CN114480157B - 一种产酸菌nq-p6及其应用与产酸菌nq-p6的培养、鉴定方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种产酸菌NQ‑P6，该菌株命名为：香鱼假单胞菌属(Pseudomonasplecoglossicida)NQ‑P6，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21591。可在产酸中进行应用，且于温度为28℃、pH为5、转速为180rpm条件下利用发酵培养基进行恒温震荡培养产酸效率最高。本发明的产酸菌，能够为生物产酸提供菌种资源。
Description
技术领域
本发明属于环境微生物技术领域，涉及一种产酸菌NQ-P6及其应用，还涉及该产酸菌NQ-P6的培养、鉴定方法。
背景技术
随着采矿业工业的发展，每年有大量的污染物被排放到土壤中，矿产资源的开采活动会产生大量的废石、尾砂等固体废弃物，占用大量土地的同时也造成地表植被的破坏，加剧了人口和土地的社会矛盾。
据统计，我国采矿占用的土地大约200万公顷，矿产资源开采产生的固体废弃物随意堆放会引起如土壤退化污染、动植物多样性减少、农作物产量和质量下降、疾病多发等。矿区开采周围的土壤均受到不同程度的重金属污染和危害，矿产资源开发带来的环境问题和生态危害引起人们越来越多的重视。常见的土壤修复技术主要为化学法和物理法，而近几年重金属污染土壤的生物联合修复技术也是土壤污染整治的重要手段之一，本研究就是采用生物联合修复技术中微生物产酸发酵液进行土壤污染治理，其机理是：在土壤环境中，微生物能够利用有效的营养和能源，而某些微生物发酵过程中通过微生物分泌有机酸络合并溶解土壤中的重金属，从而降低土壤重金属的毒性。这些微生物能代谢产生柠檬酸、草酸等物质，这些代谢产物能与重金属产生鳌合或是形成草酸盐沉淀，从而减轻重金属的伤害。
这种微生物修复方式因其成本低、效率高、污染小，被称为环境友好方法，正成为是来国内外研究的重点。
发明内容
本发明的目的是提供一种产酸菌NQ-P6及其应用与产酸菌NQ-P6的培养、鉴定方法，为生物产酸提供了菌种资源。
本发明所采用的技术方案是，一种产酸菌NQ-P6，该菌株命名为：香鱼假单胞菌属(Pseudomonas plecoglossicida)NQ-P6，已于2021年01月04 日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为 CGMCC NO：21591。
产酸菌NQ-P6的培养方法，具体为：
步骤1、菌株的分离培养
采集受重金属污染严重的土壤作为样品；
制备分离培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃灭菌20min，倒平板待其凝固，制成制成无菌的分离培养基备用；
将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于分离培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养1-2d；
步骤2、鉴别产酸菌株
制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入LB固体培养基，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落，划线培养于产酸鉴别培养基；
培养1-2d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；
步骤3、扩大培养：
配置LB液体培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃高温灭菌20min，待用；
将步骤2得到的产酸菌株挑取少量接种于LB液体培养基，于恒温振荡培养箱中以180rpm，保持28℃培养24h，得到大量产酸菌株。
产酸菌NQ-P6在产酸中的应用，利用发酵培养基培养产酸菌NQ-P6进行产酸，发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸0.5g，NaCI 5.0g，KH2PO40.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸馏水1L，调整pH为6.5，于121℃高温灭菌20min；将产酸菌NQ-P6 菌液以2％的添加比例加入发酵培养基，将准备好的发酵培养基于温度为 28℃、转速为180rpm条件进行恒温震荡培养。
产酸菌NQ-P6的鉴定方法，包括：利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定。
利用16S rRNA对菌种鉴定具体为：
目的菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增：通过细菌通用引物，包括上游引物Eubac27F:5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3和下游引物Eubac 1492R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目的菌株的16S rRNA基因序列；发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
首先进行0.1mol/L NaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置。然后准确吸取10.0mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀。用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL三角瓶中，加入1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下NaOH用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗NaOH的含量。
本发明的有益效果是：
菌株的耐重金属效果：测定产酸产酸菌NQ-P6在不同浓度的Pb2+、Cd2+和Zn2+培养基中培养2d后测定培养基中的OD600值考察产酸细菌对重金属的耐受性。随着重金属离子浓度的增加，产酸菌NQ-P6受到不同程度的抑制情况，当产酸菌NQ-P6重金属Pb2+浓度为500mg/L时，其抑制效果较强， OD600值在0.8-1.0左右；重金属Cd2+会对产酸菌NQ-P6产生抑制作用，前 24h几乎不生长，24h以后缓慢生长，但随着重金属Cd2+浓度越大抑制效果越强，当Cd2+浓度为150mg/L时，几乎完全抑制了菌的生长；而高浓度的重金属Zn2+对产酸菌NQ-P6几乎不产生抑制效果。
本发明的产酸菌NQ-P6的筛选与鉴定方法，能够为生物产酸提供菌种资源。
附图说明
图1是本发明的产酸菌图；
图2是本发明产酸菌基于16S rRNA序列构建的系统发育树；
图3是本发明产酸菌的生长曲线以及不同发酵时期培养基中pH变化图；
图4是本发明中不同浓度重金属Zn对产酸菌生长的影响；
图5是本发明中不同浓度重金属Zn对产酸菌pH的影响；
图6是本发明中不同浓度重金属Cd对产酸菌生长的影响；
图7是本发明中不同浓度重金属Cd对产酸菌pH的影响；
图8是本发明中不同浓度重金属Pb对产酸菌生长的影响；
图9是本发明中不同浓度重金属Pb对产酸菌pH的影响；
图10是本发明中不同温度对产酸菌NQ-P6发酵液pH的影响图；
图11是本发明中不同温度对产酸菌NQ-P6发酵液消耗NaOH量的影响图；
图12不同初始pH对产酸菌NQ-P6发酵液pH的影响图；
图13不同初始pH对产酸菌NQ-P6发酵液消耗NaOH量的影响图；
图14不同转速对产酸菌NQ-P6发酵液pH的影响图；
图15不同转速对产酸菌NQ-P6发酵液消耗NaOH量的影响图。
保藏信息：产酸菌已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏编号为CGMCC NO：21591。命名为：香鱼假单胞菌(Pseudomonasplecoglossicida)NQ-P6。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
一种产酸菌NQ-P6，该菌株命名为：香鱼假单胞菌属(Pseudomonasplecoglossicida)NQ-P6，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO：21591。
产酸菌NQ-P6的培养方法，具体为：
步骤1、菌株的分离培养
采集陕西省宁强县矿区附近受重金属污染严重的土壤作为样品；目的是从中分离具有产酸能力的微生物。
制备分离培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃灭菌20min，倒平板待其凝固，制成制成无菌的分离培养基备用；
将采集的土壤样品与无菌水混合制备土壤悬液，土壤悬液经梯度稀释后涂布于分离培养基表面，并编号，于30℃恒温培养箱中培养1-2d；吸取不同梯度的土壤悬液需换用不同的吸管。该部分采用常规操作。
步骤2、鉴别产酸菌株
制备产酸鉴别培养基：将1.6％溴甲酚紫加入LB固体培养基，在121℃高温灭菌20min，倒平板待其凝固后制成无菌的产酸鉴别培养基备用，其颜色为紫色；
将步骤1培养后的菌株取出，观察菌株形态，挑选出不同形态菌落，划线培养于产酸鉴别培养基；
培养1-2d后产酸鉴别培养基由紫色变为黄色则说明该菌株具有产酸能力，若无变化则说明该菌株不具有产酸能力，挑取具有产酸能力的菌株多次划线于产酸鉴别培养基中，获取纯化后的单一菌株；获得单一产酸菌株之后保藏于4℃冰箱中，待后续实验使用。
步骤3、扩大培养：
配置LB液体培养基：将酵母提取物5.0g，蛋白胨10.0g，NaCl 5.0g，蒸馏水1L，混合后于121℃高温灭菌20min，待用；
将步骤2得到的产酸菌株挑取少量接种于LB液体培养基，于恒温振荡培养箱中以180rpm，保持28℃培养24h，得到大量产酸菌株。
菌株形态观察和生理生化
菌落表面呈圆形，直径为1mm，菌落呈灰黄色，不透明，表面光滑湿润，边缘规则。
如图2所示，产酸菌NQ-P6基于16S rRNA序列构建的系统发育树，简介获得步骤：
系统进化分析：将测序结果与GenBank上已登录的基因序列进行比对，发现与香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)同源性最高，为100％。利用MEGA 5软件进行多序列比对分析，Neighbor-joining法构建系统发育树，如图2。综合生理生化特征和分子生物学特性，确定产酸菌NQ-P6为香鱼假单胞菌属(Pseudomonas plecoglossicida)。
如图3可知，产酸菌NQ-P6在LB液体培养基中生长，延滞期较短，对数生长期为2-12h，在培养到24h后处于生长的平稳期。生长40h以后菌株的生物量达到2.2mg·mL-1。产酸菌NQ-P6在培养0-24h时，pH变化幅度为5.7降低至4.18，24h后发酵液pH逐渐上升。
产酸菌NQ-P6在产酸中的应用，利用发酵培养基培养产酸菌NQ-P6进行产酸，发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸0.5g，NaCI 5.0g，KH2PO40.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，MgSO4·7H2O 0.5 g，蒸馏水1L，调整pH为6.5，于121℃高温灭菌20min；将产酸菌NQ-P6 菌液以2％的添加比例加入发酵培养基，将准备好的发酵培养基于温度为 28℃、转速为180rpm条件进行恒温震荡培养。
产酸菌NQ-P6的鉴定方法，包括：利用16S rRNA基因序列对菌种鉴定和发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定。
利用16S rRNA对菌种鉴定具体为：
目的菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增：通过细菌通用引物，包括上游引物Eubac27F:5-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3和下游引物Eubac 1492R： 5-GGTTACCTTGTTACGACTT-3，在聚合酶的作用下，经预变性、变性、退火、延伸、35个循环、修复延伸、获得目的菌株的16S rRNA基因序列。
发酵培养基内发酵液中有机酸含量的测定具体为：
首先进行0.1mol/L NaOH标准溶液、1％酚酞指示剂的配置；然后准确吸取10.0mL样品发酵液，转移到100mL容量瓶中，加蒸馏水至100mL刻度并摇匀；用滤纸过滤，准确吸取滤液20mL放入100mL三角瓶中，加入 1％酚酞2滴，用0.1mol/L NaOH标准溶液滴定至初显粉色在0.5min内不褪色为终点，记下NaOH用量，重复取三次取平均值。并测定空白组消耗NaOH的含量。
对重金属Zn、Cd和Pb的耐受性
测定产酸产酸菌NQ-P6在不同浓度的Pb2+、Cd2+和Zn2+培养基中培养2 d后，测定培养基中的OD600值，随着重金属离子浓度的增加，产酸菌NQ-P6 受到不同程度的抑制情况，当产酸菌NQ-P6重金属Pb2+浓度为500mg/L时，其抑制效果较强，OD600值在0.8-1.0左右；重金属Cd2+会对产酸菌NQ-P6 产生抑制作用，前24h几乎不生长，24h以后缓慢生长，但随着重金属Cd2+浓度越大抑制效果越强，当Cd2+浓度为150mg/L时，几乎完全抑制了菌的生长；而高浓度的重金属Zn2+对产酸菌NQ-P6几乎不产生抑制效果。说明产酸菌NQ-P6耐重金属效果Zn2+>Pb2 +>Cd2+。
产酸菌NQ-P6在未添加重金属的发酵培养基中初始pH值为5.7，然后 pH逐渐下降，24h后上升。在重金属Zn2+胁迫情况下，产酸菌NQ-P6 0-24h 产酸效果收到抑制，但仍具有产酸能力。
当受到重金属Cd2+抑制时，产酸菌NQ-P6前24h几乎不生长，24h以后 Cd2+浓度越大抑制效果越强，Cd2+浓度为150mg/L时，几乎完全抑制了菌的生长；
产酸菌NQ-P6在未添加重金属的发酵培养基中初始pH值为5.7，然后pH逐渐下降，24h后上升。在重金属Cd2+胁迫情况下，当Cd2+浓度大于150 mg/L时，对菌株产酸具有抑制作用。
随着重金属Pb2+浓度的增加，产酸菌NQ-P6受到不同程度的抑制情况，当Pb2+浓度达到500mg/L时，产酸菌NQ-P6 OD600值在0.8-1.0左右，抑制效果较强。
产酸菌NQ-P6在未添加重金属的发酵培养基中初始pH值为5.7，然后pH逐渐下降，24h后上升。在重金属胁迫情况下，当Pb2+浓度为500mg/L 时，抑制产酸，但仍具有一定的产酸效果。
采用单因素实验法分析不同温度、初始发酵液pH及转速对菌株发酵产酸的影响情况。
1.温度
温度设置梯度为25℃、28℃、30℃、32℃和35℃，分别测定不同温度下发酵液中pH的变化与发酵液NaOH的消耗量，来确定最佳产酸的温度条件。
如图10-11所示，当培养温度为28℃时，发酵液pH下降能力最大，且消耗NaOH量最多，所以当培养温度达到28℃的时候产酸菌NQ-P6产酸能力最强。
2.pH
初始发酵液pH设置梯度为5、5.5、6、6.5和7，分别测定不同初始发酵液pH下发酵液中pH的变化与发酵液NaOH的消耗量，来确定最佳产酸的初始发酵液pH条件。
如图12-13所示，当培养初始发酵液pH为5时，发酵液pH下降能力最大，且消耗NaOH量最多，所以当培养初始发酵液pH达到5的时候产酸菌NQ-P6产酸能力最强。
3.转速
转速设置梯度为100rpm、120rpm、140rpm、160rpm和180rpm，分别测定不同转速下发酵液中pH的变化与发酵液NaOH的消耗量，来确定最佳产酸的转速条件。
如图14-15所示，当培养转速为180rpm时，发酵液pH下降能力最大，且消耗NaOH量最多，所以当培养初始发酵液转速达到180rpm的时候产酸菌NQ-P6产酸能力最强。
序列表
<110> 西安文理学院
<120> 一种产酸菌NQ-P6及其应用与产酸菌NQ-P6的培养、鉴定方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1466
<212> DNA/RNA
<213> 香鱼假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida )
<400> 1
tcagattgaa cgctggcggc aggcctaaca catgcaagtc gagcggatga cgggagcttg 60
ctccttgatt cagcggcgga cgggtgagta atgcctagga atctgcctgg tagtggggga 120
caacgtttcg aaaggaacgc taataccgca tacgtcctac gggagaaagc aggggacctt 180
cgggccttgc gctatcagat gagcctaggt cggattagct agttggtggg gtaatggctc 240
accaaggcga cgatccgtaa ctggtctgag aggatgatca gtcacactgg aactgagaca 300
cggtccagac tcctacggga ggcagcagtg gggaatattg gacaatgggc gaaagcctga 360
tccagccatg ccgcgtgtgt gaagaaggtc ttcggattgt aaagcacttt aagttgggag 420
gaagggcagt aagttaatac cttgctgttt tgacgttacc gacagaataa gcaccggcta 480
actctgtgcc agcagccgcg gtaatacaga gggtgcaagc gttaatcgga attactgggc 540
gtaaagcgcg cgtaggtggt tcgttaagtt ggatgtgaaa gccccgggct caacctggga 600
actgcatcca aaactggcga gctagagtac ggtagagggt ggtggaattt cctgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagatatag gaaggaacac cagtggcgaa ggcgaccacc tggactgata 720
ctgacactga ggtgcgaaag cgtggggagc aaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
ccgtaaacga tgtcaactag ccgttggaat ccttgagatt ttagtggcgc agctaacgca 840
ttaagttgac cgcctgggga gtacggccgc aaggttaaaa ctcaaatgaa ttgacggggg 900
cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggc 960
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gctgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg taacgagcgc 1080
aacccttgtc cttagttacc agcacgttat ggtgggcact ctaaggagac tgccggtgac 1140
aaaccggagg aaggtgggga tgacgtcaag tcatcatggc ccttacggcc tgggctacac 1200
acgtgctaca atggtcggta cagagggttg ccaagccgcg aggtggagct aatctcacaa 1260
aaccgatcgt agtccggatc gcagtctgca actcgactgc gtgaagtcgg aatcgctagt 1320
aatcgcgaat cagaatgtcg cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca 1380
caccatggga gtgggttgca ccagaagtag ctagtctaac cttcgggggg acggttacca 1440
cggtgtgatt catgactggg gtgaag 1466
Claims (3)
1.一种产酸菌NQ-P6，其特征在于，该菌株命名为：香鱼假单胞菌属(Pseudomonasplecoglossicida)NQ-P6，已于2021年01月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO：21591。
2.根据权利要求1所述的产酸菌NQ-P6在产酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，利用发酵培养基培养产酸菌NQ-P6进行产酸，发酵培养基采用葡萄糖20.0g，蛋白胨5.0g，酵母粉0.5g，L-半胱氨酸0.5g，NaCI5.0g，KH2PO40.5g，FeSO4·7H2O0.01g，MgSO4·7H2O0.5g，蒸馏水1L，调整pH为6.5，于121℃高温灭菌20min；将产酸菌NQ-P6菌液以2％的添加比例加入发酵培养基，将准备好的发酵培养基于温度为28℃、转速为180rpm条件进行恒温震荡培养。
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| CN202110770417.6A CN114480157B (zh) | 2021-07-08 | 2021-07-08 | 一种产酸菌nq-p6及其应用与产酸菌nq-p6的培养、鉴定方法 |
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| CN110699303A (zh) * | 2019-11-19 | 2020-01-17 | 河南工业大学 | 一株高效解磷假单胞菌及其微生物菌剂和应用 |
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2021
- 2021-07-08 CN CN202110770417.6A patent/CN114480157B/zh active Active
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Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| Pseudomonas plecoglossicida as a novel organism for the bioremediation of cypermethrin;Hansa Boricha等;Biology and Medicine;第1卷(第4期);1-10 * |
Also Published As
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|---|---|
| CN114480157A (zh) | 2022-05-13 |
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