respectivamente (Tabla 3). Estos resultados demuestran que la modificación de la actividad de transcetolasa conduce a un incremento en la productividad de riboflavina.

Tabla 3: Rendimiento de riboflavina y de biomasa en sustrato después de un tiempo de fermentación de 48 h

Rendimiento B2 Diferencia Rendimiento de Biomasa Diferencia [%] (p/p) [%](p/p)

RB50::[pRF69] 3,59 ± 0,27 20,26 ± 0,80 BS3534 5,14 ± 0,09 + 43% 18,92 ± 0,37 - 7% BS3528 4,23 ± 0,19 + 18% 17,78 ± 1,73 - 12%

5 Ejemplo 11: Métodos analíticos para la determinación de riboflavina

Para la determinación de riboflavina, se puede usar el siguiente método analítico (Bretzel et al., J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 22, 19-26, 1999). El sistema cromatográfico fue un sistema Hewlett-Packard 1100 equipado con una bomba binaria, un termostato de

columna y un automuestreador enfriado. Se usó en línea tanto un detector de conjunto de diodos como un detector 10 de fluorescencia. Se registraron dos señales, UV a 280 nm y traza de fluorescencia a excitación de 446 nm, emisión

520 nm. Se usó una columna de acero inoxidable Supercosil LC-8-DB (150 x 4,6 mm, tamaño de partículas 3 !m) junto con un cartucho de guarda. Las fases móviles fueron 100 mM de ácido acético (A) y metanol (B). Se usó una elución en gradiente según el siguiente esquema:

Tiempo [min.] %A %B 0 982 6 982 15 5050 25 5050

15 La temperatura de la columna se ajustó a 20ºC, y el caudal fue 1,0 ml/min. El tiempo del experimento fue 25 min. Las muestras de fermentación se diluyeron, se filtraron y se analizaron sin tratamiento adicional. La riboflavina se

cuantificó mediante comparación con un patrón externo. Los cálculos se basan en la señal de UV a 280 nm. Como material estándar, se usó riboflavina adquirida de Fluka (9471 Buchs, Suiza) (pureza ∀ 99,0%). 20 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> DSM IP Assets BV

<120> Enzima modificada y su uso

<130> 24818

<160> 30 25 <170> PatentIn version 3.2

<210> 1

<211> 2004

<212>

ADN 30 <213> Bacillus sp.

<400> 1

<210> 2

<211> 667

<212> PRT

<213> Bacillus sp.

<400> 2

<210> 3

<211> 37

<212>

ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador <400>3 aggagaaatc atatggatac aattgaaaag aaatcag 37

10 <210> 4

<211> 22

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> Cebador

<400> 4 ggacatactg ccggtgttga tg 22

<210> 5

<211> 36 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 5 aattaaatga attcattaaa gaggagaaat catatg 36

<210> 6

<211> 35

<212> ADN 5 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 6

aattaaatgg atcccttatt gattaatgcc ttaac 35 10 <210> 7

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 15 <223> cebador

<400> 7 gttctgaggt cattactgg 19

<210> 8

<211> 22 20 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 8 25 ggacatactg ccggtgttga tg 22

<210> 9

<211> 19

<212> ADN

<213> Artificial 30 <220>

<223> Cebador

<400> 9 ttgaagaatt aacagcggc 19

<210> 10 35 <211> 18

<212> ADN

<213> Artificial <220>

<223> Cebador

<400> 10

cagcttgaac tggcaatc 18 5 <210> 11

<211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 10 <223> Cebador

<400> 11 gtcctgcgat tcgccttg 18

<210> 12

<211> 18 15 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 12 20 acgaaacacc cgacgctc 18

<210> 13

<211> 38

<212> ADN

<213> Artificial 25 <220>

<223> Cebador

<400> 13 aattaaatgg atccttactt attgattaat gccttaac 38

<210> 14 30 <211> 18

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

35 <400> 14 ggatgccaaa ctgcttcc 18

<210> 15

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 5 <223> Cebador

<400> 15 agcagtttgg catccaacgc atcttccggt gaagttc 37

<210> 16

<211> 37 10 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 16 15 agcagtttgg catcccaagc atcttccggt gaagttc 37

<210> 17

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial 20 <220>

<223> Cebador

<400> 17 agcagtttgg catccgcagc atcttccggt gaagttc 37

<210> 18 25 <211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

30 <400> 18 agcagtttgg catccaaagc atcttccggt gaagttc 37

<210> 19

<211> 37

<212> ADN 35 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador <400> 19 agcagtttgg catcctcagc atcttccggt gaagttc 37

<210> 20

<211> 37 5 <212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 20 10 agcagtttgg catccacagc atcttccggt gaagttc 37

<210> 21

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial 15 <220>

<223> Cebador

<400> 21 agcagtttgg catcccatgc atcttccggt gaagttc 37

<210> 22 20 <211 > 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

25 <400> 22 agcagtttgg catccgtggc atcttccggt gaagttc 37

<210> 23

<211> 37

<212> ADN 30 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 23

agcagtttgg catccattgc atcttccggt gaagttc 37 35 <210> 24

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 24 5 agcagtttgg catccttggc atcttccggt gaagttc 37

<210> 25

<211> 37

<212> ADN

<213> Artificial 10 <220>

<223> Cebador

<400> 25 agcagtttgg catccatggc atcttccggt gaagttc 37

<210> 26 15 <211> 37

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

20 <400> 26 agcagtttgg catccggtgc atcttccggt gaagttc 37

<210> 27 <211>21

<212> ADN 25 <213> Artificial

<220>

<223> Cebador

<400> 27

ggggcagcaa aacaccagga c 21 30 <210> 28

<211> 44

<212> ADN

<213> Artificial

<220> 35 <223> Cebador

<400> 28 gatctcgacc ctgcagccca agcacacagg aacctcttga tccc 44

<210> 29

<211> 47

<212> ADN

<213> Artificial 5 <220>

<223> Cebador

<400> 29 gcgtcaaaac gcataccatt ttgaacaaaa ccttcctacc atcgatc 47

<210> 30 10 <211> 24

<212> ADN

<213> Artificial

<220>

<223> Cebador

15 <400> 30 cttattgatt aatgccttaa ctcg 24

Claims (7)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Un procedimiento para la producción de sustancias para las que ribosa-5-fosfato, ribulosa-5-fosfato, o xilulosa-5fosfato es un precursor biosintético, que comprende cultivar un microorganismo en un medio adecuado en condiciones que permiten la expresión de una transcetolasa modificada y separar el producto de fermentación del medio, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado de Bacillus o Corynebacterium genéticamente manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dicha transcetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO: 2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo sobre una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada, y en el que el microorganismo sigue siendo prototrófico para aminoácidos aromáticos.

2. 2.

   Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la transcetolasa es una transcetolasa de Bacillus.

3. 3.

   Un procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que el polinucleótido que codifica la transcetolasa se muestra en SEC ID NO:1.

4. 4.

   Un procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que el producto de fermentación se selecciona de riboflavina, un precursor de riboflavina, FMN, FAD, fosfato de piridoxal y uno o más de sus derivados.

5. 5.

   Un procedimiento según la reivindicación 4, en el que el producto de fermentación es riboflavina.

6. 6.

   Uso de una transcetolasa modificada para la producción de riboflavina en un microorganismo, en el que la secuencia de aminoácidos de la transcetolasa modificada contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO:2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa está reducida entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada.

7. 7.

   Uso de un microorganismo para la producción de riboflavina, seleccionándose dicho microorganismo de un microorganismo productor de riboflavina seleccionado de Bacillus o Corynebacterium genéticamente manipulado mediante ingeniería con un polinucleótido que codifica dicha transcetolasa modificada que tiene una secuencia de aminoácidos que contiene al menos una mutación en una posición que corresponde a la posición 357 como se muestra en SEC ID NO:2, y en el que la velocidad de crecimiento de dicho microorganismo en una fuente de carbono que es metabolizada exclusivamente por la ruta de fosfato de pentosa se reduce entre 10 a 90% en comparación con una célula hospedante que contiene una transcetolasa no modificada, y en el que el microorganismo sigue siendo prototrófico para aminoácidos aromáticos.

   Figura 1:

   Alineamiento de secuencias múltiples CLUSTAL W (1.83)

   Figura 2: